Name: Zapisy fizjologiczne i sekwencjonowanie RNA wyrostków smakowych komara Aedes aegypti wywołującego żółtą febrę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj metody elektrofizjologiczne i sekwencjonowania RNA do badania neuronów smakowych u Aedes aegypti. Techniki te pozwalają identyfikować geny odpowiedzialne za percepcję gorzkich związków chemicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Bryanowi T. Vinyardowi z USDA, Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Biometrical Consulting Service, Beltsville, MD za analizy statystyczne. Prace te były częściowo wspierane przez grant dla J.C.D. z programu badawczego Deployed War Fighter Protection (DWFP) finansowanego przez Departament Obrony za pośrednictwem Rady ds. Zwalczania Szkodników Sił Zbrojnych (AFPMB).

1. Hodowla dorosłych Ae. Aegypti
<ol>
	<li>Wykluwaj jaja w wodzie o głębokości około 3/4 cala na płytkiej tacy. Przeludnienie zmniejszy liczebność dorosłych.</li>
	<li>Tylne larwy w temperaturze 25 °C (12-hL:12-hD) i karmić się mielonym pokarmem dla ryb. 
	UWAGA: Przekarmienie może zmniejszyć przeżywalność.</li>
	<li>Poczwarki należy usuwać pojedynczo za pomocą pipety Pasteura codziennie i przenosić do plastikowych naczyń (9 cm × 5,5 cm) w małych pojemnikach z pokrywkami o drobnych oczkach, ustalając w ten sposób 24-godzinne grupy wiekowe.</li>
	<li>Dorosłe komary należy karmić 10% roztworem sacharozy za pomocą wacika umieszczonego na ściankach ekranu klatki trzymającej komary w komorze środowiskowej o temperaturze 27 °C i wilgotności względnej 70% w tym samym fotoperiodzie co larwy.</li>
	<li>Do elektrofizjologii użyj 5-10-dniowych zwierząt. Ogólnie rzecz biorąc, większe zwierzęta będą dawać lepsze wyniki. Do izolacji RNA należy użyć zwierząt, które znajdują się w jednej 24-godzinnej grupie wiekowej w wieku 5-10 dni.</li>
</ol>
2. Przygotowanie chemikaliów
<ol>
	<li>Określ odpowiednie stężenie elektrolitu (np. 1-10 mM), które wywołuje minimalną aktywność z wybranych neuronów czuciowych. 10 mM NaCl lub 1 mM KCl są rozsądnymi elektrolitami do testowania podstawowej aktywności na początku eksperymentu.</li>
	<li>Rozpuść każdą eksperymentalną substancję chemiczną w odpowiednim rozpuszczalniku (jeśli nie w wodzie, użyj etanolu lub DMSO), który ma niewielki lub żaden wpływ na aktywność kolców w porównaniu z samym elektrolitem. Końcowe stężenia 10% etanolu lub 1% DMSO są rozsądnymi stężeniami początkowymi.</li>
	<li>Wybierz odpowiednie (np. chininę w przypadku gorzkiego lub sacharozę w przypadku słodkiego) substancje chemiczne do kontroli, które są dobrze opisanymi środkami odstraszającymi lub stymulującymi odżywianie owadów.</li>
</ol>
3. Elektrofizjologia (nagranie końcówki8; Rysunek 1)
<ol>
	<li>Formuj szklane elektrody poprzez mechaniczne ciągnięcie szklanych kapilarn. Zoptymalizuj ustawienia ogrzewania i ciągnięcia, aby przyciągnąć szkło, aby utworzyć odpowiednio ukształtowane elektrody nagrywające. Ostrożnie odłamaj koniec szklanej elektrody za pomocą kleszczy pod mikroskopem preparacyjnym, aby utworzyć otwór końcówki elektrody, który jest wystarczająco szeroki, aby objąć czujnik celu, ale wystarczająco mały, aby uniknąć kontaktu z sąsiednimi strukturami.</li>
	<li>Pod mikroskopem zidentyfikuj wizualnie na podstawie morfologii i ustaw docelową sensillę/sensillum, aby zapewnić powtarzalność zapisu końcówki. Przygotuj zwierzęta tak, aby umożliwić swobodny dostęp do sensilli pod kątem wejścia elektrody.</li>
	<li>Dorosłe owady należy znieczulać na zimno w zamrażarce w temperaturze -20 °C. Unikać uszkodzenia neuronów obwodowych przez nadmierną ekspozycję na niskie temperatury. Wytnij wąskie paski taśmy celofanowej żyletką na szkiełku. Unieruchom całego owada na szklanej szkiełku za pomocą wąskich pasków.</li>
	<li>Włóż chemicznie zaostrzony drut wolframowy do grzbietowej klatki piersiowej lub oka, aby służył jako obojętna (masowa) elektroda.</li>
	<li>Napełnij szklaną elektrodę wykonaną w kroku 3.1 interesującym Cię roztworem stymulującym. Za pomocą włożonej strzykawki napełnij kapilatę od pociągniętego końca do końca. Wytrząśnij wszystkie pęcherzyki powietrza, przytrzymując ściągnięty koniec w dół. Włóż srebrny drut (opcjonalnie chlorkowany) do szklanej elektrody wykonanej w kroku 3.1, aby służył jako elektroda rejestrująca i stymulująca.</li>
	<li>Podłącz elektrody do przedwzmacniacza, który jest przeznaczony do nagrań z kontaktowej wrażliwości chemoreceptywnej u owadów. Ten przedwzmacniacz (filtr pasmowo-przepustowy 300 Hz-3 kHz) skróci czas stabilizacji, aby uchwycić aktywność neuronalną jak najbliżej wprowadzenia bodźca. Zbieraj, przechowuj i analizuj sygnały elektryczne za pomocą mikrokomputera wyposażonego w oprogramowanie do nagrywania impulsów. 
	UWAGA: Prawidłowe uziemienie zestawu nagrywania może drastycznie poprawić stosunek sygnału do szumu.</li>
	<li>Stymulować sensillę roztworem kontrolnym (tylko elektrolit), aby zapewnić funkcjonalność. Policz skoki rozpoczynające się 200 ms po artefakcie bodźca dla wszystkich przygotowań.</li>
	<li>Losowo określa kolejność badanych substancji chemicznych we wszystkich eksperymentach, z wyjątkiem badań dawka-odpowiedź, w celu wyeliminowania błędu systematycznego. W przypadku badań dawka-odpowiedź należy wystawić sensillę na działanie rosnących stężeń eksperymentalnej substancji chemicznej. Odczekaj co najmniej 3 minuty między stymulacjami, aby zapewnić odpowiednią regenerację. 
