Name: Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Poznaj izolację mitochondriów z komórek hodowlanych i tkanek myszy oraz analizę ich potencjału błonowego przy użyciu barwnika TMRE. Ta metoda umożliwia badanie funkcji mitochondrialnych i zdrowia komórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez grant NSF CHE-1229562 (VDGM), Biuro Badań Licencjackich na Uniwersytecie Elon, Wydział Chemii Elon oraz Elon Lumen Prize (TL i TAD), Elon College Fellows Program (JAC) i Elon College Honors Program (TAD).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Wake Forest. Pary hodowlane dla modelu myszy SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] uzyskano z The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Nietransgeniczne samice typu dzikiego (WT) i SOD1G93A samce [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] zostały wyhodowane w celu wyhodowania SOD1G93A myszy i nietransgenicznych rodzeństwa z miotu WT, które zostały wykorzystane w eksperymentach.
1. Modele do badań
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa
	<ol>
		<li>Utrzymuj ludzkie embrionalne komórki nerkowe (HEK-T293) w DMEM uzupełnione 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliną-streptomycyną i 1% L-glutaminą, w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
		<li>Hoduj komórki w kolbach T75 i pozwól im osiągnąć 90% konfluencji. </li>
		<li>Przeprowadzić podział komórek poprzez trypsynizację (0,25% Trypsin-EDTA) przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO2 , inaktywację trypsyny przy równej objętości pożywki komórkowej i odwirowanie komórek przez 5 minut w temperaturze 700 x g w 4 °C.</li>
		<li>Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce hodowlanej.</li>
		<li>Komórki nasienne w odpowiedniej kolbie lub płytce 7 x 104 komórki do kolby T75 48 godzin przed poddaniem działaniu cytokin. Powinno to dać ~70% gęstości w momencie zabiegu.</li>
		<li>Surowica głodzy komórki 24 godziny później, odsysając pożywkę i zastępując ją tą samą objętością pożywki bez surowicy (DMEM, sterylne).</li>
		<li>Przygotować TNF-α, IL1-β i IFN-γ z liofilizowanego proszku z ultraczystą wodą o stężeniach roboczych odpowiednio 5 pg/μl, 10 ng/μl i 10 ng/μl i dodać je do studzienek/kolb.</li>
		<li>Leczyć wygłodzone komórki surowicy poprzez dodanie rozpuszczonych cytokin bezpośrednio do pożywki do hodowli komórkowych w odpowiednich kolbach. Leczenie składało się z pojedynczych cytokin, koktajlu wszystkich 3 (określanego jako "*3") lub sterylnej wody jako kontroli (określanej jako "0").</li>
		<li>Inkubować leczone komórki przez 24, 48 lub 72 godziny przed oceną i pobraniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena żywotności komórek
	<ol>
		<li>Sporządzić 5 mg/ml roztworu bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu (MTT) w 1x PBS.</li>
		<li>W przypadku płytek 12-dołkowych dodaj 100 μl roztworu MTT do każdego dołka i delikatnie zamieszaj, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie.</li>
		<li>Inkubować płytki przez 15 minut–1 godzinę w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i sprawdzić pod mikroskopem pod kątem obecności fioletowego zabarwienia. Jeśli nie ma fioletu, ponownie zawiruj i pozwól komórkom inkubować w odstępach 5 minut, aż zaobserwuje się fiolet. Ilość niezbędnego czasu powinna być określona przez każdego badacza.</li>
		<li>Używając powtarzalnego pipetora, dodaj 700 μl rozpuszczalnika MTT (4 mM HCl i 0,1% NP40 w izopropanolu) do każdego dołka i kołysz płytką (płytkami) w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut lub do momentu, gdy cały fioletowy kolor opuści komórki. Jeśli fioletowy kolor nie wychodzi z komórek, dodaj dodatkowe 200 μl rozpuszczalnika i kontynuuj wirowanie.</li>
		<li>Do analizy pobrać 100 μl z każdej studzienki i umieścić na 96-dołkowej płytce i odczytać na czytniku płytek przy użyciu 570 nm i referencyjnej długości fali 630 nm, jednak 595 nm jest również dopuszczalne, o ile odczyty są dokonywane w spójnych ustawieniach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Model zwierzęcy ALS
	<ol>
		<li>
		Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Wake Forest. Pary hodowlane dla modelu myszy SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] uzyskano z The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Nietransgeniczne samice typu dzikiego (WT) i SOD1G93A samce [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] zostały wyhodowane w celu wyhodowania SOD1G93A myszy i nietransgenicznych rodzeństwa WT, które zostały wykorzystane w eksperymentach.
		</li>
		<li>Przeprowadzić genotypowanie za pomocą standardowych starterów przeciwko zmutowanemu SOD125.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja mitochondriów
UWAGA: Ważne jest, aby pracować szybko i utrzymywać wszystko na lodzie przez cały czas trwania procedury.
<ol>
	<li>Przygotowanie buforu izolacyjnego mitochondriów (MIB), bufora izolacyjnego rdzenia kręgowego (SC MIB) i buforu eksperymentalnego (EB)
	<ol>
		<li>Przygotuj z wyprzedzeniem następujące roztwory podstawowe dla MIB i EB.</li>
		<li>Przygotować 1 M Tris/MOPS, rozpuszczając 12,1 g zasady Tris w 70 mlH2O. Dodać suchy MOPS, aby uzyskać pH do 7,4. Dostosować objętość do 100 ml final. Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Otrzymać 1 M Kphos przez zmieszanie 80,2 ml K2HPO4 i 19,8 ml KH2PO4. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotować 0,2 M EGTA/Tris, dodając 3,8 g EGTA do 10 mlH2O. Dodaj 1 M Tris/MOPS aż do rozpuszczenia, ~30-40 ml. Dostosuj do 50 ml, sterylny filtr i przechowuj w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że pH wyniesie ~6,7.</li>
		<li>Przygotuj 1 M glutaminianu, sporządzając 10 ml 1 M roztworu kwasu glutaminowego. Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować 1 M jabłczan, sporządzając 10 ml 1 M roztworu kwasu jabłkowego. Dodaj Tris/MOPS do 50 mM. Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotuj MIB w stężeniu 200 mM sacharozy, 10 mM Tris/MOPS, pH 7,4 i 1 mM EGTA/Tris. Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wykonaj SC MIB o stężeniu 250 mM sacharozy, 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT i koktajlu inhibitorów proteazy.</li>
		<li>Przygotować EB o stężeniu 125 mM KCl, 10 mM Tris/MOPS, pH 7,4, 5 mM glutaminianu, 2,5 mM jabłczanu, 1 mM fosforanu K, pH 7,4 i 10 mM EGTA/Tris. Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie sprzętu przed pobraniem komórek.
	<ol>
		<li>Opłucz małe szklane naczynie i tłuczek do homogenizacji trzy razy sterylną wodą i umieść na lodzie.</li>
