Name: Ekspresja białek fluorescencyjnych w Branchiostoma lanceolatum przez wstrzyknięcie mRNA do niezapłodnionych oocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Poznaj mikroiniekcję mRNA do oocytów Branchiostoma lanceolatum w celu ekspresji białek fluorescencyjnych. Ta metoda umożliwia obrazowanie in vivo rozwoju zarodków i otwiera nowe możliwości w biologii rozwojowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" dla hodowli zwierząt. Prace te były wspierane przez fundusze ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 i ANR-11-JSV2-002-01) dla Michaela Schuberta, przez grant Unii Europejskiej 6PR "Embryomics" oraz przez grant ANR "ANR-10-BLAN-121801 Dev-Process" dla Jeana-François Nicolasa i Nadine Peyriéras. Stypendium doktoranckie im. João Emanuela Carvalho jest finansowane przez FCT (SFRH/BD/86878/2012).
Prośby o opisane tutaj wektory można kierować bezpośrednio do autorów.

1. Przygotowanie instrumentów i odczynników
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Pipety transferowe Pasteura
	<ol>
		<li>Wygeneruj serię pipet transferowych Pasteura o różnych średnicach końcówek, przeciągając pipety Pasteura o długości 230 mm nad płomieniem z różnymi prędkościami. Upewnij się, że stożek jest tak długi, jak to możliwe, aby zapewnić płynną i precyzyjną kontrolę zasysania.</li>
		<li>Rysownikiem diamentowym podrap pipetę wzdłuż linii prostopadłej do długości pipety. Obiema rękami pociągnij pipetę równolegle do jej długości, aby uzyskać cięcie. Szybko wypoleruj pipetę płomieniowo, nie uszczelniając końcówki.</li>
		<li>Zmieniaj średnicę końcówki w zależności od stadium oocytów/zarodków, które mają być pipetowane: 300-400 μm dla oocytów niezapłodnionych (około 150 μm średnicy), 600 μm dla zapłodnionych jaj (około 500 μm średnicy), 200-400 μm dla wyklutych neuruli. Użyj pipet z rurką aspiracyjną monitorowaną przez jamę ustną, aby przenieść oocyty/zarodki z jednej szalki do drugiej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Igły iniekcyjne
	<ol>
		<li>Manipuluj naczyniami włosowatymi w rękawiczkach, aby zapewnić warunki wolne od RNaz. Stosować szkło borokrzemianowe z kapilarami z żarnikiem o wymiarach OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, długości 10 mm.</li>
		<li>Jeśli kapilary są naciągane na typ ściągacza igłowego z filamentem grzewczym opisany na liście materiałów, użyj następujących ustawień: Ciepło 600, Ciągnięcie 50, Prędkość 80, Czas 60, Ciśnienie 200 lub 300. W przeciwnym razie należy upewnić się, że kształt, który ma kluczowe znaczenie dla udanych wstrzyknięć, jest taki, jak pokazano na rysunku 2 z następującymi właściwościami: zewnętrzna średnica końcówki 4-8 μm, długość stożka 2 cm. 
		UWAGA: Igły można wyciągać przed sezonem tarła i używać przez cały sezon.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>5% roztwór podstawowy czerwieni fenolowej (4x)
	<ol>
		<li>Przygotuj świeże przed każdym sezonem tarłowym.</li>
		<li>W probówce filtracyjnej o wielkości 0,22 μm odważyć 25 mg proszku czerwieni fenolowej.</li>
		<li>Dodać 0,5 ml wody wolnej od DNaz i RNaz do probówki zawierającej proszek.</li>
		<li>Wirować przez 3-5 minut w temperaturze 18 000 x g w temperaturze pokojowej, aby przefiltrować i wysterylizować roztwór i usunąć kryształy, które mogłyby zatkać igłę do wstrzykiwań.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C lub 250 μl porcji w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>0,25 mg/ml roztwór polilizyny
	<ol>
		<li>Przygotuj świeże przed każdym sezonem tarłowym.</li>
		<li>Rozpuścić 5 mg poli-L-lizyny w 20 ml wody destylowanej. Przechowywać 5 ml porcji w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Natychmiast i tylko raz użyć rozmrożonej podwielokrotności, aby zapewnić powtarzalne i solidne przyleganie oocytów do naczynia pokrytego polilizyną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza mRNA
	<ol>
		<li>Przygotuj świeże przed każdym sezonem tarłowym.</li>
		<li>Linearyzować 5 μg DNA będącego przedmiotem zainteresowania odpowiednim enzymem (zwykle przez 2 godziny, w temperaturze 37 °C). Aby sprawdzić kompletność trawienia, należy przez 20 minut przepuszczać 2% objętości mieszanki mineralizacyjnej na 1% żelu agarozowo-TBE w buforze TBE o mocy 150 W.</li>
		<li>Ekstrahuj zlinearyzowane DNA za pomocą fenolu 25:24:1 (pH 8,0):chloroform:alkohol izoamylowy. Wirować przez 20 sekund, odwirować 10 minut przy 18 000 x g i zebrać fazę wodną (górną).</li>
		<li>Ponownie wyekstrahować fazę wodną chloroformem 24:1: alkohol izoamylowy. Wirować przez 20 sekund, odwirować 10 minut przy 18 000 x g i zebrać fazę wodną.</li>
		<li>Wytrącić zlinearyzowane DNA za pomocą 100:10:300 zlinearyzowanego DNA: 3 M octanu sodu (pH 5,2): 100% etanolu przez noc w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Wirować 20 minut przy 18 000 x g w temperaturze 4 °C. Wypłukać w 70% etanolu.</li>
		<li>Wirować 10 minut przy 18 000 x g w temperaturze 4 °C. Pozostawić do wyschnięcia i ponownie zawiesić w wodzie wolnej od RNaz o końcowym stężeniu 0,5 μg/μl.</li>
		<li>Transkrybuj 1 μg zlinearyzowanego DNA za pomocą zestawu do syntezy mRNA z odpowiednią polimerazą, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Ekstrahuj mRNA za pomocą fenolu 5:1 (pH 4,7): roztworu zatrzymującego chloroform i octan amonu dostarczony z zestawem.</li>
		<li>Wirować przez 20 sekund, odwirować 10 minut przy 18 000 x g i zebrać fazę wodną.</li>
		<li>Ponownie wyekstrahować fazę wodną chloroformem 24:1: alkohol izoamylowy. Wirować przez 20 sekund, odwirować 10 minut przy 18 000 x g i zebrać fazę wodną.</li>
		<li>Wytrącić mRNA 100% izopropanolem przez noc w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Wirować 20 minut przy 18 000 x g w temperaturze 4 °C. Wypłukać w 80% etanolu.</li>
