Elektroporacja in utero u myszy
In utero elektroporacja jest ważną techniką badania mechanizmów molekularnych kierujących proliferacją, różnicowaniem, migracją i dojrzewaniem komórek…
Elektroporacja in utero jest kluczową techniką badania mechanizmów molekularnych sterujących neurorozwojem. Poprzez wstrzykiwanie DNA w celu zmiany ekspresji genów w konkretnych obszarach rozwijającego się mózgu gryzonia, badacze mogą analizować proliferację, różnicowanie, migrację i dojrzewanie komórek neuronalnych w ich naturalnym środowisku.
Niniejszy film przedstawi kluczowe zasady elektroporacji in utero, zapewni podstawowy przegląd sposobu wykonania tej techniki oraz omówi jej zastosowania w badaniach z zakresu neurobiologii.
Zanim przejdziemy do szczegółowego opisu procedury, omówmy najpierw zasady elektroporacji. Procedura ta wykorzystuje impulsy elektryczne, które tworzą przejściowe pory w błonach komórkowych, umożliwiając wniknięcie DNA do wnętrza komórki. Ponieważ ujemnie naładowane DNA przemieszcza się w stronę elektrody dodatniej, można celować w różne populacje komórek w zależności od ustawienia pola elektrycznego.
Choć elektroporację tradycyjnie stosowano w badaniach in vitro, postęp naukowy rozszerzył jej zastosowanie na nienaruszone organy, w tym te występujące w embrionach myszy rozwijających się in utero.
Elektroporacja in utero, w przeciwieństwie do hodowli komórkowych lub technik ex vivo, ma tę zaletę, że transfektowane komórki są nadal narażone na wszystkie sygnały fizjologiczne kierujące normalnym rozwojem. Jest to szczególnie istotne w mózgu, gdzie struktury takie jak aksony wymagają sygnałów naprowadzających od innych typów komórek, aby rozwijać się prawidłowo.
Rozwój mózgu w szczególności obejmuje zaprogramowaną serię zdarzeń proliferacji i migracji, co oznacza, że w zależności od czasu przeprowadzenia elektroporacji można celować w różne warstwy tkanki.
Wreszcie, dostępność różnych typów elektrod pozwala badaczom na dotarcie zarówno do obszarów położonych blisko powierzchni mózgu, jak i do obszarów głębszych. Elektrody płaskie stosuje się przy celowaniu w powierzchowne części mózgu, takie jak kora i hipokamp, natomiast mniejsze elektrody igłowe wykorzystuje się w przypadku struktur głębokich, takich jak wzgórze i podwzgórze.
Po omówieniu podstawowych zasad tej techniki, przygotujmy niezbędne materiały, aby móc przejść do procedury chirurgicznej oraz elektroporacji in utero.
Najpierw należy wysterylizować wszystkie instrumenty i przetrzeć obszar operacyjny 70% etanolem. Następnie należy przygotować roztwór do iniekcji, rozpuszczając plazmidowe DNA w sterylnym PBS zawierającym 0,1% Fast Green. Fast Green dodaje się w celu umożliwienia wizualizacji roztworu w embrionie. Na koniec, przy użyciu wyciągarki do igieł, należy przygotować ultracienką igłę, aby zminimalizować utratę płynu owodniowego i zapobiec w konsekwencji śmiertelności płodów.
Po przygotowaniu wszystkich elementów, omówimy podstawowe etapy elektroporacji tkanki mózgowej u rozwijających się gryzoni. Rozpocznij od znieczulenia ciężarnej samicy przy użyciu 5% isofluranu, a następnie przenieś ją do rurki respiratora podającej 2,25% isofluranu przez cały czas trwania procedury. Następnie, w celu przeciwbólowego leczenia pooperacyjnego, podaj podskórnie lek przeciwbólowy, taki jak buprenorfina. Następnie ogol brzuch i wysterylizuj miejsce nacięcia.
Aby chirurgicznie odsłonić macicę, wykonaj pionowe nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry i za pomocą nożyczek przetnij otrzewną. Aby zapobiec wysychaniu embrionów, zakryj otwór gazą nasączoną sterylną solą fizjologiczną. Następnie ostrożnie wyciągnij łańcuch embrionalny z jamy brzusznej, dbając o to, aby embriony pozostały wilgotne poprzez przykrywanie ich sterylną, podgrzaną solą fizjologiczną.
