Zapisy fizjologiczne i sekwencjonowanie RNA wyrostków smakowych komara Aedes aegypti wywołującego żółtą febrę
30 grudnia 2014
Korzystając z dwóch metod do oszacowania ekspresji genów w głównych wyrostkach smakowych Aedes aegypti, zidentyfikowaliśmy zestaw genów przypuszczalnie leżących u podstaw reakcji neuronalnych na gorzkie i odpychające związki, zgodnie z badaniem elektrofizjologicznym.
Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja reakcji neuronów smakowych u owadów oraz pomiar ekspresji genów w tkankach smakowych. Osiąga się to poprzez uprzednie zarejestrowanie reakcji określonych włosków smakowych na kilka smaków w różnych stężeniach. Drugim krokiem jest dokładne wypreparowanie tkanek smakowych.
Następnie oddziel próbki według płci i wyrostka robaczkowego. Następnie wyizoluj całkowite RNA z każdej próbki tkanki i utwórz preparaty CD NA do sekwencjonowania nowej generacji i QPCR. Ostatnim krokiem jest analiza danych dotyczących ekspresji genów i sformułowanie hipotez, takich jak to, w jaki sposób ekspresja genów czuciowych chemos pośredniczy w fizjologicznych reakcjach na smaki owadów.
Ostatecznie zapisy elektrofizjologiczne służą do pokazania zakresu recepcyjnego owadziego układu smakowego, a sekwencjonowanie RNA tkanki smakowej służy do podkreślenia najważniejszych składników genetycznych odbioru smakowego. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tych metodach, będą miały trudności z powodu niewielkiego rozmiaru chemii owadów. Przydatki czuciowe.
Niezależnie od tego, czy przeprowadza się preparację, czy rejestrację z małych narządów owadów, praktyka u pacjentów jest kluczem do opanowania tych technik. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyciągnąć cienką elektrodę rejestrującą z cienką końcówką w ściągaczu do pipet ze szklaną kapilarą pod mikroskopem preparacyjnym. Ostrożnie oderwij końcówkę elektrody tak, aby jej otwór był wystarczająco szeroki, aby objąć docelowe centrum, ale wystarczająco mały, aby uniknąć kontaktu z sąsiednimi konstrukcjami.
Następnie znieczulenie dwóch do czterech dorosłych owadów w zamrażarce w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 20 sekund. Następnie unieruchamij jednego z owadów za pomocą szkiełka nakrywkowego z małymi paskami taśmy celofanowej. Pod mikroskopem.
Zidentyfikuj czujnik celu na podstawie jego morfologii i położenia, a następnie ustaw zwierzę tak, aby umożliwić swobodny dostęp do niego pod kątem wejścia elektrody. Następnie włóż drut wolframowy do jego grzbietowej klatki piersiowej. Aby służyła jako elektroda uziemiająca, napełnij elektrodę szklaną od końcówki interesującym Cię roztworem stymulującym.
Wytrząśnij pęcherzyki powietrza, przytrzymując końcówkę w dół. Włóż srebrny drut do elektrody, aby służył jako elektroda rejestrująca i stymulująca. Następnie podłącz elektrody do wzmacniacza wstępnego, co pozwala na skrócenie czasu ustalania w celu uchwycenia aktywności neuronalnej.
Przedwzmacniacz jest podłączony do komputera wyposażonego w oprogramowanie do nagrywania impulsów w celu zbierania, przechowywania i analizowania sygnałów elektrycznych. Teraz stymuluj centum roztworem kontrolnym, aby zapewnić jego funkcjonalność. Policz skoki rozpoczynające się 200 milisekund po artefakcie bodźca.
Aby uzyskać wyniki odpowiedzi na dawkę. Wystawić centum na rosnące stężenia eksperymentalnej substancji chemicznej i pozostawić co najmniej trzyminutowe przerwy między stymulacjami, aby zapewnić odpowiednią regenerację. W tej procedurze przygotuj płytką chłodnicę z suchym lodem.
W przypadku probówek do pobierania tkanek oznacz 1,5-mililitrowe probówki zatrzaskowe wolne od RNA do pobierania różnych rodzajów tkanek. Trzymaj rurki zamknięte, aby uniknąć nadmiernej kondensacji. Następnie znieczul od 30 do 40 komarów w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 15 do 30 sekund.
Następnie przenieś znieczulone komary do zimnego etapu i posortuj według płci. Odwróć owady grzbietową stroną do dołu, chwytając je za skrzydła, uważając, aby nie uszkodzić przydatków smakowych. Pod mikroskopem preparacyjnym przeanalizuj sparowaną etykietę Bella lub tarsi od samców lub samic, delikatnie chwytając komara, pro Bois tuż obok etykiety.
Bella z jedną parą kleszczyków, aby odsłonić wewnętrzny rysik i usunąć etykietę drugą parą kleszczyków. Następnie umieść tkankę w zimnej probówce do pobierania tkanki stępu. Delikatnie chwyć nogę komara na styku kości piszczelowej i pierwszego segmentu stępu i usuń stęp.