		<li>Wirować 10 minut przy 18 000 x g w temperaturze 4 °C. Pozostaw granulat do wyschnięcia w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 5-10 minut, ponieważ wtedy trudno będzie go ponownie zawiesić. Zawiesić w wodzie wolnej od DNaz i RNaz do końcowego stężenia co najmniej 2 μg/μl, aby zapewnić przyzwoite końcowe stężenie mRNA w mieszance iniekcyjnej.</li>
		<li>Aby sprawdzić jakość i wielkość produktu transkrypcji, należy umieścić 0,5 μl mRNA w wolnym od RNaz 1% żelu agarozowo-TBE w buforze TBE o mocy 150 W przez 20 minut. Przechowywać 2 μl podwielokrotności w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naczynia pokryte polilizyną 
	UWAGA: Naczynia pokryte polilizyną służą do unieruchamiania oocytów podczas iniekcji.
	<ol>
		<li>Dla każdej płytki Petriego o średnicy 35 mm (w sumie 5) należy przykryć dno płytki Petriego 1 ml rozmrożonego roztworu polilizyny o stężeniu 0,25 mg/ml. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Dla każdej płytki Petriego z 35 mm hodowli komórkowej (w sumie 5) przenieść 0,25 mg/ml roztworu polilizyny do innej płytki Petriego z 35 mm hodowli komórkowej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Odrzucić 0,25 mg/ml roztworu polilizyny.</li>
		<li>Pozostaw szalki Petriego do wyschnięcia, do góry nogami w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
		<li>Naczynia pokryte polilizyną należy przechowywać zawinięte w folię spożywczą w temperaturze 4 °C, aby uniknąć zanieczyszczenia, maksymalnie przez tydzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potrawy w panierce agarozowej 
	UWAGA: Służą do hodowli zarodków z iniekcjami. Agaroza zapewnia poduszkę dla wstrzykniętych zarodków i zapobiega ich przywieraniu do dna naczynia.
	<ol>
		<li>Wytwarzaj sztuczną wodę morską (ASW) przy użyciu 37-38 g/l soli komercyjnych + 0,25 mM NaHCO3 w wodzie z odwróconej osmozy.</li>
		<li>Rozpuścić agarozę do stężenia 1% w ASW przefiltrowanym przez 0,22 μm, podgrzewając roztwór w kuchence mikrofalowej.</li>
		<li>Szybko przelej ciepły roztwór agarozy z jednej szalki Petriego o średnicy 35 mm do drugiej, aby uzyskać bardzo cienką warstwę agarozy na naczyniu.</li>
		<li>Naczynia pokryte agarozą zawinięte w folię Saran należy przechowywać w temperaturze 4 °C, aby uniknąć zanieczyszczenia, maksymalnie przez tydzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mieszanka iniekcyjna i ładowanie igieł iniekcyjnych
	<ol>
		<li>Na około 2 godziny przed rozpoczęciem iniekcji należy przygotować mieszaninę iniekcji o objętości 2 μl w wodzie wolnej od RNaz i DNaz o końcowym stężeniu 1-1,8 μg/μl mRNA, 15% glicerolu, 1,25% czerwieni fenolowej. 
		UWAGA: Czerwień fenolowa barwi roztwór, co umożliwia monitorowanie skuteczności iniekcji i identyfikację pomyślnie wstrzykniętych zarodków. Glicerol sprzyja dyfuzji mRNA w oocycie.</li>
		<li>Wirować 4 minuty przy 18 000 x g do osadzania kryształów. Trzymaj na lodzie do czasu użycia.</li>
		<li>Za pomocą pipety o pojemności 10 μl zebrać 0,5 μl mieszanki iniekcyjnej, omijając dno probówki, gdzie kryształy zostały osadzone.</li>
		<li>Wypełnić co najmniej dwie igły do wstrzykiwań (w przypadku gdyby jedna z nich pękła podczas wstrzykiwania), pipetując 0,5 μl kropli mieszanki iniekcyjnej do dużego otworu igły.</li>
		<li>Umieścić igły w słoiku do przechowywania z płynem na dnie w temperaturze 4 °C, aby zapobiec odparowaniu mieszanki do wstrzykiwań. Pozostaw mieszaninę do wstrzykiwań powoli przemieszczającą się do końcówki igły do wstrzykiwań przez co najmniej 1 godzinę, aby zminimalizować tworzenie się pęcherzyków.</li>
		<li>Dodatkową mieszankę do wstrzykiwań należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez maksymalnie trzy dodatkowe użycia, po których jakość mRNA ulega pogorszeniu (dane nie pokazane).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pobieranie materiału biologicznego, mikroiniekcja i hodowla zarodków
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Pobieranie komórek jajowych i plemników 
	UWAGA: Patrz Theodosiou et al.12 dla szczegółowego protokołu indukowania tarła i zbierania gamet.
	<ol>
		<li>Szokować samce i samice w ASW w temperaturze 23 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Na jedną do dwóch godzin przed zachodem słońca przenieś dorosłe osobniki do osobnych kubków w ASW w temperaturze 19 °C, ponieważ większość dorosłych osobników składa tarło 1-2 godziny po zachodzie słońca.</li>
		<li>Opłucz szalki Petriego o średnicy 35 mm w przefiltrowanym ASW i pozwól im wyschnąć do góry nogami, aby zapobiec przywieraniu oocytów do dna naczynia.</li>
		<li>Po tarle natychmiast zbierz plemniki i oocyty za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl.
		<ol>
			<li>Trzymaj plemniki i oocyty oddzielnie od dorosłego amfioksusa, ponieważ kontakt z nimi jest szkodliwy dla zdrowia gamet (dane nie pokazane).</li>
			<li>Ponadto unikaj zaskakiwania dorosłych, co prowadzi do ruchów, które rozpraszają, a tym samym rozcieńczają zarówno plemniki, jak i oocyty. Aby plemniki były aktywne tak długo, jak to możliwe i zoptymalizować tempo zapłodnienia, należy zebrać plemniki tak skoncentrowane, jak to możliwe.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Trzymaj nasienie na lodzie w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Przenieść oocyty w przefiltrowanym ASW do wstępnie wypłukanych szalek Petriego o średnicy 35 mm.</li>
		<li>Przenieść 100-500 oocytów za pomocą wcześniej pobranej pipety Pasteura o średnicy 300-400 μm na inną szalkę Petriego o średnicy 35 mm w celu wykonania iniekcji.</li>
		<li>Pozostałą część lęgu należy zapłodnić jako kontrolę jakości plemników i oocytów lub do innych eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniekcja do oocytów
	<ol>
		<li>Zamontować igłę iniekcyjną na mikromanipulatorze pod kątem 50° w stosunku do płaszczyzny poziomej. 
		UWAGA: Kąty mniejsze niż 50° będą popychać oocyty na szalce, podczas gdy kąty większe niż 50° nie pozwolą na odpowiednie monitorowanie położenia igły względem oocytu.</li>
