Kwantyfikacja fenotypów ustno-twarzowych u Xenopus

Ogólnym celem poniższej procedury jest opisanie fenotypów twarzy w jamie ustnej zarodków xap Levis w ilościowo-statystyczny sposób. Osiąga się to poprzez uprzednie zamontowanie oderwanych głów zarodków xip w glinianej formie w celu dokumentacji fotograficznej z wykorzystaniem obrazów. Wymiary twarzy są mierzone w celu uzyskania informacji o wielkości obszaru twarzy jamy ustnej.

Następnie punkty orientacyjne są nanoszone za pomocą morfometrii geometrycznej w celu oceny kształtu okolicy twarzy w jamie ustnej. Wyniki wskazują na znaczące zmiany wielkości i kształtu w okolicy twarzy Opus w oparciu o analizy statystyczne wymiarów twarzy i względnego położenia punktu orientacyjnego. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w rozwój kości lub twarzy, może być również stosowana do innych badań morfologii kręgowców, takich jak porównania blisko spokrewnionych gatunków do celów ewolucyjnych lub ekologicznych.

W tej sekcji opisano, jak wykonać gliniane naczynia do przechowywania głów zarodków do ich dokumentacji fotograficznej. Najpierw spłaszcz trochę plasteliny do naczynia o dowolnym rozmiarze i wygładź ją, aby pokryła cały talerz. Następnie delikatnie wciśnij prostą igłę do drażnienia w glinę pod kątem 45 stopni.

Trzymaj igłę mocno i powoli przesuwaj naczynie, aby utworzyć wklęsłą linię. Następnie użyj szklanej pipety, aby wykonać płytkie okrągłe wgłębienia wzdłuż każdej linii. W każdym zagłębieniu można umieścić głowę zarodka przed załadowaniem.

Głowice wypełniły naczynie PBT. Szczegóły dotyczące hodowli zarodków są przedstawione w protokole tekstowym, podobnie jak szczegóły dotyczące mocowania zarodków. W przypadku tego protokołu należy przymocować zarodki między etapami 42 i 45.

Najpierw umieść utrwalone zarodki na 150-milimetrowej szalce Petriego zawierającej około 100 mililitrów PBT. A teraz odetnijcie im głowy. Najpierw przytrzymaj zarodek za pomocą kleszczy i użyj skalpela, aby wykonać nacięcie po tylnej stronie jelita.

Po drugie, wykonaj nacięcie po przedniej stronie jelita w pobliżu serca, aby całkowicie usunąć głowę. Za pomocą pipety przenieś głowice do glinianego naczynia z żyłką. Bardzo ważne jest, aby główki zarodków były umieszczane w glinie dokładnie w tej samej orientacji do fotografii.

Aby zapewnić sukces, użyj rzędów narysowanych w glinie jako prowadnic. Jest to również korzystne, jeśli ta sama osoba zrobi wszystkie zdjęcia tego samego dnia. W przypadku widoku z przodu, zdjęcia umieszczają głowy z tyłu do dołu w zagłębieniach.

Użyj kleszczy, aby manipulować głowami i otaczającą je gliną, tak aby głowy były zamocowane przodem do kamery i nie były przechylone w celu uzyskania widoku bocznego. Fotografie ustawiają głowy tak, aby ich boki były skierowane w tym samym kierunku. Manipuluj głowami i otaczającą je gliną, tak aby wszystkie gruczoły cementowe były skierowane w dół pod tym samym kątem.

Teraz za pomocą dowolnego mikroskopu preparacyjnego z możliwością przechwytywania obrazu zbierz obrazy głów kijanek. Użyj kilku świateł, aby zapobiec nadmiernemu zacienieniu i użyj najwyższego możliwego powiększenia. Sfotografuj każdą głowę w ten sam sposób.

Następnie zapisz obrazy nieskompresowane i w najwyższej możliwej rozdzielczości. Na podstawie zdjęć zmierz wymiary twarzy w jamie ustnej. Najpierw określ szerokość twarzy.

Zidentyfikuj punkty, w których brzuszna część każdego oka styka się z obrzeżami twarzy i zmierz odległość między tymi punktami. Szczegóły dotyczące pomiaru wysokości twarzy i okolicy twarzy w jamie ustnej można znaleźć w protokole tekstowym. Zwróć szczególną uwagę na określenie długości pyska Na obrazach bocznych wykonaj pionową linię, która zaznacza przednią część oka.

Następnie zmierz odległość poziomą od najbardziej wysuniętego do przodu punktu, w którym powierzchnia styka się z grzbietową krawędzią gruczołu cementowego, do pionowej linii wyznaczającej przednią część oka. Inne wymiary, takie jak szerokość ust i okrągłość, są wyjaśnione w protokole tekstowym dla tej analizy, współrzędne punktu orientacyjnego twarzy powinny być ustandaryzowane i zapisane do pliku. Punkty orientacyjne powinny oddawać kształt obrazu i nadawać się do użytku na wszystkich obrazach.

Dlatego nie należy używać struktur, które mogą nie istnieć we wszystkich próbkach. Teraz otwórz pierwszy plik obrazu. Aby dokonać oceny, wybierz zakładkę wtyczki na głównym pasku narzędzi i wybierz selektor punktów.

