Name: Wysoce wydajna ligacja małych cząsteczek RNA do kwantyfikacji mikroRNA za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Poznaj metodę dwuetapowej ligacji małych cząsteczek RNA do kwantyfikacji mikroRNA za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Technika umożliwia dokładną analizę transkryptomową z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować członkom laboratorium Yi, szczególnie Zhaojie Zhangowi za owocne dyskusje na temat projektowania linkerów i skuteczności ligacji, a także Amerykańskiemu Towarzystwu Onkologicznemu za wsparcie tej pracy poprzez stypendium podoktorskie (#125209) dla J.E.L. Badania opisane w tej publikacji były również wspierane przez National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health pod numerem nagrody R01AR059697 (do R.Y.) oraz grant badawczy z Linda Crnic Institute for Down Syndrome. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

UWAGA: Bardzo ważne jest utrzymanie warunków wolnych od RNaz podczas całej procedury.
1. Adenilacja łącznika 3'
<ol>
	<li>Rozcieńczony oligonukleotyd DNA przeznaczony do reakcji ligacji 3' do 100 μM w wolnym od nukleazH2O. 
	UWAGA: Oligonukleotyd powinien mieć grupę fosforanową 5', randomizowany dinukleotyd na końcu 5' i dideoksycytozynę 3'. Grupa fosforanowa 5' jest wymaganiem enzymu Mth do efektywnej adenylacji 5'10. Fosforan może być dodany przez wstępną obróbkę oligonukleotydu kinazą polinukleotydową lub zamówiony bezpośrednio z modyfikacją. Randomizowany dinukleotyd na końcu 5' jest ważny dla zminimalizowania preferencji sekwencji, jaką wykazują ligazy RNA dla niektórych reakcji łączenia końca końcowego w stosunku do innych6. 3' dideoksycytozyna umieszcza element blokujący na końcu 3' oligonukleotydu, aby zahamować tworzenie się konkatamerów łącznik-łącznik podczas kolejnych etapów ligacji, a także służy do blokowania końca 3' cząsteczki miRNA-Linker utworzonej na końcu reakcji ligacji 3'11. Sekwencja łącznika oligonukleotydowego wybrana do bezstronnej metody miR-Seq jest następująca: 5'PO4NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3'.</li>
	<li>Złożyć następującą reakcję adenylacji: 200 pmol 3' oligonukleotyd łącznikowy, 4 μl 10x 5' bufor adenylacyjny DNA, 4 μl 1 mM ATP, 4 μl Ligazy Mth RNA, wolne od nukleazH2Odo końcowej objętości 40 μl.</li>
	<li>Inkubować reakcję w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę. Zakończyć reakcję ogrzewając do temperatury 85 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Wytrącić adenylowany łącznik przez dodanie 2,5 objętości 100% etanolu i 1/3 objętości 10 M octanu amonu w celu usunięcia pozostałości ATP i zapobieżenia nieprzewidzianym ligacjom w przyszłych reakcjach.
	<ol>
		<li>Krótko wymieszaj alkohol, sól i roztwór oligo do jednorodności, wirując z pełną prędkością w mikrowirówce (~15 000 x g) w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Umyj osad w 70% etanolu, wysusz na powietrzu i ponownie zawieś w odpowiedniej objętości H2O bez nukleaz, aby uzyskać 50-100 μM adenylowanego oligo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdź adenylację, uruchamiając 18% żel poliakrylamidowy.
	<ol>
		<li>Przygotuj żel, mieszając ze sobą: 6,3 g mocznika, 6,75 ml 40% akrylamidu i 1,5 ml 10x TBE. DodaćH2Odo 15 ml.</li>
		<li>Mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia mocznika i dodać 150 μl 10% (m/v) nadsiarczanu amonu (APS) i 15 μl tetramethlyethylenodiamine (TEMED).</li>
		<li>Po stwardnieniu żelu należy go uruchomić przez 30 minut przy szerokości żelu 24 V/cm z 1x buforem TBE w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach przepłucz studnie z uruchomionym buforem.</li>
		<li>Wymieszać 5 pmol adenylowanych oligonukleotydów z 2x denaturującym buforem ładującym RNA i równą objętość (95% (v/v) formamidu, 0,02% (w/v) SDS, 0,02% błękitu bromofenolowego (w/v), 0,01% (w/v) cyjanolu ksylenowego, 1,0 mM EDTA), krótko podgrzać do 75 °C i schłodzić na lodzie. Dozować całą próbkę do dołka żelu. Uwzględnij również identyczną ilość nieadenylowanej kontroli i wzorce wielkości o niskiej masie cząsteczkowej.</li>
		<li>Uruchom żel przy napięciu 24 V/cm, aż błękit bromofenolowy znajdzie się w 3/4 na dnie żelu. Zdemontuj aparaturę, żel po barwieniu z 1x roztworem sybr-gold w 1x TBE i wizualizuj na pudełku z transiluminatorem UV (Rysunek 2). 
		UWAGA: Żel oczyszcza adenylowany oligo w sposób podobny do opisanego powyżej, jeśli kontrole "bez wejściowego RNA" skutkują dużą ilością produktu PCR w porównaniu z próbkami z wejściowym RNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ligacja łącznika do końca miRNA 3'
<ol>
	<li>Podwiązanie 3'
	<ol>
		<li>Złóż następujące elementy na lodzie w podanej kolejności: 1,0 μl 50% (w/v) PEG 8000, 0,5 μl 10x bufor ligazy RNA (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT), 1,0 μl adenylowany 3' Linker (100 μM), 0,5 μl inhibitor RNazy, 0,5-8,0 μg całkowitego RNA, 0,5 μl ligazy T4 RNA 2, wolnej od nukleazH2Odo końcowej objętości 5 μl.</li>
		<li>Wymieszać reakcję przez pipetowanie, ponieważ roztwór jest zbyt lepki, aby wirować ze względu na wysokie stężenie PEG 8000. Po dokładnym wymieszaniu umieść reakcję w termocyklerze z podgrzewaną pokrywką. Ustawić blok na 16 °C i inkubować przez 4 godziny 
