Name: Izolowanie wzmocnionych wariantów Hsp104 przy użyciu modeli proteinopatii drożdżowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Poznaj metodę izolowania wariantów Hsp104 przy użyciu modeli drożdżowych do badania białek związanych z chorobami błędnie zwijającymi się białek. Technika ta pozwala identyfikować supresory toksyczności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Sue Lindquist, Aaronowi Gitlerowi i Martinowi Duennwaldowi za uprzejme podzielenie się odczynnikami. Nasze badania były wspierane przez: American Heart Association Post-Doctoral Fellowship (M.E.J); Nagroda Dyrektora NIH dla Nowego Innowatora DP2OD002177, NIH przyznaje R21NS067354, R21HD074510 i R01GM099836, nagrodę Badawczy Stowarzyszenia Dystrofii Mięśniowej (MDA277268), Packard Center for ALS Research na Uniwersytecie Johnsa Hopkinsa, Target ALS oraz Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award (J.S.).

1. Generowanie biblioteki
<ol>
	<li>Aby skonstruować biblioteki Hsp104 za pomocą podatnego na błędy PCR specyficznego dla domeny, najpierw amplifikuj domenę zainteresowania za pomocą podatnej na błędy polimerazy DNA20.</li>
	<li>Oczyść produkt PCR przez ekstrakcję żelem.</li>
	<li>Wykonaj etap wydłużania megastartera przy użyciu standardowego protokołu mutagenezy ukierunkowanej na miejsce: połącz plazmid matrycowy 50 ng, megaprimer 250 ng, 200 μM dNTP i polimerazę DNA o wysokiej wierności w buforze PCR i rozcieńczyć do 50 μl całkowitej objętości wodą klasy PCR20. Uruchom standardowy program PCR. 
	UWAGA: Konkretne użyte startery będą się różnić w zależności od konkretnego regionu genu, który ma być amplifikowany.
	<ol>
		<li>Po PCR trawić DNA matrycy rodzicielskiej za pomocą 1 μl enzymu restrykcyjnego DpnI przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekształć bibliotekę za pomocą elektroporacji lub w inny sposób w ultrakompetentną E. coli i oczyść ją za pomocą miniprep. 
	UWAGA: Generowanie bibliotek różni się znacznie w zależności od celów danego eksperymentu. Hsp104 jest bardzo dużym białkiem, więc randomizacja całego genu jest niepraktyczna, dlatego stosujemy podatny na błędy PCR specyficzne dla domeny. Dodatkowo, struktura Hsp104 pozostaje słabo poznana, co sprawia, że projektowanie bibliotek kierowanych stanowi wyzwanie21. Biblioteki mogą być konstruowane przy użyciu ukierunkowanych lub losowych podejść do mutagenezy, przy czym jedynym ograniczeniem jest to, że szkielet plazmidu matrycowego powinien zawierać gen URA3, aby umożliwić selekcję licznika 5-FOA na pożywkach dekstrozy.</li>
</ol>
2. Transformacja biblioteki Hsp104
<ol>
	<li>Zintegruj substrat związany z chorobą z drożdżami W303aΔhsp104 przy użyciu standardowego protokołu transformacji octanu litu/PEG22. Wybierz pojedyncze kolonie i przebadaj je pod kątem toksyczności, aby wyizolować szczep o wysokiej toksyczności substratu związanego z chorobą23, 
	UWAGA: Użyj zintegrowanego szczepu i wyizoluj pojedynczą kolonię, aby zapewnić równą ekspresję we wszystkich komórkach. Sklonuj substrat chorobowy do plazmidu, umożliwiając integrację genu z dowolnym markerem innym niż uracyl (używamy histydyny) i biblioteki Hsp104 do plazmidu pAG416GAL (marker uracylu)24. Aby umożliwić wybór licznika 5-FOA, upewnij się, że biblioteka jest wyrażona z plazmidu z markerem uracylu. Można również zastosować inne szczepy drożdży. Zauważyliśmy podobny fenotyp tłumienia toksyczności przy użyciu szczepów drożdży W303a i BY4741 zarówno na tle WT, jak i Δhsp104 (M.E.J. i J.S., niepublikowane obserwacje).</li>
