Name: Długoterminowe obrazowanie poklatkowe eksplantatów ślimaka myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Poznaj metodę długoterminowego obrazowania poklatkowego eksplantatów ślimaka myszy. Technika ta umożliwia obserwację ruchów morfogenetycznych i zmian ekspresji genów reporterowych w czasie pięciodniowego eksperymentu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękuję Willy'emu Sunowi za pomoc techniczną i Dr. Krisowi Gellynckowi za pomocne komentarze oraz trzem anonimowym recenzentom za konstruktywne rady. Praca ta została sfinansowana przez Sunnybrook Hearing Regeneration Initiative

Tkanka myszy została pobrana od myszy Sox2EGFP-reporter 12 utrzymywanych i uśpionych zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Hodowla ślimaków embrionalnych
<ol>
	<li>Uzupełnij zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, mieszając 8,89 ml DMEM, 1 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 μl 100x suplementu N2 i 10 μl 10 mg/ml cyprofloksacyny. Uzupełnij Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), mieszając 495 ml HBSS z 5 ml 100% HEPES.</li>
	<li>Przygotuj naczynia z kulturą szklanego dna:
	<ol>
		<li>W okapie z przepływem laminarnym zawiesić 200 μl substratu do ekstrakcji błony podstawnej w 5 ml DMEM. Przygotuj naczynia hodowlane ze szklanym dnem o średnicy 35 mm z dołkami 10 mm. Odpipetować 150 μl substratu/DMEM do środka każdego naczynia ze szklanym dnem. Szalki te mogą być używane po 40 minutach inkubacji lub mogą być przechowywane w inkubatorze CO2 w temperaturze 35 °C przez co najmniej tydzień. 
		UWAGA: Naczynia ze szklanym dnem są używane z następujących powodów: aby zapewnić, że podstawa naczynia jest przezroczysta i odpowiednia do obrazowania, aby stworzyć studzienkę w środku naczynia, która pozwala eksplantatom osiedlić się w łatwym do zlokalizowania obszarze i wreszcie, aby po eksperymencie próbka mogła zostać przetworzona do barwienia immunologicznego i późniejszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj stanowisko pracy i narzędzia:
	<ol>
		<li>Włącz czystą ławkę z przepływem laminarnym i spryskaj ją 70% EtOH, aby stworzyć czystą przestrzeń roboczą. Namocz kleszcze, łyżki i czarną naczynie z elastomeru silikonowego 184 (mieszanka elastomeru silikonowego 184 (10 części), utwardzacza (1 część) i węgla drzewnego w proszku (2,5 g)) w 70% EtOH.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na czystym stanowisku pracy zbierz zarodki do eksperymentu. Zebrać zarodki odpowiedniej ciąży w lodowatym HBSS z dodatkiem 1% HEPES.
	<ol>
		<li>Określ zewnętrzny lub widoczny narząd, który będzie wykazywał aktywność reporterową i zbadaj zarodki za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Zbierz zarodki, które wykazują aktywność reporterową w lodowatym HBSS uzupełnionym 1% HEPES, ponieważ są one przedmiotem eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz kości skroniowe:
	<ol>
		<li>Pracując szybko, używając chłodnego źródła światła i drobnych kleszczy, zbierz głowy szczeniąt. Uważaj, aby zapiąć kręgi szyjne i poniżej szczęki, aby uniknąć uszkodzenia kości skroniowych.</li>
