Wysoce wydajna ligacja małych cząsteczek RNA do kwantyfikacji mikroRNA za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Ogólnym celem tej procedury jest bezstronne przygotowanie mikroRNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Osiąga się to poprzez najpierw przygotowanie lub zakup oligonukleotydów DNA, które są zdolne do ligacji do trzech głównych końców mikro RNA. Drugim krokiem jest ligacja trzech głównych oligonukleotydów DNA do trzech głównych końców mikro RNA.

Następnie produkt ligacji jest oczyszczany w żelu, a łącznik oligonukleotydowy z pięcioma pierwszymi RNA jest ligowany do pięciu głównych końców mikro RNA. Ostatnim krokiem jest przekształcenie cząsteczek hybrydowych w CDNA, a następnie amplifikacja CDNA w reakcji łańcuchowej polimerazy. Ostatecznie klonowanie mikroRNA i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości wykorzystuje się do pokazania szerokiego profilu transkryptomu mikroRNA w sposób ilościowy przy rozdzielczości poszczególnych nukleotydów.

Główną przewagą naszej techniki nad istniejącymi technikami, takimi jak mikrosekwencjonowanie mikropromieni qPCR blot, jest to, że nasza technika lepiej odzwierciedla rzeczywisty poziom mikropromieniowania w skali laboratoryjnej obejmującej cały transkrypt w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w biologię mikroRNA, można ją również zastosować do innych technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, takich jak HC clip i RNA-Seq. Oligonukleotydy DNA do tej procedury są przeznaczone do trzech pierwszych reakcji ligacji i powinny mieć pięć głównych grup fosforanowych, losowy dinukleotyd na pięciu głównych końcach i trzypierwszorzędną cytozynę rozcieńczają oligonukleotydy DNA do 100 mikromolów w wodzie wolnej od nukleaz.

Zmontuj reakcję wentylacji, łącząc te odczynniki 200 piko moli trzech głównych oligonukleotydów łącznikowych, cztery mikrolitry pięciu podstawowych wentylacyjnych DNAA, cztery mikrolitry TP, cztery mikrolitry MT, cztery mikrolitry M-T-H-R-N-A, ligazę i wodę wolną od nukleaz do końcowej objętości 40 mikrolitrów. Inkubować reakcję w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez godzinę. Zakończ reakcję, podgrzewając do 85 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Wytrącić łącznik TED, dodając 2,5 objętości 100% etanolu i jedną trzecią objętości 10-molowego octanu amonu. Aby usunąć pozostałości TP i zapobiec nieoczekiwanym ligacjom w przyszłych reakcjach, należy wymieszać alkohol, sól i roztwór oligonukleotydów do jednorodności, wirując z pełną prędkością w mikrowirówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Umyj osad w 70% etanolu na sucho i ponownie zawieś go w odpowiedniej objętości wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać od 50 do 100 mikromolów wentylowanego oligonukleotydu.

Potwierdź wentylację oligonukleotydu za pomocą elektroforezy na 18% żelu poliakrylamidowym. Uruchom żel przez 30 minut przy szerokości żelu 24 V centymetra za pomocą jednego bufora do pracy XTBE w temperaturze pokojowej. Po upływie 30 minut przepłucz studzienki buforem roboczym.

Oligonukleotydy DNA do tej procedury są przeznaczone do trzech pierwszych reakcji ligacji i powinny mieć pięciopierwszorzędną grupę fosforanową, losowy dinukleotyd na piątym końcu i trzypierwszorzędną oksytocynę. Rozcieńczyć oligonukleotydy DNA do 100 mikromolów w wodzie wolnej od nukleaz. Uruchom żel pod napięciem 24 woltów na centymetr, aż błękit bromofenolowy znajdzie się w trzech czwartych drogi do dna wkładu żelowego.

Zabarwić żel roztworem one x cyber gold w jednym XTBE i wizualizować na pudełku z transluminatorem UV. Powinno nastąpić przesunięcie pojedynczego nukleotydu w wielkości oligonukleotydu DNA, który został poddany wentylacji przez ligazę M-T-H-R-N-A dla trzech pierwszych reakcji ligacji. Zmontuj następujące elementy na lodzie w tej kolejności.

Jeden mikrolitr 50% PEG 8 000 0,5 mikrolitra 10 buforu ligazy XRNA. Jeden mikrolitr wentylowanego łącznika trójelementowego, 0,5 mikrolitra inhibitora RNA, 0,5 do ośmiu mikrogramów całkowitego RNA, 0,5 mikrolitra T, czterech RNA, ligazy dwa i wody wolnej od nukleaz do końcowej objętości pięciu mikrolitrów. Wymieszać reakcję przez pipetowanie po dokładnym wymieszaniu.

Umieść reakcję w termocyklerze z podgrzewaną pokrywką. Ustaw blok na 16 stopni Celsjusza i inkubuj przez cztery godziny. Należy zauważyć, że reakcję można skalować do końcowej objętości 20 mikrolitrów bez utraty skuteczności ligacji.

Po podwiązaniu trzech głównych wymieszać reakcję z równą objętością dwóch ciepła buforowego ładującego XRNA do 70 stopni Celsjusza przez pięć minut i schłodzić na lodzie. Następny żel. Oczyść próbkę za pomocą 15% żelu poliakrylamidowego.

Uruchom żel przy szerokości żelu 24 woltów centymetra przez co najmniej 30 minut. Wyłącz zasilanie i przepłucz studnie pracującym buforem. Załaduj próbkę i uruchom żel przy tym samym napięciu, co podczas biegu wstępnego, aż wydmuchiwany bromofenol właśnie opuści żel.