Używając mikroskopu sekcyjnego, zidentyfikuj embriony odpowiednio ułożone, aby zapewnić łatwy dostęp do mózgu. Stabilizując głowę embrionu palcami lub pęsetą, wstrzyknij roztwór DNA przez ścianę macicy bezpośrednio do mózgu. Umieść elektrodę po każdej stronie głowy, przy czym elektrodę dodatnią skieruj w stronę, w którą ma zostać przeprowadzona elektroporacja DNA. Po przeprowadzeniu elektroporacji wszystkich odpowiednio ułożonych embrionów, ostrożnie umieść róg macicy z powrotem w jamie brzusznej.
Przed zamknięciem nacięcia wprowadź do jamy 2 - 3 ml ciepłej soli fizjologicznej. Zszyj otrzewną za pomocą nici wchłanialnych, a następnie zamknij skórę za pomocą zszywek. Na koniec przenieś mysz do klatki z matą grzewczą i monitoruj jej stan.
Po omówieniu sposobu przeprowadzania elektroporacji in utero, przyjrzyjmy się niektórym dalszym zastosowaniom tej techniki.
Elektroporacja in utero jest użytecznym narzędziem do badania wpływu konkretnych genów na rozwój układu nerwowego. Elektroporowane konstrukty mogą prowadzić do nadekspresji białek typu dzikiego lub zmutowanych albo całkowicie blokować ekspresję białek. Fenotypy neurologiczne można następnie oceniać na poziomie mikroskopowym lub całego organizmu. Na przykład badacze ci ustalili, że przejściowa nadekspresja genu DISC-1, powiązanego z schizofrenią, w rozwijającym się mózgu myszy skutkowała nadwrażliwością na amfetaminę w późniejszym etapie życia.
Elektroporacja in utero może być również przydatna do wizualizacji konkretnych populacji komórek i tworzonych przez nie połączeń poprzez dostarczenie do tkanki nerwowej sekwencji kodujących białka fluorescencyjne. Na przykład badacze ci przeprowadzili elektroporację genu zielonego białka fluorescencyjnego do siatkówek w stadium E13.5, aby zbadać komórki zwojowe siatkówki (RGC), które przesyłają informacje wzrokowe z oka do mózgu. Badanie siatkówek w stadium E18.5 pokazuje, jak technika ta może być wykorzystana do śledzenia przebiegu aksonu RGC przez nerw wzrokowy, skrzyżowanie wzrokowe i droga wzrokowa.
Wreszcie, wiele istotnych zdarzeń w rozwoju układu nerwowego zachodzi po urodzeniu, co zainspirowało naukowców do opracowania zmodyfikowanej techniki zwanej elektroporacją in vivo. Procedura ta opiera się na tych samych podstawowych krokach co elektroporacja in utero, ale jest zazwyczaj wykonywana w ciągu pierwszych kilku dni po urodzeniu. Prenatalna manipulacja genetyczna jest szczególnie użyteczna w badaniu typów komórek powstających później, takich jak te znajdujące się w opisanym tutaj opuszkach węchowych.
Właśnie obejrzeli Państwo film JoVE na temat elektroporacji in utero. Film ten zawierał kluczowe zasady i podstawowy przegląd sposobu przeprowadzania elektroporacji in utero, a także kilka dalszych zastosowań, które pozwalają badaczom badać mechanizmy molekularne kierujące neurorozwojem.
Dziękujemy za oglądanie!
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Elektroporacja in utero jest kluczową techniką badania mechanizmów molekularnych sterujących neurorozwojem. Poprzez wstrzykiwanie DNA w celu zmiany ekspresji genów w konkretnych obszarach rozwijającego się mózgu gryzonia, badacze mogą analizować proliferację, różnicowanie, migrację i dojrzewanie komórek neuronalnych w ich naturalnym środowisku.
Niniejszy film przedstawi kluczowe zasady elektroporacji in utero, zapewni podstawowy przegląd sposobu wykonania tej techniki oraz omówi jej zastosowania w badaniach z zakresu neurobiologii.
Zanim przejdziemy do szczegółowego opisu procedury, omówmy najpierw zasady elektroporacji. Procedura ta wykorzystuje impulsy elektryczne, które tworzą przejściowe pory w błonach komórkowych, umożliwiając wniknięcie DNA do wnętrza komórki. Ponieważ ujemnie naładowane DNA przemieszcza się w stronę elektrody dodatniej, można celować w różne populacje komórek w zależności od ustawienia pola elektrycznego.