	UWAGA: To wymaganie może się różnić w zależności od owada i sensilli. Próg definiuje się jako stężenie, dla którego błąd standardowy nie pokrywa się z błędem standardowym dla najniższego badanego stężenia.</li>
</ol>
4. Izolacja i sekwencjonowanie RNA (Rysunek 2)
<ol>
	<li>Przygotuj ciasno dopasowane tłuczki wolne od RNAzy, schładzając je na suchym lodzie przed rozerwaniem tkanek. Przygotuj dołączone tłuczki wolne od RNaz, które ściśle przylegają do probówek z zatrzaskami. Probówki zbiorcze należy trzymać zamknięte, chyba że są aktywnie preparowane, aby uniknąć nadmiernej kondensacji.</li>
	<li>Za pomocą aspiratora z filtrem umieść od 30 do 40 znieczulonych na zimno komarów (15 sekund w zamrażarce w temperaturze -20 °C) na zimnym etapie i posortuj według płci. Ułóż zwierzęta grzbietem do dołu, chwytając skrzydła, aby nie uszkodzić przydatków smakowych.</li>
	<li>Używając dwóch par cienkich kleszczyków, wypreparuj sparowaną etykietę lub stęp od samców lub samic pod mikroskopem preparacyjnym i ogranicz włączenie sąsiednich tkanek. 
	UWAGA: 500 sparowanych labelli daje około 800-1,000 nanogramów całkowitego mRNA. 400 pojedynczych stępów (po 5 segmentów każdy) daje 1200-1800 nanogramów całkowitego mRNA.</li>
	<li>Za pomocą jednej pary kleszczy do łapania oddechu lekko chwyć trąbkę komara tuż proksymalnie do labelli, odsłaniając wewnętrzne stylety. Używając drugiej pary kleszczy do pobierania, usuń labellę i dodaj tkankę z boku zimnej probówki do pobierania opłat.</li>
	<li>Za pomocą jednej pary kleszczy lekko chwyć nogę komara na styku kości piszczelowej i pierwszego segmentu stępu. Używając drugiej pary kleszczy, usuń stęp i dodaj chusteczkę z boku rurki do pobierania zimnego pokarmu. 
	UWAGA: Weź pod uwagę typy komórek na styku tkanki pożądanej i niechcianej. Chociaż ważne jest, aby ograniczyć włączenie sąsiedniej tkanki, równie ważne jest, aby nie pomijać części pożądanej tkanki. Próbka końcowa musi dokładnie reprezentować cały narząd będący przedmiotem zainteresowania. Stwórz precyzyjną granicę za pomocą kleszczy chwytających, tak aby kleszcze do pobierania mogły się precyzyjnie uwolnić, skrobając lub chwytając tylko pożądaną tkankę.</li>
	<li>Okresowo odwirowywać probówkę zbiorczą w temperaturze 0 °C wirującej przy 9 000 x g, aby utrzymać tkankę na dnie probówki. Jeśli podczas sekcji w probówkach zbiorczych gromadzi się wilgoć, dodaj 50 ml zimnego odczynnika Trizol, aby pokryć pobraną tkankę.</li>
	<li>Używając markera laboratoryjnego zapobiegającego rozmazywaniu, wyraźnie oznacz jedną probówkę z zatrzaskiem o pojemności 1,5 ml bez RNaz dla każdego rodzaju tkanki do pobrania. Używając stojaka na probówki o pojemności 1,5 ml i ciekłego azotu, zamroź, a następnie zmiel tkankę na drobny proszek (drobne kawałki, jeśli są w Trizol). Powtórz raz. Doprowadzić całkowitą objętość Trizolu do 1 ml i ponownie zawiesić zmieloną tkankę poprzez wirowanie.</li>
	<li>Dodaj 200 ul chloroformu i dokładnie wymieszaj. Po 5 minutach w temperaturze pokojowej odwirować w wirówce w temperaturze 4 °C i 11 000 x g przez 15 minut. Ostrożnie dodaj warstwę wodną bezpośrednio do kolumny filtrującej genomowe DNA. Wirować z prędkością 11 000 x g przez 5 minut. Dodać równą objętość 70% etanolu wolnego od RNaz do przepływu i wymieszać pipetą. Przenieś ciecz do kolumny zbierającej RNA i kontynuuj ekstrakcję RNA zgodnie z dostarczonymi instrukcjami.</li>
	<li>Określ ilościowo i oceń czystość całkowitego RNA na precyzyjnym spektrofotometrze i postępuj zgodnie z dowolną standardową metodą sekwencjonowania RNA.</li>
</ol>
5. Ilościowa walidacja sekwencjonowania RNA metodą RT-PCR (Rysunek 3)
<ol>
	<li>Wybierz jak najwięcej genów, aby porównać względne poziomy ekspresji genów w zakresie dynamicznym, zarówno pod względem przewidywanej obfitości sekwencji, jak i przypuszczalnej funkcji genu chemosensorycznego.</li>
	<li>Zaprojektuj pary starterów dla każdego genu docelowego, aby amplifikować określony produkt PCR o parach zasad 100-180. Wyklucz niespecyficzną amplifikację gDNA, upewniając się, że co najmniej jeden starter na zestaw obejmuje granicę intronów. Alternatywnie należy zastosować leczenie DNazą w celu zmniejszenia zanieczyszczenia genomu.</li>
	<li>Zbierz tkankę owada zgodnie z opisem w poprzednim rozdziale. Oblicz, ile tkanki jest potrzebne, aby dostarczyć wystarczającą ilość RNA do zakończenia wszystkich reakcji qRT-PCR. 
	UWAGA: Biologiczne reakcje potrójne i techniczne potrójne zapewnią maksymalną pewność wyników.</li>
	<li>Oblicz względną kwantyfikację genu jakoX target-(Ct[target]-Ct[reference]) dla każdego genu docelowego i średnią dla każdej kontrpróby, zarówno biologiczną, jak i techniczną. Użyj genów porządkowych, aby znormalizować wartości Ct między powtórzeniami biologicznymi i ukorzenić skalę osi Y w porównaniach ekspresji względnej.</li>
	<li>Oceń podobieństwo zestawów danych RNA-seq i qRT-PCR za pomocą opartej na regresji, procedury równoważności bootstrap9, iteracyjnej stosowanej, do danych z każdej tkanki. 
	UWAGA: Ta procedura identyfikuje najmniejszy "region podobieństwa", który można skonstruować na podstawie obserwowanych danych sekwencyjnych RNA i qRT-PCR, i pozwala na uznanie względnej ekspresji genu mierzonej za pomocą qRT-PCR za statystycznie równoważną pomiarowi względnej ekspresji genów za sekwencję RNA.</li>
</ol>

