Name: Protokół szybkiej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ dla Xist RNA w połączeniu z immunofluorescencją modyfikacji histonów w inaktywacji chromosomu X (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Poznaj szybką hybrydyzację fluorescencyjną in situ dla RNA Xist z immunofluorescencją modyfikacji histonów w inaktywacji chromosomu X. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki RNA na poziomie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Hongjae Sunwoo za pomocne rady dotyczące projektowania oligonukleotydów w RNA FISH. Dziękujemy również Serenity Curtis za zredagowanie rękopisu. Nowy Jork był wspierany przez stypendium podoktorskie na badania za granicą Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JSPS). Praca ta była wspierana przez NIH (RO1-GM102184), March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337) oraz Fundusz Rozwoju i Grant Powierniczy w Cincinnati Children's Hospital Medical Center dla Y.O.

1. Przygotowanie sondy
<ol>
	<li>Otrzymać wiele unikalnych oligonukleotydów w Xist (oligonukleotydy o długości 20-30 nukleotydów, temperatura topnienia 63-65 ºC, tabela 1) z modyfikacją 5'-aminową i zawiesić w wodzie.</li>
	<li>Równomolowe ilości oligonukleotydów należy połączyć modyfikacją 5'-aminową (łącznie 4,5 μg) i oznaczyć barwnikiem fluorescencyjnym reagującym aminą zgodnie z instrukcją producenta.
	<ol>
		<li>Rozpuścić połączone oligonukleotydy w końcowych 5 μl wody wolnej od nukleaz i dodać 3 μl 1 M wodorowęglanu sodu do roztworu oligonukleotydów.</li>
		<li>Dodać 2 μl DMSO do fiolki z barwnikiem reagującym z aminami i krótko przetrząsnąć.</li>
		<li>Wymieszaj roztwór oligonukleotydu z reaktywnym barwnikiem w DMSO i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść znakowane fluorescencyjnie sondy oligonukleotydowe za pomocą kolumny G-25, a następnie wytrącić etanol.
	<ol>
		<li>Odwirować kolumnę G-25 o sile 750 x g przez 1 minutę, aby usunąć nadmiar bufora do przechowywania.</li>
		<li>Dodać 40 μl wody wolnej od nukleaz do mieszaniny do znakowania wytworzonej w kroku 1.2.3 i nałożyć na kolumnę G-25. Wirować przy 750 x g przez 2 min.</li>
		<li>Dodać 50 μl wody wolnej od nukleaz, 10 μl 3 M octanu sodu (pH 5.2) i 250 μl etanolu do oczyszczonej sondy z kroku 1.3.2. Przechowywać w temperaturze -80 °C przez 30 minut i odwirowywać w temperaturze 21 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wytrącone oligonukleotydy przemyć raz 1 ml 70% etanolu.</li>
		<li>Zawiesić ponownie w 50 μl wody wolnej od nukleaz lub TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA) do końcowego stężenia około 10 μM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć znakowane fluorescencyjnie sondy oligonukleotydowe do końcowego stężenia 250 nM buforem hybrydyzacyjnym (10% formamidu; 2x SSC [300 mM NaCl; 30 mM cytrynian sodu]; 2 mg/ml BSA; 10% siarczan dekstranu). 
	UWAGA: Dzięki temu szybkiemu protokołowi FISH, sondy oligonukleotydowe w Xist zostały zaprojektowane i używane w wyższym stężeniu niż normalny protokół FISH przy użyciu sond oligonukleotydowych w celu skrócenia czasu inkubacji hybrydyzacji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie slajdów
UWAGA: Preparaty mogą być przygotowane dla immuno-FISH przy użyciu komórek różnicujących embrionalny zarodek myszy (ES) lub ciało zarodkowe (EB)20,21, hodując je bezpośrednio na szkiełku traktowanym polilizyną lub używając cytospiny z zawiesiną komórkową. Tutaj pokazano przygotowanie preparatu za pomocą cytospiny.
<ol>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną w naczyniu 6-dołkowym. Umyć PBS (temperatura pokojowa) i dokładnie odssać.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml trypsyny do naczynia 6-dołkowego, inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 5 ml pożywki i rozproszyć komórki, delikatnie pipetując kilkakrotnie w górę i w dół.</li>
	<li>Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml, wirować przez 5 minut przy 200 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić pożywkę i delikatnie zawiesić komórki w 2 ml PBS.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i rozcieńcz zawiesinę komórek w stężeniu 4 x 105 komórek/ml za pomocą PBS.</li>
