Ekspresja białek fluorescencyjnych w Branchiostoma lanceolatum przez wstrzyknięcie mRNA do niezapłodnionych oocytów

Ogólnym celem tej procedury jest wprowadzenie mRNA, kodującego białko fluorescencyjne do oocytów oskrzela stomijnego i latać, aby umożliwić obrazowanie fluorescencyjne in vivo rozwijających się zarodków. Osiąga się to poprzez pierwsze wywołanie tarła dojrzałych amfi ais, samców i samic przez szok temperaturowy trwający 24 godziny. Po szoku temperaturowym samice i samce umieszcza się w indywidualnych miseczkach tarłowych, co pozwala na pobranie odpowiednio oocytów i plemników.

Gdy cyty zostaną ustawione w naczyniu pokrytym polilizyną, specjalnie przygotowana igła do mikroiniekcji jest używana do wstrzykiwania roztworu do wnętrza cytu. Ostatnim krokiem jest zapłodnienie cytu jedną do pięciu kropli plemnika. Ostatecznie dwufotonowy skaning laserowy.

Mikroskopia służy do pokazania wszechobecnej ekspresji białek fluorescencyjnych wytwarzanych z mikrowstrzykniętego mRNA. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy mikroiniekcji są trudne do nauczenia, ponieważ wymagane są umiejętności techniczne, których nie można szczegółowo opisać i opisać w druku. Na początek przygotuj naczynia pokryte polilizyną, które służą do unieruchamiania cytów podczas wstrzyknięcia.

Dla każdej 35-milimetrowej hodowli komórkowej szalki Petriego przykryj dno roztworem polilizyny i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie przenieś roztwór polilizyny do innego naczynia i ponownie inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Wyrzuć roztwór i pozwól szalkom Petriego wyschnąć do góry nogami w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Po wyschnięciu panierowane naczynia należy przechowywać zawinięte w folię spożywczą w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia. Aby przygotować naczynia pokryte aros używane do hodowli wstrzykniętych zarodków, przygotuj sztuczną wodę morską i wodę z odwróconej osmozy. Następnie rozpuść aros do stężenia 1% w przefiltrowanym SW szybko przelej ciepły roztwór aros z jednej szalki Petriego na drugą, aby zapewnić bardzo cienką powłokę aros naczynia.

Zawiń pokryte naczynia w folię Saran i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do tygodnia. Najpierw przygotuj mieszankę iniekcyjną w RNA i fenolu wodnym wolnym od DNA. Kolor czerwony barwi roztwór i pozwala na identyfikację pomyślnie wstrzykniętych zarodków.

Następnie odwiruj mieszankę, aby osadzać kryształy i trzymaj na lodzie, aż będzie gotowa do użycia. Gdy będziesz gotowy, załaduj pipetę o pojemności 10 mikrolitrów z 0,5 mikrolitra mieszanki iniekcyjnej, omijając dno probówki, w której kryształy zostały granulowane. Wypełnić igłę do wstrzykiwań, odpipetowując kroplę o objętości 0,5 mikrolitra do wstrzykiwań.

Wymieszać z dużym otworem igły. Przygotować dwie igły na wypadek, gdyby jedna z nich pękła podczas wstrzyknięcia. Igły należy przechowywać w słoiku z wodą na dnie, aby zapobiec parowaniu wstrzyknięcia.

Wymieszaj i umieść w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pozostawić mieszaninę do wstrzykiwań powoli przemieszczającą się do końcówki igły do wstrzykiwań przez co najmniej jedną godzinę, aby zminimalizować tworzenie się pęcherzyków. Aby rozpocząć pobieranie oocytów i plemników, samce i samice są poddawane szokowi w SW przez 24 godziny, a następnie przenoszone do pojedynczych kubków na jedną do dwóch godzin przed tarłem.

Po tarle natychmiast zbierz plemniki i cyty. Uważaj, aby nie przestraszyć dorosłych podczas zbierania. Dodatkowy ruch może rozproszyć się, a tym samym rozcieńczyć zarówno plemniki, jak i cyty po pobraniu.

Trzymaj plemniki na lodzie w 1,5-mililitrowej probówce i przenieś cyty w przefiltrowanym SW do wstępnie wypłukanych szalek Petriego. Przenieś od 100 do 500 cytów na kolejną 35-milimetrową szalkę Petriego, aby wykonać zastrzyki. Na koniec zapłodnić pozostałą część lęgu cytów jako kontrolę jakości nasienia i cytów lub do innych eksperymentów.

Aby rozpocząć procedurę wstrzykiwania, zainstaluj igłę na mikromanipulatorze pod kątem 50 stopni w stosunku do płaszczyzny poziomej pod fluorescencyjną lunetą sekcyjną z 25 lornetkami, przenieś 30 cytów do naczynia pokrytego polilizyną i przefiltruj SW, aby pomóc w śledzeniu wstrzykniętych cytów. Ułóż je wzdłuż linii w uporządkowany sposób. Zawsze wstrzykuj małe liczby, aby zminimalizować ekspozycję.