Następnie umieść chusteczkę w tubie oznaczonej na zimno. Obracaj probówki zbiorcze przez jedną minutę w wirówce o temperaturze zero stopni Celsjusza pod kątem 9 000 razy większej grawitacji, aby utrzymać tkankę na dnie probówki. Jeśli podczas preparacji w probówkach zbiorczych gromadzi się wilgoć, dodaj 50 mikrolitrów zimnego odczynnika triolowego, aby przykryć i chronić pobraną tkankę.
Zamroź probówki w 1,5-mililitrowym stojaku na probówki zawierającym ciekły azot. Następnie przygotuj ciasno dopasowane tłuczki wolne od RNA, schładzając je na suchym lodzie przed rozerwaniem tkanek. Następnie zmiel tkankę na drobny proszek i powtórz jeszcze raz.
Doprowadź całkowitą objętość triolu do jednego mililitra i zregeneruj. Zawieś zmieloną tkankę przez wirowanie. Następnie dodaj 200 mikrolitrów chloroformu do zmielonej tkanki i dokładnie wymieszaj.
Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej odwiruj go w wirówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 11 000 razy grawitacji przez 15 minut. Ostrożnie dodaj warstwę wodną bezpośrednio do kolumny filtrującej genomowe DNA. Następnie obracaj go w dół z prędkością 11 000 razy większą od grawitacji przez pięć minut.
Dodać równą objętość 70% etanolu wolnego od RNA do przepływu i wymieszać przez pipetowanie. Przenieś ciecz do kolumny zbierającej RNA i kontynuuj ekstrakcję RNA. Następnie określ ilościowo i oceń czystość całkowitego RNA na precyzyjnym spektrofotometrze i postępuj zgodnie z dowolną standardową metodą sekwencjonowania RNA.
Śladowe zapisy potencjałów czynnościowych z adiutatora E GTI degustatora wskazują na skuteczność bezpośredniej stymulacji za pomocą szeregu substancji chemicznych. Technika ta może być wykorzystana do ilościowego określenia reakcji na dowolną stymulującą substancję chemiczną poprzez zliczanie skoków o danej amplitudzie i czasie trwania w rozsądnym zakresie czasu krótszym niż 500 milisekund. Te trzy kolce odpowiadają trzem podtypom neuronów czuciowych o różnej wrażliwości.
Kontrpróby biologiczne dla zestawów danych RNA-Seq mogą być ograniczone ze względu na koszty lub trudności w pobieraniu tkanek. Q-R-T-P-C-R oferuje możliwość walidacji małych podzbiorów całkowitej ekspresji genów przy niższych kosztach i wymaga mniejszej ilości źródła. RNA pokazane w lewym panelu obok siebie to porównanie między względnym wyrażeniem określonym przez RN Aeq a względnym wyrażeniem określonym przez Q-R-T-P-C-R.
Te dwie metody opierają się na różnych substancjach chemicznych do szacowania obfitości genów. Funkcje równoważności statystycznej przedstawione graficznie w prawym panelu pokazują granice pewności w każdym przypadku. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak preparować tkankę owada w celu izolacji RNA i rejestrować sygnały neuronalne z włosków smakowych żywych owadów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje reakcje neuronów smakowych u Aedes aegypti na różne smaki oraz mierzy ekspresję genów w tkankach smakowych. Dzięki zastosowaniu technik elektrofizjologicznych badanie identyfikuje geny powiązane z odpowiedziami neuronalnymi na związki gorzkie i odpychające.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Entomologia
- Ekspresja genów
Wprowadzenie
- System smakowy u owadów odgrywa kluczową rolę w percepcji smaku.
- Aedes aegypti służy jako organizm modelowy do badania reakcji sensorycznych.
- Zrozumienie ekspresji genów może ujawnić mechanizmy percepcji smaku.
- Metody elektrofizjologiczne są niezbędne do pomiaru aktywności neuronalnej.
Cel badania
- Obserwacja odpowiedzi neuronów smakowych na różne związki smakowe.
- Pomiar ekspresji genów w tkankach smakowych Aedes aegypti.
- Sformułowanie hipotezy dotyczącej wpływu genów chemosensorycznych na reakcje fizjologiczne na smaki.
Zastosowane metody
- Rejestrowanie odpowiedzi włosków smakowych na różne smaki w różnych stężeniach.
- Disekcja tkanek smakowych i rozdzielenie próbek ze względu na płeć oraz przydatki.
- Izolacja całkowitego RNA z każdej próbki tkanki.
- Przygotowanie cDNA do sekwencjonowania nowej generacji oraz qPCR.
Główne wyniki
- Identyfikacja genów związanych z odpowiedziami neuronalnymi na związki gorzkie.
- Wgląd w podłoże genetyczne percepcji smaku u Aedes aegypti.
- Analiza danych potwierdza hipotezy dotyczące funkcji genów chemosensorycznych.
