Barwienie histologiczne tkanki nerwowej

Plastry, czyli skrawki tkanki mózgowej, stanowią bogaty materiał do badania struktury i funkcji mózgu. Jednak niebarwiona tkanka mózgowa jest wizualnie jednorodna, przypominając czyste płótno. Barwienie jest sposobem na „namalowanie” mózgu, aby wyraźnie zwizualizować komórkowe, strukturalne i molekularne komponenty tego organu. Choć większość barwień opiera się na wspólnych metodach histologicznych, każde podejście ma unikalny cel morfologiczny. Niniejszy film przedstawi ogólne zasady histologii mózgu, zademonstruje niektóre powszechne techniki barwienia oraz omówi kilka zastosowań tych metod w dzisiejszych laboratoriach neuronauki.

Zanim omówimy sposób przeprowadzania procedur barwienia neurologicznego, przejrzyjmy cele tych technik.

Barwienia histologiczne są powszechnie stosowane w celu zapewnienia kontrastu, co pozwala na uwidocznienie cech nierozróżnialnych w niebarwionej tkance. Na przykład, aby zwizualizować ciała komórek neuronów, czyli somata, z których składa się istota szara układu nerwowego, dostępnych jest wiele metod barwienia. Barwniki stosowane w metodzie Nissla wiążą się z kwasami nukeinowymi, farbując somata na fioletowo i ujawniając organizację neuronów.

Z kolei w celu analizy istoty białej można barwić mielinę – osłonkę z kwasów tłuszczowych otaczającą aksony – za pomocą barwników takich jak Luxol Fast Blue. Alternatywnie, barwienie immunohistochemiczne może uwidocznić cele molekularne występujące w konkretnych typach komórek. Technika ta wykorzystuje specyficzność wiązania przeciwciał z celami molekularnymi znanymi jako antygeny. Zastosowanie przeciwciał sprzężonych z enzymami lub związkami fluorescencyjnymi pozwala badaczom na wizualizację miejsc ich wiązania przy użyciu reakcji enzymatycznych lub fluorescencji.

Po zapoznaniu się z koncepcją barwienia przekrojów, przyjrzyjmy się powszechnym etapom histologicznym, które poprzedzają barwienie tkanki mózgowej i zapewniają optymalne warunki do wizualizacji.

Aby zachować strukturę tkanki, w pierwszej kolejności przeprowadza się perfuzję mózgu – polega ona na usunięciu krwi z mózgu i wykorzystaniu naczyń krwionośnych zwierzęcia do wprowadzenia chemicznego utrwalacza. Po wyjęciu organu mózg jest całkowicie zanurzony w utrwalaczu w celu zakończenia procesu konserwacji.

Następnie preparat zostaje zatopiony w medium o właściwościach mechanicznych zbliżonych do tkanki mózgowej, np. w parafini. Po zatopieniu mózg jest cięty na cienkie przekroje przy użyciu instrumentu zwanego mikrotomem. Plastry są następnie osadzane na szkiełkach przedmiotowych i pozostawiane do wyschnięcia.

Ponieważ większość barwników jest na bazie wody, tkanka musi zostać odparafinowana i rehydratowana przed rozpoczęciem barwienia. W tym celu szkiełka płucze się w ksylenole, aby rozpuścić wosk, a następnie stopniowo rehydratuje poprzez serię coraz bardziej rozcieńczonego etanolu. Proces ten należy przeprowadzać w dygestorium, stosując odpowiednie środki ochrony indywidualnej.

Po przygotowaniu tkanki mózgu można przystąpić do procedury barwienia.

Pierwszy krok, nazywany blokowaniem, redukuje barwienie tła spowodowane niespecyficznym wiązaniem przeciwciał. Ekspozycja skrawka na surowicę pozwala na wprowadzenie nieoznaczonych przeciwciał, które wiążą się z miejscami niebędącymi celem. Po blokowaniu trwającym od 30 minut do całej nocy tkanka jest gotowa do inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym, które wiąże się ze specyficznymi celami molekularnymi.