		<li>Zbierz niezbędne przedmioty, takie jak standardowe wiertło, skrobaki do komórek, probówki i roztwory o pojemności 1,5 ml, 15 ml i 50 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja mitochondriów
	<ol>
		<li>Hodowane komórki
		<ol>
			<li>Dla każdego typu próbki należy użyć dwóch kolb T175 z komórkami.</li>
			<li>Upewnij się, że komórki są w ~90% zlewające się i użyj w eksperymentach kontrolnych lub płytkuj i traktuj zgodnie z opisem powyżej w kroku 1.2.</li>
			<li>Na blacie stołu odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć przylegające komórki 15 ml 1x PBS za każdym razem.</li>
			<li>Odessać bufor i zeskrobać kolby w celu usunięcia przylegających komórek z dna kolby.</li>
			<li>Dodać 15 ml 1x PBS do każdej kolby, zamieszać i przenieść do pojedynczych stożkowych probówek o pojemności 15 ml i umieścić na lodzie.</li>
			<li>Po zakończeniu skrobania probówki należy odwirowywać przez 5 minut przy 700 x g, 4 °C za pomocą wirówki stołowej z obracanym wirnikiem kubełkowym.</li>
			<li>Odessać supernatanty i ponownie zawiesić każdą osadkę w 1 ml MIB.</li>
			<li>Połączyć obie zawiesiny i przenieść do małego szklanego naczynia w celu homogenizacji.</li>
			<li>Dodać MIB do naczynia do momentu, aż bufor dotrze do pierwszej linii. Homogenizuj komórki za pomocą tłuczka przymocowanego do wiertła ze średnią prędkością przez trzy przejścia. Upewnij się, że na tym etapie naczynie znajduje się na lodzie, aby nie wyjmować tłuczka ponad płyn i używać stałej prędkości z ciągłymi przejściami.</li>
			<li>Przenieść homogenizowany roztwór do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. </li>
			<li>Pobrać roztwór do strzykawki o pojemności 3 ml za pomocą igły 1 1/2 cala o rozmiarze 18 i wyrzucić go z powrotem do stożkowej probówki na lodzie za pomocą igły 1/2 cala o rozmiarze 27. Należy uważać, aby usunąć roztwór z wewnętrznej ścianki probówki, aby wykorzystać tę siłę do przerwania błony komórkowej.</li>
			<li>Powtórzyć czynności z użyciem strzykawki w sumie pięć razy. </li>
			<li>Przenieść roztwór do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirowywać przez 5 minut przy 600 x g, 4 °C w wirówce stołowej za pomocą obracającego się wirnika kubełkowego.</li>
			<li>Ostrożnie usunąć sklarowany osad i rozprowadzić w trzech probówkach o pojemności 1,5 ml. 
			UWAGA: Mitochondria znajdują się w supernatancie po tym pierwszym, wolnym sprośnie, podczas gdy błony komórkowe i nieuszkodzone komórki są granulowane.</li>
			<li>Probówki wirówkowe w wirniku o stałym kącie nachylenia 10 000 x g, 4 °C przez 5 min.</li>
			<li>Odessać supernatanty i połączyć granulki w 100 μl MIB i natychmiast umieścić na lodzie. 
			UWAGA: Mitochondria znajdują się w granulce po tym szybkim wirowaniu. Mitochondria zazwyczaj zachowują swój potencjał błonowy dla ~2-3 jonów lodu po izolacji i są najbardziej stabilne jako skoncentrowany roztwór podstawowy w MIB.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Izolacja mitochondriów z tkanki myszy
		<ol>
			<li>Znieczulić mysz zgodnie z protokołem IACUC. Ustaw waporyzator na 5,0%, aby wywołać znieczulenie. Potwierdzono, że zwierzę jest znieczulone przez brak odruchu szczypania stopy lub odruchu mrugania, gdy zbliża się do oka lub stuka wacikiem. Utrzymuj mysz w znieczuleniu przez cały zabieg chirurgiczny, utrzymując waporyzator w zakresie od 1,5% do 2,0%.</li>
			<li>Odetnij wątrobę i rdzeń kręgowy od każdego zwierzęcia i umieść osobno w lodowatym chłodnym 1x PBS -/-, aby spłukać krew.</li>
			<li>W przypadku wątroby przenieś tkankę do naczynia wagowego na lodzie i posiekaj na drobne kawałki za pomocą świeżej żyletki przez 1 minutę.</li>
			<li>Dodać tkankę i odpowiedni bufor (MIB dla wątroby lub SC MIB dla rdzenia kręgowego) do naczynia, aż bufor dotrze do pierwszej linii. Homogenizuj tkankę tłuczkiem ręcznie przez pięć przejść. Upewnij się, że na tym etapie naczynie znajduje się na lodzie, aby nie wyjmować tłuczka ponad płyn i używać stałej prędkości z ciągłymi przejściami.</li>
			<li>Przenieść homogenaty do czystych probówek o pojemności 15 ml.</li>
			<li>Probówki wirówkowe w wirniku o stałym kącie nachylenia 750 x g, 4 °C przez 10 min.</li>
			<li>Zachowaj supernatanty w czystych probówkach i umieść je na lodzie. 
			UWAGA: Mitochondria znajdują się w supernatancie po tym pierwszym, wolnym sprośnie, podczas gdy błony komórkowe i nieuszkodzone komórki są granulowane.</li>
			<li>Ponownie zawiesić granulki rdzenia kręgowego w 500 μl SC MIB.</li>
			<li>Ponownie homogenizuj każdy trzy razy, tym razem napełniając naczynie tylko do połowy SC MIB.</li>
			<li>Przenieść nowy homogenat do świeżej probówki.</li>
			<li>Wirować w wirniku o stałym kącie nachylenia 750 x g, 4 °C przez 10 min.</li>
			<li>Połącz te nowe supernatanty, które zawierają więcej mitochondriów, z pierwszym supernatantem z każdej próbki.</li>
			<li>Probówki wirówkowe w wirniku o stałym kącie nachylenia 10 000 x g, 4 °C przez 5 min.</li>
			<li>Odessać supernatanty i ponownie zawiesić granulki wątroby w 500 μl MIB, a granulki rdzenia kręgowego w 50 μl SC MIB i natychmiast umieścić na lodzie. 
			UWAGA: Mitochondria znajdują się w granulce po tym szybkim wirowaniu. Mitochondria zazwyczaj zachowują swój potencjał błonowy dla ~2-3 jonów lodu po izolacji i są najbardziej stabilne jako skoncentrowany roztwór podstawowy w MIB.</li>
			<li>Wykonaj test stężenia białka, aby oszacować stężenie mitochondriów w roztworze. Postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi korzystania z komercyjnego zestawu do oznaczania białek lub podobnej metody26. Typowe stężenia mitochondriów to: 2 kolby T175 dają ~ 2 mg / ml, 1 wątroba myszy ~ 3-5 mg / ml i 1 rdzeń kręgowy myszy ~ 1-3 mg / ml.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test cytochromu c przy użyciu zestawu badawczo-rozwojowego Szczur/mysz Quantikine Quantikine ELISA (dostosowany na podstawie protokołu dostarczonego przez producenta).
	<ol>
		<li>Bezpośrednio przed rozpoczęciem reakcji należy rozcieńczyć mitochondria do stężenia roboczego 0,5 mg/ml za pomocą EB i rozprowadzić rozcieńczone mitochondria w probówkach o pojemności 1,5 ml do reakcji (zwykle 30-50 μl mitochondriów na probówkę).</li>
		<li>Dodaj EB lub DMSO, w ilości 1% całkowitej objętości, do rozcieńczonych mitochondriów i inkubuj reakcje na stole przez 7-10 minut. Reakcje te są stabilne do 30 minut w temperaturze pokojowej, jeśli potrzebne są dłuższe ramy czasowe.</li>
		<li>Mitochondria osadzać przez odwirowanie w rotorze o stałym kącie nachylenia przy 10 000 x g, 4 °C przez 5 minut, a następnie ostrożnie oddzielić supernatant i umieścić go w oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml. 