		<li>Pod fluorescencyjną lunetą sekcyjną z okularami 25X przenieś 30 oocytów za pomocą pipety Pasteura o średnicy 300-400 μm na naczyniu pokrytym polilizyną zawierającym przefiltrowany ASW.</li>
		<li>Umieść oocyty wzdłuż linii, aby wykonać wstrzyknięcia w uporządkowany sposób i odróżnić oocyty wstrzyknięte od niewstrzykniętych. Wstrzyknąć małą liczbę (30 oocytów), aby zminimalizować czas ekspozycji oocytów na polilizynę, która ma tendencję do deformacji rozwijających się zarodków (dane nie pokazane).</li>
		<li>Użyj oświetlenia ciemnego pola, aby oocyty były jak najbardziej przezroczyste.</li>
		<li>Za pomocą pokrętła ruchu zgrubnego mikromanipulatora zbliżyć igłę do komórki jajowej.</li>
		<li>Za pomocą cienkich kleszczyków rozetnij igłę na poziomie, na którym końcówka zaczyna być zakrzywiona. Pulsując wtryskiwaczem, sprawdź, czy czerwona mieszanka iniekcyjna rzeczywiście wypływa z igły.</li>
		<li>Przy 200-krotnym powiększeniu i za pomocą precyzyjnego pokrętła ruchu mikromanipulatora delikatnie przesunąć igłę do wstrzykiwania wewnątrz rdzenia oocytu. 
		UWAGA: W przypadku włożenia zbyt powierzchownie, wstrzyknięty roztwór nie pozostanie w oocycie. Jeśli zostanie włożony zbyt głęboko, oocyt zostanie zniszczony.</li>
		<li>Wstrzykiwać za pomocą 1-3 impulsów o czasie trwania 120 ms i ciśnieniu 1-10 psi. Jeśli igła jest wystarczająco cienka, wstrzykiwać ją z ciągłym przepływem pod stałym ciśnieniem. Upewnij się, że objętość wstrzyknięcia odpowiada 1/5 do 1/3 objętości pojedynczego oocytu.</li>
		<li>Po wstrzyknięciu należy szybko wyciągnąć igłę, aby uniknąć wycieku z komórki jajowej.</li>
		<li>Sprawdzić, czy wstrzyknięty roztwór pozostaje w oocycie i czy po kilku sekundach wstrzyknięty roztwór rozprzestrzenia się po oocycie.</li>
		<li>Przejdź do następnego oocytu w linii.</li>
		<li>Zachowaj kilka niewstrzykniętych zarodków z każdej serii jako kontrolę ujemną w celu oszacowania fluorescencji tła podczas skanowania w poszukiwaniu wstrzykniętych zarodków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapłodnienie, selekcja wstrzykniętych zarodków i hodowla zarodków
	<ol>
		<li>Zapłodnić oocyty zaraz po wstrzyknięciu serii. Ponieważ jakość oocytów pogarsza się z czasem, wstrzyknij i zapłodnij oocyty w ciągu 1 godziny po tarle12.</li>
		<li>W zależności od stężenia plemników dodaj 1-5 kropli plemników do oocytów i zamieszaj naczynie. 
		UWAGA: Otoczka zapłodnienia powinna stać się widoczna na zarodkach po około 1 minutach.</li>
		<li>Pozwól zarodkom oderwać się od naczynia pokrytego polilizyną, jednocześnie wstrzykując kolejną serię oocytów.</li>
		<li>Przenieść zarodki za pomocą pipety Pasteura o wielkości 600 μm do płytki Petriego pokrytej agarozą. Wyjąć zarodki z naczynia pokrytego polilizyną tak szybko, jak to możliwe, jeśli to w ogóle możliwe, przed etapem 2-komórkowym. 
		UWAGA: W przypadku długotrwałej ekspozycji na polilizynę, zarodki mają tendencję do przekształcania się w gęsto upakowane blastule, spłaszczone po stronie dotykającej dna naczynia.</li>
		<li>Na etapie od 2 do 4 komórek wybierz za pomocą fluorescencyjnej lunety preparacyjnej z filtrem DSR pomyślnie wstrzyknięte zarodki, tj. te o normalnej morfologii, które wykazują sygnał czerwonej fluorescencji pochodzący z czerwieni fenolowej.</li>
		<li>Przechowywać zarodki w kulturze w przefiltrowanym ASW na pokrytych agarozą płytkach Petriego w temperaturze 19 °C do pożądanego etapu obrazowania in vivo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Weber, T., Köster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+tools+for+multicolor+imaging+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae.</a> Methods. 62, 279-291 (2013).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+message+clear%3A+visualizing+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+as+a+tool+of+mechanical+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microinjection as a tool of mechanical delivery.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).</li>
<li>Stepicheva, N. A., Song, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microinjections+of+sea+urchin+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High throughput microinjections of sea urchin zygotes.</a> J. Vis. Exp. , e50841(2014).</li>
<li>Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphioxus+and+tunicates+as+evolutionary+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Ecol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems.</a> Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).</li>
<li>Bertrand, S., Escriva, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology%3A+amphioxus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus.</a> Development. 138, 4819-4830 (2011).</li>
<li>Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+new+characters+after+whole+genome+duplications%3A+insights+from+amphioxus%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).</li>
<li>Lemaire, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology%3A+the+tunicates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates.</a> Development. 138, 2143-2152 (2011).</li>
<li>Yu, J. K., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cephalochordates+%28amphioxus+or+lancelets%29%3A+a+model+for+understanding+the+evolution+of+chordate+characters%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li>
<li>Fuentes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+spawning+behavior+and+development+of+the+European+amphioxus+%28Branchiostoma+lanceolatum%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool.+B%22%5BJournal%5D)">Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum).</a> J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).</li>
<li>Li, G., Shu, Z., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Year-round+reproduction+and+induced+spawning+of+Chinese+amphioxus%2C+Branchiostoma+belcheri%2C+in+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory.</a> PLoS One. 8, e75461(2013).</li>
