Protokół szybkiej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ dla Xist RNA w połączeniu z immunofluorescencją modyfikacji histonów w inaktywacji chromosomu X

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie dynamiki długiego istnienia niekodującego RNA i związanej z nim modyfikacji epigenetycznej podczas inaktywacji chromosomu X przy użyciu szybkiej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w połączeniu z immunofluorescencją. Protokół ten wymaga przygotowania preparatów cytozynowych z różnicującymi się komórkami ciała zarodka, które są przenikane, a następnie utrwalane do barwienia. Następnie marker fluorescencyjny zlokalizowany przez przeciwciało przeciwko histonowi H-3 trimetylolizynie 27 gromadzi się na nieaktywnym chromosomie X.

Ostatni etap wykorzystuje sondy oligonukleotydowe, które zawierają modyfikację pięciu pierwszych aminokwasów i są znakowane średnim reaktywnym fluoroforem AM do wykonania exist. Ryba RNA. Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna służy do pokazania lokalizacji istniejącej chmury RNA i modyfikacji histonów podczas różnicowania komórek EES.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że używamy wielu unikalnych oligonukleotydów, które są znakowane pojedynczym fluoro four. Zapewnia nam to detekcję transspecyficzną, która zmniejsza tło, a to z kolei zwiększa penetrację do jądra i zwiększa lub wzmacnia intensywność sygnałów. Ponadto, gdy zwiększymy stężenie sond, możemy znacznie skrócić czas potrzebny na ukończenie tego eksperymentu z rybami immunologicznymi.

Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w lokalizację istniejącego RZS na nieaktywnym chromosomie ex i związaną z nim modyfikację chromo. Może być również stosowany w innych systemach biologicznych do wykrywania RZS i związanych z tym modyfikacji epigenetycznych, lokalizacji jądrowej i regulacji międzypokoleniowej. Aby przygotować sondy, najpierw uzyskaj wiele oligonukleotydów o długości od 20 do 30 nukleotydów o temperaturze topnienia od 63 do 65 stopni Celsjusza, które zawierają unikalną sekwencję antysensowną do istniejącej modyfikacji RNA i pięciu pierwszych aminokwasów.

Zawieś te oligonukleotydy w puli czystej wody, równomolowe ilości różnych oligonukleotydów, co daje w sumie 4,5 mikrograma DNA. Następnie, postępując zgodnie z instrukcjami producenta, oznacz oligonukleotydy średnioreaktywnym barwnikiem fluorescencyjnym zgodnie z etykietowaniem oligonukleukleotydów. Przepuść je przez kolumnę G 25.

Następnie za pomocą etanolu i octanu sodu wytrącić oligonukleotydów. Wymaga to półgodzinnego okresu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, a następnie wirowania w temperaturze 21 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie po umyciu umyj granulat raz 70% etanolem.

Resus zawiesić oligonukleotydów w 50 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz lub tris EDTA do końcowego stężenia 10 mikromolowego DNA. To sprawia, że roztwór podstawowy sondy do użycia sondy ponownie koncentruje go do 250 nanomolowców w buforze hybrydyzacyjnym. Na początek należy mieć komórki różnicujące ES lub EB rosnące w sześciu dołkach, zassać pożywkę hodowlaną z dołków, a następnie umyć komórki temperaturą pokojową.

PBS dokładnie zasysa PBS. Następnie dodaj 0,5 mililitra roztworu trypsyny do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez pięć do 10 minut. Zatrzymaj reakcję tripsin, dodając pięć mililitrów pożywki do każdego dołka i delikatnie je pipetując.

Następnie przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki. Teraz wiruj komórki przez pięć minut w temperaturze 200 G w temperaturze pokojowej, usuń cały supernatant i ponownie zawieś paletę komórek w dwóch mililitrach PBS. Następnie policz komórki i rozcieńcz zawiesinę do 400 000 komórek na mililitr w PBS.

Teraz zmontuj każdy slajd z kartą filtrującą, komorą i klipsem. Zrób tyle, ile potrzeba i umieść je w wirniku wirowania cyto. Dodaj 250 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdego szkiełka i obracaj szkiełka z prędkością 1500 obr./min przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie trwała ondulacja i napraw. Po pierwsze, szybko przenieś szkiełka do lodowatego PBS na pięć minut jako etap płukania. Po drugie, przenieś szkiełka do lodowatego bufora CSK na jedną minutę, aby spęczniały trzecia, przenieś szkiełka do bufora CSKT na pięć minut, aby przesiąknąć komórki.

Po czwarte, umyj komórki w lodowatym buforze CSK przez minutę. I na koniec utrwal je w temperaturze pokojowej 4% aldehydu paraform w PBS przez 10 minut. Najpierw wyjmij szkiełka z roztworu PFA.

