Oznaczanie stężenia wirusa za pomocą testów płytki nazębnej: przy użyciu tradycyjnych i nowatorskich systemów nakładek

Ogólnym celem tej procedury jest określenie stężenia wirusa poprzez ilościowe określenie zmienności zakaźnej poprzez zliczenie dyskretnych blaszek w hodowli komórkowej. Osiąga się to poprzez pierwsze posiew komórek w celu utworzenia zlewającej się monowarstwy dla infekcji. Drugim krokiem jest przeprowadzenie seryjnego rozcieńczenia nieznanej próbki wirusa, która ma zostać oznaczona ilościowo.

Następnie zlewające się monowarstwy są infekowane za pomocą seryjnego rozcieńczania materiału wirusowego, a następnie nakładania nakładki unieruchamiającej. Ostatnim krokiem jest utrwalenie i wybarwienie blaszek po odpowiednim czasie inkubacji dla danego wirusa w celu zliczenia dyskretnych blaszek. Ostatecznie testy płytki nazębnej mogą być stosowane i modyfikowane na wiele różnych sposobów w celu określenia miana wirusa w nieznanej próbce wirusa.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak nakładanie półstałe, jest to, że aplikacja i usuwanie są znacznie prostsze zarówno w przypadku zastosowań o wysokiej przepustowości, jak i tradycyjnych. Ponadto nie jest wymagane podgrzewanie odczynników. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku badań nad wieloma różnymi wirusami litycznymi, takimi jak zastosowanie płynnej nakładki.

W formacie 96 dołków pozwala na szybkie badania przesiewowe nowych związków terapeutycznych, co może znacznie skrócić długie godziny spędzone w laboratorium podczas wykonywania tradycyjnych testów płytki nazębnej W dniu poprzedzającym płytkę testową odpowiednie komórki dla danego wirusa, aby osiągnąć płynność od 90 do 100% w dniu infekcji. Roztwory podstawowe można również przygotować dzień przed testem, najpierw przygotować roztwór utrwalający 10% formaldehydu w wodzie destylowanej, mieszając 5,56 mililitra 36% formaldehydu z 14,44 mililitrami wody destylowanej. Następnie przygotuj plamę fioletu krystalicznego składającą się z 1% fioletu krystalicznego w 20% etanolu rozcieńczonego wodą destylowaną.

Następnie, podczas pracy w sterylnych warunkach, przygotuj odpowiednie dwa x podłoża z płytką nazębną dla rodzaju używanych komórek. Przefiltruj roztwór przez filtr 0,2 mikrona, jeśli którykolwiek z odczynników nie jest sterylny. Aby przygotować płynną nakładkę do użycia w teście płytki nazębnej w 2,4 grama komórek avy do kolby zawierającej 97,6 mililitra wody destylowanej, która szybko miesza się z mieszadłem.

Wymieszaj roztwór w temperaturze pokojowej, aż stanie się zbyt lepki dla mieszadła. W tym momencie przenieść kolbę do wytrząsarki kolby i mocno mieszać przez 30 minut, aby zapewnić równomierną homogenizację. Na koniec autoklawować roztwór w temperaturze 121 stopni Celsjusza przy 14 PSI przez 30 minut.

A kiedy program się zakończy, przechowuj szczelnie zapieczętowany w temperaturze pokojowej na nakładkę aros. Przygotuj 0,6% agro roztwór podstawowy w wodzie destylowanej. Wymieszać z mieszadłem i autoklawem, aby wprowadzić do roztworu lub nałożyć karboksylometylocelulozę.

Przygotować 2% roztwór karboksymetylocelulozy w wodzie destylowanej i wymieszać w autoklawie, jak dzień po posiewaniu. Użyj odwróconego mikroskopu, aby sprawdzić płynność i żywotność komórek przed rozpoczęciem testu. Upewnij się, że komórki wykazują standardową morfologię komórkową i około 90% płynności CO.

Wykonać dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenie zakaźnych próbek w komórkowych pożywkach wzrostowych, zmieniając liczbę wymaganych rozcieńczeń w zależności od oczekiwanego miana danego wirusa. Przygotuj również niezainfekowaną próbkę kontrolną, aby niezależnie zapewnić żywotność komórek i pomóc w identyfikacji płytki nazębnej. Odpipetować niezainfekowaną kontrolę i seryjne rozcieńczenie do dołków płytki, uważając, aby nie naruszyć monowarstwy.

Użyj wystarczającej objętości inokulum, aby pokryć komórki, utrzymując objętość tak niską, jak to możliwe, aby zmaksymalizować kontakt wirusa z monowarstwą. Umieść płytki w inkubatorze do hodowli tkankowych i infekuj komórki przez 45 minut do jednej godziny co 20 minut. Delikatnie kołysz płytkami, aby zapewnić równomierne pokrycie i zapobiec wysychaniu monowarstwy komórkowej podczas infekcji.

