Izolowanie wzmocnionych wariantów Hsp104 przy użyciu modeli proteinopatii drożdżowej

Celem poniższego eksperymentu jest badanie przesiewowe bibliotek HS P 1 0 4 pod kątem wyboru wariantów, które hamują toksyczność białek związanych z zaburzeniami nieprawidłowego fałdowania białek. Osiąga się to poprzez kotransformację bibliotek wariantów HSP 1, 0, 4 z substratem związanym z chorobą w drożdżach i coex eksprymującym te dwa białka w drugim etapie. Wybrane drożdże traktuje się pięcioma kwasami fluorowymi lub pięcioma FOA w celu kontrselekcji plazmidu HSP 1 0 4.

Następnie trafienia są sekwencjonowane poprzez amplifikację regionu mutagenu przez PCR kolonii lub identyfikację mutacji w genie HSP 1 0 4. Ostatecznie, tłumienie toksyczności substratu związanego z chorobą można ocenić w celu zidentyfikowania wariantów HS P 1 0 4, które są najbardziej obiecujące do dalszej charakterystyki. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak selekcja oparta na wiązaniach, jest to, że technika ta pozwala na wybór wariantów, które tłumią toksyczność substratu związanego z chorobą.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fałdowania białek poprzez identyfikację białek, które mogą odwrócić nieprawidłowe fałdowanie białek. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w nasilenie HS P 1 0 4, może być również stosowana do bibliotek przesiewowych dowolnego białka w celu tłumienia toksyczności dowolnego substratu, który jest toksyczny w drożdżach. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ wiele kolonii może wymagać badań przesiewowych w celu znalezienia prawidłowych trafień Aby przeprowadzić badanie przesiewowe pod kątem tłumienia toksyczności protei, zacznij od zmycia HSP 1 0 4 kolonii z płytek za pomocą pożywki dropout uzupełnionej rafinozą, pipety serologicznej i sterylnego drewna, a aplikatory przenoszą płynne płuczki do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i dokładnie wirują kolonie, aby oddzielić wszelkie grudki komórek.

Następnie rozcieńczyć zawiesinę komórkową do lekko mętnej kultury i hodować komórki przez noc w pożywce rafinozy, wstrząsając w temperaturze 30 stopni Celsjusza. W tym czasie również rozwijaj równolegle typ dziki HSP 1 0 4 i kontrolki wektorowe. Następnego porannego talerza, zakres stężeń komórek na poszczególnych płytkach galaktozy, aby wygenerować co najmniej jedną płytkę na grupę z pojedynczymi koloniami.

Znormalizuj wektor i kultury typu świata HSP 1 0 4 do OD 600 biblioteki i płyty. Równe objętości tych komórek do eksperymentalnych stężeń szczepów, aby porównać wzrost biblioteki w stosunku do kontroli w celu oceny selekcji. Rygorystyczność również nakłada bibliotekę na pożywki tłumiące glukozę, a następnie inkubuje wszystkie płytki przez dwa do trzech dni w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż kolonie wydają się używać pięciu FOA do selekcji komórek, które nie utrzymują już plazmidów eksprymujących HSP 1 0 4, a następnie usuwają pojedyncze kolonie z każdego szczepu w duplikacie na pożywkach z podwójnym i pojedynczym dropoutem na nocną inkubację w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Płytki te zostaną później wykorzystane do sekwencjonowania, aby zapobiec wysychaniu płytek. Owiń płyty SD Es Euro folią i zainstaluj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wykonując pięć ekranów FOA. Następnie przełóż kolonie z płytek syczących SD do pojedynczych kolonii na pięciu płytkach FOA przez jeden do dwóch dni inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż pojawią się pojedyncze kolonie. Następny.

Z każdych pięciu płytek FOA wybierz i smuga. Trzy rodziny, które przeżyły, na jednym SD Euro i jeden SD jego talerz na ocalałą kolonię po kolejnym jednym do dwóch dni inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Kolonie, które utraciły plazmid HSP 1 0 4, będą rosły na płytkach syczących SD, ale nie na płytkach SD Euro.

Hoduj te odmiany do nasycenia w pożywce rafinozowej w 96 roku. Głęboko zanurz dwie mililitrowe płytki przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsając. Następnie, aby wyeliminować wszelkie fałszywe alarmy, wykonaj test wykrywania.