<ol><li>Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repellent+and+deterrent+effects+of+SS220%2C+picaridin%2C+and+DEET+suppress+human+blood+feeding+by+Aedes+aegypti%2C+Anopheles+stephensi%2C+and+Phlebotomus+papatasi%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi.</a> J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).</li>
<li>Dickens, J. C., Bohbot, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini+review%3A+Mode+of+action+of+mosquito+repellents.Pestic%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic.</a> Biochem. Physiol. 106 (3), 149-155 (2013).</li>
<li>Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+chemosensory+appendages+in+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae+reveals+tissue-+and+sex-specific+signatures+of+odor+coding%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding.</a> BMC Genomics. 12 (271), (2011).</li>
<li>Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+and+transcriptomic+analysis+of+chemosensory+receptors+in+a+pair+of+divergent+ant+species+reveals+sex-specific+signatures+of+odor+coding%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genet%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding.</a> PLOS Genet. 8 (8), e1002930(2012).</li>
<li>Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+adult+Drosophila+antenna+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Studies%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing.</a> Zoological Studies. 52 (42), (2013).</li>
<li>Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., Rützler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+the+Aedes+aegypti+odorant+receptor+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family.</a> Insect Mol. Biol. 16 (5), 525-537 (2007).</li>
<li>Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odour+receptors+and+neurons+for+DEET+and+new+insect+repellents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents.</a> Nature. 502 (7472), 507-512 (2013).</li>
<li>Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+of+a+primary+chemoreceptor+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The physiology of a primary chemoreceptor unit.</a> Science. 122 (3166), 417-418 (1955).</li>
<li>Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regression-based+equivalence+test+for+model+validation%3A+shifting+the+burden+of+proof%5BTitle%5D)+AND+%22Tree+Physiol%22%5BJournal%5D)">A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof.</a> Tree Physiol. 25 (7), 903-913 (2005).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq.</a> Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).</li>
<li>Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).</li>
<li>Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+receptor+neuron+responds+to+DEET+and+other+insect+repellents+in+the+yellow-fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwiss%22%5BJournal%5D)">Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Naturwiss. 100 (3), 269-273 (2013).</li>
<li>Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+receptor+expression+in+the+labella+and+tarsi+of+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (12), 1161-1171 (2013).</li>
<li>Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gr+family+of+candidate+gustatory+and+olfactory+receptors+in+the+yellow-fever+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti.</a> Chem. Senses. 33 (1), 79-93 (2008).</li>
<li>Ramsköld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+abundance+of+ubiquitously+expressed+genes+revealed+by+tissue+transcriptome+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data.</a> PLoS Comput. Biol. 5 (12), e1000598(2009).</li>
<li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+based+criterion+for+gene+expression+calls+using+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Theory+Biosci%22%5BJournal%5D)">A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data.</a> Theory Biosci. 132 (3), 159-164 (2013).</li>
<li>Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+active+genes+in+deep+RNA-seq+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies.</a> BMC Genomics. 14 (778), (2013).</li>
<li>Isono, K., Morita, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+designs+of+insect+taste+receptor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cellu.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular designs of insect taste receptor system.</a> Front. Cellu. Neurosci. 4 (20), 1-16 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najtrudniejszym aspektem rejestrowania potencjałów czynnościowych z zmysłów smakowych jest ustalenie, które reakcje są "normalne". W przypadku zastosowania rejestracji pojedynczej końcówki zmysłu smakowego po raz pierwszy dla danego gatunku owadów, całkowita liczba i czułość neuronów receptora smakowego (GRN) jest prawdopodobnie nieznana. Wiele wstępnych zapisów jest wymaganych w pierwszej kolejności, aby zdecydować o zakresie i stężeniach substancji chemicznych do testowania. W tym przypadku zaczęliśmy od obserwacji, że...