	<li>Przekształć bibliotekę Hsp104 w ten szczep przy użyciu tego samego protokołu transformacji octanu litu/PEG22. Odpowiednio przeskaluj transformację w górę, aby zachować przestrzeń sekwencji biblioteki i zachować przewidywany rozmiar biblioteki.</li>
	<li>Mieszaninę transformacyjną należy umieścić na nieindukujących, selektywnych płytkach (np. SD-His-Ura) przy użyciu wystarczającej liczby płytek, aby zapewnić wzrost dużej liczby kolonii. Użyj dużych szalek Petriego (150 mm), aby zminimalizować liczbę potrzebnych talerzy. Odzysk transformantów za pomocą płyt pozwala na ocenę sprawności transformacji.</li>
	<li>Transformacja Hsp104WT i wektorowych kontroli ujemnych równolegle.</li>
</ol>
3. Badania przesiewowe pod kątem tłumienia proteotoksyczności
<ol>
	<li>Zmyj kolonie z płytek za pomocą pożywki z rafinozą (np. SRaff-His-Ura). Użyj pipety serologicznej i sterylnych drewnianych aplikatorów, aby poluzować kolonie z płytek. Przelej płynne płuczki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dokładnie przemieszaj, aby oddzielić wszelkie grudki komórek. Rozcieńczyć do lekko mętnej kultury, OD600 ~ 0,025, 
	UWAGA: Tutaj rafinoza służy do odciążenia komórek od tłumienia indukcji za pośrednictwem glukozy, przygotowując w ten sposób komórki do indukcji za pośrednictwem galaktozy.</li>
	<li>Rozcieńczoną kulturę hodować przez noc w pożywce rafinozowej, wytrząsając w temperaturze 30 °C. Hodować Hsp104WT i kontrolki wektorowe równolegle.</li>
	<li>Następnego ranka nanieś różne stężenia na poszczególne płytki galaktozy (np. SGal-His-Ura) (1 μl do 2 ml zagęszczonej kultury w całkowitej objętości 400 μl). Posiew w szerokim zakresie stężeń zapewni, że płytka będzie miała pojedyncze kolonie. Rzeczywiste wymagane stężenie zależy od toksyczności substratu choroby będącego przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Znormalizuj wektor i kultury Hsp104WT do OD600 biblioteki i płyt równe objętości, aby porównać wzrost biblioteki względem kontroli.</li>
	<li>Aby ocenić rygorystyczność selekcji, należy umieścić bibliotekę na pożywkach glukozowych (represyjnych). Inkubować płytki przez 2-3 dni w temperaturze 30 ºC, aż pojawią się kolonie (ryc. 2). Oceń powstałe kolonie i porównaj z kontrolami. 
	UWAGA: Często uzyskuje się zarówno duże, jak i małe kolonie, ale nie obserwuje się korelacji między wielkością kolonii a aktywnością. Przesiewaj te potencjalne trafienia za pomocą techniki wyboru licznika 5-FOA (krok 4), aby zminimalizować liczbę wyników fałszywie dodatnich przenoszonych do sekwencjonowania.</li>
</ol>
4. Kontrselekcja 5-FOA i wykrywanie w celu wyeliminowania fałszywych alarmów
<ol>
	<li>Pojedyncze kolonie należy rozmieścić po kolei na podwójnych i pojedynczych pożywkach (np. płytkach SD-His-Ura i SD-His) i hodować przez noc w temperaturze 30 ºC. Powtórzyć z kontrolami wektorowymi i Hsp104WT. Posiewanie na SD-His przed 5-FOA zwiększa wydajność kroku 5-FOA, zwiększając prawdopodobieństwo, że komórki utracą plazmid Hsp104 po posiewie na 5-FOA.</li>
	<li>Aby zapobiec wysychaniu płytek, należy owinąć płytki SD-His-Ura w parafilm i przechowywać w temperaturze 4 ºC podczas wykonywania przesiewu 5-FOA. Płytki te zostaną ostatecznie wykorzystane do sekwencjonowania.</li>
	<li>Na płytkach 5-FOA (pożywka YPD + 1g/L 5-FOA) rozprowadzić kolonie od płytek SD-His do pojedynczych kolonii, należy je inkubować przez 1-2 dni w temperaturze 30 ºC, aż pojawią się pojedyncze kolonie. Tutaj 5-FOA jest przekształcany w produkt toksyczny (5-fluorodeoksyurydynę) w komórkach zawierających gen URA3. W ten sposób wszystkie komórki, które nadal zawierają plazmid Hsp104, umrą.</li>