	<li>Zmontuj szkiełko, kartę filtracyjną i komorę z klipsem i umieść je w odpowiednich szczelinach w wirniku cytospiny. Dodać 250 μl każdej próbki przygotowanej w kroku 2.6 do każdej komory połączonych jednostek w cytospinie. Wirować z prędkością 1 500 obr./min przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Napełnij 3 słoiki z kopiną na lodzie odpowiednio 40 ml lodowatego PBS, buforu CSK (10 mM PIPES, pH 6,8; 100 mM NaCl; 300 mM sacharozy; 3 mM MgCl2) i buforu CSKT (bufor CSK z 0,5% Triton X-100).</li>
	<li>Po zakończeniu cytospinu szybko przenieś szkiełko do lodowatego PBS i inkubuj przez 5 minut.</li>
	<li>Przenieść szkiełko do lodowatego bufora CSK i inkubować przez 1 minutę.</li>
	<li>Przenieść szkiełko do lodowatego bufora CSKT i inkubować przez 5 minut.</li>
	<li>Przenieść szkiełko z powrotem do lodowatego bufora CSK i inkubować przez 1 minutę.</li>
	<li>Przenieść szkiełko do 4% paraformaldehydu w PBS i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Immunofluorescencja
<ol>
	<li>Umieść szkiełka w słoiku z PBST (1x PBS z 0,1% Tween-20) na kilka sekund.</li>
	<li>Umieść szkiełka pod kątem, aby pozostały bufor spłynął w dół szkiełka. Ostrożnie zetrzyj nadmiar płynu ze szkiełka i umieść go w pustym pudełku z końcówką pipety z wodą. Na szkiełko nałóż 40 μl roztworu blokującego (1x PBS, 1% BSA, 0,1% Tween-20), delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć szkiełko nakrywkowe, usunąć roztwór blokujący i dodać 40 μl pierwszorzędowego przeciwciała histonowego H3K27me3 rozcieńczonego do stężenia 1:500 w roztworze blokującym. Umieścić szkiełko nakrywkowe z powrotem na szkiełku podstawowym i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Inhibitor RNazy w roztworze blokującym może być pomocny w zachowaniu RNA w tym protokole RNA FISH, gdy stosowane są przeciwciała poliklonalne.</li>
	<li>Umyj szkiełko 2 razy w słoikach coplin wypełnionych PBST, po 5 minut każdy, delikatnie wstrząsając podczas mycia.</li>
	<li>Umieść szkiełka pod kątem, aby pozostały bufor spłynął w dół szkiełka. Ostrożnie wytrzyj nadmiar płynu i umieść szkiełko z powrotem w pudełku na końcówki. Nałożyć 40 μl przeciwciała drugorzędowego (1:500) rozcieńczonego w roztworze blokującym, umieścić szkiełko nakrywkowe i inkubować przez 15 minut w ciemności. W kolejnych krokach trzymaj zjeżdżalnię w ciemności przez cały czas.</li>
	<li>Umyć 2 razy w słoikach coplin z PBST, jak w kroku 3.4.</li>
</ol>
4. RNA RYBA z sondami oligonukleotydowymi
<ol>
	<li>Opróżnione pudełko z końcówką pipety należy wstępnie ogrzać wodą na dnie, aby zapobiec wysychaniu szkiełek w temperaturze 37 °C dla RNA FISH w kroku 4.3.</li>
	<li>Umieść szkiełka pod kątem, aby pozostały bufor spłynął w dół szkiełka. Ostrożnie zetrzyj nadmiar płynu ze szkiełka z kroku 3.6 i umieść szkiełko w pudełku z końcówką pipety z wodą na dnie. Dodać 500 μl buforu do płukania ryb (10% formamidu w 2x SSC) na szkiełko i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć roztwór do płukania FISH, dodać 8 μl sond oligonukleotydowych na szkiełko, umieścić szkiełko nakrywkowe i przenieść szkiełko do wstępnie ogrzanego pudełka z końcówką pipety z wodą na dnie; inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny.</li>
	<li>Umieścić 3 podgrzane słoiki z kopinem w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C z buforem do płukania FISH, buforem do płukania FISH z DAPI i 2x SSC.</li>
	<li>Po 1-2 godzinnej inkubacji dla RNA FISH umieść szkiełko w wstępnie podgrzanym buforze do płukania FISH.</li>
	<li>Inkubować szkiełko przez kilka minut, aż szkiełko nakrywkowe spadnie z szkiełka.</li>
	<li>Umieścić szkiełko z powrotem w buforze do przemywania i kontynuować inkubację przez 5 minut.</li>
	<li>Przenieść szkiełko do innego słoika z podgrzanym buforem do płukania ryb o stężeniu 0,5 ng/ml DAPI i inkubować przez 5 minut.</li>
	<li>Przenieść szkiełko do innego słoika z kopinem z podgrzanym 2x SSC i inkubować przez 5 minut.</li>
	<li>Umieść szkiełka pod kątem, aby pozostały bufor spłynął w dół szkiełka. Ostrożnie wytrzyj nadmiar płynu i umieść szkiełko z powrotem w suchym pudełku z końcówkami. Dodaj 4 μl płynu zapobiegającego blaknięciu z DAPI na szkiełko podstawowe i umieść szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci i obserwuj pod mikroskopem. Szkiełko można przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przez kilka miesięcy.</li>
</ol>