		UWAGA: Reakcję można zwiększyć do końcowej objętości 20 μl bez utraty skuteczności ligacji. Reaguj przez 4 godziny w temperaturze otoczenia lub przez noc w temperaturze 4 °C, aby uzyskać zasadniczo identyczną wydajność ligacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie żelu
	<ol>
		<li>Po ligacji 3' wymieszać reakcję z równą objętością bufora ładującego 2x RNA. Podgrzej do 70 °C przez 5 minut i ostudź na lodzie.</li>
		<li>Uruchom próbkę na 15% żelu poliakrylamidowym w celu oczyszczenia PAGE.
		<ol>
			<li>Przygotować 15% żel poliakryloamidowy zawierający 7 M mocznika, w sposób podobny do opisanego wcześniej w kroku 1.5.</li>
			<li>Uruchom żel pod napięciem 24 V/cm szerokości żelu przez co najmniej 30 minut. Wyłącz zasilanie, przepłucz studzienki, załaduj próbkę i uruchom żel przy tym samym napięciu, co przed uruchomieniem.</li>
			<li>Załaduj próbkę i uruchom STRONĘ, aż błękit bromofenolowy opuści żel. Pożądany produkt będzie migrował w pobliżu cyjanolu ksylenowego.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie, wizualizacja i wycinanie
	<ol>
		<li>Zdemontuj aparat żelowy i umieść żel na czystej tacy z 1x buforem do pracy (TBE), 1x sybr-gold i kamieniem na 15 minut.</li>
		<li>Usuń żel z naczynia barwiącego i wizualizuj na pudełku z transiluminatorem UV pokrytym czystą folią. Produkt ligacji powinien mieć około 45 nukleotydów długości.</li>
		<li>Obszar zawierający produkt do podwiązywania należy wyciąć czystą żyletką i umieścić w probówce do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja produktu i wytrącanie
	<ol>
		<li>Przekłuć dno probówki do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml igłą o pojemności 30 g i umieścić przebitą probówkę w drugiej czystej, nisko retencyjnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Wirować przez 5 minut przy ~15 000 x g.</li>
		<li>Potwierdź wzrokowo, że cały plasterek żelu przeszedł przez otwór w dętce. W razie potrzeby użyj czystej końcówki pipety, aby wepchnąć niektóre fragmenty żelu bliżej otworu.</li>
		<li>Wyrzucić pustą probówkę o pojemności 0,5 ml i dodać 400 μl buforu kolumnowego o wysokiej zawartości soli (HSCB 400 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% SDS) do zawiesiny akrylamidu. Rurka(i) skalna w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Przenieś zawiesinę do kolumny wirującej z octanu celulozy o grubości 0,22 mikrona za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze. Wirować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej przy ~15 000 x g, aby zebrać cały płyn z matrycy żelu akrylamidowego.</li>
		<li>Przenieść płyn do czystej probówki o niskiej retencji 1,5 ml zawierającej 1 μl 20 mg/ml glikogenu. Dodać równą objętość izopropanolu i 1/10objętości octanu sodu. Wymieszać roztwór, kilkakrotnie odwracając probówkę i wytrącić w zamrażarce o temperaturze -80 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Wirować z pełną prędkością w temperaturze 4 °C przez 20 minut w celu osadzenia kwasu nukleinowego. Usunąć supernatant i przemyć w 70% etanolu. Suszyć na powietrzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej i przejść bezpośrednio do etapu podwiązania 5'.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ligacja łącznika do końca 5' hybrydy łącznika miRNA-3'
<ol>
	<li>Do granulowanego kwasu nukleinowego dodaj następujące składniki: 2 μl PEG 8000 (50% w/v), 0,5 μl 10x RNA Ligas Buffer, 0,5 μl ATP (10 mM), 0,5 μl NN-RNA oligo (100 μM) i H2O do końcowej objętości 4 μl. 
	UWAGA: Skład "oligonugolaktykotydy NN-RNA" jest następujący: 5′ odwrócony dideoksy-TCUACAGUCCGACGAUCNN3′ i został oczyszczony przez producenta za pomocą HPLC.</li>
	<li>Wymieszać tę próbkę, wielokrotnie pipetując w górę i w dół. Rób to przez jakiś czas (do 5 minut), aby upewnić się, że osad został całkowicie ponownie rozpuszczony. Jeśli ponowna solubilizacja jest problematyczna, należy krótko (3-5 minut) podgrzać próbkę do temperatury 37 °C i wznowić pipetowanie w celu wymieszania.</li>
	<li>Gdy osad znajdzie się z powrotem w roztworze, przenieś zawartość do czystej probówki PCR zawierającej 1 μl mieszaniny 1:1 inhibitora RNazy i ligazy T4 RNA 1 (5 jednostek). Ponownie wymieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Inkubować reakcję w termocyklerze w temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Natychmiast przejść do syntezy cDNA.</li>
</ol>
4. Odwrotna transkrypcja/synteza cDNA
<ol>
	<li>Do reakcji ligacji 5' dodać następujące składniki: 2 μl buforu 5x RT, 0,75 μl 100 mM naziemnej telewizji cyfrowej, 1 μl Illumina RT Primer 5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3' (1 μM) i 0,5 μl dNTP (10 mM).</li>
	<li>Mieszać pipetując i podgrzewać do temperatury 65 °C przez 5 minut. Następnie powoli schładzaj na blacie ławki.</li>
	<li>Gdy reakcja ostygnie do temperatury pokojowej, umieść probówkę na lodzie i dodaj po 0,5 μl enzymu odwrotnej transkryptazy i inhibitora RNazy. Wymieszać przez pipetowanie i umieścić w termocyklerze na etapie przedłużenia wskazanym w instrukcjach producenta.</li>
	<li>Po zakończeniu dodaj 5 μl H2O wolnego od nukleaz, aby uzyskać ostateczną objętość biblioteki cDNA do 15 μl.</li>
</ol>
5. Przygotowanie biblioteki
<ol>