		<li>Ostrożnie otwórz czaszkę. Usuń mózg, odetnij przód głowy i przenieś tylną czaszkę do świeżego, lodowatego HBSS uzupełnionego 1% HEPES w czystym naczyniu. Ostrożnie wypreparuj kości skroniowe w kształcie orzeszków ziemnych, uważając, aby utrzymać układ przedsionkowy w takcie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypreparuj ślimak:
	<ol>
		<li>Przenieś kości skroniowe do czarnego naczynia pokrytego elastomerem silikonowym w lodowatym HBSS uzupełnionym 1% HEPES, przypnij przedsionkową część kości. Włóż szpilki do owadów pod skosem, aby ustabilizować kość skroniową i zrobić miejsce na kleszcze. Przypinanie jest kluczowym krokiem w tym procesie, ponieważ jeśli kość skroniowa może się zbytnio poruszać, bardzo trudno jest pobrać nienaruszony ślimak.</li>
		<li>Ostrożnie usuń chrząstkę otaczającą ślimak. Włóż jeden ząb kleszczy do chrząstki na zewnętrznej krawędzi podstawy ślimaka i wciśnij otwór w chrząstkę.</li>
		<li>Przypnij klapkę z boku, włóż ząb kleszczy i delikatnie oddziel dach kanału od chrząstki. Przypnij poziomo w poprzek góry i po przekątnej, a następnie ostrożnie zdejmij przednią część kapsułki. Włóż ząbek kleszczyków między pozostałą chrząstkę a kanalik i delikatnie odetnij ostatni odcinek. Wierzchołkowa powierzchnia ślimaka jest teraz odsłonięta.</li>
		<li>Zaczynając od podstawy, złap obszar, w którym dach kanału styka się z nabłonkiem ślimaka i otwórz przewód ślimakowy. Delikatnie zdejmij dach, przycinając w razie potrzeby, aż zostanie całkowicie usunięty. Odetnij wszelkie części membrany pozostawione po środkowej stronie kanału. Oczyść przewód z nadmiaru tkanki mezenchymalnej i odłącz przewód od układu przedsionkowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uprawa eksplantatów:
	<ol>
		<li>Umieść eksplantat, powierzchnią świetlistą do góry, na środku naczynia hodowlanego ze szkła pokrytego podłożem, ostrożnie odciągnij cały płyn i pozostaw na dwie minuty. Dodaj kroplami 150 μl suplementowanego DMEM do eksplantatu, uważając, aby go nie zakłócić. Jeśli eksplant unosi się swobodnie, zmień położenie za pomocą kleszczy, ale należy uważać, aby eksplant osiadł na dnie naczynia, aby mógł przymocować się do podłoża.</li>
		<li>Umieść naczynia ze szklanym dnem na głębokiej szalce Petriego o średnicy 12 cm, z małym naczyniem ze sterylną wodą, aby utrzymać wilgotność. Umieścić kultury w inkubatorze o temperaturze 35 °C na noc, aby eksplant przyczepił się do podłoża i spłaszczył.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obrazowanie na żywo
<ol>
	<li>Wybierz próbki eksplantatów. Użyj fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, aby ocenić stan każdego eksplantowanego ślimaka. Wybieraj tylko eksplantaty, w których kanał jest nienaruszony i przymocowany do szkła od podstawy do wierzchołka.</li>
	<li>Ustawić inkubator w temperaturze 35 °C z 5% CO2 w celu hodowli tkanki ślimakowej. Umieść kultury w mikroskopie inkubatora:
	<ol>
		<li>Delikatnie odessać uzupełniony DMEM i zastąpić go co najmniej 500 μl świeżej pożywki. Do obrazowania do 6 dni lepsze jest 1-1,5 ml. W przypadkach, gdy eksplantaty są luźno przymocowane, odpipetuj pierścień pożywki wokół krawędzi naczynia. Ten dodatkowy płyn utworzy miniaturową "nawilżoną komorę" bez zakłócania eksplantatu, podczas gdy będzie on nadal przyczepiał się do matrycy.