<ol><li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosome+dosage+compensation%3A+how+mammals+keep+the+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).</li>
<li>Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gracefully+ageing+at+50%2C+X-chromosome+inactivation+becomes+a+paradigm+for+RNA+and+chromatin+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).</li>
<li>Gendrel, A. V., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifty+years+of+X-inactivation+research%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fifty years of X-inactivation research.</a> Development. 138, 5049-5055 (2011).</li>
<li>Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+by+RNAs%3A+X-inactivation+as+a+model+for+lncRNA+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function.</a> J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).</li>
<li>Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+Xist+in+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Requirement for Xist in X chromosome inactivation.</a> Nature. 379, 131-137 (1996).</li>
<li>Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xist-deficient+mice+are+defective+in+dosage+compensation+but+not+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis.</a> Genes Dev. 11, 156-166 (1997).</li>
<li>Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XIST+RNA+paints+the+inactive+X+chromosome+at+interphase%3A+evidence+for+a+novel+RNA+involved+in+nuclear%2Fchromosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure.</a> J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).</li>
<li>Sado, T., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+chromosome+silencing+by+the+long+non-coding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Xist.+Phil+Trans+R+Soc+B%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA.</a> Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).</li>
<li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322, 750-756 (2008).</li>
<li>Plath, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+histone+H3+lysine+27+methylation+in+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation.</a> Science. 300, 131-135 (2003).</li>
<li>Silva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+histone+h3+methylation+on+the+inactive+X+chromosome+requires+transient+recruitment+of+Eed-Enx1+polycomb+group+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes.</a> Dev Cell. 4, 481-495 (2003).</li>
<li>Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+synthesis+of+the+genes+for+ribosomal+RNA+during+amphibian+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).</li>
<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5, 877-879 (2008).</li>
<li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunofluorescence%2C+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization%2C+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes%2C+transcriptional+activity%2C+nuclear+organization%2C+and+X-chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).</li>
<li>Katayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+transcription+in+the+mammalian+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antisense transcription in the mammalian transcriptome.</a> Science. 309, 1564-1566 (2005).</li>
<li>Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-inactivation+intergenic+transcription+elements+that+regulate+the+probability+of+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice.</a> Mol Cell. 11, 731-743 (2003).</li>
<li>Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+inactivation+in+mouse+ES+cells%3A+histone+modifications+and+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH.</a> Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).</li>
<li>Khalil, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).</li>
<li>Martin, G. R., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+clonal+lines+of+teratocarcinoma+cells%3A+formation+of+embryoid+bodies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).</li>
<li>Lee, J. T., Lu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+of+Tsix+leads+to+nonrandom+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation.</a> Cell. 99, 47-57 (1999).</li>
<li>Zhang, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+RNAs+mark+sex+chromosomes+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells.</a> Genetics. 182, 685-698 (2009).</li>
<li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).</li>
<li>Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+histone+H3+modifications+as+revealed+by+a+panel+of+specific+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies.</a> Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).</li>
<li>Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersection+of+the+RNA+interference+and+X-inactivation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways.</a> Science. 320, 1336-1341 (2008).</li>
<li>Kohlmaier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromosomal+memory+triggered+by+Xist+regulates+histone+methylation+in+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation.</a> PLoS Biol. 2, 171(2004).</li>
<li>Wang, K. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Mol Cell. 43, 904-914 (2011).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