Wykazano, że związki takie jak DEET, Picaridin, Citronellal i IR3535 skutecznie odstraszają komary, w tym ważny wektor choroby Aedes aegypti1,2. Rejestrujemy potencjały czynnościowe z neuronów czuciowych związanych ze specyficzną zmysłowością smakową, aby określić komórki zaangażowane w odstraszanie komarów. W połączeniu z dalszym sekwencjonowaniem ekspresji genów w tych tkankach, możemy zidentyfikować geny, które najprawdopodobniej pośredniczą w odpowiedziach tych komórek w celu zbadania nowych związków w celu poprawy zdolności odstraszania.
RNA-seq to potężne narzędzie, szybko stając się standardem do śledzenia czasowych i przestrzennych zmian w ekspresji genów. Analizy sekwencyjne RNA chemosensorycznych przydatków i narządów owadów wykorzystano do odkrycia receptorów molekularnych u kilku gatunków owadów3-5, znacznie poprawiając konwencjonalne wyszukiwanie oparte na PCR gen po genie6. Owady reprezentują najbardziej zróżnicowaną klasę zwierząt, stwarzając wiele możliwości badania powiązań między genami a unikalnymi fenotypami. Technologia sekwencjonowania RNA może być stosowana na każdej żywej tkance owada. Podobnie, zapis elektrofizjologiczny z komórek czuciowych w obrębie jednoporowatej zmysłu smakowego można uzyskać u wielu różnych gatunków owadów. Połączenie tych dwóch technik pozwala naukowcom zawęzić zestaw genów zaangażowanych w obserwowany fenotyp chemosensoryczny. Różne gatunki będą stanowić specyficzne wyzwania, ale mogą informować o związku między genami receptorów chemosensorycznych a adaptacją chemosensoryczną. Wielkość i morfologia czubek sensorycznych jest zmienna i może wymagać obszernego rozwiązywania problemów podczas rejestrowania potencjałów czynnościowych w celu redukcji szumu i identyfikacji powtarzalnych sygnałów. Sekcje narządów chemosensorycznych mogą być trywialne lub delikatne i czasochłonne, w zależności od morfologii i wielkości owada. Odzyskiwanie wysokiej jakości RNA może również wymagać pewnych rozwiązań problemowych, takich jak unikanie niektórych pigmentów podczas pobierania tkanek.
Podczas gdy demonstrowanie działania związków odstraszających poprzez próby behawioralne jest bezpośrednie i pouczające, to podejście jest czasochłonne i szerokie w odniesieniu do mechanizmu działania. Elektrofizjologia w połączeniu z sekwencją RNA pozwala na bardziej szczegółowe analizy tego, co kieruje zachowaniami unikającymi u owadów. Po zidentyfikowaniu "zestawu narzędzi" dyskryminacji chemicznej u danego gatunku owadów możliwe są bardziej szczegółowe próby ulepszenia znanych repelentów. Receptory i związane z nimi białka w komórkach czuciowych odpowiedzialne za te zachowania mogą być wyrażane heterologicznie w celu bezpośredniego badania chemicznego. Co więcej, modelowanie molekularne może przewidzieć, które substancje chemiczne wywołają silne reakcje tych receptorów7.
Migawka wszystkich aktywnych genów w wąskim zestawie tkanek chemosensorycznych może być również przydatna do identyfikacji podobnych genów u innych gatunków. Korzystając z homologii sekwencji i podobieństw ekspresji, naukowcy mogą tworzyć zestawy receptorów molekularnych, które najprawdopodobniej pośredniczą w reakcjach na repelenty, które są szeroko skuteczne w przypadku owadów. Przedstawiamy następujący protokół, aby pomóc naukowcom w dekonstrukcji szlaków chemosensorycznych owadów i przekonać więcej osób do zagłębienia się w neuroetologię owadów niemodelowych i ważnych gospodarczo.

