Przygotowanie dwuwarstw lipidowych na podłożu miki do obrazowania mikroskopii optycznej o wysokiej rozdzielczości

Przedstawiona tutaj procedura pokazuje prostą metodę otrzymywania lipidów na bazie MICA za pomocą warstw odpowiednich do obrazowania w wysokiej rozdzielczości, takich jak badania śledzenia pojedynczych cząsteczek tur. Powierzchnię MICA przygotowuje się poprzez rozszczepienie kanapki z pojedynczego arkusza MICA przyklejonego między szklanym szkiełkiem mikroskopowym a szkiełkiem nakrywkowym za pomocą kleju optycznego, który odsłania płaską i niezwykle cienką powierzchnię świeżej miki. Dzięki zamontowaniu małej plastikowej komory wykonanej z półtoramililitrowego kubka na fiolkę, objętość pęcherzyków lipidowych wymaganych do utworzenia dwuwarstwowej może wynosić zaledwie 30 mikrolitrów.

W pierwszym kroku weź wielowarstwowy arkusz MICA w takiej postaci, w jakiej pochodzi od dostawcy i pokrój go nożyczkami na mniejsze kawałki. Wszystkie ulotki na dwie lub trzy cieńsze ulotki za pomocą świeżego ostrza noża. Teraz wyczyść pokrowiec dokładnie śpi.

Polega to na umieszczeniu osłony o grubości 0,17 milimetra. Śpi w szklanym słoiku treningowym na każdej pokrywie. Śpij w osobnym gnieździe i sonikuj w detergencie przez 30 minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza.

Umyj pokrowiec. Może spać od 10 do 20 razy z mini wodą i wysuszyć suszarką strumieniem powietrza lub azotu. Weź szkiełko mikroskopowe i wyczyść je na miejscu.

Mała kropla około 15 mikrolitrów optycznego ahe o niskiej lepkości na wybuch mikroskopu i kulę ziemską wcześniej. Wytnij ulotkę hasif na pudełku z lampą UV przez kilka minut. Użyj taśmy klejącej, aby odkleić kilka warstw miki.

Pierwsze kilka warstw zostanie rozdrobnionych, więc rób to, aż zobaczysz, że warstwy przyczepiają się do szkockiej. Taśmy są jednolite i pełne. Zakryj taśmę.

Umieść kroplę kleju optycznego o wysokiej lepkości na powierzchni Micah. Upewnij się, że nie ma tam pęcherzyków powietrza. Delikatnie umieść czystą osłonę snu na kropli ofensywnej.

Użyj pęsety, aby delikatnie stuknąć w szkło, aby rozprowadzić ahe. Ponownie utwardź klej światłem UV przez kilka minut. Użyj noża, aby rozłupać kanapkę składającą się ze szkła.

Przesuń MICA i przykryj sen. W większości przypadków tylko bardzo cienka warstwa MICA pozostanie przyklejona do pokrowca na sen. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby sprawdzić powierzchnię MICA, wykonując małe zadrapanie końcówką igły lub pęsetą.

Możesz łatwo stwierdzić, czy powierzchnia to rzeczywiście mika, gdzie powierzchnia jest równomiernie porysowana, jak tutaj, czy na kleju optycznym, jak tutaj, gdzie powierzchnia jest świecąca. Weź filiżankę z półtoramililitrowej szklanej fiolki, usuń puszkę gazową i przyklej nakrętkę do powierzchni MICA za pomocą lakieru do paznokci. Pozostaw do wyschnięcia na kilka minut.

Teraz możesz przygotować dwuwarstwową naprawę lipidów lipid po warstwie przy użyciu standardowego protokołu tutaj. Kroplę pęcherzyków lipidowych o pojemności 30 mikrolitrów umieszcza się w komorze nakrętki fiolki i inkubuje przez 60 minut przed umyciem buforu. Po umyciu próbka jest gotowa do obrazowania.

W takim przypadku jest montowany w specjalnie wykonanym uchwycie na próbkę. Na tak przygotowanej powierzchni MICA można łatwo zaobserwować pojedyncze cząsteczki. Tutaj porównujemy A-D-O-P-C według warstwy podpartej na szkle i mice.

Należy pamiętać, że rodzaj ruchu różni się znacznie między tymi dwiema powierzchniami. Ścieżka pojedynczych cząsteczek narysowana kolorami w prawych panelach wyraźnie pokazuje, że zachowanie dyfuzji na MICA różni się od tego na szkle. Nie ma jednak znaczącej różnicy w jakości obrazowania.

Średni splot funkcji prostej przy połowie maksymalnej intensywności dla 20 plamek jest prawie taki sam dla obu podłoży, co wskazuje, że powierzchnia MICA jest w pełni przepuszczalna dla światła bez wprowadzania zauważalnych aberracji optycznych. Ogólnie rzecz biorąc, MSDS wykazuje oczywistą różnicę w zachowaniu dyfuzji. Jednak w każdym przypadku można zaobserwować dwie populacje cząstek dyfundujących w różnym tempie.

Dwa różne współczynniki dyfuzji, szybki i wolny, uzyskano z podwójnego wykładniczego zasilania do skumulowanego prawdopodobieństwa przemieszczenia kwadratowego. W przypadku tej dwuwarstwy DOPC oba składniki dyfuzyjne są szybsze na powierzchni MICA, wolno poruszające się cząstki na MICA są około 10 do 20 razy wolniejsze niż szybkie. Powolna populacja na szkle jest jednak bliska unieruchomienia.

Wykazaliśmy, że rodzaj powierzchni może mieć wpływ na dyfuzję dwuwarstw lipidowych. Z tego względu należy być ostrożnym przy porównywaniu wyników badań nad dwuwarstwami osadzonymi na różnych podłożach, takich jak MICA, a dwuwarstwami obrazowania szkła na MICA jest zwykle dość trudne ze względu na skomplikowane przygotowanie, które pokazaliśmy, ale prosty ale skuteczny sposób przygotowania tak wysokiej jakości powierzchni.