W tym artykule przedstawiliśmy szybki protokół immuno-FISH, który zajmuje mniej niż 5 godzin, aby zakończyć przygotowanie preparatu, Xist RNA FISH i immunofluorescencję dla H3K27me3. W porównaniu z ogólnym podejściem immuno-FISH do wykrywania RNA Xist, które zwykle wymaga nocnej inkubacji dla RNA FISH, protokół ten nie tylko znacznie skraca czas, ale także poprawia czułość immunologicznych FISH przy użyciu sond oligonukleotydowych.
Ponieważ Xist jest silnie transkrybowany podczas inaktywacji c...

Inaktywacja chromosomu X u ssaków (XCI) to strategia kompensacji nierównowagi w dawkowaniu genów sprzężonych z chromosomem X między XX i XY, gdzie jeden z dwóch chromosomów X u samic jest transkrypcyjnie inaktywowany1. Inaktywacja chromosomu X jest doskonałym systemem modelowym do długich badań nad niekodującym RNA (lncRNA). Inaktywacja chromosomu X jest regulowana przez wiele lncRNA i była intensywnie badana w ciągu ostatnich kilku dekad w celu odkrycia mechanizmów przesłuchów między lncRNA, transkrypcją, strukturą chromatyny i organizacją jądrową 2,3.
Centrum inaktywacji X (XIC) znajdujące się na chromosomie X jest złożonym genetycznym locus składającym się z wielu genów produkujących niekodujące RNA4. X-nieaktywny specyficzny transkrypt (Xist) lncRNA u ssaków eutherian jest jednym z takich lncRNA, który odgrywa kluczową rolę w inaktywacji chromosomu X5,6. Transkrypty Xist otaczają lokalizację przyszłego Xi, aby zainicjować inaktywację chromosomu X i pojawiają się jako chmura podczas wizualizacji za pomocą RNA FISH; formacja ta jest określana jako "Chmura Xist"7. Ponieważ RNA Xist oddziałuje z różnymi enzymami modyfikującymi chromatynę, podczasinaktywacji chromosomu X obserwuje się kolokalizację chmur Xist z różnymi modyfikacjami epigenetycznymi dla cichej chromatyny i transkrypcji represyjnej 8. Na przykład RNA Xist oddziałuje z kompleksem represyjnym polycomb 2 (PRC2), który jest odpowiedzialny za H3K27me3 i indukuje represyjny stan chromatyny9. Występowanie chmury Xist na Xi i jej kolokalizacja z intensywną modyfikacją H3K27me3 reprezentuje fakultatywny heterochromatynowy krajobraz Xi10,11.
Techniki cytogenetyczne, takie jak DNA/RNA FISH przeszły długą drogę od tradycyjnej metody wykorzystującej radioznakowane sondy12 do najnowszych i zaawansowanych technik o zwiększonej czułości i obrazowaniu fluorescencyjnym przy użyciu wielu sond oligonukleotydowych13,14. DNA / RNA FISH w połączeniu z immunofluorescencją jest rutynowo stosowany jako narzędzie cytologiczne do zrozumienia czasoprzestrzennej organizacji jądra, lokalizacji RNA, struktury i modyfikacji chromatyny. Najbardziej standardowe przygotowanie sondy dla RNA FISH polega na użyciu plazmidowych lub bakteryjnych klonów sztucznych chromosomów (BAC), a następnie ich znakowaniu za pomocą translacji nicków lub losowego