Przygotuj roztwór roboczy nakładki do nakładek płynnych. Wymieszaj podgrzane podłoże z płytką nazębną i 1,2 do 2,4% temperatury pokojowej Zapas komórek w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać roztwór roboczy 0,6 do 1,2% podłoża do nakładania komórek avy lub nakładek AROS lub CMC mieszanych podgrzanych pożywek płytki nazębnej i roztworu podstawowego podgrzanego 0,6% AROS lub 2% CMC w stosunku jeden do jednego. Następnie umieść w łaźni wodnej o temperaturze 56 stopni Celsjusza, 30 minut w celu wyrównania temperatury.

Upewnij się, że roztwór jest ciepły, ale nie gorący w dotyku, aby zapobiec śmierci komórek i zmniejszeniu miana wirusa. Po infekcji nałóż nakładki na zainfekowane monowarstwy po dodaniu nakładki Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwa do 14 dni w zależności od analizowanego wirusa, aby utrwalić komórki za pomocą płynnej nakładki, wylać lub odessać nakładkę e-komórkową, a następnie pipetować 10% roztwór formaldehydu do studzienek i utrwalać w temperaturze pokojowej przez 30 minut do nocy lub bezpośrednio aros lub CMC. Po utrwaleniu dodać roztwór formaldehydu do nakładki na godzinę do nocy w temperaturze pokojowej, wyrzucić formaldehyd, a następnie ręcznie usunąć szpatułką półstałe zatyczki w miejscu, w którym się znajduje.

Przed barwieniem spłucz płytki komórkowe aby usunąć resztki utrwalacza nakładki. Aby zabarwić, przykryj komórki minimalną ilością roztworu fioletu krystalicznego na około 15 minut. W razie potrzeby kołysz płytami, aby zapewnić równomierne pokrycie.

Delikatnie zmyj plamę z fioletu krystalicznego wodą po utrwaleniu, poplamieniu i wysuszeniu, przechowuj plex na czas nieokreślony do przyszłej analizy. Policz tabliczki w każdej studni, dyskontując studnie z mniej niż pięcioma lub większymi niż 100 tabliczkami. Należy przyjąć średnią dla wszelkich kontrprób technicznych o tym samym rozcieńczeniu.

Zwróć uwagę na rozmiar i morfologię płytki. Określić miano wirusa w próbce podstawowej, biorąc średnią liczbę blaszek do rozcieńczenia i odwrotność całkowitego współczynnika rozcieńczenia. Ten obraz przedstawia porównania nakładek nazębnych wirusa gorączki Rift Valley z wykorzystaniem 12-dołkowych płytek, które zostały posiane 2,5 razy 10 piątych komórek na 12-dołkowych płytkach i zakażone 200 mikrolitrami przy użyciu tej samej seryjnie rozcieńczonej próbki wyjściowej MP 12.

Po infekcji zastosowano 1,5-mililitrowe nakładki 0,3%aros, 0,6%AVY lub 1%CMC w celu bezpośredniego porównania nakładek. Ten histogram przedstawia wyniki liczby płytek nazębnych i titterpingu dla wszystkich trzech nakładek. Tu. Pokazano, że porównania nakładek płytki ViiV z wykorzystaniem płytek 12-dołkowych zostały posiane jak poprzednio i zakażone objętością 200 mikrolitrów przy użyciu tej samej seryjnie rozcieńczonej próbki wyjściowej szczepu szczepionki ViiV TC 83 po zakażeniu, nałożono 1,5-mililitrowe nakładki 0,3% aros, 0,6% komórki lub 1% CMC, jak poprzednio.

Ponownie histogram pokazuje wyniki liczby blaszek miażdżycowych i mianowania dla wszystkich trzech nakładek. Na tym obrazie przedstawiono przykład nakładek płytki nazębnej o wysokiej przepustowości. 96-dołkową płytkę VIR posianą trzykrotnie 10 czwartych komórek na studzienkę zainfekowano 50 mikrolitrami inokulum przy użyciu tej samej seryjnie rozcieńczonej próbki wyjściowej wirusa gorączki doliny Rift MP 12 przez jedną godzinę w poczwórnym duplikacie dla nakładek 0,6 i 1,2% Końcowe stężenia komórek avy zostały przetestowane w celu określenia wykonalności i odtwarzalności wykorzystania płynnych nakładek w sposób wysokoprzepustowy.

Ten histogram pokazuje miana wyznaczone dla każdej nakładki. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że każdy wirus jest inny i konieczne mogą być optymalizacje, w tym wykorzystanie różnych typów komórek, czasu inkubacji i/lub pożywki wzrostowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać podstawowy test płytki nazębnej przy użyciu zarówno płynnych, jak i półstałych nakładek.