	<li>Umieść pojedyncze kolonie z płytek 5-FOA w dwóch egzemplarzach na płytkach SD-Ura i SD-His. Przetestuj 3 kolonie dla każdego trafienia, aby zwiększyć prawdopodobieństwo, że co najmniej jedna kolonia na każde trafienie utraci plazmid Hsp104. Inkubować przez 1-2 dni w temperaturze 30 °C. Kolonie, które utraciły plazmid Hsp104, będą rosły na płytkach SD-His, ale nie na płytkach SD-Ura.</li>
	<li>Hoduj szczepy, które utraciły plazmidy Hsp104 do testów plamienia. Hoduj szczepy do nasycenia w pożywkach rafinozowych (np. SRaff-His) w 96 płytkach DeepWell 2 ml przez noc w temperaturze 30 ºC, wstrząsając. Pamiętaj, aby uwzględnić szczepy kontrolne traktowane 5-FOA.</li>
	<li>Przygotuj płytki do testu plamistego. Używając pipety wielokanałowej, podajcie 200 μl pożywki rafinozowej (np. SRaff-His) na dołek z płytki 96-dołkowej, rezerwując kolumny 1 i 7 na czyste kultury. Podwielokrotność 250 μl każdej z 16 nasyconych kultur rozmieścić w kolumnach 1 i 7 płytki.</li>
	<li>Seryjnie rozcieńczać kultury 5 razy w każdej kolumnie płytki, dokładnie mieszając za pomocą pipety wielokanałowej. Usunąć 50 μl rozcieńczonej kultury z kolumn 6 i 12, aby upewnić się, że końcowa objętość każdej studzienki wynosi 200 μl. Jest to niezbędne, aby zapewnić równomierne plamienie.</li>
	<li>Używając narzędzia replikatora z 96 (frogger), narysuj kultury w dwóch egzemplarzach na płytkach SD-His i SGal-His. Inkubować płytki w temperaturze 30 ºC przez 2-3 dni.</li>
	<li>Wybrać do sekwencjonowania szczepów, które wykazują toksyczność na płytkach SGal-His podobną do toksyczności kontrolnej. Odrzuć jako fałszywie dodatnie szczepy, które nie są tak toksyczne jak kontrole. 5-FOA jest również często toksyczny sam w sobie, dlatego należy wyrzucić szczepy, które wykazują defekt wzrostu na płytkach SD-His lub które wykazują znacznie większą toksyczność niż sam substrat choroby (ryc. 3).</li>
</ol>
5. Sekwencjonowanie wariantów Hsp104 metodą Colony PCR
<ol>
	<li>Zeskrobać ~10 μl drożdży z płytek SD-His-Ura w 3 μl 20 mM NaOH w probówkach paskowych do PCR i zlizować komórki przez zamrażanie i rozmrażanie. Umieścić probówki paskowe w zamrażarce o temperaturze -80 ºC na 10 minut lub w ciekłym azocie, a następnie inkubować w temperaturze 99 ºC w termocyklerze przez 10 minut. Rozcieńczyć szczepy do 100 μl wodą klasy PCR.</li>
	<li>Przygotuj reakcje PCR: 5 μl matrycy PCR, 0,5 μl 100 μM każdy starter, 0,5 μl 10 mM dNTP, 0,25 μl polimerazy DNA w buforze PCR i uzupełnij do 25 μl całkowitej objętości wodą klasy PCR. Zaprojektuj startery, aby wzmocnić losowy region plus około 100 pz na obu końcach. Zminimalizuj rozmiar amplifikowanego obszaru, aby zwiększyć prawdopodobieństwo pomyślnego wzmocnienia. Uruchom standardowy program PCR.</li>
	<li>Analizować próbki za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, aby potwierdzić amplifikację produktu PCR o odpowiedniej wielkości. Powtórz PCR, jeśli nie ma produktu. 
	UWAGA: Niepowodzenie PCR jest zwykle spowodowane zbyt dużą ilością drożdży użytych w kroku 5.1.</li>
	<li>Przygotuj próbki do sekwencjonowania DNA. Usuń startery PCR przez oczyszczanie PCR lub przy użyciu odczynnika do czyszczenia produktu PCR, takiego jak egzonukleaza I i enzym fosfatazy alkalicznej krewetek (ExoSAP-IT) w celu degradacji jednoniciowego DNA. Odczynnik ten enzymatycznie rozkłada niewłączone startery i dNTP, co pozwala na wyższą przepustowość.</li>
	<li>Sekwencjonuj produkty PCR. Pamiętaj, aby dokładnie przeanalizować chromatogramy sekwencjonowania pod kątem mutacji. Mutacje można zaobserwować jako mieszaninę dwóch nukleotydów w danym miejscu (ryc. 4), ponieważ drożdże często zawierają wiele plazmidów.</li>
</ol>