		UWAGA: Probówki można zamrozić w temperaturze -20 °C w celu późniejszej analizy lub natychmiast zużyć.</li>
		<li>Oznaczyć uwalnianie cytochromu c przez porównanie stężenia cytochromu c w osadzie i supernatancie27.
		<ol>
			<li>Przygotuj próbki, rozpuszczając granulki w pierwotnej objętości reakcji z 0,5% Tx-100 w 1x PBS.</li>
			<li>Dla każdej próbki przygotuj 2 studzienki na płytce ELISA, jedną dla rozpuszczonego osadu i jedną dla supernatantu z reakcji przez dodanie 100 μl koniugatu cytochromu c (stosować prosto z butelki) plus 100 μl 0,5% Tx-100 w 1x PBS, a następnie całą próbkę osadu lub supernatantu.</li>
			<li>Delikatnie obracać płytkę na niskim poziomie (poziom 2-4) przez 20 sekund, aby wymieszać, przykryć i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
			<li>Następnie należy czterokrotnie umyć płytkę buforem myjącym rozcieńczonym zgodnie z zaleceniami producenta. Usuń nadmiar roztworu, stukając w dołki ręcznik papierowy.</li>
			<li>Następnie dodaj 150 μl roztworu rozwijającego 1:1 A+B do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez 20-30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Na koniec dodać 50 μl roztworu zatrzymującego do każdej studzienki i dokonać odczytów absorbancji przy 540 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Oblicz ilość uwalnianego cytochromu c, porównując ilość cytochromu c w osadzie i supernatance dla każdej reakcji.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ocena funkcji mitochondrialnej (dys)funkcji
<ol>
	<li>Bezpośrednio przed rozpoczęciem reakcji należy rozcieńczyć mitochondria do stężenia roboczego 0,5 mg/ml za pomocą EB i umieścić w probówkach o pojemności 1,5 ml do reakcji (zwykle stosuje się 30-50 μl mitochondriów na probówkę).</li>
	<li>Leczenie mitochondrialne
	<ol>
		<li>Dodać odpowiednie zabiegi (kontrola EB, 1 μM FCCP zmieszany z 50 nM Walinomycyną, 10 μM rotenonem, 5 μM oligomycyną, 2 mM KCN lub 200 μM ADP, stężenia końcowe) w celu rozdzielenia reakcji przy 1/10 całkowitej objętości rozcieńczonych mitochondriów. Inkubować reakcje na stole przez 7 min. 
		UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z tymi substancjami, ponieważ przypadkowe spożycie lub wchłonięcie przez skórę może być szkodliwe.</li>
		<li>Rozcieńczyć TMRE, rozpuszczony w sterylnej wodzie o stężeniu roboczym 100 μM i przechowywany w temperaturze -20 °C, do 2 μM i dodać objętość równą objętości reakcji mitochondrialnej.</li>
		<li>Inkubuj reakcje na blacie stołu przez 7 minut.</li>
		<li>Mitochondria osadów przez odwirowanie w wirniku o stałym kącie nachylenia przy 10 000 x g, 4 °C przez 5 min.</li>
		<li>Załadować połowę objętości supernatantu z każdej próbki na płytkę 396-dołkową i odczytać fluorescencję. 
		UWAGA: Długości fal wzbudzenia i emisji TMRE należy zoptymalizować zgodnie z instrukcjami producenta przy użyciu objętości i płytki, które zostaną użyte do testu. Używając standardowej 384-dołkowej czarnej płytki o zawartości 25 μl 1 μM TMRE (końcowe stężenie reakcji), najsilniejszy sygnał uzyskano przy użyciu długości fal wzbudzenia/emisji 485 nm/535 nm.</li>
		<li>Obliczyć różnicę fałdowania we fluorescencji między kontrolą (EB) a każdym zabiegiem, dzieląc względną wartość fluorescencji (RFU) uzyskaną z czytnika płytek dla próbki doświadczalnej przez RFU od próbki kontrolnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Madeira, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+mitochondrial+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+In+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Overview of mitochondrial bioenergetics.</a> Methods In Molecular Biology. 810, 1-6 (2012).</li>
<li>Sakamuru, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+homogenous+membrane+potential+assay+to+assess+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Application of a homogenous membrane potential assay to assess mitochondrial function.</a> Physiological Genomics. 44, 495-503 (2012).</li>
<li>Clayton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the mitochondrial genome.</a> Journal Of Inherited Metabolic Disease. 15, 439-447 (1992).</li>
<li>Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+import+system+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The protein import system of mitochondria.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271, 31763-31766 (1996).</li>
<li>Mayer, A., Neupert, W., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+import%3A+reversible+binding+of+the+presequence+at+the+trans+side+of+the+outer+membrane+drives+partial+translocation+and+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein import: reversible binding of the presequence at the trans side of the outer membrane drives partial translocation and unfolding.</a> Cell. 80, 127-137 (1995).</li>
<li>Green, D. R., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology+of+mitochondrial+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology of mitochondrial cell death.</a> Science. 305, 626-629 (2004).</li>
<li>Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+of+Bcl-2+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+In+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, a008714(2013).</li>
<li>Hardwick, J. M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+BCL-2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: BCL-2 proteins.</a> Cell. 138, 404(2009).</li>
<li>Zoratti, M., Szabo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1241, 139-176 (1995).</li>
<li>Wu, C. C., Bratton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+intrinsic+apoptosis+pathway+by+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Regulation of the intrinsic apoptosis pathway by reactive oxygen species.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 19, 546-558 (2013).</li>
<li>Kuwana, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3+domains+of+BH3-only+proteins+differentially+regulate+Bax-mediated+mitochondrial+membrane+permeabilization+both+directly+and+indirectly%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly.</a> Molecular Cell. 17, 525-535 (2005).</li>
<li>Joshi, D. C., Bakowska, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+mitochondrial+membrane+potential+and+reactive+oxygen+species+in+live+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons.</a> Journal Of Visualized Experiments. , (2011).</li>
