Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie oddychających mitochondriów z hodowanych komórek lub tkanki myszy, a następnie ocena siły ich potencjału błonowego jako miary stanu komórkowego. W przypadku hodowanych komórek osiąga się to poprzez najpierw posiew, a następnie obróbkę komórek. Następnie komórki są homogenizowane, a homogenat jest przepuszczany przez igłę w celu dalszego uwolnienia mitochondriów z komórek.

W przypadku tkanki myszy wątroba jest wycinana od myszy, a następnie homogenizowana na lodzie z obydwoma rodzajami materiału wyjściowego. Wirowanie różnicowe jest następnie stosowane w celu wyizolowania mitochondriów od reszty zawartości komórkowej. Po poddaniu mitochondriów pewnej obróbce, w tym dodaniu barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na potencjał błonowy, wykonuje się pomiary fluorescencji TMRE w celu obliczenia siły potencjału błonowego.

Ostatecznie funkcję mitochondriów i zaburzenia potencjału błony mitochondrialnej można ocenić za pomocą barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na potencjał błonowy w połączeniu z czytnikiem płytek fluorescencyjnych W przypadku leczenia zwykłymi mitochondriami na sprzęgaczach i inhibitorach, Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w apoptozę indukowaną cytokinami i dysfunkcję mitochondriów w LS.It można również zastosować do dowolnego innego systemu, w którym porównanie dwóch lub więcej różnych próbek poszukiwanych, takich jak zdrowe kontra choroba lub dwa różne gatunki zwierząt o różnym tempie metabolizmu. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Ponieważ etapy izolacji mitochondriów są trudne do nauczenia.

Dzieje się tak, ponieważ podczas wykonywania techniki istnieje wiele niuansów, które można przeoczyć w sekcjach dotyczących tradycyjnych metod. Rozpocznij tę procedurę od wyhodowania ludzkich embrionalnych komórek nerkowych, jak opisano w protokole tekstowym, na 48 godzin przed płytką do leczenia cytokinami, 160 000 komórek w kolbie T 1 75, aby uzyskać około 70% gęstości w momencie leczenia. Następnie surowica zagłodzić komórki 24 godziny później, odsysając pożywkę i zastępując ją tą samą objętością pożywki wolnej od surowicy.

Na koniec należy potraktować komórki pozbawione surowicy poprzez dodanie rozpuszczonych cytokin bezpośrednio do pożywki do hodowli komórkowej w celu przeprowadzenia izolacji mitochondriów. Najpierw odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć przylegające komórki 15 mililitrami jednego x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS. Za każdym razem po przepłukaniu należy zassać bufor i zeskrobać kolbę, aby usunąć przylegające komórki z dna.

Następnie dodać 15 mililitrów jednego XPBS do każdej kolby, zakręcić i przenieść do pojedynczych 15-mililitrowych stożkowych probówek na lodzie. Po zakończeniu skrobania należy odwirować probówki przez pięć minut w temperaturze 700 razy G w czterech stopniach Celsjusza, używając wirówki stołowej z wahadłowym wirnikiem kubełkowym po odwirowaniu, odessaniu supernatantów i resus. Zawiesić każdą osadkę w jednym mililitrze mitochondrialnego buforu izolacyjnego.

Następnie połącz obie zawiesiny i przenieś do małego szklanego naczynia w celu homogenizacji w mitochondriach ponownie zawieszonych i bufora izolacji mitochondriów do szklanego naczynia, aż roztwór dotrze do pierwszej linii Z tłuczkiem przymocowanym do wiertarki przystąp do homogenizacji komórek na lodzie ze średnią prędkością przez trzy przejścia. Należy zachować ostrożność, aby usunąć pęcherzyki powietrza podczas umieszczania tłuczka w roztworze, nie wyjmować tłuczka nad ciecz i używać stałej prędkości z ciągłymi przejściami. Przenieś homogenizowany roztwór do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

Następnie wciągnąć roztwór do trzymililitrowej strzykawki za pomocą igły o rozmiarze 18, jeden na pół cala i wyrzucić go z powrotem do stożkowej rurki na lodzie za pomocą igły o rozmiarze 27 i pół cala. Należy uważać, aby usunąć roztwór z wewnętrznej ścianki probówki, aby wykorzystać tę siłę do przerwania błony komórkowej. Powtórz kroki strzykawki w sumie pięć razy, a następnie przenieś roztwór do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i wiruj przez pięć minut w temperaturze 600 razy G i cztery stopnie Celsjusza w wirówce stołowej za pomocą wahadłowego wirnika kubełkowego.