primingu15. Jednak prawie 70% genów u myszy i 40% genów u ludzi wykazuje nakładanie się transkryptów sensownych i antysensownych16, co wymaga metody FISH specyficznej dla nici w celu odróżnienia transkryptów sensownych i antysensownych. Sondy RNA transkrybowane in vitro (rybosonda) są często używane do specyficznego dla nici RNA FISH17,18; jednak obejmuje to przygotowanie klonu plazmidu lub produktu PCR z promotorem T7, SP6 lub T3 i syntezę rybosond. Co więcej, rybosondy pochodzące z genomowego DNA lub cDNA często zawierają niespecyficzne regiony i powtarzające się elementy, co powoduje wysoki poziom szumu tła. Inną kwestią jest to, że rybosondy, które mają długość kilkuset nukleotydów i zawierają wiele fluoroforów, nie mogą skutecznie przeniknąć do jądra. Aby obejść ten problem, opracowano wiele krótszych sond oligonukleotydowych znakowanych pojedynczym fluoroforem na końcu, które mają dobrą czułość, jednolitą siłę sygnału oraz łatwość oczyszczania i obsługi14. Ponadto oligonukleotydy DNA są na ogół bardziej stabilne niż RNA. Zastosowaliśmy podobną strategię stosowania oligonukleotydów w Xist RNA FISH19 z immunofluorescencją, aby zrozumieć dynamikę epigenetyczną Xi indukowaną przez lncRNA Xist podczas procesu inaktywacji chromosomu X. Protokół ten opisuje tworzenie sond oligonukleotydowych i prawidłowe przygotowanie komórek, a także wykorzystanie immunofluorescencji i RNA FISH. Xist RNA FISH przy użyciu wielu oligonukleotydów jest opłacalnym podejściem w dłuższej perspektywie, jeśli Xist RNA FISH jest rutynowo wykonywany w laboratorium. Technika ta może być wykorzystana do identyfikacji lncRNA w komórkach, jednocześnie mapując jego kolokalizację z modyfikacjami lub czynnikami epigenetycznymi. Jedną z głównych zalet protokołu jest możliwość łatwej modyfikacji go w celu dopasowania do własnych zainteresowań badawczych.

<table><tbody><tr><td>oligonukleotydy z modyfikacją 5'-aminową</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Reactive Dye</td><td>Life Technologies</td><td>A32750</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny MicroSpin G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 2</td><td>Shandon</td><td>59900102</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, klasa biologii molekularnej (dla buforu hybrydyzacyjnego)</td> <td>Roche</td><td></td><td></td>10715859103</tr><tr><td>Przeciwciało histonowe H3K27me3</td><td>Aktywny motyw</td><td>61017</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, wysoce zaadsorbowany</td><td>krzyżowo Life Technologies</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik przeciwblaknięcia ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół szybkiej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ dla xist rna w połączeniu z immunofluorescencją modyfikacji histonów w inaktywacji chromosomu x