<li>Theodosiou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphioxus+spawning+behavior+in+an+artificial+seawater+facility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool.+B%22%5BJournal%5D)">Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility.</a> J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).</li>
<li>Holland, L. Z., Yu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cephalochordate+%28amphioxus%29+embryos%3A+procurement%2C+culture%2C+and+basic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods.</a> Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).</li>
<li>Holland, L. Z., Onai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+gene+function+in+amphioxus+embryos+by+microinjection+of+mRNAs+and+morpholino+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides.</a> Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).</li>
<li>Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+microinjection+method+for+unfertilized+eggs+of+Asian+amphioxus+Branchiostoma+belcheri%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri.</a> Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).</li>
<li>Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-targeted+green+fluorescent+protein+reliably+and+uniquely+marks+cells+through+apoptotic+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death.</a> Cytometry. 43, 273-278 (2001).</li>
<li>Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+nuclei+in+Aspergillus+oryzae+with+EGFP+and+analysis+of+the+number+of+nuclei+in+each+conidium+by+FACS%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Biotechnol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).</li>
<li>Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+embryos+regulate+the+nuclear+localization+of+XMyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD.</a> Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).</li>
<li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li>
<li>Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+preferred+nucleotide+sequences+around+the+translation+initiation+codon+in+eukaryote+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).</li>
<li>Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon+usage+tabulated+from+international+DNA+sequence+databases%3A+status+for+the+year+2000%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000.</a> Nucleic Acids Res. 28, 292(2000).</li>
<li>Deheyn, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+green+fluorescent+protein+%28GFP%29+in+amphioxus%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus.</a> Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).</li>
<li>Schubert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signaling+acts+via+Hox1+to+establish+the+posterior+limit+of+the+pharynx+in+the+chordate+amphioxus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus.</a> Development. 132, 61-73 (2005).</li>
<li>Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retinoic+acid-Hox+hierarchy+controls+both+anterior%2Fposterior+patterning+and+neuronal+specification+in+the+developing+central+nervous+system+of+the+cephalochordate+amphioxus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus.</a> Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).</li>
<li>Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+expression+of+FoxD+reporter+constructs+in+amphioxus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos.</a> Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).</li>
<li>Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis-regulation+of+the+amphioxus+engrailed+gene%3A+insights+into+evolution+of+a+muscle-specific+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer.</a> Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).</li>
<li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amphioxus+genome+illuminates+vertebrate+origins+and+cephalochordate+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology.</a> Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).</li>
<li>Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+the+vertebrate+Tol2+transposable+element+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster.</a> Gene. 425, 64-68 (2008).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+at+specific+genomic+loci+of+amphioxus+Branchiostoma+belcheri+using+TALEN+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method.</a> J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).</li>
<li>Zhang, Q. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+culture+of+two+lancelets+and+production+of+the+second+filial+generations+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool.+B%22%5BJournal%5D)">Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory.</a> J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).</li>
<li>Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+aquaculture+of+the+Japanese+lancelet+Branchiostoma+japonicum+for+7+years%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool.+B%22%5BJournal%5D)">Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years.</a> J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).</li>
<li>Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+generating+year-round+access+to+amphioxus+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory.</a> PLoS One. 8, e71599(1371).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule po raz pierwszy przedstawiamy szczegółowy i powtarzalny protokół wstrzykiwania oocytów B. lanceolatum , które po B. floridae13,14 i B. belcheri15 są tym samym trzecim gatunkiem amfioksusa, dla którego opisano taką technikę. Co istotne, opisany tu protokół zawiera również opis układów wektorowych przystosowanych do wytwarzania białek fluorescencyjnych u B. lanceolatum z wstrzykniętego mRNA wytworzonego in vitro (opisanego poniżej). Razem te ...