<ol><li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model%3A+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Determinants+and+Genetic+Modifiers+of+Aggregation+and+Toxicity+for+the+ALS+Disease+Protein+FUS%2FTLS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS.</a> PLoS Biol. 9 (4), (2011).</li>
<li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+Cells+Provide+Insight+into+Alpha-Synuclein+Biology+and+Pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li>
<li>Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+diseases%3A+a+decade+of+discoveries+paves+the+way+for+therapeutic+breakthroughs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs.</a> Nat Med. 10 (10), 1055-1063 (2004).</li>
<li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress%2C+aging%2C+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Stress, aging, and neurodegenerative disease.</a> N Engl J Med. 355 (21), 2254-2255 (2006).</li>
<li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).</li>
<li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313 (5785), 324-328 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nature genetics. 41 (3), 308-315 (2009).</li>
<li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+%26+mechanisms%22%5BJournal%5D)">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease models & mechanisms. (3-4), 194-208 (2010).</li>
<li>Tardiff, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+reveal+a+%27druggable%27+Rsp5%2FNedd4+network+that+ameliorates+alpha-synuclein+toxicity+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast reveal a 'druggable' Rsp5/Nedd4 network that ameliorates alpha-synuclein toxicity in neurons.</a> Science. 342 (6161), 979-983 (2013).</li>
<li>Tardiff, D. F., Tucci, M. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+8-hydroxyquinolines+protect+models+of+TDP-43+protein%2C+alpha-synuclein%2C+and+polyglutamine+proteotoxicity+through+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Different 8-hydroxyquinolines protect models of TDP-43 protein, alpha-synuclein, and polyglutamine proteotoxicity through distinct mechanisms.</a> The Journal of biological chemistry. 287 (6), 4107-4120 (2012).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+modulation+of+eIF2alpha+phosphorylation+rescues+TDP-43+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Therapeutic modulation of eIF2alpha phosphorylation rescues TDP-43 toxicity in amyotrophic lateral sclerosis disease models.</a> Nature. 46 (2), 152-160 (2014).</li>
<li>Ju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+model+of+FUS%2FTLS-dependent+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity.</a> PLoS Biol. 9 (4), (2011).</li>
<li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp104%3A+a+weapon+to+combat+diverse+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders.</a> Neurosignals. 16 (1), 63-74 (2008).</li>
<li>Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+Hsp104+to+protein-misfolding+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders.</a> Biochem Cell Biol. 88 (1), 1-13 (2010).</li>
<li>DeSantis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operational+Plasticity+Enables+Hsp104+to+Disaggregate+Diverse+Amyloid+and+Nonamyloid+Clients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Operational Plasticity Enables Hsp104 to Disaggregate Diverse Amyloid and Nonamyloid Clients.</a> Cell. 151 (4), 778-793 (2012).</li>
<li>Jackrel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiated+Hsp104+Variants+Antagonize+Diverse+Proteotoxic+Misfolding+Events%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Potentiated Hsp104 Variants Antagonize Diverse Proteotoxic Misfolding Events.</a> Cell. 156 (1-2), 170-182 (2014).</li>
<li>Wittrup, K. D., Verdine, G. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWittrup%2C+KD+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Wittrup, K. D., Verdine, G. L. 503, Academic Press. 13-14 (2012).</li>
<li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoeke%2C+JD+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 154, Academic Press. Lawrence Grossman Ray Wu. 164-175 (1987).</li>
<li>Miyazaki, K. Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP). Directed Evolution Library Creation: Methods in Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiyazaki%2C+K+%22eds+FrancesH+Arnold+%26+George+Georgiou%22">eds FrancesH Arnold & George Georgiou</a>. 231, Humana Press. 23-28 (2003).</li>
<li>Saibil, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+machines+for+protein+folding%2C+unfolding+and+disaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (10), 630-642 (2013).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li>
<li>Armakola, M., Hart, M. P., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TDP-43 toxicity in yeast.</a> Methods. 53 (3), 238-245 (2011).</li>
<li>Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suite+of+Gateway%C2%AE+cloning+vectors+for+high-throughput+genetic+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A suite of Gateway® cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 24 (10), 913-919 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy nasze podejście do izolowania wzmocnionych wariantów Hsp104, które hamują toksyczność substratów związanych z chorobą, przy użyciu modeli proteinopatii drożdżowej. Dzięki takiemu podejściu duże biblioteki wariantów mogą być przesiewane z dużą przepustowością, przy czym jedynym ograniczeniem jest liczba wariantów, które przechodzą przez ekran pomocniczy 5-FOA. Wykonując te kroki w formacie 96 dołków, rutynowo sprawdzamy do 200 trafień na raz w kroku 5-FOA w ciągu 1-2 tygodni. Liczba trafień uzy...