Choć elektroporację tradycyjnie stosowano w badaniach in vitro, postęp naukowy rozszerzył jej zastosowanie na nienaruszone organy, w tym te występujące w embrionach myszy rozwijających się in utero.
Elektroporacja in utero, w przeciwieństwie do hodowli komórkowych lub technik ex vivo, ma tę zaletę, że transfektowane komórki są nadal narażone na wszystkie sygnały fizjologiczne kierujące normalnym rozwojem. Jest to szczególnie istotne w mózgu, gdzie struktury takie jak aksony wymagają sygnałów naprowadzających od innych typów komórek, aby rozwijać się prawidłowo.
Rozwój mózgu w szczególności obejmuje zaprogramowaną serię zdarzeń proliferacji i migracji, co oznacza, że w zależności od czasu przeprowadzenia elektroporacji można celować w różne warstwy tkanki.
Wreszcie, dostępność różnych typów elektrod pozwala badaczom na dotarcie zarówno do obszarów położonych blisko powierzchni mózgu, jak i do obszarów głębszych. Elektrody płaskie stosuje się przy celowaniu w powierzchowne części mózgu, takie jak kora i hipokamp, natomiast mniejsze elektrody igłowe wykorzystuje się w przypadku struktur głębokich, takich jak wzgórze i podwzgórze.
Po omówieniu podstawowych zasad tej techniki, przygotujmy niezbędne materiały, aby móc przejść do procedury chirurgicznej oraz elektroporacji in utero.
Najpierw należy wysterylizować wszystkie instrumenty i przetrzeć obszar operacyjny 70% etanolem. Następnie należy przygotować roztwór do iniekcji, rozpuszczając plazmidowe DNA w sterylnym PBS zawierającym 0,1% Fast Green. Fast Green dodaje się w celu umożliwienia wizualizacji roztworu w embrionie. Na koniec, przy użyciu wyciągarki do igieł, należy przygotować ultracienką igłę, aby zminimalizować utratę płynu owodniowego i zapobiec w konsekwencji śmiertelności płodów.
Po przygotowaniu wszystkich elementów, omówimy podstawowe etapy elektroporacji tkanki mózgowej u rozwijających się gryzoni. Rozpocznij od znieczulenia ciężarnej samicy przy użyciu 5% isofluranu, a następnie przenieś ją do rurki respiratora podającej 2,25% isofluranu przez cały czas trwania procedury. Następnie, w celu przeciwbólowego leczenia pooperacyjnego, podaj podskórnie lek przeciwbólowy, taki jak buprenorfina. Następnie ogol brzuch i wysterylizuj miejsce nacięcia.
Aby chirurgicznie odsłonić macicę, wykonaj pionowe nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry i za pomocą nożyczek przetnij otrzewną. Aby zapobiec wysychaniu embrionów, zakryj otwór gazą nasączoną sterylną solą fizjologiczną. Następnie ostrożnie wyciągnij łańcuch embrionalny z jamy brzusznej, dbając o to, aby embriony pozostały wilgotne poprzez przykrywanie ich sterylną, podgrzaną solą fizjologiczną.
Używając mikroskopu sekcyjnego, zidentyfikuj embriony odpowiednio ułożone, aby zapewnić łatwy dostęp do mózgu. Stabilizując głowę embrionu palcami lub pęsetą, wstrzyknij roztwór DNA przez ścianę macicy bezpośrednio do mózgu. Umieść elektrodę po każdej stronie głowy, przy czym elektrodę dodatnią skieruj w stronę, w którą ma zostać przeprowadzona elektroporacja DNA. Po przeprowadzeniu elektroporacji wszystkich odpowiednio ułożonych embrionów, ostrożnie umieść róg macicy z powrotem w jamie brzusznej.
Przed zamknięciem nacięcia wprowadź do jamy 2 - 3 ml ciepłej soli fizjologicznej. Zszyj otrzewną za pomocą nici wchłanialnych, a następnie zamknij skórę za pomocą zszywek. Na koniec przenieś mysz do klatki z matą grzewczą i monitoruj jej stan.
Po omówieniu sposobu przeprowadzania elektroporacji in utero, przyjrzyjmy się niektórym dalszym zastosowaniom tej techniki.
Elektroporacja in utero jest użytecznym narzędziem do badania wpływu konkretnych genów na rozwój układu nerwowego. Elektroporowane konstrukty mogą prowadzić do nadekspresji białek typu dzikiego lub zmutowanych albo całkowicie blokować ekspresję białek. Fenotypy neurologiczne można następnie oceniać na poziomie mikroskopowym lub całego organizmu. Na przykład badacze ci ustalili, że przejściowa nadekspresja genu DISC-1, powiązanego z schizofrenią, w rozwijającym się mózgu myszy skutkowała nadwrażliwością na amfetaminę w późniejszym etapie życia.
