Synteza immunoukierunkowanych magnetoplazmonicznych nanoklastrów

Ogólnym celem tej procedury jest synteza immuno-ukierunkowanych magnetoplazmonicznych nanoklastrów o silnym momencie magnetycznym i silnej absorbancji bliskiej podczerwieni. Osiąga się to poprzez pierwszą syntezę nanocząstek rdzenia tlenku żelaza. Drugim krokiem jest osadzenie złotej powłoki na nanocząstkach rdzenia tlenku żelaza.

Następnie nanoklastry są formowane metodą mikroemulsji olejowo-wodnej. Ostatnim krokiem jest koniugacja przeciwciał monoklonalnych z nanoklastrami. Ostatecznie, obrazowanie ciemnego pola jest wykorzystywane do pokazania swoistości molekularnej immunotargetowanych magnetoplazmonicznych klastrów Nano podejście I zapewnia połączenie prostych nanocząstek syntezy z silnym momentem magnetycznym bez poświęcania właściwości super paramagnetycznych i silnych, widzialnych absorbentów podczerwieni kolanowej, które rozwiązują wszystkie główne ograniczenia poprzednich metod, a procedura zostanie zademonstrowana przez studenta Grady'ego, Frank W, który opracował procedurę w moim laboratorium Aby wytworzyć nanocząstki, najpierw ustaw LabWare w dygestorium, podłącz kolbę z okrągłym dnem do kondensatora i zanurz ją w kąpieli oleju silikonowego na płycie grzejnej.

Monitoruj kąpiel za pomocą termometru, który może wskazywać powyżej stu i 60 stopni Celsjusza, nosząc odzież ochronną. Zacznij łączyć odczynniki w metalowej kolbie, ponieważ temperatury reakcji są bardzo wysokie jak na Pyrex. Aby uzyskać magnetyczną zawiesinę nanocząstek, połącz octan żelaza, kwas oleinowy, ole laminę, jeden, dwa, H, aec, diol i eter fenylowy.

Energicznie wymieszaj mieszaninę i podgrzej ją do 250 do 260 stopni Celsjusza. Nie podgrzewaj go wyżej, bo eter fenylowy zagotuje się, a naczynie pęknie. Utrzymuj wysoką temperaturę przez godzinę pod refluksem, a następnie pozwól reakcji ostygnąć.

Wróć do temperatury pokojowej, aby osadzić złotą powłokę na nanocząstkach rdzenia magnetycznego. Dodać następujące materiały do nowej kolby okrągłodennej, octan złota, kwas oleinowy, ole lamina, jeden, dwa. On aec dial i eter fenylowy.

Następnie dodaj pięć mililitrów zawiesiny magnetycznych nanocząstek. Podgrzej tę reakcję do 180 stopni Celsjusza i utrzymuj ją tam pod refluksem przez godzinę. Następnie poczekaj, aż roztwór ostygnie do temperatury pokojowej.

Aby wytrącić hybrydowe pierwotne nanocząstki, dodaj 50 mililitrów etanolu do zawiesiny. Następnie załaduj zawiesinę do probówki wirówkowej i odwiruj ją w dół. Teraz ponownie zawieś osad w 25 mililitrach heksanu za pomocą sonikatu i dodaj z powrotem 25 mililitrów etanolu i powtórz wirowanie.

Powtórz proces prania jeszcze trzy razy. Na koniec wysusz osad pierwotnych nanocząstek hybrydowych w próżni, wysusz przez noc. Nie kontynuuj, dopóki cząstki nie zostaną całkowicie wysuszone.

Aby stworzyć hybrydowe magnetoplazmoniczne nanoklastry zaczynają się od resus, zawieszając suche pierwotne nanocząstki w mililitrze heksanu. Stosowanie sonikatu należy postępować, gdy nie ma widocznego osadu. Następnie kroplami dodaj zawiesinę nanocząstek do 10 mililitrów siarczanu esalu sodu w 20-mililitrowej szklanej fiolce, spróbuj utrzymać roztwór w dwóch fazach, zakręć i potrząśnij fiolką ręcznie.

Następnie sonikować roztwór dwufazowy przez dwie godziny. Umieścić fiolkę w pobliżu środka wanny. Kąpiel będzie się stopniowo nagrzewać po dwóch godzinach.

Podgrzej mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie pozwól mu ostygnąć z powrotem do temperatury pokojowej. Teraz odwirować zawiesinę o stężeniu 100 G przez 30 minut.

Zachowaj supernatant i ponownie zawieś osad w 0,1 milimolowym roztworze cytrynianu sodu, stosując 10 minut sonikacji. Te nano klastry powinny mieć średnicę około 180 nanometrów. Następnie odwirować, zapisany supernatant o stężeniu 400 G przez 30 minut.

Ponownie zachowaj supernatant i ponownie zawieś osad w 0,1 milimolowym roztworze cytrynianu sodu, stosując 10 minut sonikacji. Nanoklastry w tej zawiesinie Resus mają średnicę około 130 nanometrów. Teraz odwiruj zapisany supernatant przy 1500 G przez 30 minut i ponownie zawieś osad jak poprzednio dla nanoklastrów o średnicy około 90 nanometrów.