<table><tbody><tr><td>Kapilara szklana</td><td>A-M Systems</td><td>628000</td><td>Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4"</td></tr><tr><td>Srebrny drut</td><td>A-M Systems</td><td>7875.015</td><td>" goły</td></tr><tr><td>drut wolframowy</td><td>Alfa Products</td><td>369</td><td>o średnicy 0,127 mm</td></tr><tr><td>Kleszcze drobnoziarniste</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252</td><td>#5SF Inox</td></tr><tr><td>Etap lodówkowy</td><td>BioQuip Products</td><td>1429</td><td>Chill Przedwzmacniacz stołowy</td></tr><tr><td></td><td>Syntech</td><td>Taste Probe</td><td>przedwzmacniacz</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do elektrofizjologii</td><td>Oprogramowanie Syntech</td><td>Autospike</td><td>do elektrofizjologii</td></tr><tr><td>Karma dla ryb TetraMin</td><td>Tetra</td><td>Tropical karma dla ryb granulki</td><td>pokarm dla ryb mielony na drobny proszek</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>Odczynnik do izolacji RNA</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74136</td><td>zawiera eliminator gDNA i kolumny wirujące RNeasy</td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nano</td><td>Drop Products</td><td>Spektrometr stołowy</td><td>ND-1000</td></tr><tr><td>Darmowe oprogramowanie do statystyk R</td><td>(stworzone przez Roberta Gentlemana i Rossa Ihakę)</td><td>www.r-project.org</td><td>Użyj funkcji lm pakietu stats i funkcji equiv.boot pakietu równoważności w środowisku obliczeniowym R.</td></tr><tr><td>Stojak na probówki 1,5 ml</td><td>Evergreen</td><td>240-6388-030</td><td>Wlej ciekły azot do kilku pustych studzienek, aby zamrozić i zmielić tkankę.</td></tr><tr><td>Probówki zbiorcze o pojemności 1,5 ml z tłuczkiem</td><td>Grainger</td><td>6HAX6</td><td>Wirówka bez RNaz</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>11178160</td><td>Zawiruj zamrożoną tkankę, aby trzymać ją na dnie probówki o pojemności 1,5 ml.</td></tr><tr><td>Primer-BLAST Narzędzie do projektowania podkładów</td><td>NCBI</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

zapisy fizjologiczne i sekwencjonowanie rna wyrostków smakowych komara aedes aegypti wywołującego żółtą febrę