<li>Vinsant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+early+pathogenesis+in+the+SOD1%28G93A%29+mouse+model+of+ALS%3A+part+I%2C+background+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods.</a> Brain and Behavior. 3, 335-350 (2013).</li>
<li>Vinsant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+early+pathogenesis+in+the+SOD1%28G93A%29+mouse+model+of+ALS%3A+part+II%2C+results+and+discussion%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part II, results and discussion.</a> Brain and Behavior. 3, 431-457 (2013).</li>
<li>Rajapakse, N., Shimizu, K., Payne, M., Busija, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+intact+mitochondria+from+neonatal+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research.+Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of intact mitochondria from neonatal rat brain.</a> Brain research. Brain Research Protocols. 8, 176-183 (2001).</li>
<li>Schmitt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-automated+method+for+isolating+functionally+intact+mitochondria+from+cultured+cells+and+tissue+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies.</a> Analytical Biochemistry. 443, 66-74 (2013).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Debatin, K. M., Poncet, D., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy%3A+targeting+the+mitochondrial+cell+death+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway.</a> Oncogene. 21, 8786-8803 (2002).</li>
<li>Del Gaizo Moore, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lymphocytic+leukemia+requires+BCL2+to+sequester+prodeath+BIM%2C+explaining+sensitivity+to+BCL2+antagonist+ABT-737%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737.</a> The Journal of Clinical Investigation. 117, 112-121 (2007).</li>
<li>Del Gaizo Moore, V., Schlis, K. D., Sallan, S. E., Armstrong, S. A., Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL-2+dependence+and+ABT-737+sensitivity+in+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">BCL-2 dependence and ABT-737 sensitivity in acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 111, 2300-2309 (2008).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+complex+I+inhibitor+rotenone+induces+apoptosis+through+enhancing+mitochondrial+reactive+oxygen+species+production%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278, 8516-8525 (2003).</li>
<li>Hynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+drug-induced+mitochondrial+toxicity+using+fluorescence-based+oxygen-sensitive+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences+%3A+An+Official+Journal+Of+The+Society+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes.</a> Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society of Toxicology. 92, 186-200 (2006).</li>
<li>Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+optical+oxygen+sensing%3A+protocols+and+critical+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses.</a> Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).</li>
<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+assessment+of+mitochondrial+membrane+permeabilization+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis+%3A+An+International+Journal+On+Programmed+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis.</a> Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).</li>
<li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Certo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+primed+by+death+signals+determine+cellular+addiction+to+antiapoptotic+BCL-2+family+members%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members.</a> Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).</li>
<li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues%3B+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver%3B+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li>
<li>Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+cytochrome+oxidase+and+succinoxidase+in+the+cytoplasm+of+the+mammalian+liver+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell.</a> The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).</li>
<li>Marques-Fernandez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNFalpha+induces+survival+through+the+FLIP-L-dependent+activation+of+the+MAPK%2FERK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway.</a> Cell Death & Disease. 4, e493(2013).</li>
<li>Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergistically+mediate+neurotoxicity%3A+involvement+of+nitric+oxide+and+of+N-methyl-D-aspartate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+And+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors.</a> Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).</li>
<li>Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+death+in+cytokine-activated+primary+human+brain+cell+culture%3A+role+of+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha.</a> Glia. 28, 114-127 (1999).</li>
<li>Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+endothelial+cell+activation+in+experimental+sepsis+with+a+two-step+cell+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model.</a> Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).</li>
<li>Brown, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes%3A+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li>
<li>Wong, A., Cortopassi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+in+a+neural+cell+line+using+a+fluorescence+plate+reader%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).</li>
<li>Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+assays+for+the+mitochondrial+permeability+transition+using+a+fluorescence+multiwell+plate+reader%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader.</a> Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).</li>
<li>Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+membrane+potential+in+the+cells+by+microchip+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry.</a> Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).</li>
<li>Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivator+of+transcription+fusion+protein+transduction+causes+membrane+inversion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Leczenie komórek HEK-293T rekombinowanymi cytokinami powoduje umiarkowaną śmierć komórki w ciągu 48 godzin (ryc. 1). Ilość śmierci komórki indukowanej przez leczenie TNF-alfa jest podobna do wcześniej opisanych badań30 , a żywotność komórek zmniejsza się po jednoczesnym podaniu wielu cytokin, które są większe niż sumowane ilości z dowolną samą cytokiną, jest również zgodna z literaturą31,32. Możliwość dostosowania ilości i rodzajów leczenia cytokinami, a także porównanie koktajli do...