		<ol>
			<li>Alternatywnie, użyj pokryw naczyń na zawiasach, aby otworzyć pokrywki, podczas gdy naczynie pozostaje w swoim dopasowaniu w mikroskopie, jeśli konieczna jest wymiana odczynników w przerwach między pobieraniem obrazów. Pokrywy naczyń na zawiasach umożliwiają otwieranie pokrywek bez naruszania próbek lub wyjmowania naczyń z ich ustawień. Dzięki temu zachowane zostanie ich dokładne położenie dla kolejnych przechwyconych obrazów.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Włóż naczynia ze szklanym dnem zawierające odpowiednie próbki do uchwytu na próbki. Mikroskop w tym przykładzie ma obrotową platformę, na której znajduje się osiem szalek na próbki o średnicy 35 mm.</li>
		<li>Pod pokrywą z przepływem laminarnym zastąp plastikowe pokrywki szklanymi pokrywkami i włóż naczynia do uchwytu na próbki. Umieść uchwyt na miskę na próbkę wewnątrz inkubatora, uważając, aby nie usunąć eksplantatów z dna naczynia ani nie naruszyć podłoża.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj procedurę obrazowania:
	<ol>
		<li>Włącz mikroskop, lampę UV i kamerę, a następnie otwórz oprogramowanie do obrazowania.</li>
		<li>Zlokalizuj próbki, wybierz obszar obrazowania, płaszczyznę ostrości i dostosuj czasy ekspozycji dla każdej potrawy po kolei. Wybierz płaszczyznę ostrości w zależności nie tylko od widoku eksplantatu w momencie rozpoczęcia, ale także mając na uwadze, jak tkanka będzie się poruszać i jak długo będzie trwał przebieg czasu.</li>
		<li>Ustawia stos Z wyśrodkowany wokół wybranej płaszczyzny ogniskowej w kanale fluorescencji. Ustaw częstotliwość i długość próbkowania dla eksperymentu. Częstotliwość próbkowania będzie ograniczona czasem potrzebnym na zebranie obrazów, więc należy ją określić po wybraniu pól widoku i ustawieniu stosu Z. W tym przypadku pobieranie próbek odbywa się co 30 minut przez pięć dni. Czas trwania eksperymentu może wynosić do 14 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wygeneruj film:
	<ol>
		<li>Pod koniec okresu poklatkowego otwórz pliki obrazów. W tym przypadku używane jest oprogramowanie Metamorph, które otwiera sekwencyjne punkty zbiórki. Klatka po klatce wybierz najlepszą płaszczyznę ogniskowej do pokazania interesującej nas populacji komórek.</li>
		<li>Przekonwertuj te obrazy na plik .avi lub wyeksportuj je jako montaż, aby wygenerować zestaw obrazów, które można otworzyć i przeanalizować w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu lub przekonwertować do wielu formatów za pomocą oprogramowania do przetwarzania wideo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).</li>
<li>Shim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+auditory+sensory+epithelium%3A+the+instrument+of+sound+perception%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 38, 1827-1833 (2006).</li>
<li>Van de Water, T., Ruben, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+the+inner+ear+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+otology%2C+rhinology%2C+and+laryngology%22%5BJournal%5D)">Growth of the inner ear in organ culture.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).</li>
<li>Jacques, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+function+for+canonical+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+the+developing+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea.</a> Development. 139, 4395-4404 (2012).</li>
<li>Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+field+laser+confocal+microscopy+for+enhanced+spatial+and+temporal+resolution+in+live-cell+imaging.+Microscopy+and+microanalysis+%3A+the+official+journal+of+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Society+of+America%2C+Microbeam+Analysis+Society%2C+Microscopical+Society+of+Canada%22%5BJournal%5D)">Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy.</a> Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).</li>
<li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+hormone+increases+fibroblast+growth+factor+receptor+expression+and+disrupts+cell+mechanics+in+the+developing+organ+of+corti%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti.</a> BMC developmental biology. 13, 6(2013).</li>
<li>Appler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata3+is+a+critical+regulator+of+cochlear+wiring%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).</li>
<li>Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+Notch+signaling+sustains+epithelial+mirror+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry.</a> Development. 138, 1143-1152 (2011).</li>
<li>Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+high-potential+embryos+by+culture+in+poly%28dimethylsiloxane%29+microwells+and+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+sterility%22%5BJournal%5D)">Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging.</a> Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).</li>
<li>Matsuoka, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology-based+prediction+of+osteogenic+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Ma, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Transforming+growth+factor-beta1+and+-beta2+in+gastric+precancer+and+cancer+and+roles+in+tumor-cell+interactions+with+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Taranova, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+is+a+dose-dependent+regulator+of+retinal+neural+progenitor+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence.</a> Genes & development. 20, 1187-1202 (2006).</li>
<li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p27%28Kip1%29+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. , 1581-1590 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieje kilka kwestii technicznych, które należy wziąć pod uwagę podczas zakładania kultur i ustawiania mikroskopu poklatkowego w celu uzyskania długotrwałego obrazowania.
Jako substrat do hodowli eksplantatów ślimakowych używamy macierzy błony podstawnej, ale podłoże powinno być dopasowane do typu komórki. Na przykład, aby zobrazować hodowle neuronów, lepszym rozwiązaniem może być zapewnienie powłoki fibronektyny. Temperaturę inkubacji i skład gazu należy również dobrać w zależności od rodza...