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Elektrofizjologiczny zapis potencjałów czynnościowych z neuronów czuciowych komarów daje badaczom wgląd w chemiczną percepcję tych wektorów chorób. Niedawno zidentyfikowaliśmy neuron wyczuwający gorycz w labellum samicy Aedes aegypti, który reaguje na DEET i inne repelenty, a także gorzką chininę, poprzez bezpośrednie badania elektrofizjologiczne. Te odpowiedzi neuronów receptora smakowego skłoniły nas do sekwencjonowania całkowitego mRNA zarówno z męskich, jak i żeńskich próbek labella i stępu, aby wyjaśnić przypuszczalne geny chemorecepcji ulegające ekspresji w tych kontaktowych tkankach chemorecepcji. Próbki stępu podzielono na podtypy pro-, mezo- i śródpiersiowe dla obu płci. Następnie zweryfikowaliśmy nasz zestaw danych, przeprowadzając qRT-PCR na tych samych próbkach tkanek i zastosowaliśmy metody statystyczne do porównania wyników między tymi dwiema metodami. Badania nad funkcjami molekularnymi mogą teraz koncentrować się na konkretnych genach, aby określić te zaangażowane w postrzeganie środków odstraszających przez komary. Te szlaki receptorowe mogą być wykorzystywane do badań przesiewowych nowych repelentów w kierunku zakłócenia zachowań związanych z poszukiwaniem żywiciela w celu ograniczenia rozprzestrzeniania się szkodliwych wirusów.

Zapisy śladów potencjałów czynnościowych z sensilli smakowych Ae. aegypti (Rysunek 1) demonstrują skuteczność bezpośredniej stymulacji różnymi substancjami chemicznymi. Technikę tę można wykorzystać do ilościowego określenia odpowiedzi na dowolny związek stymulujący poprzez zliczanie impulsów o określonej amplitudzie i czasie trwania w odpowiednim przedziale czasowym (zazwyczaj krótszym niż 500 ms). Zapisy śladów muszą być łatwo powtarzalne w danym zestawie warunków eksperymentalnych. W przeciwn...

Korzystając z dwóch metod do oszacowania ekspresji genów w głównych wyrostkach smakowych Aedes aegypti, zidentyfikowaliśmy zestaw genów przypuszczalnie leżących u podstaw reakcji neuronalnych na gorzkie i odpychające związki, zgodnie z badaniem elektrofizjologicznym.

Zapisy fizjologiczne i sekwencjonowanie RNA wyrostków smakowych komara Aedes aegypti wywołującego żółtą febrę