Przeciwciała są zazwyczaj rozcieńczane w roztworze blokującym zawierającym detergent, który zaburza błony komórkowe i umożliwia przeciwciałom wniknięcie do cytoplazmy.

Po inkubacji przez noc nadmiar przeciwciał pierwszorzędowych jest usuwany poprzez krótkie przemycia w buforze. Następnie wprowadza się przeciwciała drugorzędowe, sprzężone z enzymami lub fluoroforami, aby specyficznie oznakować przeciwciała pierwszorzędowe. Po kilku godzinach nadmiar przeciwciał jest usuwany poprzez wielokrotną wymianę buforu.

Teraz, gdy cele zostały oznakowane, omówmy sposób ich detekcji. W przypadku przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z enzymami osiąga się to poprzez wprowadzenie substratu chromogennego. Gdy substrat wchodzi w interakcję z enzymem, następuje zmiana barwy, stąd nazwa „chromogenny”. Po uzyskaniu pożądanego barwienia, zazwyczaj po około 2 minutach, reakcję zatrzymuje się poprzez szybkie zanurzenie skrawków w wodzie.

Po barwieniu przeciwciałami może być konieczny drugi etap, aby zapewnić wynikom odpowiedni kontekst neuroanatomiczny. Na przykład można zdecydować się na zwiększenie kontrastu tkanki za pomocą barwienia metodą Nissla. Procedura ta opiera się na barwnikach zasadowych, takich jak fiolet krezylowy, które oddziałują z kwasami nukleinowymi.

Pierwszym krokiem jest przefiltrowanie roztworu barwnika w celu usunięcia nierozpuszczonych kryształów. Następnie preparaty inkubuje się w barwniku do momentu uzyskania pożądanego kontrastu. Po tym czasie przekroje należy przemyć kilkukrotnie w świeżej wodzie, aby zatrzymać proces barwienia.

Następnie preparaty zanurza się w serii alkoholi, aby usunąć nadmiar barwnika i odwodnić skrawki. Po odwodnieniu skrawki przejrzystnie się w ksylenie, który usuwa alkohol i poprawia jakość obrazowania, ponieważ posiada właściwości dyfrakcji światła zbliżone do właściwości tkanki.

Aby zachować zabarwione przekroje do późniejszej analizy, należy je przykryć szkiełkiem przykrywkowym, stosując trwałe medium montażowe, i pozostawić do wyschnięcia na noc.

Po przedstawieniu procedur i celów barwienia, przyjrzyjmy się niektórym zastosowaniom tej metody.

Przede wszystkim, barwienie histologiczne jest rutynowo stosowane do wizualizacji pojedynczych neuronów. Z kolei wizualizacja jest niezbędna w technikach takich jak mikrodysekcja laserowa, w której badacze wykorzystują laser do izolowania konkretnych komórek hodowanych na cienkiej błonie. Z zabarwionych i wyciętych komórek można wyekstrahować materiał genetyczny, co pozwala badaczom na analizę ekspresji genów specyficznych dla neuronów.

Barwienie może być również wykorzystywane do charakterystyki cech morfologicznych pojedynczych neuronów. W tym eksperymencie immunohistochemia jest przeprowadzana na komórkach wykazujących ekspresję GFP w celu wizualizacji dendrytów tworzących synapsy. Barwienie porównuje się pomiędzy komórkami normalnymi a aktywowanymi, co wykazuje, że dendryty ulegają licznym zmianom w odpowiedzi na bodźce aktywujące.

Wreszcie, dzięki swoistości IHC, ekspresję poszczególnych białek można wykorzystać do identyfikacji lokalizacji i tożsamości unikalnych populacji komórek w układzie nerwowym. Na przykład barwienie móżdżku myszy przeciwciałami przeciwko zebrinie 2 ujawnia lokalizację wyspecjalizowanych neuronów znanych jako komórki Purkinjego.

Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do celowanego barwienia przekrojów mózgu. W tym filmie zaprezentowaliśmy ogólne metody i cele barwienia, a także szczegółowe procedury dotyczące IHC oraz barwienia metodą Nissla.

Dziękujemy za uwagę!