Czas na polilizynę, która ma tendencję do deformacji rozwijających się zarodków. Użyj oświetlenia ciemnego pola, aby cyty były tak przezroczyste, jak to tylko możliwe. Następnie, za pomocą pokrętła ruchu zgrubnego, zbliżyć igłę do wstrzykiwania do cytu za pomocą cienkich kleszczyków. Ciąć.

Otwórz igłę na poziomie, na którym końcówka zaczyna się zakrzywiać, pulsując wraz z wtryskiwaczem. Sprawdzić, czy czerwona mieszanina do wstrzykiwań wypływa z igły przy 200-krotnym powiększeniu. Za pomocą pokrętła o precyzyjnym ruchu delikatnie przesuń igłę do wstrzykiwań wewnątrz rdzenia cytu.

W przypadku wprowadzenia dwóch na powierzchni, wstrzyknięty roztwór nie pozostanie w miejscu UO. Jeśli zostanie włożona zbyt głęboko, strona UO zostanie zniszczona. Wstrzykiwać od jednego do trzech impulsów.

Jeśli igła jest wystarczająco cienka, wstrzykiwać ją z ciągłym przepływem pod stałym ciśnieniem. Upewnij się, że objętość wstrzykniętego jajka odpowiada jednej piątej do jednej trzeciej objętości pojedynczego oocytu po wstrzyknięciu. Szybko wyciągnąć igłę, aby uniknąć wycieku.

Sprawdzić, czy wstrzyknięty roztwór pozostaje w cytacie i czy po kilku sekundach wstrzyknięty roztwór rozprzestrzenia się po całym cytacie. Przejdź do następnego cytu w linii. Zachowaj kilka niewstrzykniętych zarodków z każdej serii jako kontrolę ujemną, aby oszacować fluorescencję tła podczas skanowania w poszukiwaniu wstrzykniętych zarodków, zapładniaj oocyty, gdy tylko seria zostanie wstrzyknięta.

Ponieważ jakość oocytów pogarsza się z czasem, wstrzyknij i zapłodnij cyty w ciągu jednej godziny. Po tarle. W zależności od stężenia plemników dodaj od jednej do pięciu kropli nasienia do UY i zakręć naczynie.

Otoczka zapłodnienia powinna stać się widoczna na zarodkach. Po około jednej minucie pozwól zarodkom oderwać się od naczynia pokrytego polilizyną, jednocześnie wstrzykując kolejną serię oocytów. Po odłączeniu przenieś zarodki na szalkę Petriego pokrytą arosem.

Jeśli to możliwe, wyjąć zarodki z naczynia pokrytego polilizyną. Przed etapem dwukomórkowym. Na etapie od dwóch do czterech komórek wybierz pomyślnie wstrzyknięte zarodki za pomocą fluorescencyjnej lunety preparacyjnej.

W przypadku filtra DSR udane wstrzyknięcie jest wskazywane przez normalną morfologię, która wykazuje sygnał czerwonej fluorescencji pochodzący z czerwieni fenolowej. Trzymaj zarodki i przefiltruj SW na szalkach Petriego pokrytych agros w temperaturze 19 stopni Celsjusza do pożądanego etapu obrazowania in vivo, te reprezentatywne obrazy zarodków bronchos stomia lancia lato zostały wykonane po mikroiniekcji mRNA i powlekaniu białek fluorescencyjnych. Ten pierwszy obraz pokazuje, że ekspresję jądrowego EGFP uzyskaną przez mikrowstrzyknięcie konstruktu H 2 B-E-G-F-P można wykryć w zarodkach już w stadium 16 komórek.

Ten zarodek w stadium żołądkowym jest przykładem wszechobecnej koekspresji EGFP ukierunkowanej na jądro m wiśni i błonę. Sygnał jądrowy powstaje w wyniku mikroiniekcji konstruktu wiśniowego H two BM, podczas gdy fluorescencja w błonach komórkowych jest uzyskiwana przez mikroiniekcję konstruktu pudełkowego EEG FP CAAX. Przekrój optyczny tego zarodka w stadium żołądkowym pokazuje, w jaki sposób jądra i kontury komórek są odpowiednio podkreślane przez ukierunkowaną na jądro mCherry i EGFP związaną z błoną.

Wizualna demonstracja tej techniki mikroiniekcji wesprze naukowców w ewolucyjnym rozwoju społeczności biologicznej w ulepszaniu istniejących i opracowywaniu nowatorskich podejść do indywidualnego obrazowania, manipulacji specyficznymi genami i stabilnego in afi, ważnego modelu dla zrozumienia ewolucji zwierząt.