Żywe komórki gromadzą energię metaboliczną w postaci tłuszczów i węglowodanów i wykorzystują tę energię do biosyntezy, transportu błonowego i ruchu. Pewna ilość energii jest uzyskiwana w cytozolu poprzez konwersję cukrów dietetycznych bezpośrednio do ATP podczas glikolizy. Jednak główne źródło produkcji ATP w komórce jest wykorzystywane w mitochondriach za pośrednictwem mitochondrialnego łańcucha oddechowego1. Architektura mitochondriów zapewnia niezbędną orientację przestrzenną dla efektywnej i wydajnej produkcji ATP. Mitochondria posiadają podwójną błonę oddzieloną przestrzenią międzybłonową i wraz z macierzą, najbardziej wewnętrznym przedziałem mitochondrialnym, mieszczą składniki i koordynują reakcje chemiczne biorące udział w wytwarzaniu ATP. Błona wewnętrzna zawiera szereg kompleksów białkowych związanych z błoną, które obejmują łańcuch oddechowy, a także syntazę ATP, kompleks białkowy, który łączy ADP i Pi w celu utworzenia ATP. Błona wewnętrzna jest złożona w grzebienie, a elektrony są przekazywane wzdłuż kompleksów łańcucha oddechowego przez cytochrom c, rozpuszczalny nośnik elektronów, który przemieszcza się między kompleksami w przestrzeni międzybłonowej. Gdy elektrony się poruszają, następuje utlenianie równoważników redukujących, a jony wodorowe są pompowane z matrycy do przestrzeni międzybłonowej. W wyniku wysokiego stężenia jonów w przestrzeni międzybłonowej powstaje gradient elektrochemiczny, w wyniku którego powstaje potencjał błonowy w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej (∆ψ)2. Tlen jest końcowym akceptorem elektronów w łańcuchu transportu elektronów, a jony wodoru przepływają przez syntazy ATP z przestrzeni międzybłonowej z powrotem do matrycy, a tym samym bezpośrednio powodują powstawanie ATP. Proces ten, opisany w całości, jest znany jako fosforylacja oksydacyjna. Fałdy grzebienia zwiększają powierzchnię błony wewnętrznej, umożliwiając maksymalny transport elektronów i produkcję ATP w każdym mitochondrium. Białka, enzymy i inne cząsteczki biorące udział w fosforylacji oksydacyjnej pochodzą zarówno z genów jądrowych, jak i mitochondrialnych. Mitochondria zawierają własne koliste DNA, kodujące 13 białek, a także tRNA i mRNA niezbędne do produkcji ATP3. Potrzeba jednak znacznie więcej białek, a zatem są one kodowane jądrowo. Większość z tych białek kodowanych jądrowo jest kierowana do macierzy mitochondrialnej za pomocą presekwencji na N-końcu białka prekursorowego, a ich import jest częściowo napędzany przez ∆ψ4,5.
Poza przyczynianiem się do bioenergetyki komórki, mitochondria wpływają również na główne procesy metaboliczne, takie jak TCA i beta-oksydacja, sygnalizacja komórkowa poprzez regulację wapnia, a także odgrywają kluczową rolę w apoptozie6. W szczególności w okresach stresu komórkowego białka z rodziny BCL-2, które znajdują się na zewnętrznej błonie mitochondriów lub oddziałują na niej, mogą powodować przepuszczalność zewnętrznej błony mitochondrialnej (MOMP)7,8. Podczas MOMP cytochrom c i inne białka są uwalniane do cytozolu i wraz z kilkoma białkami cytozolowymi tworzą kompleks zwany apoptosomem9,10. Apoptosom aktywuje kaspazy, które następnie rozszczepiają białka komórkowe i DNA podczas fazy wykonywania apoptozy. Gdy tylko wystąpi MOMP, ∆Ψ ulega zapadnięciu, a produkcja ATP zostaje wstrzymana. Tak więc, gdy apoptoza jest inicjowana, funkcja mitochondriów jest zagrożona, a zmiany w ∆Ψ mogą być skorelowane ze zdrowiem mitochondriów i komórek12. Podczas gdy apoptoza jest punktem końcowym w wielu modelach choroby, funkcja mitochondriów i zmiany w ∆Ψ mogą również dostarczyć cennych informacji na temat pochodzenia i/lub progresji choroby. Na przykład w przebiegu chorób neurodegeneracyjnych udokumentowano zmiany strukturalne i funkcjonalne mitochondriów13,14.
W pierwszej części protokołu opisana jest izolacja nienaruszonych mitochondriów, które zachowują swoje ΔΨ. Komórki HEK-293T wystawiono na działanie różnych stężeń i kombinacji rekombinowanych TNF-α, IL1-β i IFN-γ w celu wywołania apoptozy. Cytokiny te zostały wybrane, ponieważ często zgłasza się, że są one wysokie w pierwotnych próbkach septycznych u ludzi15, a zewnętrzna ścieżka apoptozy może być wywołana przez interakcję wiązania TNF-α z jego receptorem6 . Ponieważ istnieją subtelne różnice niezbędne do wyizolowania funkcjonalnych mitochondriów z tkanek pierwotnych w porównaniu z komórkami hodowanymi, a także dlatego, że wiele badań wykorzystuje zwierzęta, protokół opisuje również, jak wyizolować mitochondria z wątroby i rdzenia kręgowego w mysim modelu stwardnienia bocznego przedniego (ALS).
Druga część protokołu została opracowana do monitorowania zaburzeń potencjału błony mitochondrialnej za pomocą czułego na potencjał barwnika fluorescencyjnego z czytnikiem płytek fluorescencyjnych. Różnice między statusem komórkowym (tj. zdrowym a niezdrowym) różnicuje się poprzez ilościowe określenie siły ΔΨ izolowanych mitochondriów w połączeniu ze środkami rozprzęgającymi, inhibitorami łańcucha oddechowego, inhibitorami złożonymi i jonoforami, z których wszystkie powodują rozproszenie potencjału błony mitochondrialnej. Im zdrowsze mitochondria, tym większa zmiana ∆Ψ po leczeniu inhibitorami mitochondriów, dlatego odpowiedź mitochondriów może być wykorzystana jako wskaźnik (dys)funkcji mitochondriów.
Użycie izolowanych mitochondriów zamiast oceny funkcji in situ dostarcza ostatecznych dowodów, że patologia lub leczenie bezpośrednio moduluje zmiany w organellach16-18. Chociaż w literaturze istnieją metody izolowania mitochondriów od hodowanych komórek, są one niejasne17 i/lub wykorzystują specjalistyczny sprzęt16. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę izolacji i można go łatwo dostosować do innych linii komórkowych, w tym tkanek pierwotnych i kultur13,14,19,20. Wiele izolowanych badań mitochondriów wykorzystuje te same rozprzęgacze i inhibitory mitochondriów, które są używane w tym protokole, ale z elektrodą Clarka (21 jest reprezentatywnym przykładem wielu artykułów w literaturze), która ponownie jest bardzo specyficznym i specjalistycznym elementem wyposażenia. Ponadto ta tradycyjna metoda ma ograniczenia, takie jak niska przepustowość i wysoka złożoność22,23 i wymaga znacznej ilości mitochondriów (~500 μg/reakcję). W tym protokole sonda potencjału TMRE z membraną fluorescencyjną jest używana w połączeniu z czytnikiem płytek fluorescencyjnych, który jest standardową maszyną w wielu laboratoriach. TMRE jest powszechnie ceniony, ponieważ szybko wnika do komórek i izolowanych mitochondriów i może być stosowany w niskich stężeniach24. Za pomocą tego protokołu można szybko skonfigurować wiele reakcji w tandemie i analizować je wsadowo. Ponadto reakcje wymagają znacznie mniejszej ilości izolowanych mitochondriów (~10 μg/reakcję). Wymagając mniejszej ilości materiału, mniejsze próbki tkanek lub hodowli komórkowych można wykorzystać jako punkt wyjścia do izolacji mitochondriów, można skonfigurować więcej powtórzeń lub reakcji i potencjalnie możliwa jest wystarczająca ilość materiału do innych izolowanych eksperymentów mitochondrialnych, takich jak produkcja ATP, zużycie tlenu lub testy importowe.