	<li>W przypadku indeksowania PCR należy przeprowadzić następującą reakcję na lodzie: 6 μl 5x bufor Phusion, 1 μl dNTPs (10 mM), 0,9 μl DMSO, 0,75 μl 5' Primer (25 μM), 0,75 μl 3' Primer (25 μM), 3 μl biblioteki cDNA (zmienne stężenie w zależności od ilości wejścia), 0,5 μl polimerazy fuzjonowej (1 jednostka), wolna od nukleazH2Odo końcowej objętości 30 μl. Wybierz sekwencje starterów, aby zapewnić kompatybilność z wybranym szablonem i platformą sekwencjonowania.
	<ol>
		<li>Uruchom reakcję PCR z następującymi ustawieniami: wstępna denaturacja w temperaturze 98 °C przez 3 minuty, przez pierwsze 4 cykle, denaturacja 98 °C przez 15 sekund, wyżarzanie w temperaturze 50 °C przez 15 sekund, przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 15 sekund. 
		UWAGA: W zależności od ilości materiału wejściowego należy zmieniać łączną liczbę cykli PCR. Zazwyczaj dla wejścia 1-2 μg całkowitego RNA wystarczy 13 całkowitych cykli PCR do wygenerowania biblioteki miR-Seq.</li>
		<li>Kolejne cykle, np. cykle 5-12, należy przeprowadzać w dwóch etapach, w których cykle wyżarzania i przedłużania są łączone i przeprowadzane w temperaturze 70 °C przez 30 sekund, a denaturacja wynosi ponownie 98 °C przez 15 sek. 
		UWAGA: Objętość reakcji wynosi 30 μl, aby umożliwić wstrzymanie programu PCR i usunięcie podwielokrotności 10 μl przy wcześniej ustalonych numerach cykli w celu monitorowania pojawienia się pożądanego produktu. Zazwyczaj cykle 10, 13 i 16 są wybierane do testowania z całkowitej próbki RNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 8% niedenaturujący żel akrylamidowy, mieszając 2 ml 40% akrylamidu, 1 ml 10x TBE iH2Oz 10 ml. Następnie dodać 100 μl 10% APS i 10 μl TEMED. Wlej żel i pozostaw do zastygnięcia.
	<ol>
		<li>Żel należy wstępnie rozprowadzić przy szerokości żelu 12 V/cm przez 30 minut. Przepłukać studzienki. Dodać 1 μl 10x bufora ładującego (15% Ficoll-400, 66 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1% (w/v) SDS, 0,01% (w/v) błękitu bromofenolowego), dodać 10 μl próbki do każdej studzienki o wymiarach 5 mm x 1 mm x 15 mm. Zazwyczaj do każdej studzienki można załadować do 30 μl próbek. Uruchom próbkę żelu przy 10 V/cm szerokości żelu w 1x buforze TBE, aż niebieski barwnik bromofenolowy po prostu wyczerpie się z dna żelu.</li>
		<li>Odbarwić i zwizualizować żel zgodnie z opisem w kroku 2.3.</li>
		<li>Wyciąć pasmo 146 par zasad i wymywać przez noc w 0,25 ml HSCB w sposób podobny do opisanego w sekcji 2.4. Wytrącić DNA w równej objętości izopropanolu i 1/10objętości octanu sodu. Przemyć granulat w 70% etanolu i ponownie zawiesić w buforze TE.</li>
		<li>Określ ilościowo bibliotekę za pomocą picogreen zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).</li>
<li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14 (10), 109(2013).</li>
<li>Consortium, T. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ENCODE+%28ENCyclopedia+Of+DNA+Elements%29+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project.</a> Science. 306 (5696), 636-640 (2004).</li>
<li>Consortium, T. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Linsen, S. E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+possibilities+of+small+RNA+digital+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling.</a> Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).</li>
<li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), 141(2011).</li>
<li>McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Acceptor+Oligoribonucleotide+Sequence+on+the+T4+RNA+Ligase+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction.</a> European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).</li>
<li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3%E2%80%B2-adapter+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (7), 54(2012).</li>
<li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-stimulated+ligation%3A+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).</li>
<li>Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaeal+RNA+ligase+is+a+homodimeric+protein+that+catalyzes+intramolecular+ligation+of+single-stranded+RNA+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).</li>
<li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Abundant+Class+of+Tiny+RNAs+with+Probable+Regulatory+Roles+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li>
<li>Yi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGCR8-dependent+microRNA+biogenesis+is+essential+for+skin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).</li>
<li>Leung, A. K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Ago2+binding+sites+from+mouse+embryonic+stem+cells+with+and+without+mature+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Opisana w niniejszym dokumencie metodologia wykorzystuje kilka kluczowych zmiennych w celu maksymalizacji efektywności ligacji, a mianowicie wysokie stężenia PEG, użycie randomizowanych łączników i wysokie stężenie łączników2,6,9. Takie podejście pozwala na wiarygodne ilościowe biblioteki sekwencjonowania z całkowitych próbek RNA2. Przeprowadziliśmy wiele miareczkowania wejściowego RNA i doszliśmy do wniosku, że poprzednia metodologia najlepiej nadaje się do całkowitych ilości RNA w zakresie 1-8 μg ...