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja reakcji neuronów smakowych u owadów oraz pomiar ekspresji genów w tkankach smakowych. Osiąga się to poprzez uprzednie zarejestrowanie reakcji określonych włosków smakowych na kilka smaków w różnych stężeniach. Drugim krokiem jest dokładne wypreparowanie tkanek smakowych.Następnie oddziel próbki według płci i wyrostka robaczkowego. Następnie wyizoluj całkowite RNA z każdej próbki tkanki i utwórz preparaty CD NA do sekwencjonowania nowej generacji i QPCR. Ostatnim krokiem jest analiza danych dotyczących ekspresji genów i sformułowanie hipotez, takich jak to, w jaki sposób ekspresja genów czuciowych chemos pośredniczy w fizjologicznych reakcjach na smaki owadów.Ostatecznie zapisy elektrofizjologiczne służą do pokazania zakresu recepcyjnego owadziego układu smakowego, a sekwencjonowanie RNA tkanki smakowej służy do podkreślenia najważniejszych składników genetycznych odbioru smakowego. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tych metodach, będą miały trudności z powodu niewielkiego rozmiaru chemii owadów. Przydatki czuciowe.Niezależnie od tego, czy przeprowadza się preparację, czy rejestrację z małych narządów owadów, praktyka u pacjentów jest kluczem do opanowania tych technik. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyciągnąć cienką elektrodę rejestrującą z cienką końcówką w ściągaczu do pipet ze szklaną kapilarą pod mikroskopem preparacyjnym. Ostrożnie oderwij końcówkę elektrody tak, aby jej otwór był wystarczająco szeroki, aby objąć docelowe centrum, ale wystarczająco mały, aby uniknąć kontaktu z sąsiednimi konstrukcjami.Następnie znieczulenie dwóch do czterech dorosłych owadów w zamrażarce w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 20 sekund. Następnie unieruchamij jednego z owadów za pomocą szkiełka nakrywkowego z małymi paskami taśmy celofanowej. Pod mikroskopem.Zidentyfikuj czujnik celu na podstawie jego morfologii i położenia, a następnie ustaw zwierzę tak, aby umożliwić swobodny dostęp do niego pod kątem wejścia elektrody. Następnie włóż drut wolframowy do jego grzbietowej klatki piersiowej. Aby służyła jako elektroda uziemiająca, napełnij elektrodę szklaną od końcówki interesującym Cię roztworem stymulującym.Wytrząśnij pęcherzyki powietrza, przytrzymując końcówkę w dół. Włóż srebrny drut do elektrody, aby służył jako elektroda rejestrująca i stymulująca. Następnie podłącz elektrody do wzmacniacza wstępnego, co pozwala na skrócenie czasu ustalania w celu uchwycenia aktywności neuronalnej.Przedwzmacniacz jest podłączony do komputera wyposażonego w oprogramowanie do nagrywania impulsów w celu zbierania, przechowywania i analizowania sygnałów elektrycznych. Teraz stymuluj centum roztworem kontrolnym, aby zapewnić jego funkcjonalność. Policz skoki rozpoczynające się 200 milisekund po artefakcie bodźca.Aby uzyskać wyniki odpowiedzi na dawkę. Wystawić centum na rosnące stężenia eksperymentalnej substancji chemicznej i pozostawić co najmniej trzyminutowe przerwy między stymulacjami, aby zapewnić odpowiednią regenerację. W tej procedurze przygotuj płytką chłodnicę z suchym lodem.W przypadku probówek do pobierania tkanek oznacz 1,5-mililitrowe probówki zatrzaskowe wolne od RNA do pobierania różnych rodzajów tkanek. Trzymaj rurki zamknięte, aby uniknąć nadmiernej kondensacji. Następnie znieczul od 30 do 40 komarów w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 15 do 30 sekund.Następnie przenieś znieczulone komary do zimnego etapu i posortuj według płci. Odwróć owady grzbietową stroną do dołu, chwytając je za skrzydła, uważając, aby nie uszkodzić przydatków smakowych. Pod mikroskopem preparacyjnym przeanalizuj sparowaną etykietę Bella lub tarsi od samców lub samic, delikatnie chwytając komara, pro Bois tuż obok etykiety.Bella z jedną parą kleszczyków, aby odsłonić wewnętrzny rysik i usunąć etykietę drugą parą kleszczyków. Następnie umieść tkankę w zimnej probówce do pobierania tkanki stępu. Delikatnie chwyć nogę komara na styku kości piszczelowej i pierwszego segmentu stępu i usuń stęp.Następnie umieść chusteczkę w tubie oznaczonej na zimno. Obracaj probówki zbiorcze przez jedną minutę w wirówce o temperaturze zero stopni Celsjusza pod kątem 9 000 razy większej grawitacji, aby utrzymać tkankę na dnie probówki. Jeśli podczas preparacji w probówkach zbiorczych gromadzi się wilgoć, dodaj 50 mikrolitrów zimnego odczynnika triolowego, aby przykryć i chronić pobraną tkankę.Zamroź probówki w 1,5-mililitrowym stojaku na probówki zawierającym ciekły azot. Następnie przygotuj ciasno dopasowane tłuczki wolne od RNA, schładzając je na suchym lodzie przed rozerwaniem tkanek. Następnie zmiel tkankę na drobny proszek i powtórz jeszcze raz.Doprowadź całkowitą objętość triolu do jednego mililitra i zregeneruj. Zawieś zmieloną tkankę przez wirowanie. Następnie dodaj 200 mikrolitrów chloroformu do zmielonej tkanki i dokładnie wymieszaj.Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej odwiruj go w wirówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 11 000 razy grawitacji przez 15 minut. Ostrożnie dodaj warstwę wodną bezpośrednio do kolumny filtrującej genomowe DNA. Następnie obracaj go w dół z prędkością 11 000 razy większą od grawitacji przez pięć minut.Dodać równą objętość 70% etanolu wolnego od RNA do przepływu i wymieszać przez pipetowanie. Przenieś ciecz do kolumny zbierającej RNA i kontynuuj ekstrakcję RNA. Następnie określ ilościowo i oceń czystość całkowitego RNA na precyzyjnym spektrofotometrze i postępuj zgodnie z dowolną standardową metodą sekwencjonowania RNA.Śladowe zapisy potencjałów czynnościowych z adiutatora E GTI degustatora wskazują na skuteczność bezpośredniej stymulacji za pomocą szeregu substancji chemicznych. Technika ta może być wykorzystana do ilościowego określenia reakcji na dowolną stymulującą substancję chemiczną poprzez zliczanie skoków o danej amplitudzie i czasie trwania w rozsądnym zakresie czasu krótszym niż 500 milisekund. Te trzy kolce odpowiadają trzem podtypom neuronów czuciowych o różnej wrażliwości.Kontrpróby biologiczne dla zestawów danych RNA-Seq mogą być ograniczone ze względu na koszty lub trudności w pobieraniu tkanek. Q-R-T-P-C-R oferuje możliwość walidacji małych podzbiorów całkowitej ekspresji genów przy niższych kosztach i wymaga mniejszej ilości źródła. RNA pokazane w lewym panelu obok siebie to porównanie między względnym wyrażeniem określonym przez RN Aeq a względnym wyrażeniem określonym przez Q-R-T-P-C-R.Te dwie metody opierają się na różnych substancjach chemicznych do szacowania obfitości genów. Funkcje równoważności statystycznej przedstawione graficznie w prawym panelu pokazują granice pewności w każdym przypadku. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak preparować tkankę owada w celu izolacji RNA i rejestrować sygnały neuronalne z włosków smakowych żywych owadów.