<table><tbody><tr><td>Kwas L-glutaminowy</td><td>Sigma</td><td>G1251</td><td>Zamiast tego można użyć soli potasowej.</td></tr><tr><td>kwas jabłkowy</td><td>Sigma</td><td>M8304</td><td>Zamiast tego można użyć soli potasowej.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Trisma base</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>Rozcieńczyć do 100&nbsp; &#956; M jako zapas roboczy w etanolu i przechowywać w temperaturze -20&nbsp; &#176;C.</td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>Zrób w DMSO i używaj jako 5&nbsp; &#956; M zapas roboczy. Przechowywać w temperaturze -20&nbsp; &#176;C.</td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Fisher</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td>Mallinckrodt</td><td>6379</td><td>Przygotować skoncentrowany bulion w etanolu, a następnie rozcieńczyć wodą&nbsp;</td></tr><tr><td>rotenon</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td>Wysoce toksyczny. Wykonane na etanolu.</td></tr><tr><td>oligomycyna</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>Wysoce toksyczna. Wykonane na etanolu.</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>TMRE</td><td>Sigma</td><td>8717-25mg</td><td>Rozcieńczony 100&nbsp; &#956; Kolba M z EB natychmiast przed użyciem.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td>1x regularny (wysoki poziom glukozy).</td></tr><tr><td>Długopis/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-155</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Fisher</td><td>SH3002101</td><td>Przechowywać porcje pod adresem -20&nbsp; &#176; C</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>14-501F</td><td>pochodzenie amerykańskie, jakość premium. Podgrzewanie dezaktywacji i przechowywanie podwielokrotności w temperaturze -20&nbsp; &#176;C.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIgma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Test Protien Barwnik (5x)</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>Każdy test białkowy może zastąpić.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td>Przygotować 2 mg/ml bulionu w wodzie do oznaczania białka.</td></tr><tr><td>MTT w proszku</td><td>Sigma</td><td>M2128</td><td>Filtr sterylizowany 5 mg / ml bulion wykonany z PBS. Przechowuj porcje na poziomie -20&nbsp; &#176; C; Przechowywać w 4&nbsp; &#176; C przez okres do 1 tygodnia.</td></tr><tr><td>Roztwór tergitolu (NP-40)</td><td>Sigma</td><td>NP40S</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki IL-1B</td><td>Gibco</td><td>PCH08014</td><td>Po otwarciu porcji sklepowych na -20&nbsp; &#176; C</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki TNF-alfa</td><td>Gibco</td><td>PHC3015L</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki IFN-gamma</td><td>Gibco</td><td>PHC4031</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS (-/-)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>Upewnij się, że nie ma jonów Mg2+ i Ca2+.</td></tr><tr><td>Cytochrom c zestaw ELISA</td><td>R& Systemy D</td><td>DTC0</td><td>Human dla komórek HEK-293T.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Porównanie między dwiema lub więcej odrębnymi grupami, takimi jak zdrowie vs. choroba, jest niezbędne do określenia statusu komórki. Mitochondria znajdują się w centrum zdrowia komórek ze względu na ich rolę zarówno w metabolizmie komórkowym, jak i produkcji energii, a także w kontroli apoptozy. Dlatego bezpośrednia ocena izolowanych mitochondriów i zaburzeń mitochondriów daje możliwość określenia, czy występuje (dys)funkcja specyficzna dla organelli. Metody opisane w tym protokole obejmują izolację nienaruszonych, funkcjonalnych mitochondriów z komórek hodowanych HEK oraz wątroby i rdzenia kręgowego myszy, ale można je łatwo dostosować do stosowania z innymi hodowanymi komórkami lub tkankami zwierzęcymi. Funkcja mitochondriów oceniana przez TMRE oraz zastosowanie powszechnych rozprzęgaczy i inhibitorów mitochondriów w połączeniu z czytnikiem płytek fluorescencyjnych sprawiają, że protokół ten jest nie tylko wszechstronny i dostępny dla większości laboratoriów badawczych, ale także oferuje wysoką przepustowość.