Metodologie oparte na sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości zostały szeroko stosowane do wielu próbek biologicznych w ostatnich latach, znacznie poszerzając nasze zrozumienie molekularnej złożoności systemów biologicznych3,4. Jednak przygotowanie próbek RNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości często powoduje specyficzne uprzedzenia nieodłącznie związane z zastosowaną metodologią, ograniczając potencjalną użyteczność tych potężnych technik. Te specyficzne dla metody odchylenia zostały dobrze udokumentowane dla opartych na ligacji, preparatów bibliotecznych małych RNA1,2,5,6. Te odchylenia skutkują 1000-krotną zmiennością liczb odczytów dla równomolowych syntetycznych miRNA, co sprawia, że wnioskowanie o obfitości miRNA na podstawie danych sekwencjonowania jest szalenie zmienne i podatne na błędy.
Badania skupiające się na właściwościach ligaz T4 RNA pochodzących z fagów udokumentowały, że enzymy wykazują preferencje oparte na nukleotydach7, które manifestują się jako stronnicze biblioteki w eksperymentach sekwencjonowania o wysokiej przepustowości1,2,8. W celu zminimalizowania uprzedzeń przenoszonych przez ligazy RNA zastosowano wiele strategii; stłoczenie makromolekularne9, randomizacja sekwencji nukleotydów na adapterze, który jest proksymalny do miejsca ligacji6, i zastosowanie wysokich stężeń adaptera ligacji2. Dzięki połączeniu tych trzech podejść opracowaliśmy przepływ pracy do bezstronnego przygotowania małych bibliotek RNA kompatybilnych z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (Rysunek 1). Aby uzyskać bezpośrednie porównania między obecnymi protokołami a naszą zoptymalizowaną metodą, zapoznaj się z naszym ostatnim raportem2. Ta zoptymalizowana metoda zapewnia skuteczność ligacji większą niż 95% zarówno w krokach 3', jak i 5' i pozwala na bezstronną ligację małych cząsteczek RNA z próbek syntetycznych i biologicznych2.

