1.14: Mysia elektroporacja w macicy

Elektroporacja in utero jest kluczową techniką badania mechanizmów molekularnych, które kierują rozwojem neurologicznym. Poprzez wstrzykiwanie DNA w celu zmiany ekspresji genów w określonych regionach rozwijającego się mózgu gryzonia, naukowcy mogą badać proliferację, różnicowanie, migrację i dojrzewanie komórek nerwowych w kontekście ich naturalnego środowiska.

W tym filmie przedstawimy kluczowe zasady elektroporacji in utero, podstawowe informacje o tym, jak wykonywać tę technikę i jej zastosowania w badaniach neurobiologicznych.

Zanim zagłębimy się w to, jak wykonać tę procedurę, przyjrzyjmy się najpierw kilku zasadom elektroporacji. Ta procedura wykorzystuje impulsy elektryczne, które tworzą przejściowe pory w błonach komórkowych, umożliwiając DNA wejście do komórki. Ponieważ ujemnie naładowane DNA będzie przemieszczać się w kierunku elektrody dodatniej, różne populacje komórek mogą być celowane w zależności od położenia pola elektrycznego.

Chociaż elektroporacja była tradycyjnie stosowana w badaniach in vitro, postęp naukowy rozszerzył jej zastosowanie na nienaruszone narządy, w tym te znajdujące się w zarodkach myszy rozwijających się w macicy.

Elektroporacja in utero, w przeciwieństwie do hodowli komórkowych lub technik ex vivo, ma tę zaletę, że transfekowane komórki będą nadal narażone na wszystkie sygnały fizjologiczne, które kierują normalnym rozwojem. Jest to szczególnie ważne w mózgu, gdzie struktury takie jak aksony wymagają wskazówek od innych typów komórek, aby prawidłowo się rozwijać.

Rozwój mózgu w szczególności obejmuje zaprogramowaną serię zdarzeń proliferacji i migracji, co oznacza, że różne warstwy tkanki mogą być celowane w oparciu o czas elektroporacji.

Wreszcie, dostępność różnych typów elektrod umożliwia naukowcom dostęp zarówno do obszarów w pobliżu powierzchni mózgu, jak i do głębszych obszarów. Elektrody łopatkowe są używane do celowania w powierzchowne części mózgu, takie jak kora mózgowa i hipokamp, podczas gdy mniejsze elektrody igłowe są używane do celowania w głębokie struktury, takie jak wzgórze i podwzgórze.

Teraz, gdy omówiliśmy kilka podstawowych zasad tej techniki, usuńmy nasze przygotowania z drogi, abyśmy mogli zagłębić się w procedurę chirurgiczną i elektroporację in utero.

Najpierw wysterylizuj wszystkie narzędzia i przetrzyj obszar operacyjny 70% etanolem. Następnie przygotuj roztwór do wstrzykiwań, rozpuszczając plazmidowe DNA w sterylnym PBS zawierającym 0,1% Fast Green. Fast Green dodaje się, aby umożliwić wizualizację roztworu do wstrzykiwań w zarodku. Wreszcie, za pomocą ściągacza do igieł, należy stworzyć ultracienką igłę, aby zmniejszyć utratę płynu owodniowego i wynikającą z tego śmiertelność płodu.

Teraz, gdy mamy już wszystko przygotowane, przejdźmy do podstawowych kroków elektroporacji tkanki mózgowej u rozwijających się gryzoni. Zacznij od znieczulenia ciężarnej matki za pomocą 5% izofluranu, a następnie przenieś go do rurki respiratora, dostarczając 2,25% izofluranu przez cały zabieg. Następnie, w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego, podaj podskórnie środek przeciwbólowy, taki jak buprenorfina. Następnie ogol brzuch i wysterylizuj miejsce nacięcia.

Aby chirurgicznie odsłonić macicę, wykonaj pionowe nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry i za pomocą nożyczek przetnij otrzewną. Aby zapobiec wysychaniu zarodków, przykryj otwór sterylną gazą nasączoną solą fizjologiczną. Następnie delikatnie wyciągnij łańcuch embrionalny z jamy brzusznej, upewniając się, że zarodki są mokre, przykrywając sterylną, wstępnie podgrzaną solą fizjologiczną.

Za pomocą mikroskopu preparacyjnego zidentyfikuj zarodki odpowiednio ustawione, aby zapewnić łatwy dostęp do mózgu. Za pomocą palców lub kleszczy ustabilizuj głowę zarodka i wstrzyknij roztwór DNA przez ścianę macicy do mózgu. Umieść elektrodę po obu stronach głowy, tak aby elektroda dodatnia była skierowana w kierunku, w którym chcesz elektroporować DNA. Gdy wszystkie odpowiednio ustawione zarodki zostaną poddane elektroporacji, ostrożnie umieść róg macicy z powrotem w jamie brzusznej.

Przed zamknięciem nacięcia dodaj do jamy 2-3 ml ciepłej soli fizjologicznej. Zszyj otrzewną za pomocą wchłanialnych szwów, a następnie zamknij skórę za pomocą zszywek. Na koniec przenieś mysz do klatki z poduszką grzewczą i monitorem.

Teraz, gdy omówiliśmy, jak wykonywać elektroporację in utero, przyjrzyjmy się niektórym dalszym zastosowaniom tej techniki.

Elektroporacja in utero jest użytecznym narzędziem do badania, w jaki sposób określone geny przyczyniają się do rozwoju neuronów. Konstrukty elektroporowane mogą kierować nadekspresją białek typu dzikiego lub zmutowanego lub całkowicie blokować ekspresję białek. Fenotypy neurologiczne można następnie ocenić na poziomie mikroskopowym lub organizmu. Na przykład, ci eksperymentatorzy ustalili, że przejściowa nadekspresja genu związanego ze schizofrenią, DISC-1 w rozwijającym się mózgu myszy, powodowała nadwrażliwość na amfetaminę w późniejszym życiu.

Elektroporacja in utero może być również przydatna do wizualizacji określonych populacji komórek i połączeń, które tworzą, dostarczając sekwencje kodujące białka fluorescencyjne do tkanki nerwowej. Na przykład, eksperymentatorzy ci elektropowalili gen białka zielonej fluorescencji do siatkówki E13,5, aby zbadać komórki zwojowe siatkówki lub RGC, które przekazują informacje wizualne z oka do mózgu. Badanie siatkówki w E18.5 pokazuje, w jaki sposób ta technika może być wykorzystana do śledzenia ścieżki aksonu RGC przez nerw wzrokowy, skrzyżowanie wzrokowe i przewód wzrokowy.

Wreszcie, wiele ważnych wydarzeń w rozwoju neuronalnym ma miejsce po urodzeniu, inspirując naukowców do opracowania zmodyfikowanej techniki zwanej elektroporacją in vivo. Procedura ta przebiega zgodnie z tymi samymi podstawowymi krokami, co elektroporacja macicy, ale zwykle jest wykonywana w ciągu pierwszych kilku dni po porodzie. Poporodowa manipulacja genetyczna jest szczególnie przydatna do badania typów komórek urodzonych później, takich jak te znajdujące się w pokazanej tutaj opuszce węchowej.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat elektroporacji w macicy. Ten film zawierał kluczowe zasady i podstawowy przegląd tego, jak wykonywać elektroporację w macicy, a także kilka dalszych zastosowań, które pozwalają naukowcom badać mechanizmy molekularne, które kierują rozwojem neurologicznym.

Dzięki za oglądanie!