- Wyniki elektrofizjologiczne korelują z odkryciami dotyczącymi ekspresji genów.
Wnioski
- Badanie to pogłębia zrozumienie funkcji neuronów smakowych u owadów.
- Wyniki przyczyniają się do szerszej wiedzy z zakresu biologii sensorycznej.
- Przyszłe badania mogą zgłębić możliwości zastosowania tych odkryć w strategiach zwalczania szkodników.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie molekularnych podstaw percepcji chemosensorycznej u wektorów chorób, takich jak Aedes aegypti, umożliwia walidację celów dla opracowania nowych repelentów. Profilowanie elektrofizjologiczne i transkrypcyjne tkanek smakowych pozwala na mechanistyczne ograniczenie ryzyka poprzez powiązanie ekspresji genów z odpowiedziami behawioralnymi, takimi jak zaburzenie poszukiwania żywiciela. To zintegrowane podejście zwiększa pewność predykcyjną podczas przesiewania związków zakłócających szlaki sensoryczne komarów, co dostarcza informacji dla wczesnych strategii kontroli wektorów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Identyfikacja neuronów receptorowych smaku reagujących na DEET i chininę, co umożliwia badanie szlaków odczuwania goryczy u wektorów chorób.
- Wartość operacyjna: Dostarczenie zwalidowanego odczytu fizjologicznego do przesiewania związków modulujących chemosensoryczne neurony komarów.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Sekwencjonowanie RNA tkanek labella i tarsów ujawnia profile ekspresji genów chemorecepcji, co wspiera opracowywanie testów zgodnych z biomarkerami.
- Wartość operacyjna: Walidacja metodą qRT-PCR zapewnia powtarzalność i dokładność ilościową w porównaniach ekspresji genów między różnymi platformami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy ekspresję genów chemosensorycznych z percepcją repelentów, co umożliwia przesiewy celowane w kierunku zakłócania zachowań poszukiwania żywiciela.
- Wartość operacyjna: Pobieranie próbek z tkanek specyficznych (tarsy pro-, meso- i metatorakalne) wspiera skalowalne, stratyfikowane według płci modele przesiewowe.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta łączy wczesne odkrywanie celów terapeutycznych poprzez przesiewanie fenotypowe z walidacją przedkliniczną, wiążąc aktywność neuronalną z celami molekularnymi w tkankach chemosensorycznych.
- Biologia odkrywcza: Rejestracje elektrofizjologiczne umożliwiają weryfikację hipotez dotyczących wpływu związków na częstotliwość wyładowań i wrażliwość neuronów smakowych.
- Przesiewanie: Wyniki RNA-seq i qRT-PCR zapewniają standaryzowane, ilościowe odczyty ekspresji genów do oceny stopnia oddziaływania na cel molekularny.
- Analityka: Liczenie potencjałów czynnościowych (spike counting) oraz testy równoważności statystycznej pozwalają na porównanie odpowiedzi neuronalnych i ekspresji genów w różnych warunkach i metodach.
- Badania translacyjne: Walidacja genów chemosensorycznych wspiera dopasowanie biomarkerów w celu przewidywania skuteczności repelentów in vivo.
- Zastosowania w przemyśle: Połączony przepływ pracy obejmujący elektrofizjologię i transkryptomikę może być wykorzystywany u różnych gatunków owadów i w różnych bibliotekach chemicznych w celu minimalizacji ryzyka przy wyborze celów w zwalczaniu wektorów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Mechanistyczna redukcja ryzyka w badaniach nad celami repelentów poprzez bezpośrednią korelację aktywności neuronalnej i ekspresji genów.
- Wartość operacyjna: Zestandaryzowane protokoły sekcji tkanek, izolacji RNA i elektrofizjologii zapewniają powtarzalność wyników pomiędzy laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Umożliwia wczesne podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac nad kandydatami na repelenty poprzez walidację zaangażowania celu w odpowiednich tkankach chemosensorycznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację związków modyfikujących specyficzne szlaki receptorów smakowych powiązanych z zachowaniami poszukiwania żywiciela, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- W celu uzyskania wiarygodnych zapisów z włosków smakowych wymagane jest doświadczenie w zakresie elektrofizjologii owadów oraz preparowania tkanek pod mikroskopem.
- Do wysokiej jakości izolacji RNA z małych próbek tkanek niezbędny jest dostęp do sprzętu wolnego od RNaz, wirówek oraz spektrofotometru.
- Standaryzacja między zespołami wymaga spójnego określania płci tkanek, oddzielania wyrostków oraz przestrzegania łańcucha chłodniczego w celu zapobiegania degradacji RNA.
- Adaptacja metody do innych gatunków komarów lub tkanek może wymagać optymalizacji rozmieszczenia elektrod oraz technik preparowania ze względu na zmienność morfologiczną.
- Ograniczenia w liczbie powtórzeń biologicznych w RNA-seq wynikające z niedoboru tkanek można zniwelować poprzez walidację kluczowych celów za pomocą qRT-PCR, co zostało wykazane w badaniu.