Modele proteinopatii drożdży zostały opracowane dla zaburzeń związanych z nieprawidłowym fałdowaniem białek, w tym stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) i choroby Parkinsona (PD)1-3. Ekspresja białek TDP-43 i FUS, które nieprawidłowo fałdują się u pacjentów z ALS, są toksyczne i nieprawidłowo zlokalizowane, tworząc agregaty cytoplazmatyczne w drożdżach1,2. Podobnie, ekspresja α-synukleiny (α-syn), która jest zaangażowana w PD, jest toksyczna i nieprawidłowo lokalizuje, tworząc agregaty cytoplazmatyczne w drożdżach3. Cechy te podsumowują fenotypy u pacjentów z tymi zaburzeniami4,5. W związku z tym modele drożdży stanowią użyteczną platformę do badań przesiewowych pod kątem białek lub małych cząsteczek, które zapobiegają lub odwracają te fenotypy2,6-13. Jesteśmy zainteresowani rozwojem białek, które są zdolne do odwrócenia agregacji i toksyczności spowodowanej TDP-43, FUS i α-syn. Skupiamy się na Hsp104, białku AAA + z drożdży, które jest wyjątkowo zdolne do dezagregacji białek zarówno z agregatów amorficznych, jak i amyloidu w drożdżach, ale nie ma ludzkiego homologu14,15. Hsp104 jest precyzyjnie dostrojony do dezagregacji endogennych prionów drożdży i ma tylko ograniczoną zdolność do dezagregacji substratów związanych z ludzkimi chorobami neurodegeneracyjnymi, z którymi zwykle nigdy się nie spotyka16,17. W związku z tym naszym celem jest opracowanie ulepszonych wersji Hsp104, które są w stanie skutecznie dezagregować te ludzkie substraty. W tym celu konstruujemy duże biblioteki wariantów Hsp104 za pomocą podatnego na błędy PCR; Biblioteki te można badać przesiewowo przy użyciu modeli proteinopatii drożdży17. Przyjęliśmy podejście ukierunkowane na domenę do konstruowania i sprawdzania bibliotek, ponieważ Hsp104 jest bardzo duży17. Początkowo skupiliśmy się na środkowej domenie (MD) Hsp10417, chociaż podobne podejścia można zastosować do badania innych domen. Modele te umożliwiają bezpośrednie badania przesiewowe pod kątem aktywności disaggregazy, w przeciwieństwie do alternatywnych technik, takich jak wyświetlanie powierzchniowe, które jest ograniczone do stosowania do monitorowania wiązania18.
Nasz protokół opiera się na dwóch krokach przesiewowych (Rysunek 1). Najpierw wybierane są warianty Hsp104, które hamują toksyczność substratu chorobowego w drożdżach. W tym celu warianty Hsp104 i substrat związany z chorobą są przekształcane w drożdże ∆hsp104. Używamy drożdży ∆hsp104 do eksploracji przestrzeni sekwencji Hsp104 przy braku Hsp104 typu dzikiego (WT)17. Co ważne, delecja Hsp104 nie wpływa na toksyczność α-syn, FUS lub TDP-43 w drożdżach, a ekspresja Hsp104WT zapewnia minimalny ratunek1,13,17. Drożdże są następnie posiewane na pożywce indukującej w celu wywołania ekspresji obu białek. Drożdże zawierające warianty Hsp104, które hamują toksyczność substratu związanego z chorobą, powodują wzrost kolonii. Warianty te są wybierane do dalszej analizy, podczas gdy kolonie utrzymujące warianty, które nie tłumią toksyczności, umierają. Jednak fałszywe alarmy stanowią poważny problem na tym ekranie. Ekspresja TDP-43, FUS i α-syn są wysoce toksyczne, co stwarza silną presję selekcyjną na pojawienie się spontanicznych genetycznych supresorów toksyczności niezwiązanych z wyrażanym wariantem Hsp104. W związku z tym użyliśmy wtórnego sita, które ma również stosunkowo wysoką przepustowość, aby wyeliminować te niespecyficzne supresory toksyczności17. W tym wtórnym badaniu przesiewowym wybrane drożdże są traktowane kwasem 5-fluorootowym (5-FOA) w celu kontrselekcji plazmidu Hsp10419. Szczepy są następnie oceniane pod kątem toksyczności substratu (TDP-43, FUS lub α-syn) za pomocą testu plamistego, aby zapewnić przywrócenie toksyczności substratu po utracie plazmidu Hsp104. Tak więc drożdże, u których toksyczność została przywrócona w tym wtórnym badaniu, prawdopodobnie pierwotnie wykazywały tłumienie toksyczności ze względu na obecność wariantu Hsp104. Drożdże te są oznaczone jako "trafienia", a plazmid Hsp104 powinien zostać następnie odzyskany i zsekwencjonowany w celu zidentyfikowania mutacji w genie Hsp10417 (ryc. 1). Wszelkie trafienia powinny być następnie ponownie potwierdzone poprzez samodzielną konstrukcję mutacji przy użyciu mutagenezy ukierunkowanej na miejsce, a następnie ponowne przetestowanie pod kątem supresji toksyczności. Potencjalne zastosowania tego protokołu są szerokie. Korzystając z tych metod, biblioteki dowolnego rodzaju białka mogą być badane pod kątem wariantów, które hamują toksyczność dowolnego białka substratowego, które jest toksyczne w drożdżach.