<table><tbody><tr><td>3' Linker (5' fosforylowany, 3' zablokowany)</td><td>Zintegrowane technologie DNA niestandardowe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5'</td><td>Scalone technologie DNA Niestandardowe</td><td></td><td>5' blokowane, oczyszczone HPLC</td></tr><tr><td>T4RNL2 (1-249 K227Q)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0351S</td><td>Specjalizuje się w ligacji wstępnie adenylowanych adapterów DNA</td></tr><tr><td>10x bufor ligacyjny (bez ATP)</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>W zestawie z M0351S</td><td></td></tr><tr><td>10-krotny bufor ligacyjny (z ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>W zestawie z M0204L</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy (mol. Wt. 8,000)</td><td>New England Biolabs</td><td>W zestawie z M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Woda bez nukleaz</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Stwierdziliśmy, że woda pobrana z aparatu destylacyjnego jest tej samej jakości.</td></tr><tr><td>T4RNL1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Indeks górny III RT</td><td>zestaw Invitrogen</td><td>18080-051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Phusion PCR</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Starter Illumina RP1</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td></td> niestandardowe <td>informacje o sekwencji dostępne z startera</td></tr><tr><td>Illumina Illumina RT</td><td>Niestandardowe</td><td></td><td>informacje o sekwencji dostępne z</td></tr><tr><td>Illumina Illumina indeks starter (y)</td><td>Zintegrowane technologie DNA niestandardowe</td><td></td><td>Informacje o sekwencji dostępne w Illumina</td></tr><tr><td>40% Akrylamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP14081</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A3678</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethyethylenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>2x Bufor ładujący RNA denaturujący</td><td>New England Biolabs</td><td>w zestawie z M0351S</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>SpinX Rurki centrikonowe</td><td>Costar</td><td>CLS8161</td><td></td></tr><tr><td>Rurki do mikrofug o niskiej retencji</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do adenylacji</td><td>New England Biolabs</td><td>E2610L</td><td></td></tr></tbody></table>