Elektroporacja in utero może być również przydatna do wizualizacji konkretnych populacji komórek i tworzonych przez nie połączeń poprzez dostarczenie do tkanki nerwowej sekwencji kodujących białka fluorescencyjne. Na przykład badacze ci przeprowadzili elektroporację genu zielonego białka fluorescencyjnego do siatkówek w stadium E13.5, aby zbadać komórki zwojowe siatkówki (RGC), które przesyłają informacje wzrokowe z oka do mózgu. Badanie siatkówek w stadium E18.5 pokazuje, jak technika ta może być wykorzystana do śledzenia przebiegu aksonu RGC przez nerw wzrokowy, skrzyżowanie wzrokowe i droga wzrokowa.
Wreszcie, wiele istotnych zdarzeń w rozwoju układu nerwowego zachodzi po urodzeniu, co zainspirowało naukowców do opracowania zmodyfikowanej techniki zwanej elektroporacją in vivo. Procedura ta opiera się na tych samych podstawowych krokach co elektroporacja in utero, ale jest zazwyczaj wykonywana w ciągu pierwszych kilku dni po urodzeniu. Prenatalna manipulacja genetyczna jest szczególnie użyteczna w badaniu typów komórek powstających później, takich jak te znajdujące się w opisanym tutaj opuszkach węchowych.
Właśnie obejrzeli Państwo film JoVE na temat elektroporacji in utero. Film ten zawierał kluczowe zasady i podstawowy przegląd sposobu przeprowadzania elektroporacji in utero, a także kilka dalszych zastosowań, które pozwalają badaczom badać mechanizmy molekularne kierujące neurorozwojem.
Dziękujemy za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does electroporation create transient pores in cell membranes?
Electroporation uses electrical pulses to temporarily disrupt cell membranes, creating transient pores that allow DNA to enter cells. Since negatively charged DNA moves toward the positive electrode, researchers can target specific cell populations by positioning the electric field appropriately. This mechanism enables precise gene delivery to desired brain regions during development.
Q2: Why is in utero electroporation better than in vitro techniques for studying neural development?
In utero electroporation allows transfected cells to remain exposed to physiological cues that guide normal development, unlike cell culture or ex vivo techniques. This is particularly important in the brain, where structures such as axons require guidance cues from other cell types to develop properly. Studying cells in their natural environment provides more accurate insights into developmental mechanisms.
Q3: What is the purpose of Fast Green in the injection solution?
Fast Green is added to the plasmid DNA injection solution at 0.1% concentration to allow visualization of the injection solution within the embryo. This dye enables researchers to confirm accurate DNA delivery to the target brain region during the surgical procedure, ensuring successful transfection of the desired neural tissue.
Q4: How do paddle electrodes and needle electrodes differ in their applications?
Paddle electrodes target superficial brain regions such as the cortex and hippocampus, while smaller needle electrodes access deeper structures like the thalamus and hypothalamus. The choice of electrode type depends on the location of the target tissue within the developing brain, allowing researchers to deliver genes to specific neural populations based on their anatomical position.
Q5: What are the main applications of in utero electroporation in neurobiology research?
In utero electroporation enables investigation of how specific genes contribute to neural development by overexpressing wildtype or mutant proteins or blocking protein expression. Researchers can also visualize specific cell populations and their connections by delivering fluorescent protein sequences into neural tissue. Additionally, neurological phenotypes can be assessed at microscopic or organismal levels to understand gene function in development.
Q6: How does the timing of electroporation allow targeting of different neural cell populations?
Brain development involves a programmed series of proliferation and migration events, meaning different tissue layers can be targeted based on when electroporation is performed. By timing the procedure to coincide with specific developmental stages, researchers can selectively transfect neural progenitors, migrating neurons, or other cell types present at particular embryonic ages, enabling stage-specific genetic manipulation.
Q7: What is in vivo electroporation and how does it extend in utero electroporation research?
In vivo electroporation follows the same basic steps as in utero electroporation but is performed within the first few days after birth. This modified technique is particularly useful for studying later-born cell types, such as those found within the olfactory bulb, allowing researchers to investigate neural development events that occur after birth when in utero manipulation is no longer possible.