Podczas rozwoju, pojedyncza komórka daje początek całemu organizmowi w bardzo złożonym procesie, który obejmuje zarówno podziały, jak i ruchy komórek. Aby lepiej zrozumieć biologiczne zasady leżące u podstaw dynamiki zachowania komórek, biolodzy rozwojowi zaczęli stosować techniki obrazowania in vivo oparte na fluorescencji. Specyficzne przedziały komórek, takie jak błony komórkowe, mogą być albo znakowane przez leczenie barwnikami fluorescencyjnymi, co jest podejściem utrudnionym przez brak swoistości i penetracji tkanki1, albo przez specyficzne wprowadzenie do zarodka egzogennych mRNA kodujących białka fluorescencyjne2. Do efektywnego dostarczania związków egzogennych, takich jak mRNA, można stosować różne techniki. Należą do nich między innymi mikroiniekcja, elektroporacja, bombardowanie mikrocząstkami, lipofekcja i transdukcja3,4. Chociaż wszystkie te podejścia mogą być wykorzystane do wprowadzenia związków egzogennych do rozwijającego się zarodka, tylko mikroiniekcja pozwala na zastosowanie wcześniej zdefiniowanych i precyzyjnych ilości do każdej komórki3. Techniki mikroiniekcji opisano dla wszystkich głównych modelowych systemów rozwojowych4 (np. muszki owocowe, nicienie, danio pręgowany, żaby, myszy), a także dla niektórych modelialternatywnych4, w tym modeli stosowanych w badaniach porównawczych mających na celu zrozumienie ewolucji mechanizmów rozwojowych (np. ukwiałów, pierścienic, jeżowców, osłonic puchatych, głowostrunowca amfioksusa).
Cephalochordates, które razem z osłonicami i kręgowcami tworzą gromadę strunowców, są szczególnie dobrze przystosowanymi modelami do badania ewolucji strunowców i różnicowania kręgowców od przodka bezkręgowców5-8. Linia głowostrunowców rozdzieliła się bardzo wcześnie podczas ewolucji strunowców; i współcześnie żyjące głowostrunowce, które dzielą się na trzy rodzaje (Branchiostoma, Asymmetron i Epigonichthys), przypominają kręgowce zarówno pod względem ogólnej anatomii, jak i architektury genomu5-8. Spośród około 30 gatunków głowostrunowców, które zostały opisane do tej pory, pięć jest dostępnych do badań embriologicznych i rozwojowych6,9: Asymmetron lucayanum (lancet Bahama), Branchiostoma floridae (amfioxus z Florydy), Branchiostoma lanceolatum (amfioks europejski), Branchiostoma belcheri (amfioksus chiński) i Branchiostoma japonicum (amfioksus japoński). Dojrzałe dorosłe osobniki trzech z tych gatunków (B. lanceolatum, B. belcheri i B. japonicum) mogą zostać nakłonione do tarła na żądanie w sezonie lęgowym10,11. Ponadto, przynajmniej w przypadku B. lanceolatum, efektywne tarło można również wywołać w sztucznej wodzie morskiej12 , dzięki czemu ten konkretny gatunek głowostrunowca jest dostępny dla laboratoriów, które nie mają dostępu do naturalnej wody morskiej. Połączenie u B. lanceolatum wygodnego i niezawodnego dostępu do zarodków z efektywną metodą dostarczania, taką jak mikroiniekcja, jak dotąd jedyna technika dostarczania opracowana u amfioksusa (zarówno u B. floridae, jak i B. belcheri)13-15, umożliwi opracowanie nowego zestawu technik manipulacyjnych, w tym podejść opartych na śledzeniu linii i dynamicznym zachowaniu komórek.
W ten sposób opracowano protokół efektywnej mikroiniekcji mRNA w celu ekspresji białek fluorescencyjnych w zarodku B. lanceolatum. Ponadto, aby zapewnić podstawowy zestaw narzędzi do obrazowania na żywo zarodków B. lanceolatum, opracowano systemy wektorowe, które umożliwiają ekspresję białek fluorescencyjnych związanych z błoną i jądrem. W celu celowania błonowego wzmocnione białko zielonej fluorescencji (eGFP) zostało połączone z ludzkim pudełkiem HRAS CAAX, a lokalizację jądrową mCherry i eGFP uzyskano przez fuzję z eksonem histonu 2B (H2B) danio pręgowanego (Figura 1, plik uzupełniający 1). Ponadto, w celu optymalizacji translacji białek, sekwencje Kozaka i kodony konstruktów zostały zmodyfikowane i przystosowane do użycia u B. lanceolatum. Podsumowując, przedstawiona tu metoda iniekcji i wektory ekspresji posłużą jako podstawa do opracowania nowych podejść eksperymentalnych dla głowostrunowców, w szczególności analiz z wykorzystaniem najnowszych technik obrazowania in vivo opartych na fluorescencji.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>35 mm Szalki Petriego</td><td>Falcon</td><td>353001</td> Jednostka filtrująca <td>poddana kulturze</td></tr><tr><td>(Stericup 1 L)</td><td>Fisher</td><td>W21719</td><td>0.22 &#956; m</td></tr><tr><td>Rurki Spin-X</td><td>Costar</td><td>8160</td><td>0.22 &#956; m</td></tr><tr><td>Słoik do przechowywania igieł do kapilar o średnicy 1,2 mm</td><td>WPI</td><td>E212</td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td></td><td></td> Pasteura <td>o długości 230 mm</td></tr><tr><td>Rurka aspiracyjna</td><td>Dutscher</td><td>75056</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary do igieł iniekcyjnych</td><td>Sutter</td><td>BF 120-94-10</td><td>Szkło borokrzemianowe z żarnikiem, OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, długość 10 mm</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Odczynniki</mocny></td></tr><tr><td>Niskotopliwa agaroza</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma</td><td>114537</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-lizyny</td><td>Sigma</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>H2O, bez DNaz/RNaz</td><td>Gibco</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 Zestaw</td> <td>do transkrypcjiZestaw</td><td>do syntezy mRNA</td>Ambion <td>AM1340</td></tr><tr><td>Phenol pH 8</td><td>Sigma</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>24:1 chloroform: alkohol izoamyliowy</td><td>Sigma</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>5:1 fenol pH 4,7: chloroform</td><td>Sigma</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Sole kryształów rafy (200 kg)</td><td>Europrix&nbsp;</td><td></td><td>Sole handlowe</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Fluorescencyjna luneta prosektoryjna z 200-krotnym powiększeniem</td><td>Lornetka Leica</td><td>MZ16F</td><td>25X, filtry DSR i GFP2</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Marzhauzer</td><td>M-33</td><td></td></tr><tr><td>Wtryskiwacz</td><td>Picospritzer</td><td>model II lub III</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz igieł</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>Ściągacz igieł z żarnikiem grzewczym</td></tr><tr><td>Szczypce drobnoziarniste</td><td>Fine Science Tools GmbH</td><td>11252-30</td><td>Dumont #5</td></tr></tbody></table>