wysoce wydajna ligacja małych cząsteczek rna do kwantyfikacji mikrorna za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Klonowanie MiRNA i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości, określane jako miR-Seq, stanowi samodzielne podejście obejmujące cały transkryptom do ilościowego oznaczania miRNA z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Technika ta wychwytuje miRNA poprzez przyłączanie adapterów oligonukleotydowych 3' i 5' do cząsteczek miRNA i umożliwia odkrycie miRNA de novo. W połączeniu z potężnymi platformami sekwencjonowania nowej generacji, miR-Seq odegrał kluczową rolę w badaniach nad biologią miRNA. Jednak znaczne odchylenia wprowadzone przez etapy ligacji oligonukleotydów uniemożliwiły zastosowanie miR-Seq jako dokładnego narzędzia do oznaczania ilościowego. Wcześniejsze badania pokazują, że błędy systematyczne w obecnych metodach miR-Seq często prowadzą do niedokładnej kwantyfikacji miRNA z błędami do 1000 razy w przypadku niektórych miRNA1,2. Aby rozwiązać te odchylenia wynikające z ligacji RNA, opracowaliśmy metodę ligacji małego RNA, która zapewnia skuteczność ligacji ponad 95% zarówno dla etapów ligacji 3', jak i 5′. Analiza porównawcza tej ulepszonej metody budowy biblioteki przy użyciu równomolowych lub różnicowo mieszanych syntetycznych miRNA konsekwentnie daje odczyty liczb z mniej niż dwukrotnym odchyleniem od oczekiwanej wartości. Co więcej, ta wysokowydajna metoda miR-Seq umożliwia dokładne profilowanie miRNA w całym genomie z próbek całkowitego RNA in vivo 2.