Pożądany produkt będzie migrował blisko cyjanu ksylenu po zakończeniu elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Umieść żel na czystej tacy z jednym x buforem do pracy i jednym x cyber gold i kołysz się przez 15 minut. Usuń żel z naczynia barwiącego i wizualizuj na pudełku z transluminatorem UV pokrytym czystą folią.

Produkt ligacji powinien mieć około 45 nukleotydów długości. Ponieważ ten produkt ligacji zwykle nie jest widoczny, ważne jest, aby umieścić próbkę syntetycznego RNA w kontroli pozytywnej na sąsiednim pasie przy użyciu czystej żyletki exci, czyli obszaru zawierającego produkt ligacji. Kierując się pozycjami próbki syntetycznego RNA i wzorcami wielkości.

Umieść fragment żelu akcyzowego w 0,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej. Przebij dno mikroprobówki wirówkowej o pojemności 0,5 mililitra igłą o rozmiarze 30 i umieść probówkę przebijającą w drugiej czystej, 1,5-mililitrowej wirówce mikrowirówki o niskiej retencji na pięć minut około 15 000 razy. G. Wizualnie potwierdź, że cały plasterek żelu przesunął się przez otwór w dętce.

W razie potrzeby użyj czystej końcówki pipety, aby wepchnąć niektóre fragmenty żelu bliżej otworu. Wyrzuć pustą probówkę o pojemności 0,5 mililitra i dodaj 400 mikrolitrów buforu kolumnowego o wysokiej zawartości soli do zawiesiny akryloamidu. Następnego dnia rozbujaj rurkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Przenieś zawiesinę do kolumny wirującej z octanu celulozy o grubości 0,22 mikrona za pomocą wirówki z końcówką do pipet o szerokim otworze przez trzy minuty w temperaturze pokojowej około 15 000 razy. G, aby zebrać całą ciecz z matrycy żelu akrylamidowego. Przenieś płyn do czystej, 1,5-mililitrowej probówki o niskiej retencji zawierającej jeden mikrolitr 20 miligramów na mililitr roztworu glikogenu.

Dodać równą objętość izopropanolu i jedną dziesiątą objętości octanu sodu i wymieszać roztwór, kilkakrotnie odwracając probówkę. Wytrącaj się w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez 20 minut. Wirować na pełnych obrotach w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut.

Aby granulować kwas nukleinowy, usuń snat i umyj w 70% etanolu w powietrzu. Suszyć osad przez 10 minut w temperaturze pokojowej i przejść bezpośrednio do pięciu głównych etapów podwiązania. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj następujące składniki do wcześniej granulowanego kwasu nukleinowego: dwa mikrolitry PEG 8, 000 0,5 mikrolitra buforu ligazy RNA, 0,5 mikrolitra TP 0,5 mikrolitra łącznika, oligonukleotyd RNA i wodę do końcowej objętości czterech mikrolitrów.

Wymieszać tę próbkę, pipetując wielokrotnie w górę i w dół przez okres do pięciu minut, aby upewnić się, że osad został całkowicie ponownie rozpuszczony. Gdy osad znajdzie się w roztworze, przenieś zawartość do czystej probówki PCR zawierającej jeden mikrolitr mieszaniny jeden do jednego inhibitora RNA i ligazy T 4 RNA zmieszanej przez pipetowanie w górę iw dół. Inkubuj reakcję w termocyklerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny.

Po zakończeniu reakcji należy natychmiast przejść do syntezy CD NA, jak opisano w tekście protokołu, po ligacji łącznika do trzech głównych końców RNA i analizie stron reakcji. Ostre pasma o dużej masie cząsteczkowej są widoczne w regionie nukleotydowym żelu od 100 do 300, co wskazuje, że cała używana próbka RNA jest wysokiej jakości. Bardzo jasny sygnał w regionie 25 nukleotydów żelu to nadmiar nieligastrowanego syntetycznego RNA z trzema pierwszymi łącznikami wskazuje na ligację wykonaną z pięcioma pikomolami syntetycznego mikro RNA i trzema pierwszymi łącznikami, które zostały oczyszczone z żelu.

Pokazano tutaj autoradiogram trzech reakcji ligacji pierwotnej przeprowadzonych z P 32 5 prime i znakowanych syntetycznym mikro RNA. Liczba godzin, w których reakcja mogła postępować, jest wskazana na górze, a liczby na dole wskazują ilości podwiązane jako procent sumy niepodwiązanych i podwiązanych. Ten autoradiogram przedstawia pięć reakcji ligacji pierwszej przeprowadzonej za pomocą P 32 5 znakowanych na pierwszym końcu, syntetycznych hybryd mikro RNA z trzema głównymi hybrydami łącznikowymi.

Liczby na dole wskazują ilości podwiązanych jako procent sumy nieligowanych i podwiązanych i ujawniają znaczenie stosowania wysokiego stężenia PEG 8 000 małych R-N-A-D-N-A. Biblioteki kompatybilne z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości są następnie generowane przez PCR. Właściwa liczba cykli PCR jest określana empirycznie.

W tym przykładzie wielkość oczekiwanego produktu DNA wynosi 146 par zasad Po opanowaniu technika ta może być wykonana prawidłowo w ciągu zaledwie dwóch dni. Podczas wykonywania tej techniki należy pamiętać, aby wszystkie końcówki i rurki były wolne od RNA.