ekspresja białek fluorescencyjnych w branchiostoma lanceolatum przez wstrzyknięcie mrna do niezapłodnionych oocytów

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Przedstawiamy tutaj solidny i skuteczny protokół ekspresji białek fluorescencyjnych po wstrzyknięciu mRNA do niezapłodnionych oocytów głowostrunowca amfioksusa, Branchiostoma lanceolatum. Używamy konstruktów dla błonowych i jądrowych ukierunkowanych mCherry i eGFP, które zostały zmodyfikowane w celu dostosowania do użycia kodonów amfioksusa i sekwencji konsensusu Kozaka. Opisujemy rodzaj igieł do wstrzykiwań, które należy zastosować, protokół unieruchomienia niezapłodnionych oocytów oraz ogólną konfigurację iniekcji. Technika ta pozwala na uzyskanie znakowanych fluorescencyjnie zarodków, w których dynamika zachowań komórek we wczesnym okresie rozwoju może być analizowana przy użyciu najnowszych strategii obrazowania in vivo. Opracowanie techniki mikroiniekcji u tego gatunku amfioksus pozwoli na obrazowanie na żywo analiz zachowań komórek w zarodku, a także manipulacje specyficzne dla genów, w tym nadekspresję genów i knockdown. Podsumowując, protokół ten jeszcze bardziej skonsoliduje podstawową strunowcę amphioxus jako model zwierzęcy do rozwiązywania problemów związanych z mechanizmami rozwoju embrionalnego i, co ważniejsze, z jego ewolucją.