<table><tbody><tr><td>GeneMorphII EZClone Domain Mutageneza</td><td>Zestaw Agilent</td><td>200552</td><td></td></tr><tr><td>150 mm szalki Petriego</td><td>Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 5-fluorootyczny Research Products</td><td>International</td><td>f10501-5.0</td><td></td></tr><tr><td>96-DeepWell 2 ml Płytki</td><td>Eppendorf</td><td>0030 502.302</td><td></td></tr><tr><td>96 pogrubione narzędzie replikatora</td><td>V& P Scientific</td><td>VP-404</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>Affymetrix</td><td>78200</td><td></td></tr></tbody></table>

izolowanie wzmocnionych wariantów hsp104 przy użyciu modeli proteinopatii drożdżowej

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Wiele zaburzeń związanych z nieprawidłowym fałdowaniem białek można modelować u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae. Białka takie jak TDP-43 i FUS, zaangażowane w stwardnienie zanikowe boczne, oraz α-synukleina, zaangażowana w chorobę Parkinsona, są toksyczne i tworzą agregaty cytoplazmatyczne w drożdżach. Cechy te podsumowują patologie białkowe obserwowane u pacjentów z tymi zaburzeniami. W związku z tym drożdże są idealną platformą do izolowania supresorów toksyczności z bibliotek wariantów białek. Jesteśmy zainteresowani zastosowaniem dezaggregaz białkowych w celu wyeliminowania nieprawidłowo sfałdowanych toksycznych konformerów białkowych. W szczególności konstruujemy Hsp104, heksameryczne białko AAA+ z drożdży, które jest wyjątkowo zdolne do rozpuszczania zarówno nieuporządkowanych agregatów, jak i amyloidu oraz przywracania białek do ich natywnych konformacji. Podczas gdy Hsp104 jest wysoce konserwatywny u eukariontów i eubakterii, nie ma znanego homologu metazoan. Hsp104 ma tylko ograniczoną zdolność do eliminowania nieuporządkowanych agregatów i włókien amyloidowych związanych z chorobami u ludzi. W związku z tym naszym celem jest zmodyfikowanie wariantów Hsp104 w celu odwrócenia nieprawidłowego fałdowania białek związanego z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi. Opracowaliśmy metody badań przesiewowych dużych bibliotek wariantów Hsp104 w celu tłumienia proteotoksyczności u drożdży. Ponieważ drożdże są podatne na spontaniczne, nieswoiste tłumienie toksyczności, opracowano dwuetapowy proces badań przesiewowych w celu wyeliminowania wyników fałszywie dodatnich. Korzystając z tych metod, zidentyfikowaliśmy szereg wzmocnionych wariantów Hsp104, które silnie hamują toksyczność i agregację TDP-43, FUS i α-synukleiny. Tutaj opisujemy ten zoptymalizowany protokół, który można dostosować do bibliotek przesiewowych zbudowanych przy użyciu dowolnego szkieletu białkowego w celu tłumienia toksyczności dowolnego białka, które jest toksyczne w drożdżach.