W celu analizy przenieś 300 mikrolitrów każdej zawiesiny do indywidualnych studzienek i płytki 96-dołkowej i odczytaj ich widma absorpcyjne UV vis NIR. Przenieś również 10 mikrolitrów na siatki miedziane powlekane węglem w celu obrazowania TEM w celu koniugacji przeciwciał z nanoklastrami. Najpierw zastąp pożywkę roztworu przeciwciała stosami, aby można je było utlenić.

Przenieś 100 mikrolitrów przeciwciał do filtra wirówkowego o masie cząsteczkowej 10 K i dodaj 3,9 mililitra czterech milimolowych hałd o pH 7,2. Następnie odwiruj go w temperaturze 3 250 g w ośmiu stopniach Celsjusza przez 20 minut. Następnie dodaj 10 mikrolitrów 100 milimolowej daty sodu par I, aby utlenić przeciwciała i przykryj fiolkę folią.

Pozwól, aby reakcja inkubowała się w pomieszczeniu. Wytrząsarka orbitalna temperatury przez 30 minut później. Ugasić reakcję utleniania, dodając pół mililitra jednego XPBS.

Teraz do utlenionych przeciwciał dodaj dwa mikrolitry roztworu łącznika i ustaw reakcję na wstrząsanie przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie przefiltrować reakcję przez kolejny filtr odcinający o masie cząsteczkowej 10 K przy 3,250 G przez 20 minut i w temperaturze ośmiu stopni Celsjusza. Następnie przenieś przeciwciało do nowej fiolki i zwiększ objętość do 100 mikrolitrów w jednym XPBS, przywracając je do pierwotnego stężenia roboczego, gotowe do koniugacji z nanoklastrami.

Teraz zbierz 100 mikrolitrów zawiesiny nano klastra o średnicy zewnętrznej około 1,0. Dodać jeden mikrolitr zmodyfikowanych przeciwciał i inkubować je w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, delikatnie wstrząsając. Po dwóch godzinach dodaj 10 mikrolitrów jednego milimolowego tiolu o mocy pięciu kilodaltonów.

Następnie Peg inkubuje reakcję przez 15 minut w temperaturze pokojowej z potrząsaniem. Teraz osadzaj sprzężone z przeciwciałami nanoklastry o masie 830 G przez trzy minuty i ponownie zawieś pastylkę w 100 mikrolitrach o masie 2% objętości pięć. Kilodalton PEG w PBS przy pH 7,2 mierzy absorbancję zawiesiny w porównaniu z gołymi nano klastrami, po koniugacji powinno nastąpić przesunięcie ku czerwieni.

Nanocząstki mogą agregować, o czym świadczy znaczne przesunięcie w czerwonym widmie NIR. Jeśli tak się stanie, zwiększ stężenie kołka tiolowego do pięciu milimolów, wydłuż czas inkubacji do 30 minut i stopniowo zmniejszaj prędkość odśrodkową o 200 G, aż nanocząstki przestaną się agregować. Zsyntetyzowane cząstki tlenku żelaza miały średnicę około pięciu nanometrów.

Po osadzeniu złotej skorupy. Ich rozmiar zwiększył się do około sześciu nanometrów. Kolor koloidalny zmienia się z brązowego dla nanocząstek tlenku żelaza na czerwono-fioletowy po osadzeniu złotej powłoki, a na koniec na fioletowo-szary kolor po złożeniu cząstek pierwotnych.

Te nano klastry mają średnicę około 180 nanometrów. Widma absorpcyjne o różnych rozmiarach cząstek pokazują, że pierwotne nanocząstki ze złotą powłoką z tlenku żelaza mają charakterystyczny pik rezonansowy na poziomie 530 nanometrów. Nie występuje on w gołych cząstkach tlenku żelaza.

Ponadto klastry mają znacznie silniejszy absorbent NIR po sprzężeniu dwóch przeciwciał anty EGFR i anty HER z nanoklastrami. Ich specyficzność została sprawdzona w stosunku do linii komórkowej EGFR dodatniego raka skóry i HER dwóch dodatnich linii komórkowych raka piersi, oba typy oznaczone jako odpowiednie komórki. W przeciwieństwie do tego, nieukierunkowane pegylowane nanoklastry nie oznaczały żadnej linii komórkowej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zsyntetyzować magneto i mononatalne klastry ukierunkowane immunologicznie w jednym semestrze. Tę technikę można wykonać w ciągu kilku godzin, jeśli działa prawidłowo. Ten nowatorski materiał niematerialny może być wykorzystywany w wielu ekscytujących zastosowaniach biomedycznych, w tym w zwiększaniu kontrastu w metodach obrazowania magnetycznego, jednoczesnym wychwytywaniu i wykrywaniu krążących komórek nowotworowych oraz multimodalnym obrazowaniu molekularnym w połączeniu z fototermiczną terapią raka.