Leczenie komórek HEK-293T w obecności 200 pg/ml TNF-α, 40 ng/ml IL1-β oraz 75 ng/ml IFN-γ (*3) przez 24–48 godz. prowadzi do stopniowego zwiększania się liczby obumierających komórek (Rycina 1A). Żywotność komórek oceniano za pomocą testu MTT, który wykazał spadek żywotności o około 10% po 24-godzinnym działaniu oraz o około 20% po 48 godz. Podobne wyniki w zakresie śmierci komórkowej obserwuje się po 48 godz. przy zastosowaniu nieco niższych stężeń cytokin (100 pg/ml TNF-α, 40 ng/ml IL1-β i 75 ng/ml IFN...

Porównanie potencjału błony mitochondrialnej między próbkami dostarcza cennych informacji o stanie komórek. Opisano szczegółowe etapy izolacji mitochondriów i oceny odpowiedzi na inhibitory i rozprzęgacze za pomocą fluorescencji. Metoda i użyteczność tego protokołu są zilustrowane przez zastosowanie hodowli komórkowej i zwierzęcego modelu stresu komórkowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie oddychających mitochondriów z hodowanych komórek lub tkanki myszy, a następnie ocena siły ich potencjału błonowego jako miary stanu komórkowego. W przypadku hodowanych komórek osiąga się to poprzez najpierw posiew, a następnie obróbkę komórek. Następnie komórki są homogenizowane, a homogenat jest przepuszczany przez igłę w celu dalszego uwolnienia mitochondriów z komórek.W przypadku tkanki myszy wątroba jest wycinana od myszy, a następnie homogenizowana na lodzie z obydwoma rodzajami materiału wyjściowego. Wirowanie różnicowe jest następnie stosowane w celu wyizolowania mitochondriów od reszty zawartości komórkowej. Po poddaniu mitochondriów pewnej obróbce, w tym dodaniu barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na potencjał błonowy, wykonuje się pomiary fluorescencji TMRE w celu obliczenia siły potencjału błonowego.Ostatecznie funkcję mitochondriów i zaburzenia potencjału błony mitochondrialnej można ocenić za pomocą barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na potencjał błonowy w połączeniu z czytnikiem płytek fluorescencyjnych W przypadku leczenia zwykłymi mitochondriami na sprzęgaczach i inhibitorach, Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w apoptozę indukowaną cytokinami i dysfunkcję mitochondriów w LS.It można również zastosować do dowolnego innego systemu, w którym porównanie dwóch lub więcej różnych próbek poszukiwanych, takich jak zdrowe kontra choroba lub dwa różne gatunki zwierząt o różnym tempie metabolizmu. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Ponieważ etapy izolacji mitochondriów są trudne do nauczenia.Dzieje się tak, ponieważ podczas wykonywania techniki istnieje wiele niuansów, które można przeoczyć w sekcjach dotyczących tradycyjnych metod. Rozpocznij tę procedurę od wyhodowania ludzkich embrionalnych komórek nerkowych, jak opisano w protokole tekstowym, na 48 godzin przed płytką do leczenia cytokinami, 160 000 komórek w kolbie T 1 75, aby uzyskać około 70% gęstości w momencie leczenia. Następnie surowica zagłodzić komórki 24 godziny później, odsysając pożywkę i zastępując ją tą samą objętością pożywki wolnej od surowicy.Na koniec należy potraktować komórki pozbawione surowicy poprzez dodanie rozpuszczonych cytokin bezpośrednio do pożywki do hodowli komórkowej w celu przeprowadzenia izolacji mitochondriów. Najpierw odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć przylegające komórki 15 mililitrami jednego x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS. Za każdym razem po przepłukaniu należy zassać bufor i zeskrobać kolbę, aby usunąć przylegające komórki z dna.Następnie dodać 15 mililitrów jednego XPBS do każdej kolby, zakręcić i przenieść do pojedynczych 15-mililitrowych stożkowych probówek na lodzie. Po zakończeniu skrobania należy odwirować probówki przez pięć minut w temperaturze 700 razy G w czterech stopniach Celsjusza, używając wirówki stołowej z wahadłowym wirnikiem kubełkowym po odwirowaniu, odessaniu supernatantów i resus. Zawiesić każdą osadkę w jednym mililitrze mitochondrialnego buforu izolacyjnego.Następnie połącz obie zawiesiny i przenieś do małego szklanego naczynia w celu homogenizacji w mitochondriach ponownie zawieszonych i bufora izolacji mitochondriów do szklanego naczynia, aż roztwór dotrze do pierwszej linii Z tłuczkiem przymocowanym do wiertarki przystąp do homogenizacji komórek na lodzie ze średnią prędkością przez trzy przejścia. Należy zachować ostrożność, aby usunąć pęcherzyki powietrza podczas umieszczania tłuczka w roztworze, nie wyjmować tłuczka nad ciecz i używać stałej prędkości z ciągłymi przejściami. Przenieś homogenizowany roztwór do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.Następnie wciągnąć roztwór do trzymililitrowej strzykawki za pomocą igły o rozmiarze 18, jeden na pół cala i wyrzucić go z powrotem do stożkowej rurki na lodzie za pomocą igły o rozmiarze 27 i pół cala. Należy uważać, aby usunąć roztwór z wewnętrznej ścianki probówki, aby wykorzystać tę siłę do przerwania błony komórkowej. Powtórz kroki strzykawki w sumie pięć razy, a następnie przenieś roztwór do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i wiruj przez pięć minut w temperaturze 600 razy G i cztery stopnie Celsjusza w wirówce stołowej za pomocą wahadłowego wirnika kubełkowego.Mitochondria znajdują się w supernatancie po tym pierwszym wirowaniu z niską prędkością, podczas gdy niektóre błony i nieuszkodzone komórki są granulowane, ostrożnie usuwaj supernatant i rozprowadź między trzema rurkami o pojemności 1,5 mililitra. Następnie odwiruj trzy probówki w wirniku o stałym kącie nachylenia 10 000 razy G cztery stopnie Celsjusza przez pięć minut. Mitochondria z hodowanych komórek mają białawy kolor.Z każdego zwierzęcia należy wyciąć wątrobę i umieścić ją w lodowatym opakowaniu bez wapnia i magnezu, aby wypłukać krew. Przenieś tkankę wątroby do naczynia na lodzie i posiekaj ją na drobne kawałki za pomocą świeżej żyletki przez jedną minutę. Następnie dodaj tkankę i odpowiedni bufor do naczynia, aż bufor dotrze do pierwszej linii.Przystąp do ręcznej homogenizacji tkanki na lodzie za pomocą tłuczka przez pięć przejść. Należy zachować ostrożność, aby usunąć pęcherzyki powietrza podczas umieszczania tłuczka w roztworze, nie wyjmować tłuczka nad ciecz i używać stałej prędkości z ciągłymi przejściami. Kontynuuj przetwarzanie próbek za pomocą wirowania i homogenizacji zgodnie z wymogami protokołu tekstowego.Po połączeniu nowych supernatantów z pierwszym supernatantem z każdej próbki, należy odwirować probówki w wirniku o stałym kącie nachylenia 10 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Ostrożnie zassaj górną białą puszystą warstwę za pomocą końcówki pipety i/lub dociskając ją do boków probówki. Następnie delikatnie odlej resztę supernatantu i resus.Zawiesić granulki mitochondriów wątroby w 500 mikrolitrach izolacji mitochondrialnej. Mitochondria buforowe z wątroby są brązowe. Próbki należy szybko umieścić na lodzie bezpośrednio przed rozpoczęciem reakcji.Rozcieńczyć mitochondria do 0,5 miligrama na mililitr. Zagęszczenie robocze z buforem eksperymentalnym. Dodaj odpowiednie zabiegi, jak wymieniono w protokole tekstowym, aby oddzielić probówki na jednej dziesiątej, całkowitej objętości rozcieńczonych mitochondriów.Następnie umieść rozcieńczone mitochondria w każdej probówce reakcyjnej i delikatnie mieszaj każdą probówkę, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie. Inkubuj reakcje na stole przez siedem minut. Następnie dodać równą objętość dwóch mikromolowych tetraetylu, pręcików dominu, estru etylowego, w skrócie TMRE do objętości reakcji mitochondrialnej.Ponownie, delikatnie mieszając każdą rurkę, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie. Po inkubacji reakcji na stole przez dodatkowe siedem minut, mitochondria osadzać przez wirowanie w wirniku o stałym kącie nachylenia 10 000 razy G cztery stopnie Celsjusza przez pięć minut. Następnie załadować połowę objętości supernatantu z każdej próbki na 3 84.Studnia przystępuje do odczytu fluorescencji próbek, a następnie oblicza różnicę fałd we fluorescencji między kontrolą a każdym traktowaniem, jak opisano w protokole tekstowym, traktowanie komórek T HEK 2, 93 TNF, alfa, IL, jeden, beta i IFN gamma przez 24 do 48 godzin prowadzi do postępującej śmierci komórki. Żywotność komórek oceniano za pomocą testów MTT, które konsekwentnie wykazują, że występuje około 10% spadek żywotności komórek po 24-godzinnym leczeniu i około 20% spadek. Przy 48-godzinnym leczeniu komórki traktowane podobnymi stężeniami dają podobne wyniki śmierci komórki po 48 godzinach.Leczenie pojedynczymi cytokinami ujawnia, że spadek żywotności jest spowodowany efektami kombinatorycznymi. Dane dotyczące żywotności reprezentują średnie odchylenie standardowe z trzech oddzielnych eksperymentów. Każdy przebieg w trzech egzemplarzach i szczelność słupków błędów świadczą o odtwarzalności danych.Procentowy spadek potencjału błonowego w mitochondriach wyizolowanych z komórek traktowanych cytokinami oznacza, że leczenie cytokinami miało wpływ na zdrowie mitochondriów, potwierdzając dane dotyczące żywotności po tej procedurze. Inne metody, takie jak ocena całkowitej ilości energii w pociągu TP lub zużycia tlenu, mogą zostać opracowane w celu oceny dodatkowych pytań, takich jak różnice w energii i oddychaniu między różnymi próbkami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować nienaruszone funkcjonalne mitochondria i ocenić siłę ich potencjału błonowego jako odzwierciedlenie stanu komórkowego.