Ślimak ssaków jest wysoce uporządkowanym, złożonym organem. U myszy, pomiędzy wyłonieniem się prymitywnego ucha wewnętrznego z pęcherzyka usznego w dniu E11 a zakończeniem programu rozwojowego we wczesnych stadiach posturodzeniowych, zachodzi wiele fal sygnalizacji komórkowej i skoordynowanych zmian w ekspresji genów. Od podstawy do wierzchołka przewodu ślimakowego biegnie nabłonek czuciowy wykrywający dźwięk, czyli narząd Cortiego. Rozwój narządu Cortiego jest doskonale kontrolowany w taki sposób, że pod koniec rozwoju będzie on składał się z pojedynczego rzędu wewnętrznych komórek rzęsatych, trzech rzędów zewnętrznych komórek rzęsatych przeplatanych pięcioma rzędami komórek podporowych (dwa rzędy komórek filarowych, trzy rzędy komórek Deitera)1. Odchylenie od tej precyzyjnej kolejności powoduje utratę słuchu, co podkreśla znaczenie badania genezy i wzorca nabłonka czuciowego2.
Hodowla in vitro ślimaka embrionalnego myszy jest niezbędnym narzędziem w badaniu mechanizmów rozwoju narządu Cortiego. Technika ta została opracowana w 1974 roku i w ciągu ostatnich 40 lat była wykorzystywana do wyjaśnienia wielu mechanizmów, za pomocą których określa się nabłonek czuciowy i ustanawia się narząd Cortiego3. Ślimak jest złożonym narządem o dynamicznych procesach rozwojowych; Manipulacja może trwać nawet siedem dni, aby zamanifestować1. Na przykład, po dodaniu inhibitorów GSK 3β do hodowli eksplantatów ślimaka w temperaturze E13, optymalny okres inkubacji w celu zaobserwowania silnego działania związku wynosi sześć dni4.
Obrazowanie na żywo rozwijającego się ślimaka pozwala na badanie zmian w morfologii organu Cortiego, zmian w ekspresji genów, śledzenia migrujących, proliferujących lub umierających komórek, a także pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wyników działania środków farmaceutycznych i zakłócania szlaków sygnałowych. Do tej pory obrazowanie ślimaka na żywo było wykonywane głównie przy użyciu mikroskopii konfokalnej do obrazowania małych obszarów narządu Cortiego w krótkich okresach czasu5-8, ale technika ta ma ograniczenia ze względu na żywotność eksplantatu. W obrazowaniu wpływu długoterminowych manipulacji na powolne procesy rozwojowe kluczowe znaczenie ma środowisko obrazowania. Zazwyczaj konfokalny system obrazowania na żywo wykorzystuje nawilżone plastikowe pudełko, które umieszcza się na mikroskopie. Ciepło i wilgoć mogą uciekać przez szczeliny w komorze inkubacyjnej, gdzie stykają się ze stołem mikroskopu, przez okna dostępu, przez otwory na zawiasach oraz przez szczeliny wokół różnych części mikroskopu, takich jak obiektyw lub źródło światła. Nie jest to optymalne dla utrzymania zdrowych eksplantatów przez więcej niż dwa lub trzy dni.
Definiujemy 'mikroskop inkubatorowy' jako odwrócony mikroskop zamknięty wewnątrz standardowego inkubatoraCO2, a nie inkubator zbudowany wokół mikroskopu. Mikroskop w inkubatorze wydłuża czas trwania eksperymentu w taki sposób, że zamiast obrazowania przez dwa lub trzy dni, próbki mogą być obrazowane przez okres do dwóch tygodni. Mikroskop w inkubatorze zapewnia doskonałe środowisko do wzrostu i różnicowania komórek, przy minimalnych zakłóceniach hodowli eksplantatów i standardowych kontrolowanych warunkach. W badaniach, które odbywają się przez wiele dni, często stosuje się codzienne pobieranie próbek obrazowych, wyjmując je z inkubatora i przenosząc do odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Chociaż takie podejście może być skuteczne, wyjęcie szalek z inkubatora powoduje stres we wrażliwej rozwijającej się tkance. Zmiany kwasowości podłoża hodowlanego i wahania temperatury spowodowane wyjęciem z inkubatora mogą skutkować nieoptymalnym rozwojem i niezdrowym stanem tkanek. Obrazowanie tego samego obszaru w tej samej płaszczyźnie ogniskowej i w tej samej orientacji w każdym punkcie czasowym jest niezwykle trudne. Dzięki zastosowaniu zautomatyzowanego systemu w inkubatorze możliwe jest utrzymanie zdrowych tkanek, zbieranie obrazów w większej liczbie punktów czasowych i zapewnienie, że ten sam obszar zostanie uchwycony w każdej klatce. W ostatnich latach opracowano kilka zintegrowanych inkubatorów tkanek pod mikroskopem, które okazały się przydatne nie tylko w praktyce klinicznej9, ale także w badaniach nad komórkami macierzystymi i nowotworami10,11.