Skonstruowaliśmy bibliotekę wariantów Hsp104 z randomizacją w domenie środkowej i przesialiśmy ją w celu znalezienia wariantów hamujących toksyczność TDP-43. Bibliotekę przetransformowano i wysiano na pożywki z glukozą oraz galaktozą (Rysunek 2), aby ocenić rygorystyczność przesiewu. Wyselekcjonowano pojedyncze kolonie, a szczepy poddano kontraselekcji za pomocą 5-FOA w celu wyeliminowania plazmidu Hsp104. Następnie oceniono te szczepy, aby potwierdzić, że toksyczność wynikała z samego TDP-43, bez obecno...

Modele proteinopatii drożdży są cennymi narzędziami do oceny toksyczności i agregacji białek związanych z chorobą. W tym miejscu przedstawiamy metody badań przesiewowych bibliotek wariantów Hsp104 pod kątem supresorów toksyczności. Protokół ten można dostosować do badań przesiewowych dowolnej biblioteki białek pod kątem supresorów toksyczności dowolnego białka, które jest toksyczne w drożdżach.

Izolowanie wzmocnionych wariantów Hsp104 przy użyciu modeli proteinopatii drożdżowej

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Celem poniższego eksperymentu jest badanie przesiewowe bibliotek HS P 1 0 4 pod kątem wyboru wariantów, które hamują toksyczność białek związanych z zaburzeniami nieprawidłowego fałdowania białek. Osiąga się to poprzez kotransformację bibliotek wariantów HSP 1, 0, 4 z substratem związanym z chorobą w drożdżach i coex eksprymującym te dwa białka w drugim etapie. Wybrane drożdże traktuje się pięcioma kwasami fluorowymi lub pięcioma FOA w celu kontrselekcji plazmidu HSP 1 0 4.Następnie trafienia są sekwencjonowane poprzez amplifikację regionu mutagenu przez PCR kolonii lub identyfikację mutacji w genie HSP 1 0 4. Ostatecznie, tłumienie toksyczności substratu związanego z chorobą można ocenić w celu zidentyfikowania wariantów HS P 1 0 4, które są najbardziej obiecujące do dalszej charakterystyki. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak selekcja oparta na wiązaniach, jest to, że technika ta pozwala na wybór wariantów, które tłumią toksyczność substratu związanego z chorobą.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fałdowania białek poprzez identyfikację białek, które mogą odwrócić nieprawidłowe fałdowanie białek. Chociaż metoda ta może

isolating-potentiated-hsp104-variants-using-yeast-proteinopathy-models

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisujemy protokół oczyszczania wysoce aktywnego białka Hsp104, heksamerycznego białka AAA+ z drożdży, które sprzęga hydrolizę ATP z disagregacją białek. Schemat ten wykorzystuje konstrukt z oznakowaniem His6 do oczyszczania powinowactwa z E. coli, a następnie chromatografię wymiany anionowej, usunięcie znacznika His6 za pomocą proteazy TEV oraz chromatografię wykluczania cząsteczkowego.

Oczyszczanie Hsp104, białkowej dysagregazy

Niniejszy manuskrypt opisuje trzy komplementarne protokoły służące do oceny toksyczności białek z ekspansją poliglutaminy (polyQ) w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Protokoły te można łatwo zmodyfikować w celu monitorowania toksyczności innych błędnie sfałdowanych białek w drożdżach.