isolation-functional-analysis-mitochondria-from-cultured-cells-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje procedurę badania oddychania mitochondriów izolowanych z mięśni szkieletowych. Metoda ta została opracowana na podstawie pracy Scorrano et al. (2007). Procedura izolacji mitochondriów zajmuje około 2 godzin. Pomiar oddychania mitochondriów może zostać ukończony w ciągu około 1 godziny.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych

Opisano metodę szybkiej izolacji mitochondriów z biopsji tkanek ssaków. Preparaty wątroby szczura lub mięśni szkieletowych homogenizowano za pomocą komercyjnego dysocjatora tkanek, a mitochondria izolowano przez filtrację różnicową przez filtry z siatki nylonowej. Czas izolacji mitochondriów wynosi &lt;30 min w porównaniu do 60 - 100 min przy użyciu metod alternatywnych.

Szybka izolacja i oczyszczanie mitochondriów do przeszczepu przez dysocjację tkanek i filtrację różnicową

Tutaj prezentujemy modyfikację wcześniej opisanej metody, która pozwala na izolację wysokiej jakości i oczyszczonych mitochondriów z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy. Procedura ta powoduje powstanie wysoce sprzężonych mitochondriów, które oddychają z wysoką funkcją podczas testów respirometycznych opartych na mikropłytkach.

Izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Prezentujemy dwuetapowy protokół wysokiej jakości izolacji mitochondriów, który jest zgodny z odkrywaniem białek i kwantyfikacją w skali proteomu. Nasz protokół nie wymaga inżynierii genetycznej, a zatem nadaje się do badania mitochondriów z dowolnych pierwotnych komórek i tkanek.

Dwuetapowa izolacja mitochondriów bez znaczników w celu lepszego odkrywania białek i kwantyfikacji

Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko małe ilości próbek.

Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

Badania bioenergetyczne i metabolomiczne mitochondriów ujawniły ich wieloaspektową rolę w wielu chorobach, ale metody izolacji tych organelli są różne. Opisana tutaj metoda jest w stanie oczyścić wysokiej jakości mitochondria z wielu źródeł tkankowych. Jakość określa się na podstawie współczynników kontroli oddechu i innych wskaźników ocenianych za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Solidna izolacja mitochondriów z tkanki serca gryzoni

Zidentyfikowaliśmy łożysko jako główny organ krwiotwórczy podczas rozwoju. Stwierdziliśmy, że macierzyste komórki krwiotwórcze (HSCs) są zarówno generowane, jak i powielane w łożysku w unikalnych niszach mikrośrodowiskowych. W niniejszej pracy opisujemy techniki eksperymentalne niezbędne do izolacji i wizualizacji HSCs w łożysku myszy.

Izolacja i analiza hematopoetycznych komórek macierzystych z łożyska

Opisujemy szybką i skuteczną metodę oczyszczania mitochondriów z drożdży Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta umożliwia wysokowydajną izolację czystych mitochondriów, które są w zasadzie wolne od zanieczyszczeń innymi organellami i zachowują swoją integralność strukturalną oraz funkcjonalną po oczyszczeniu.

Oczyszczanie mitochondriów z komórek drożdży

W tym nagranym protokole zaprezentowano technikę sekcji służącą do usunięcia zakrętu zębatego u dorosłej myszy przy użyciu stereomikroskopu.

Disekcja zakrętu zębatego hipokampa dorosłej myszy

Poznaj izolację mitochondriów z komórek hodowlanych i tkanek myszy oraz analizę ich potencjału błonowego przy użyciu barwnika TMRE. Ta metoda umożliwia badanie funkcji mitochondrialnych i zdrowia komórkowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Przeglądaj więcej filmów