physiological-recordings-rna-sequencing-gustatory-appendages-yellow

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Reakcje elektrofizjologiczne neuronów sensorycznych węchu na odoranty u owadów można mierzyć za pomocą rejestracji z pojedynczych sensyli. W tym artykule wideo zademonstrujemy, jak przeprowadzić rejestrację z pojedynczych sensyli w czułkach muszki owocowej (Drosophila melanogaster) oraz w palpach szczękowych komara malarycznego (Anopheles gambiae).

Rejestracja z pojedynczych sensyli u owadów Drosophila melanogaster oraz Anopheles gambiae

Opisano uproszczoną, a zarazem dokładną metodę pobierania i barwienia hemocytów komarów. Nasza metoda łączy prostotę perfuzji z precyzją technik wysokociśnieniowych w celu wyizolowania czystych preparatów hemocytów u komarów z rodzaju Aedes. Metoda ta ułatwia badania wymagające wiedzy na temat typów hemocytów oraz ich liczebności.

Protokół pobierania i barwienia hemocytów z komarów żółtej febry Aedes aegypti

Analizy RNA-Seq stają się coraz ważniejsze dla identyfikacji molekularnych podstaw cech adaptacyjnych w organizmach niemodelowych. W tym miejscu opisano protokół identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji między komarami Aedes albopictus z diapauzą i bez diapauzy, od hodowli komarów po sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne danych RNA-Seq.

Eksperymentalny i bioinformatyczny protokół do analiz sekwencyjnych RNA diapauzy fotoperiodycznej u azjatyckiego komara tygrysiego, Aedes albopictus

Ciało tłuszczowe jest centralnym organem metabolicznym u owadów. Przedstawiamy system hodowli narządów na żywo, który umożliwia użytkownikowi badanie reakcji izolowanej tkanki tłuszczowej na różne bodźce.

System hodowli narządów tłuszczowych u Aedes aegypti, wektora wirusa Zika

Dla efektywnej kontroli przenoszenia wirusów przenoszonych przez komary, szczególnie interesująca jest wiedza na temat potencjału wektorowego poszczególnych komarów. Opisujemy wymuszone ślinotok jako metodę analizy kompetencji wektorowych Aedes albopictus i trzech różnych taksonów Culex pod kątem przenoszenia wirusa Zika.

Wymuszone wydzielanie śliny jako metoda analizy kompetencji wektorowych komarów

Celem tego protokołu jest dostarczanie komarom Aedes aegypti pokarmów pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków z krwi za pomocą sztucznego karmnika membranowego i precyzyjne określenie ilościowe ilości spożytego posiłku.

Karmienie i ilościowe oznaczanie krwi pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków u komarów Aedes aegypti

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje krok po kroku protokół udanych i nisko stosowanych elektroantennogramów u kilku rodzajów komarów, w tym zarówno u samic, jak i u samców.

Przewodnik krok po kroku po elektroantennografii komarów

Doustne podawanie dsRNA wytwarzanego przez bakterie, metoda dostarczania interferencji RNA (RNAi), która jest rutynowo stosowana u Caenorhabditis elegans, została tutaj z powodzeniem zastosowana u dorosłych komarów. Nasza metoda pozwala na rzetelne badania genetyki odwrotnej i badania wektorów blokujących transmisję bez użycia iniekcji.

Skuteczne doustne podawanie RNA interferencji (RNAi) dorosłym komarom z rodzaju Anopheles gambiae

Opisano procedury badania zachowań komarów Culex tarsalis na ludzkich rękach za pomocą elektropenetracji AC-DC.

Elektropenetrografia AC-DC do badania zachowań sondujących i połykanych komarów Culex tarsalis na ludzkich rękach

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół edycji genomu poprzez mikroiniekcję embrionalną u komara A. aegypti przy użyciu technologii CRISPR-Cas9.

Edycja genomu u komara Aedes aegypti z żółtą febrą przy użyciu CRISPR-Cas9

Poznaj metody elektrofizjologiczne i sekwencjonowania RNA do badania neuronów smakowych u Aedes aegypti. Techniki te pozwalają identyfikować geny odpowiedzialne za percepcję gorzkich związków chemicznych.

Zapisy fizjologiczne i sekwencjonowanie RNA wyrostków smakowych komara Aedes aegypti wywołującego żółtą febrę

Przeglądaj więcej filmów