Testy wzrostu do oceny toksyczności poliglutaminy w drożdżach

Ten artykuł skupia się na identyfikacji wysoce pewnych zestawów danych interakcji między białkami gospodarza i patogenu przy użyciu kombinacji dwóch ortogonalnych metod: drożdży dwuhybrydowych, a następnie wysokoprzepustowego testu interakcji w komórkach ssaków o nazwie HT-GPCA.

Podejście porównawcze do scharakteryzowania krajobrazu interakcji białko-białko gospodarz-patogen

Ten artykuł opisuje użycie białka fuzyjnego lucyferazy świetlika i GFP do badania in vivo fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae.  Za pomocą tego odczynnika można jednocześnie monitorować fałdowanie modelowego białka zdenaturowanego termicznie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i testu enzymatycznego w celu zbadania roli składników sieci proteostazy w kontroli jakości białka.

Sprzężone testy do monitorowania ponownego fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae

Oligomeryzacja receptora ryanodyny, homo-tetramerycznego kanału jonowego pośredniczącego w uwalnianiu Ca2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów, jest krytyczna dla skurczu mięśnia szkieletowego i sercowego. W tym artykule przedstawiono komplementarne metody in vivo i in vitro do wykrywania samoasocjacji białek i wyznaczania stechiometrii homo-oligomerów.

Genetyczne i biochemiczne podejścia do oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro: studium przypadku receptora ryanodyny

Ten protokół opisuje metodologię o wysokiej przepustowości do funkcjonalnego badania przesiewowego pod kątem dziedziczenia opartego na białkach u S. cerevisiae.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u S. cerevisiae

Ten artykuł opisuje protokoły do oceny wpływu białek fluorescencyjnych na agregację i toksyczność nieprawidłowo sfałdowanej ekspansji poliglutaminy w celu szybkiej oceny nowo niescharakteryzowanego białka fluorescencyjnego w kontekście reporterów fluorescencyjnych.

Wpływ białek fluorescencyjnych na partnerów fuzji za pomocą testów toksyczności poliglutaminy w drożdżach

Przedstawione są tutaj cztery protokoły do konstruowania i wykorzystywania szczepów reporterowych drożdży Saccharomyces cerevisiae do badania potencjału transaktywacji ludzkiego P53, wpływu różnych mutacji związanych z rakiem, współekspresji białek oddziałujących oraz efektów określonych małych cząsteczek.

Drożdże jako podwozie do opracowywania testów funkcjonalnych do badania ludzkiego p53

Ten protokół przedstawia procedury eksperymentalne do charakteryzowania zmian w całym genomie w poziomach modyfikacji potranslacyjnych histonów (PTM) występujących w związku z nadekspresją białek związanych z ALS i chorobą Parkinsona w modelach Saccharomyces cerevisiae. Po oddzieleniu SDS-PAGE poszczególne poziomy PTM histonów są wykrywane za pomocą przeciwciał specyficznych dla modyfikacji za pomocą Western blot.

Charakterystyka zmian modyfikacji potranslacyjnej histonów w modelach neurodegeneracyjnej proteinopatii drożdży

Fizjologiczny model in vivo α-synukleiny jest niezbędny do zbadania i zrozumienia patogenezy choroby Parkinsona. Opisujemy metodę monitorowania cytotoksyczności i tworzenia agregatów α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży.

Metoda badania toksyczności i agregacji α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży

Interakcje biomolekuł, takie jak interakcje białko-białko, są molekularną podstawą funkcji biologicznych. Jeśli uda się wyizolować mutanty bez interakcji/upośledzone, które specyficznie nie mają odpowiedniej interakcji, znacznie pomogą one w zrozumieniu funkcji tej interakcji. W tym artykule przedstawiono skuteczny sposób izolowania mutantów bez interakcji/z upośledzeniem.

Izolowanie mutantów o zerowej interakcji/upośledzonych przy użyciu testu dwuhybrydowego drożdży

Poznaj metodę izolowania wariantów Hsp104 przy użyciu modeli drożdżowych do badania białek związanych z chorobami błędnie zwijającymi się białek. Technika ta pozwala identyfikować supresory toksyczności.

Izolowanie wzmocnionych wariantów Hsp104 przy użyciu modeli proteinopatii drożdżowej

Przeglądaj więcej filmów