Mitochondria znajdują się w supernatancie po tym pierwszym wirowaniu z niską prędkością, podczas gdy niektóre błony i nieuszkodzone komórki są granulowane, ostrożnie usuwaj supernatant i rozprowadź między trzema rurkami o pojemności 1,5 mililitra. Następnie odwiruj trzy probówki w wirniku o stałym kącie nachylenia 10 000 razy G cztery stopnie Celsjusza przez pięć minut. Mitochondria z hodowanych komórek mają białawy kolor.

Z każdego zwierzęcia należy wyciąć wątrobę i umieścić ją w lodowatym opakowaniu bez wapnia i magnezu, aby wypłukać krew. Przenieś tkankę wątroby do naczynia na lodzie i posiekaj ją na drobne kawałki za pomocą świeżej żyletki przez jedną minutę. Następnie dodaj tkankę i odpowiedni bufor do naczynia, aż bufor dotrze do pierwszej linii.

Przystąp do ręcznej homogenizacji tkanki na lodzie za pomocą tłuczka przez pięć przejść. Należy zachować ostrożność, aby usunąć pęcherzyki powietrza podczas umieszczania tłuczka w roztworze, nie wyjmować tłuczka nad ciecz i używać stałej prędkości z ciągłymi przejściami. Kontynuuj przetwarzanie próbek za pomocą wirowania i homogenizacji zgodnie z wymogami protokołu tekstowego.

Po połączeniu nowych supernatantów z pierwszym supernatantem z każdej próbki, należy odwirować probówki w wirniku o stałym kącie nachylenia 10 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Ostrożnie zassaj górną białą puszystą warstwę za pomocą końcówki pipety i/lub dociskając ją do boków probówki. Następnie delikatnie odlej resztę supernatantu i resus.

Zawiesić granulki mitochondriów wątroby w 500 mikrolitrach izolacji mitochondrialnej. Mitochondria buforowe z wątroby są brązowe. Próbki należy szybko umieścić na lodzie bezpośrednio przed rozpoczęciem reakcji.

Rozcieńczyć mitochondria do 0,5 miligrama na mililitr. Zagęszczenie robocze z buforem eksperymentalnym. Dodaj odpowiednie zabiegi, jak wymieniono w protokole tekstowym, aby oddzielić probówki na jednej dziesiątej, całkowitej objętości rozcieńczonych mitochondriów.

Następnie umieść rozcieńczone mitochondria w każdej probówce reakcyjnej i delikatnie mieszaj każdą probówkę, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie. Inkubuj reakcje na stole przez siedem minut. Następnie dodać równą objętość dwóch mikromolowych tetraetylu, pręcików dominu, estru etylowego, w skrócie TMRE do objętości reakcji mitochondrialnej.

Ponownie, delikatnie mieszając każdą rurkę, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie. Po inkubacji reakcji na stole przez dodatkowe siedem minut, mitochondria osadzać przez wirowanie w wirniku o stałym kącie nachylenia 10 000 razy G cztery stopnie Celsjusza przez pięć minut. Następnie załadować połowę objętości supernatantu z każdej próbki na 3 84.

Studnia przystępuje do odczytu fluorescencji próbek, a następnie oblicza różnicę fałd we fluorescencji między kontrolą a każdym traktowaniem, jak opisano w protokole tekstowym, traktowanie komórek T HEK 2, 93 TNF, alfa, IL, jeden, beta i IFN gamma przez 24 do 48 godzin prowadzi do postępującej śmierci komórki. Żywotność komórek oceniano za pomocą testów MTT, które konsekwentnie wykazują, że występuje około 10% spadek żywotności komórek po 24-godzinnym leczeniu i około 20% spadek. Przy 48-godzinnym leczeniu komórki traktowane podobnymi stężeniami dają podobne wyniki śmierci komórki po 48 godzinach.

Leczenie pojedynczymi cytokinami ujawnia, że spadek żywotności jest spowodowany efektami kombinatorycznymi. Dane dotyczące żywotności reprezentują średnie odchylenie standardowe z trzech oddzielnych eksperymentów. Każdy przebieg w trzech egzemplarzach i szczelność słupków błędów świadczą o odtwarzalności danych.

Procentowy spadek potencjału błonowego w mitochondriach wyizolowanych z komórek traktowanych cytokinami oznacza, że leczenie cytokinami miało wpływ na zdrowie mitochondriów, potwierdzając dane dotyczące żywotności po tej procedurze. Inne metody, takie jak ocena całkowitej ilości energii w pociągu TP lub zużycia tlenu, mogą zostać opracowane w celu oceny dodatkowych pytań, takich jak różnice w energii i oddychaniu między różnymi próbkami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować nienaruszone funkcjonalne mitochondria i ocenić siłę ich potencjału błonowego jako odzwierciedlenie stanu komórkowego.