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Połączenie fluorescencyjnej hybrydyzacji RNA in situ (FISH) z immunofluorescencją (immuno-FISH) tworzy technikę, która może być wykorzystana na poziomie pojedynczej komórki do wykrywania przestrzennej dynamiki lokalizacji RNA z jednoczesnym wglądem w lokalizację białek, modyfikacje epigenetyczne i inne szczegóły, które mogą być podkreślone przez immunofluorescencję. Inaktywacja chromosomu X jest paradygmatem wyciszania genów za pośrednictwem długiego, niekodującego RNA (lncRNA). Akumulacja lncRNA lncRNA nieaktywnego swoistego transkryptu (Xist) (zwana chmurą Xist) na jednym z dwóch chromosomów X u samic ssaków jest krytycznym krokiem do zainicjowania inaktywacji chromosomu X. Xist RNA bezpośrednio lub pośrednio oddziałuje z różnymi enzymami modyfikującymi chromatynę i wprowadza odrębne krajobrazy epigenetyczne do nieaktywnego chromosomu X (Xi). Jedną ze znanych epigenetycznych cech charakterystycznych Xi jest modyfikacja histonu H3 trimetylolizyny 27 (H3K27me3). Tutaj opisujemy prosty i szybki protokół immuno-FISH do wykrywania Xist RNA za pomocą RNA FISH z wieloma sondami oligonukleotydowymi w połączeniu z immunofluorescencją H3K27me3 w celu zbadania lokalizacji Xist RNA i związanych z nim modyfikacji epigenetycznych. Zastosowanie sond oligonukleotydowych skutkuje krótszym czasem inkubacji i bardziej czułym wykrywaniem RNA Xist w porównaniu z sondami RNA transkrybowanymi in vitro (rybosondami). Protokół ten stanowi potężne narzędzie do zrozumienia dynamiki lncRNA i związanej z nią modyfikacji epigenetycznej, struktury chromatyny, organizacji jądrowej i regulacji transkrypcji.

Reprezentatywne obrazy szybkiej metody immuno-FISH przedstawiono na Rysunku 1A. W różnicujących się komórkach żeńskich wykryto ko-lokalizację chmury RNA Xist oraz sygnału H3K27me3 na chromosomie Xi. W 12. dniu różnicowania ponad 90% komórek EB posiadało chmurę Xist (Rysunek 1B). Krótkie sondy oligonukleotydowe efektywnie przeniknęły do jąder komórkowych, co pozwoliło na wizualizację niemal wszystkich sygnałów H3K27me3 ko-lokalizujących się z RNA Xist (Rysunek 1C; 97%, n ...

Opracowaliśmy łatwo dostosowany protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w połączeniu z immunofluorescencją. Pozwala to na szczegółowe badanie dynamiki RNA z jednoczesnym wglądem w strukturę chromatyny, organizację jądra i regulację transkrypcji na poziomie pojedynczej komórki.

Protokół szybkiej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ dla Xist RNA w połączeniu z immunofluorescencją modyfikacji histonów w inaktywacji chromosomu X

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie dynamiki długiego istnienia niekodującego RNA i związanej z nim modyfikacji epigenetycznej podczas inaktywacji chromosomu X przy użyciu szybkiej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w połączeniu z immunofluorescencją. Protokół ten wymaga przygotowania preparatów cytozynowych z różnicującymi się komórkami ciała zarodka, które są przenikane, a następnie utrwalane do barwienia. Następnie marker fluorescencyjny zlokalizowany przez przeciwciało przeciwko histonowi H-3 trimetylolizynie 27 gromadzi się na nieaktywnym chromosomie X.Ostatni etap wykorzystuje sondy oligonukleotydowe, które zawierają modyfikację pięciu pierwszych aminokwasów i są znakowane średnim reaktywnym fluoroforem AM do wykonania exist. Ryba RNA. Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna służy do pokazania lokalizacji istniejącej chmury RNA i modyfikacji histonów podczas różnicowania komórek EES.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że używamy wielu unikalnych oligonukleotydów, które są znakowane pojedynczym fluoro four. Zapewnia nam to detekcję transspecyficzną, która zmniejsza tło, a to z kolei zwiększa penetrację do jądra i zwiększa lub wzmacnia inten