Oczekiwanymi wynikami dla poprzedniej metody powinny być początkowo obserwacja przesunięcia o jeden nukleotyd (wzrostu) w wielkości oligonukleotydu DNA, który został poddany adenylacji przez ligazę RNA Mth (Rysunek 2). Po ligacji 3’, wizualizacja żelu poliakrylamidowego wskazuje (patrz Rysunek 3) wyraźne pasma o wysokiej masie cząsteczkowej widoczne w regionie 100-300 nukleotydów żelu. Świadczy to o wysokiej jakości (braku degradacji) użytej próbki całkowitego RNA. Po drugie, w ...

MikroRNA (miRNA) to szeroko konserwatywna klasa cząsteczek regulatorowych. Tutaj opisujemy metodę klonowania miRNA, która opiera się na dwóch silnych etapach ligacji, po których następuje sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Nasza metoda pozwala na dokładną ocenę ilościową miRNA w całym genomie.

Wysoce wydajna ligacja małych cząsteczek RNA do kwantyfikacji mikroRNA za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Ogólnym celem tej procedury jest bezstronne przygotowanie mikroRNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Osiąga się to poprzez najpierw przygotowanie lub zakup oligonukleotydów DNA, które są zdolne do ligacji do trzech głównych końców mikro RNA. Drugim krokiem jest ligacja trzech głównych oligonukleotydów DNA do trzech głównych końców mikro RNA.Następnie produkt ligacji jest oczyszczany w żelu, a łącznik oligonukleotydowy z pięcioma pierwszymi RNA jest ligowany do pięciu głównych końców mikro RNA. Ostatnim krokiem jest przekształcenie cząsteczek hybrydowych w CDNA, a następnie amplifikacja CDNA w reakcji łańcuchowej polimerazy. Ostatecznie klonowanie mikroRNA i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości wykorzystuje się do pokazania szerokiego profilu transkryptomu mikroRNA w sposób ilościowy przy rozdzielczości poszczególnych nukleotydów.Główną przewagą naszej techniki nad istniejącymi technikami, takimi jak mikrosekwencjonowanie mikropromieni qPCR blot, jest to, że nasza technika lepiej odzwierciedla rzeczywisty poziom mikropromieniowania w skali laboratoryjnej obejmującej cały transkrypt w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w b

highly-efficient-ligation-small-rna-molecules-for-microrna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Opisujemy protokół PCR w czasie rzeczywistym do profilowania mikroRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Z wyjątkiem protokołów ekstrakcji RNA, procedura może zostać rozszerzona na RNA wyekstrahowane z innych płynów ustrojowych, hodowanych komórek lub próbek tkanek.

Profilowanie mikroRNA płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Celem tego protokołu jest wykorzystanie mikro-dysekcji laserowej jako skutecznej metody izolowania czystych populacji typów komórek z heterogenicznych tkanek prostaty do dalszej analizy RNA.

Laserowa mikrodysekcja ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego do analizy RNA

Tutaj opisujemy krok po kroku strategię izolowania małych RNA, wzbogacania mikroRNA i przygotowywania próbek do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Następnie opisujemy, jak przetwarzać odczyty sekwencji i dopasowywać je do mikroRNA za pomocą narzędzi open source.

Kompletny potok do izolowania i sekwencjonowania mikroRNA oraz analizowania ich przy użyciu narzędzi open source

Prezentujemy szczegółowy protokół naprawy małej biblioteki RNA z mniejszym odchyleniem niż standardowe metody i zwiększoną czułością dla 2'-O-metylowych RNA. Protokół ten można przestrzegać, używając domowych odczynników w celu zaoszczędzenia kosztów lub używając zestawów dla wygody.

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

Ta metoda demonstruje użycie techniki północnej hybrydyzacji do wykrywania miRNA z całkowitego ekstraktu RNA.

Analiza plam RNA w celu wykrywania i kwantyfikacji mikroRNA roślin

Bezwzględna kwantyfikacja Sekwencjonowanie RNA (AQRNA-seq) to technologia opracowana do ilościowego określania krajobrazu wszystkich małych RNA w mieszaninach biologicznych. W tym miejscu zademonstrowano zarówno etapy przygotowania biblioteki, jak i przetwarzania danych AQRNA-seq, określając ilościowo zmiany w puli transferu RNA (tRNA) w Mycobacterium bovis BCG podczas spoczynku wywołanego głodem.

AQRNA-seq do ilościowego oznaczania małych RNA

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Niniejsza metoda opisuje wysokowydajną syntezę in vitro zarówno zmodyfikowanego (z czapeczką), jak i niezmodyfikowanego (bez czapeczki) mRNA z liniowego plazmidu zawierającego gen lucyferazy Gaussia (GLuc). RNA zostaje poddane oczyszczaniu, a następnie część mRNA bez czapeczki zostaje enzymatycznie zmodyfikowana z wykorzystaniem enzymu czapeczkującego wirusa Vaccinia. W ostatnim kroku mRNA jest transfekowane do komórek HeLa, a następnie analizowana jest aktywność lucyferazy w supernatantach...

Transkrypcja in vitro i capping mRNA lucyferazy Gaussia z następującą transfekcją komórek HeLa

Poznaj metodę dwuetapowej ligacji małych cząsteczek RNA do kwantyfikacji mikroRNA za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Technika umożliwia dokładną analizę transkryptomową z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu.

Wysoce wydajna ligacja małych cząsteczek RNA do kwantyfikacji mikroRNA za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Przeglądaj więcej filmów