Opisany powyżej protokół stanowi podstawę do mikroiniekcji oocytów B. lanceolatum, a tym samym do wprowadzania do rozwijających się embrionów B. lanceolatum mRNA kodującego białka fluorescencyjne do obrazowania in vivo. Chociaż technika ta jest niewątpliwie solidna i niezawodna, odsetek udanych iniekcji przy zastosowaniu tego protokołu pozostaje zmienny (Tabela 1). Bardzo prawdopodobnym wyjaśnieniem tego intrygującego faktu jest ogromna zmienność partii oocytów: różne partie ja...

Informujemy tutaj o solidnej i efektywnej ekspresji białek fluorescencyjnych po wstrzyknięciu mRNA do niezapłodnionych oocytów Branchiostoma lanceolatum. Opracowanie techniki mikroiniekcji w tym podstawowym strunacie utoruje drogę dla dalekosiężnych innowacji technicznych w tym powstającym systemie modelowym, w tym obrazowania in vivo i manipulacji specyficznych dla genów.

Ekspresja białek fluorescencyjnych w Branchiostoma lanceolatum przez wstrzyknięcie mRNA do niezapłodnionych oocytów

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Ogólnym celem tej procedury jest wprowadzenie mRNA, kodującego białko fluorescencyjne do oocytów oskrzela stomijnego i latać, aby umożliwić obrazowanie fluorescencyjne in vivo rozwijających się zarodków. Osiąga się to poprzez pierwsze wywołanie tarła dojrzałych amfi ais, samców i samic przez szok temperaturowy trwający 24 godziny. Po szoku temperaturowym samice i samce umieszcza się w indywidualnych miseczkach tarłowych, co pozwala na pobranie odpowiednio oocytów i plemników.Gdy cyty zostaną ustawione w naczyniu pokrytym polilizyną, specjalnie przygotowana igła do mikroiniekcji jest używana do wstrzykiwania roztworu do wnętrza cytu. Ostatnim krokiem jest zapłodnienie cytu jedną do pięciu kropli plemnika. Ostatecznie dwufotonowy skaning laserowy.Mikroskopia służy do pokazania wszechobecnej ekspresji białek fluorescencyjnych wytwarzanych z mikrowstrzykniętego mRNA. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy mikroiniekcji są trudne do nauczenia, ponieważ wymagane są umiejętności techniczne, których nie można szczegółowo opisać i opisać w druku. Na początek przygotuj naczynia pokryte polilizyną, które służą do unieruchamiania cytów podczas wstrzyknięcia.Dla każdej 35-milimetrowej hodowli komórkowej szalki Petriego przykryj dno roztworem polilizyny i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie przenieś roztwór polilizyny do innego naczynia i ponownie inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Wyrzuć roztwór i pozwól szalkom Petriego wyschnąć do góry nogami w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.Po wyschnięciu panierowane naczynia należy przechowywać zawinięte w folię spożywczą w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia. Aby przygotować naczynia pokryte aros używane do hodowli wstrzykniętych zarodków, przygotuj sztuczną wodę morską i wodę z odwróconej osmozy. Następnie rozpuść aros do stężenia 1% w przefiltrowanym SW szybko przelej ciepły roztwór aros z jednej szalki Petriego na drugą, aby zapewnić bardzo cienką powłokę aros naczynia.Zawiń pokryte naczynia w folię Saran i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do tygodnia. Najpierw przygotuj mieszankę iniekcyjną w RNA i fenolu wodnym wolnym od DNA. Kolor czerwony barwi roztwór i pozwala na identyfikację pomyślnie wstrzykniętych zarodków.Następnie odwiruj mieszankę, aby osadzać kryształy i trzymaj na lodzie, aż będzie gotowa do użycia. Gdy będziesz gotowy, załaduj pipetę o pojemności 10 mikrolitrów z 0,5 mikrolitra mieszanki iniekcyjnej, omijając dno probówki, w której kryształy zostały granulowane. Wypełnić igłę do wstrzykiwań, odpipetowując kroplę o objętości 0,5 mikrolitra do wstrzykiwań.Wymieszać z dużym otworem igły. Przygotować dwie igły na wypadek, gdyby jedna z nich pękła podczas wstrzyknięcia. Igły należy przechowywać w słoiku z wodą na dnie, aby zapobiec parowaniu wstrzyknięcia.Wymieszaj i umieść w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pozostawić mieszaninę do wstrzykiwań powoli przemieszczającą się do końcówki igły do wstrzykiwań przez co najmniej jedną godzinę, aby zminimalizować tworzenie się pęcherzyków. Aby rozpocząć pobieranie oocytów i plemników, samce i samice są poddawane szokowi w SW przez 24 godziny, a następnie przenoszone do pojedynczych kubków na jedną do dwóch godzin przed tarłem.Po tarle natychmiast zbierz plemniki i cyty. Uważaj, aby nie przestraszyć dorosłych podczas zbierania. Dodatkowy ruch może rozproszyć się, a tym samym rozcieńczyć zarówno plemniki, jak i cyty po pobraniu.Trzymaj plemniki na lodzie w 1,5-mililitrowej probówce i przenieś cyty w przefiltrowanym SW do wstępnie wypłukanych szalek Petriego. Przenieś od 100 do 500 cytów na kolejną 35-milimetrową szalkę Petriego, aby wykonać zastrzyki. Na koniec zapłodnić pozostałą część lęgu cytów jako kontrolę jakości nasienia i cytów lub do innych eksperymentów.Aby rozpocząć procedurę wstrzykiwania, zainstaluj igłę na mikromanipulatorze pod kątem 50 stopni w stosunku do płaszczyzny poziomej pod fluorescencyjną lunetą sekcyjną z 25 lornetkami, przenieś 30 cytów do naczynia pokrytego polilizyną i przefiltruj SW, aby pomóc w śledzeniu wstrzykniętych cytów. Ułóż je wzdłuż linii w uporządkowany sposób. Zawsze wstrzykuj małe liczby, aby zminimalizować ekspozycję.Czas na polilizynę, która ma tendencję do deformacji rozwijających się zarodków. Użyj oświetlenia ciemnego pola, aby cyty były tak przezroczyste, jak to tylko możliwe. Następnie, za pomocą pokrętła ruchu zgrubnego, zbliżyć igłę do wstrzykiwania do cytu za pomocą cienkich kleszczyków. Ciąć.Otwórz igłę na poziomie, na którym końcówka zaczyna się zakrzywiać, pulsując wraz z wtryskiwaczem. Sprawdzić, czy czerwona mieszanina do wstrzykiwań wypływa z igły przy 200-krotnym powiększeniu. Za pomocą pokrętła o precyzyjnym ruchu delikatnie przesuń igłę do wstrzykiwań wewnątrz rdzenia cytu.W przypadku wprowadzenia dwóch na powierzchni, wstrzyknięty roztwór nie pozostanie w miejscu UO. Jeśli zostanie włożona zbyt głęboko, strona UO zostanie zniszczona. Wstrzykiwać od jednego do trzech impulsów.Jeśli igła jest wystarczająco cienka, wstrzykiwać ją z ciągłym przepływem pod stałym ciśnieniem. Upewnij się, że objętość wstrzykniętego jajka odpowiada jednej piątej do jednej trzeciej objętości pojedynczego oocytu po wstrzyknięciu. Szybko wyciągnąć igłę, aby uniknąć wycieku.Sprawdzić, czy wstrzyknięty roztwór pozostaje w cytacie i czy po kilku sekundach wstrzyknięty roztwór rozprzestrzenia się po całym cytacie. Przejdź do następnego cytu w linii. Zachowaj kilka niewstrzykniętych zarodków z każdej serii jako kontrolę ujemną, aby oszacować fluorescencję tła podczas skanowania w poszukiwaniu wstrzykniętych zarodków, zapładniaj oocyty, gdy tylko seria zostanie wstrzyknięta.Ponieważ jakość oocytów pogarsza się z czasem, wstrzyknij i zapłodnij cyty w ciągu jednej godziny. Po tarle. W zależności od stężenia plemników dodaj od jednej do pięciu kropli nasienia do UY i zakręć naczynie.Otoczka zapłodnienia powinna stać się widoczna na zarodkach. Po około jednej minucie pozwól zarodkom oderwać się od naczynia pokrytego polilizyną, jednocześnie wstrzykując kolejną serię oocytów. Po odłączeniu przenieś zarodki na szalkę Petriego pokrytą arosem.Jeśli to możliwe, wyjąć zarodki z naczynia pokrytego polilizyną. Przed etapem dwukomórkowym. Na etapie od dwóch do czterech komórek wybierz pomyślnie wstrzyknięte zarodki za pomocą fluorescencyjnej lunety preparacyjnej.W przypadku filtra DSR udane wstrzyknięcie jest wskazywane przez normalną morfologię, która wykazuje sygnał czerwonej fluorescencji pochodzący z czerwieni fenolowej. Trzymaj zarodki i przefiltruj SW na szalkach Petriego pokrytych agros w temperaturze 19 stopni Celsjusza do pożądanego etapu obrazowania in vivo, te reprezentatywne obrazy zarodków bronchos stomia lancia lato zostały wykonane po mikroiniekcji mRNA i powlekaniu białek fluorescencyjnych. Ten pierwszy obraz pokazuje, że ekspresję jądrowego EGFP uzyskaną przez mikrowstrzyknięcie konstruktu H 2 B-E-G-F-P można wykryć w zarodkach już w stadium 16 komórek.Ten zarodek w stadium żołądkowym jest przykładem wszechobecnej koekspresji EGFP ukierunkowanej na jądro m wiśni i błonę. Sygnał jądrowy powstaje w wyniku mikroiniekcji konstruktu wiśniowego H two BM, podczas gdy fluorescencja w błonach komórkowych jest uzyskiwana przez mikroiniekcję konstruktu pudełkowego EEG FP CAAX. Przekrój optyczny tego zarodka w stadium żołądkowym pokazuje, w jaki sposób jądra i kontury komórek są odpowiednio podkreślane przez ukierunkowaną na jądro mCherry i EGFP związaną z błoną.Wizualna demonstracja tej techniki mikroiniekcji wesprze naukowców w ewolucyjnym rozwoju społeczności biologicznej w ulepszaniu istniejących i opracowywaniu nowatorskich podejść do indywidualnego obrazowania, manipulacji specyficznymi genami i stabilnego in afi, ważnego modelu dla zrozumienia ewolucji zwierząt.