Pod koniec inkubacji stosuje się wielokanałową pipetę do porcji 200 mikrolitrów pożywki rafinozowej na studzienkę do nowej płytki 96-dołkowej, rezerwując kolumny pierwszą i siódmą dla czystych kultur. Następnie porcjować 250 mikrolitrów każdej z 16 nasyconych kultur do kolumn pierwszej i siódmej płytki i seryjnie rozcieńczać kultury po pięć razy do każdej kolumny płytki, dokładnie mieszając pipetą wielokanałową. Następnie, aby zapewnić równomierne plamienie, usuń 50 mikrolitrów rozcieńczonej kultury z kolumny szóstej i 12, aby upewnić się, że końcowa objętość każdej studzienki wynosi 200 mikrolitrów.

Następnie użyj narzędzia do replikatora 96 V, aby wykryć kultury w duplikacie na płytkach syczących SD i eskalowych. Po dwu- lub trzydniowej inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza wybierz szczepy do sekwencjonowania, które wykazują toksyczność na płytkach syczących eskal. Podobnie jak w przypadku kontroli, szczepy fałszywie dodatnie, które nie są tak toksyczne, jak kontrole, które można odrzucić.

Odrzuć również szczepy, które wykazują wadę wzrostu na sd. Jego płytki lub które wykazują znacznie większą toksyczność niż sam substrat choroby. Aby zsekwencjonować warianty HSP 1, 0, 4 metodą PCR kolonii, najpierw zeskrob około 10 mikrolitrów drożdży z płytek Euro syczących SD do trzech mikrolitrów 20 miliwodorotlenku sodu w probówkach pozbawionych izolacji PCR, aby ułożyć komórki przez rozmrożenie.

Najpierw umieść paski w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po 10 minutach w zamrażarce inkubować probówki w temperaturze 99 stopni Celsjusza w termocyklerze przez 10 minut, a następnie rozcieńczyć szczepy do 100 mikrolitrów wodą klasy PCR przy użyciu wysokiego stężenia startera. Następnie uruchom standardowy program PCR na próbkach, a następnie przeanalizuj próbki za pomocą elektroforezy żelowej, aby potwierdzić amplifikację produktu A PCR o odpowiedniej wielkości.

Na koniec zsekwencjonuj produkty PCR, zwracając uwagę na dokładną analizę chromatogramów sekwencjonowania pod kątem mutacji. Mutacje można zaobserwować jako mieszaninę dwóch nukleotydów w danym miejscu, ponieważ drożdże często zawierają wiele plazmidów. W tym reprezentatywnym eksperymencie, po skonstruowaniu biblioteki wariantów HSP 1 0 4 losowo zrandomizowanych w środkowej domenie, biblioteka została przekształcona w drożdże zawierające plazmid do indukowanej galaktozą ekspresji TDP 43.

Transformanty zostały następnie odzyskane i posiane na płytkach z glukozą i galaktozą, aby ocenić rygorystyczność ekranu Trafienia zostały wybrane z płytki galaktozy. Po pięciu testach plamienia leczenia FOA podzbioru wariantów wybranych w początkowym badaniu przesiewowym. Wskazano, że z czterech wybranych kolonii, dwie wykazywały HSP 1 0 4, w którym pośredniczyła supresja toksyczności TDP 43.

Jeden z nich był fałszywie dodatni, a drugi wykazywał zwiększoną toksyczność. Po pięciu zabiegach FOA, dwa prawdziwe trafienia zostały następnie zsekwencjonowane za pomocą PCR kolonii w celu zidentyfikowania mutacji w domenie środkowej. Te mutacje HS P 1 0 4 można następnie wykonać w macierzystym plazmidzie HSP 1 0 4 za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce, aby potwierdzić ich supresję toksyczności Po opanowaniu technika ta może być stosowana do przesiewania do 200 trafień na raz w pięciu FO, krok w ciągu jednego do dwóch tygodni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas próby tej procedury ważne jest, aby dokładnie przeanalizować wyniki sekwencjonowania, ponieważ często uzyskuje się mieszaniny plazmidów zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak mikroskopia fluorescencyjna, mogą być wykonane, aby pomóc odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: w jaki sposób warianty HSP 1 0 4 wpływają na agregację substratu związanego z chorobą? Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeszukiwać biblioteki wariantów HSP 1 0 4 w celu wyboru supresorów toksyczności.