Następnie przenieś je do słoika coplan z PBST na kilka sekund, a następnie ustaw je pod kątem, aby odsączyły. Następnie załaduj puste pudełko na końcówki do pipet wodą poniżej wkładki uchwytu końcówki. Następnie zetrzyj tylne strony szkiełek i przenieś je do tego pudełka.

Teraz nałóż na każde szkiełko 40 mikrolitrów roztworu blokującego i delikatnie przykryj szkiełka nakrywkowe. Pozwól im inkubować w pudełku przez 10 minut na ławce. Następnie zdejmij szkiełka nakrywkowe i ustaw suwaki pod kątem.

Teraz dodaj 40 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwotnego. Wymień szkiełka nakrywkowe i pozwól im inkubować na stole przez 30 minut po pół godziny. Usunąć niezwiązane przeciwciała, myjąc szkiełka dwukrotnie w PBST w słoikach coplan.

Delikatnie potrząsaj i pozwól każdemu praniu odejść na pięć minut. Następnie przywróć szkiełka do kąta i pozwól, aby PBST spłynął. Następnie wytrzyj nadmiar roztworu z tylnych stron szkiełka, a następnie włóż szkiełka z powrotem do pudełka.

Teraz nałóż 40 mikrolitrów od jednego do 500 wtórnych roztworów przeciwciał na każde szkiełko. Przykryj szkiełka szkiełkami nakrywkowymi i pozwól im inkubować na ławce przez 15 minut, chroniąc je przed światłem. Zjeżdżalnie powinny być zawsze chronione przed światłem.

Usuń przeciwciała za pomocą PBST jak poprzednio, a następnie ustaw szkiełka pod kątem, aby odsączyły. Podczas wykonywania immunofluorescencji podgrzej pudełko zawierające wodę do 37 stopni Celsjusza. Po wytarciu buforu myjącego z tylnych stron szkiełka, umieść je w pudełku z końcówkami do pipet z wodą o temperaturze i nałóż 500 mikrolitrów buforu do płukania ryb na każde szkiełko.

Pozwól im inkubować przez pięć minut. Po pięciu minutach odessać roztwór ze szkiełek obok każdego szkiełka w temperaturze pokojowej o objętości ośmiu mikrolitrów sondy roboczej i nałożyć szkiełko nakrywkowe. Teraz przenieś szkiełka do podgrzewanego pudełka na szkiełka i inkubuj je przez jedną do dwóch godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po inkubacji wykąpać szkiełka w buforze do płukania ryb w słoiku coplan w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy szkiełka nakrywkowe odpadną, co zwykle trwa kilka minut, usuń szkiełka nakrywkowe i pozwól szkiełkom inkubować przez pięć minut. Następnie przenieś szkiełka do słoika zawierającego bufor do płukania ryb z 0,5 nanograma dappy stainu na mililitr, również w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pozwól szkiełkom inkubować w tym roztworze przez pięć minut. Teraz umyj szkiełko w dwóch XSSC pięć minut w 37 stopniach Celsjusza. Na koniec ustaw suwaki na skośnym odpływie nadmiar dwóch XSSC.

Zetrzyj je i zamontuj z czterema mikrolitrami roztworu Antify zawierającego dpi. Do obserwacji lokalizacji istniejącego RNA i modyfikacji histonów wykorzystano szybkie immuno ryby. W różnicowaniu żeńskich komórek EB RNA wygląda jak zielona chmura pokrywająca całą długość jednego inaktywowanego chromosomu X W tych komórkach modyfikacja histonu H 3 trimetylolizyny 27 jest wizualizowana na czerwono, a jądra są przeciwbarwione przez DPI na niebiesko.

Różnicujące żeńskie komórki EB myszy przetwarzano w 12. dniu różnicowania. W tym czasie ponad 90% komórek wykazało istniejącą chmurę w komórkach Jądra krótkie sondy oligonukleotydowe były w stanie skutecznie przenikać, co spowodowało zabarwienie prawie wszystkich sygnałów histonu H trzy trimetylolizyny 27 Z istniejącymi chmurami RNA w 150 jądrach, stwierdzono, że 97% istniejących sygnałów RNA kolokalizuje się z tymi metylowanymi histonami. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż pięć godzin, aby ukończyć lekkie przygotowanie.

Immunoimmunofluorescencja dla niego wynosi trzy trymestry w 27 i występuje RZS. Jeśli wykonaliśmy prawidłowo, ten protokół immunologiczny dla ryb może być zastosowany do innych modyfikacji epigenetycznych RNA i interesujących białek. Aby zastosować ten protokół do innego systemu biologicznego, może być potrzebna pewna optymalizacja. Powodzenia w eksperymentach.