expression-fluorescent-proteins-branchiostoma-lanceolatum-mrna

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Mikroiniekcja jest uznaną i skuteczną metodą wprowadzania obcych substancji do zapłodnionych embrionów danio pręgowanego. W niniejszej pracy prezentujemy niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u danio pręgowanego.

Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

Obumierające komórki są usuwane z tkanek nabłonkowych poprzez skoordynowany skurcz komórek sąsiednich, bez naruszania funkcji barierowej. Przejrzystość optyczna rozwijających się rybek danio przymrużonych stanowi doskonały system do wizualizacji procesu ekstruzji w żywych nabłonkach. W niniejszej pracy opisujemy metody indukcji i obrazowania ekstruzji w naskórku larw rybek danio przymrużonych z rozdzielczością komórkową.

Obrazowanie na żywo ekstruzji komórek z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego

Zewnętrzna warstwa ektodermy embrionalnej Xenopus stała się atrakcyjnym modelem do badań polaryzacji komórkowej. Opisano analizę, w której ocenia się subkomórkową dystrybucję białek fluorescencyjnych w komórkach ektodermy. Niniejszy protokół pomoże w odpowiedzi na pytania dotyczące przestrzennej kontroli sygnalizacji.

Polaryzowana translokacja białek fluorescencyjnych w ektodermie Xenopus w odpowiedzi na sygnalizację Wnt

Ekspresja ektopowa to jedna z technik wyjaśniających rolę mikroRNA w rozwoju mózgu. Jednak celowanie w określone obszary za pomocą elektroporacji in ovo jest trudne. Tutaj pokazujemy skuteczny sposób selektywnego elektroportowania brzusznych i grzbietowych obszarów śródmózgowia.

In ovo Ekspresja mikroRNA w brzusznym śródmózgowiu piskląt

Poziomy białka w komórkach i tkankach są często ściśle regulowane przez równowagę produkcji białka i jego usuwania. Korzystając z rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP), kinetykę klirensu białek można eksperymentalnie zmierzyć in vivo.

Pomiar stabilności białek w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP)

Zoptymalizowany protokół dojrzewania in vitro oocytów danio pręgowanego, używany do manipulacji produktami genów matki, jest prezentowany tutaj.

Funkcjonalna manipulacja matczynymi produktami genowymi z wykorzystaniem dojrzewania oocytów in vitro u danio pręgowanego

Obrazowanie morfogenezy zarodków owadów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszach świetlnych stało się najnowocześniejszym rozwiązaniem. Protokół ten nakreśla i porównuje trzy techniki montażu odpowiednie dla zarodków Tribolium castaneum, wprowadza dwie nowatorskie, wykonane na zamówienie linie transgeniczne, dobrze nadające się do obrazowania na żywo, omawia podstawowe kontrole jakości i wskazuje obecne ograniczenia eksperymentalne.

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum

Opisujemy elektroporację informacyjnego RNA (mRNA) jako metodę, która pozwala na szybką i efektywną ekspresję wielu białek w systemie modelowym zarodka przepiórki. Metoda ta może być stosowana do fluorescencyjnego znakowania komórek i rejestrowania ich ruchów in vivo za pomocą mikroskopii poklatkowej wkrótce po elektroporacji.

Szybka i wydajna ekspresja wielu białek w zarodkach ptaków za pomocą elektroporacji mRNA

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Ta praca opisuje protokół dla modułowego systemu transgenezy Tol2, metody klonowania opartej na bramie, służącej do tworzenia i wstrzykiwania transgenicznych konstruktów do embrionów zebranego.

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania białek znacznikiem białka fluorescencyjnego u larw danio pręgowanego, nowo opracowany i zmodyfikowany system in vivo, szczególnie przydatny do wizualizacji białek o niskiej obfitości u danio pręgowanego.

Znakowanie fluorescencyjne w celu wizualizacji białek o niskiej ekspresji u danio pręgowanego

Poznaj mikroiniekcję mRNA do oocytów Branchiostoma lanceolatum w celu ekspresji białek fluorescencyjnych. Ta metoda umożliwia obrazowanie in vivo rozwoju zarodków i otwiera nowe możliwości w biologii rozwojowej.

Ekspresja białek fluorescencyjnych w Branchiostoma lanceolatum przez wstrzyknięcie mRNA do niezapłodnionych oocytów

Przeglądaj więcej filmów