1.13: Hodowla eksplantatów tkanki nerwowej

Hodowle eksplantatów służą jako technika badania rozwoju określonych populacji komórek i struktur neuronalnych. W eksperymentach neurobiologicznych rozwojowych eksplantaty to tkanki nerwowe wycięte z zarodka w celu dalszego rozwoju in vitro. Kultury te dają naukowcom możliwość manipulowania i wizualizacji rozwijających się tkanek w sposób, który nie jest możliwy in vivo. W tym filmie przedstawimy kilka ważnych zasad pracy z eksplantowanymi tkankami, procedury krok po kroku dla dwóch podejść do hodowli eksplantatów, a także zastosowania tej techniki.

Zanim zagłębimy się w metody, przyjrzyjmy się kilku podstawowym zasadom. Eksplantaty można ustalić z wielu organizmów modelowych i różnych typów tkanek. Ogólnie rzecz biorąc, kultury są tworzone poprzez ostrożne usunięcie tkanki nerwowej z zarodka, wypreparowanie obszaru zainteresowania i umieszczenie go w sztucznym środowisku.

Tkanki można również podzielić na cienkie arkusze i uprawiać w "kulturze plastrów". Ponieważ środowisko hodowlane jest zaprojektowane tak, aby naśladować warunki in vivo całego narządu, ta strategia hodowli jest często nazywana "organotypową".

Zanim zaczniesz, wysterylizuj swoje narzędzia 70% etanolem. Następnie poddaj eutanazji ciężarną mysz przy użyciu metody preferowanej przez laboratorium. Następnie chirurgicznie wyciąć macicę i umieścić w lodowatym buforze. Przenieś naczynie do mikroskopu preparacyjnego i usuń pojedyncze zarodki z woreczka żółtkowego. Następnie wyizoluj mózg, ostrożnie wypreparuj obszar zainteresowania i przenieś do naczynia hodowlanego zawierającego pożywkę hodowlaną. Eksplantaty można utrzymywać w 37 ? C inkubator zawierający 5% CO2 przez kilka tygodni poprzez wymianę 50% pożywki co 2 - 3 dni.

Hodowla warstwowa tkanki mózgowej wymaga kilku dodatkowych kroków. Przed cięciem tkanka jest osadzona w agarozie, która zapewnia podparcie tkance, dzięki czemu pozostaje nienaruszona podczas krojenia. Aby to zrobić, 1,5% roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia jest podgrzewany, aż agaroza się rozpuści. Następnie agaroza jest przenoszona do form osadzających i pozostawiana do lekkiego ostygnięcia, aby uniknąć uszkodzenia tkanki.

Tkankę można następnie ostrożnie zanurzyć, a agarozę pozostawić do stwardnienia. Powstałe bloki są przycinane, a następnie przyklejane do stolika na próbki i cięte za pomocą wibratomu, który jest instrumentem wykorzystującym wibrujące ostrze do cięcia cienkich plasterków żywej tkanki. W miarę wytwarzania plastrów są one ostrożnie przenoszone na powlekaną płytkę zawierającą pożywkę hodowlaną i hodowane, jak wspomniano wcześniej.

Istnieje wiele zalet stosowania kultur eksplantatów w porównaniu z metodami in vivo i innymi metodami in vitro. Po pierwsze, komórki w eksplantowanej tkance są bardziej dostępne dla narzędzi eksperymentalnych. Po drugie, fakt, że eksplantaty utrzymują złożoną architekturę komórkową rozwijającej się tkanki nerwowej, oznacza, że można badać interakcje komórka-komórka. Po trzecie, ponieważ naukowcy mogą kontrolować skład chemiczny pożywki hodowlanej, mogą używać eksplantatów do testowania wpływu określonych związków na rozwój tkanek.

Niemniej jednak, ponieważ jest usuwany ze swojego naturalnego środowiska, należy zachować szczególną ostrożność, aby utrzymać szczęśliwą i zdrową tkankę in vitro. Na przykład obecność macierzy zewnątrzkomórkowej lub ECM ma znaczący wpływ na zachowanie komórek, dlatego oczyszczone białka ECM są często używane do powlekania szalek hodowlanych. Kolejną ważną kwestią jest roztwór, w którym kąpie się eksplantaty. Podczas gdy często stosuje się tradycyjne pożywki do hodowli komórkowych, niektóre eksperymenty wymagają roztworów, które bardzo przypominają płyn krążący w ośrodkowym układzie nerwowym: płyn mózgowo-rdzeniowy, który jest krytycznym odczynnikiem w eksperymentach takich jak te, które zaraz zobaczysz.

Teraz, gdy omówiliśmy metody hodowli eksplantatów, zobaczmy, jak te techniki są stosowane.

Testy migracji komórek wykorzystują eksplantowaną tkankę do badania odpychających i przyciągających sygnałów, które są zaangażowane w ruch komórek nerwowych. W tym eksperymencie kulki, które zostały wcześniej nasączone czynnikami wzrostu, są wszczepiane do eksplantatów tyłomózgowia w celu zbadania migracji komórek nerwowych. Po 3 - 4 dniach ekspozycji neurony zobrazowano za pomocą mikroskopu konfokalnego. Wyniki pokazują, że neurony ruchowe migrują w kierunku kulek nasączonych czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego, ale nie kontrolują kulek nasączonych buforem.

Testy kohodowli są często stosowane do badania interakcji komórka-komórka podczas rozwoju. W tym przykładzie segmenty rdzenia kręgowego hodowano na warstwie komórek mięśniowych, aby zbadać, w jaki sposób tworzone są połączenia między neuronami ruchowymi rdzenia kręgowego a mięśniami szkieletowymi. Już 2 dni po inkubacji obserwuje się wypustki z neuronów, znanych również jako neuryty, wyłaniające się z eksplantatu. W ciągu 5 dni obserwuje się unerwienie funkcjonalne poprzez skurcz warstwy komórek mięśniowych.

Podczas rozwoju układu nerwowego neurony muszą wydłużyć swoje aksony, aby nawiązać połączenie między tkanką docelową a ośrodkowym układem nerwowym. Jednym ze sposobów badania tego złożonego procesu są testy naprowadzania aksonów. Naukowcy wykorzystują eksplantowane tkanki do zbadania czynników w neuronach i otaczającym środowisku, które pomagają kierować aksonem do właściwej lokalizacji.

Właśnie obejrzałeś przewodnik JoVE dotyczący hodowli eksplantatów tkanki nerwowej. W tym filmie omówiono zalety kultur eksplantatów, strategie hodowli, protokoły krok po kroku dwóch powszechnie stosowanych procedur eksplantacji oraz sposoby, w jakie techniki te są obecnie wykorzystywane w laboratorium.

Dzięki za oglądanie!