quick-fluorescent-situ-hybridization-protocol-for-xist-rna-combined

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Hybrydyzacja in situ w preparatach całych jest jedną z najszerzej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości, służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz określania nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Włączyliśmy barwienie jąder jodkiem propidyny w celu uwydatnienia organizacji tkanki.

Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Opisana jest ilościowa metoda analizy czasu replikacji chromosomów. Metoda wykorzystuje inkorporację BrdU w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu oceny czasu replikacji chromosomów ssaków. Technika ta pozwala na bezpośrednie porównanie przegrupowanych i nieprzegrupowanych chromosomów w tej samej komórce.

Czas replikacji chromosomów w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) pozwala na wykrywanie kwasów nukleinowych w ich naturalnym środowisku w komórkach. Opisujemy tutaj protokół połączonego, jednoczesnego wykrywania RNA i DNA za pomocą FISH, który może być wykorzystany do badania inaktywacji chromosomu X w embrionalnych komórkach macierzystych myszy.

Połączona fluorescencyjna hybrydyzacja in situ DNA-RNA (FISH) w celu zbadania inaktywacji chromosomu X w zróżnicowanych żeńskich embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Tutaj prezentujemy prostą metodę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji DNA in situ (DNA ISH) w celu wizualizacji powtarzających się sekwencji heterochromatycznych na chromosomach montowanych na szkiełkach. Metoda wymaga minimalnej ilości odczynników i jest uniwersalna w użyciu z krótkimi lub długimi sondami, różnymi tkankami oraz detekcją za pomocą sygnałów fluorescencyjnych lub nieopartych na fluorescencji.

Prosta metoda fluorescencji DNA Hybrydyzacja in situ do zgniecionych chromosomów

Lokalizacja ekspresji genów w określonych typach komórek może być trudna ze względu na brak specyficznych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy protokół jednoczesnego potrójnego wykrywania ekspresji genów poprzez połączenie hybrydyzacji in situ RNA z podwójną fluorescencją z barwieniem immunologicznym.

Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy

Opisany protokół hybrydyzacji RNA in situ pozwala na wykrycie RNA w całych zarodkach Drosophila lub wypreparowanych tkankach. Korzystając z 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych i wzmocnienia sygnału tyramidu, transkrypty mogą być wykrywane z wysoką rozdzielczością, czułością i przepustowością oraz przy stosunkowo niskich kosztach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Ten artykuł przedstawia dwie metody oparte na fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu określenia zawartości chromosomu X komórek jajnika w nieprzeszczepionej i przeszczepionej tkance kory jajnika od kobiet z aberracjami chromosomu X.

Badanie aberracji chromosomowych X w komórkach jajnika za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano dwukolorową hybrydyzację in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization), metodę umożliwiającą wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji dwóch różnych genów w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Davida Wilkinsona, Domingosa Henrique, Phila Inghama i Davida Ish-Horowicza.

Podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

Poznaj szybką hybrydyzację fluorescencyjną in situ dla RNA Xist z immunofluorescencją modyfikacji histonów w inaktywacji chromosomu X. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki RNA na poziomie pojedynczych komórek.

Protokół szybkiej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ dla Xist RNA w połączeniu z immunofluorescencją modyfikacji histonów w inaktywacji chromosomu X (Wideo) | JoVE Journal

Protokół szybkiej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ dla Xist RNA w połączeniu z immunofluorescencją modyfikacji histonów w inaktywacji chromosomu X

Przeglądaj więcej filmów