Z menu rozwijanego wybierz zakładkę Dodaj punkty i umieść punkty orientacyjne na obrazie. Wyglądają jak wielokolorowe. Krzyże przełączają się między punktami orientacyjnymi za pomocą narzędzia Przesuwanie krzyży.

Po umieszczeniu wszystkich wybierz kartę wyświetlania wyników na głównym pasku narzędzi i wybierz opcję pokaż. Spowoduje to wyświetlenie współrzędnych punktu orientacyjnego. Następnie skopiuj współrzędne do programu arkusza kalkulacyjnego w pustym wierszu powyżej wklejonego typu danych LM równa się, a następnie liczby punktów orientacyjnych w próbce w wierszu poniżej.

Wklejony identyfikator typu danych jest równy, po którym następuje nazwa identyfikująca próbkę. Każda próbka musi posiadać niepowtarzalny identyfikator. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie przykładowe obrazy zostaną zmapowane i wprowadzone do arkusza kalkulacyjnego.

Następnie skopiuj kolumny z przykładową identyfikacją i współrzędnymi każdego punktu orientacyjnego i zapisz je w dokumencie tekstowym. Następnie otwórz oprogramowanie morfometryczne. W tym oprogramowaniu wybierz opcję Utwórz nowy zestaw danych z menu głównego.

Nazwij plik i zestaw danych na ekranie podręcznym i zaimportuj plik jako TPS. Teraz wybierz plik tekstowy współrzędnych, aby utworzyć zestaw danych. Następnie wykonaj dopasowanie i wyrównanie prokrustu.

Najpierw zaznacz zestaw danych w zakładce drzewa projektu. Następnie wybierz praktyki wstępne na głównym pasku narzędzi i dopasuj nowe prokrusty z menu rozwijanego. Z dostępnych opcji wybierz opcję Wyrównany według osi głównej.

Następnie wybierz opcję ponownego wykonania dopasowania Crusty w menu rozwijanym praktyk wstępnych, wybierz opcję generuj macierz Covance i wybierz opcję Wykonaj. Teraz na karcie wyników wyświetl korelacje macierzy Covance. Aby odróżnić próbki eksperymentalne i kontrolne, utwórz plik klasyfikatora, przypisując każdą próbkę w zestawie danych do odpowiedniej zmiennej klasyfikatora.

W arkuszu kalkulacyjnym utwórz kolumnę z etykietą ID i utwórz kolumnę z etykietą leczenia. Następnie wymień każdą próbkę w kolumnie ID i przypisz ją do grupy. W kolumnie leczenia zapisz go jako plik tekstowy i zaimportuj go w oprogramowaniu morfometrycznym za pomocą opcji wybierz dopasowanie według identyfikatora.

Teraz na karcie porównania utwórz transformację analizy funkcji dyskryminacyjnej w menu podręcznym. W ramach tej funkcji upewnij się, że wybrano odpowiedni zestaw danych, a typem danych są współrzędne dopasowania prokrustu. Zaznacz pary grup, które chcesz porównać, a następnie uruchom test 1000 permutacji.

Aby wyświetlić mapę wektorową współrzędnych, należy przejść do menu grafika i wybrać zakładkę różnica kształtu. Jeśli obraz jest odwrócony, wyświetl menu podręczne w obszarze kreślenia, aby odwrócić diagram do właściwej orientacji. Ponadto w menu kontekstowym zmień wykres na siatkę transformacji, aby nałożyć wektory na szczegóły siatki podczas tworzenia analizy składowych podstawowych.

Analiza składowych zasady wykresu rozrzutu. Siatki transformacji CVA, wykres rozrzutu i siatki transformacji CVA są dostępne w protokole tekstowym. Zarodki traktowano jednym mikromolowym receptorem kwasu retinowego lub inhibitorem RAR od stadium rozwojowego 24 do stadium 30, a następnie utrwalono w stadium 42 i sfotografowano zarodki kontrolne leczone DMSO.

Zwykle leczenie inhibitorem RAR skutkowało zwężeniem twarzy, nieprawidłowościami oczu i zniekształconymi trójkątnymi ustami. Po przeprowadzeniu geometrycznej analizy morfometrycznej oszacowano wariancję za pomocą analizy składowych podstawowych. Zarodki poddane działaniu substancji wyraźnie odróżniały się od zarodków kontrolnych.

Wzdłuż jednej osi komputera strzałki identyfikują statystyczne wartości odstające z wnętrza grupy. Różnice morfologiczne oceniono następnie za pomocą analizy funkcji dyskryminacyjnych. Dramatyczne zmiany w położeniu bocznych punktów orientacyjnych wskazują na zwężenie kształtu twarzy.

Strzałki wskazują na niewielkie przesunięcie pozycji nozdrzy na zewnątrz. Zauważalne jest również zniekształcenie w obszarze środkowej powierzchni. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać kombinacji tradycyjnych pomiarów rozmiaru i morfometrii geometrycznej do oceny rozmiaru i kształtu twarzy embrionalnej.