Tutaj prezentujemy protokół długoterminowego obrazowania na żywo embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy. Używamy zautomatyzowanego systemu mikroskopowego wewnątrz standardowego inkubatoraCO2, który ma możliwość rejestrowania obrazów wielu próbek w określonych punktach czasowych. System składa się z odwróconego mikroskopu umieszczonego wewnątrz inkubatora. Próbki są umieszczane na obrotowym podium, które umożliwia obrazowanie wielu próbek w każdym punkcie czasowym. Oświetlenie, przechwytywanie obrazu i obracanie podestu są kontrolowane przez zautomatyzowany system obsługiwany przez oprogramowanie Metamorph. Ustawiając procedurę obrazowania za pomocą oprogramowania operacyjnego, możemy ustawić eksperyment tak, aby trwał do dwóch tygodni przy minimalnej interwencji człowieka. W tym przykładzie używamy zarówno jasnego pola, jak i fluorescencji, aby pokazać wielkoskalowy wzrost i rearanżację ślimaka, a konkretnie regionu prosensorycznego. W tym eksperymencie ślimaki zostaną wypreparowane od myszy reporterowych Sox2EGFP w dniu embrionalnym E13. Zostaną założone kultury in vitro, a następnie zobrazowane w ciągu pięciu dni.

<table><tbody><tr><td>Zmodyfikowane media Eagle firmy Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>12430</td><td>Wiele marek produkuje ten</td></tr><tr><td>ekstrakt z membrany podstawnej&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Matrigel. Alternatywne podobne produkty są dostępne u innych dostawców. http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Zewnątrzkomórkowe+Macierz+Białka+ECM+i+Przyłączenie+Czynniki%28Nauki przyrodnicze%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>16000044</td><td>Wiele marek produkuje to http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>5630080</td><td>Wiele marek produkuje to http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=</td></tr><tr><td>100 x suplement N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>Wiele marek produkuje to http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=</td></tr><tr><td>Ciprofloksacyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17850-5G-F</td><td>Wiele marek produkuje to http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&region=CA</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka</td><td>Gibco</td><td>14170161</td><td>Wiele marek to produkuje. Przed użyciem należy go ponownie sprawdzić. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td></tr><tr><td>Szczypce do drobnych narzędzi</td><td>naukowych</td><td>11254-20</td><td>Numer rozmiaru 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29</td></tr><tr><td>Curette&nbsp;</td><td>Narzędzia Fine Science</td><td>10080-05</td><td>rozmiar 1 mm&nbsp; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118</td></tr><tr><td>Szpilki do owadów</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-35</td><td>Musi być ze stali nierdzewnej http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td></tr><tr><td>50 mm plastikowe naczynia</td><td>Corning/Falcon</td><td>351006</td><td>Wiele marek produkuje ten</td></tr><tr><td>węgiel drzewny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05105-250G</td><td>Wiele marek produkuje podobne przedmioty http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&region=CA</td></tr><tr><td>184 elastomer silikonowy</td><td>Dow / Corning&nbsp;</td><td>SYLGARD&reg; 184 ZESTAW ELASTOMERÓW SILIKONOWYCH</td><td>Potrawy są przygotowywane domowo z kilkutygodniowym wyprzedzeniem. Elastomer silikonowy może pochodzić od dowolnego dostawcy.<a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291">http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291</a></td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>Wymiary naczynia są określone przez specyfikację systemu obrazowania.&nbsp; średnica 35 mm, Szkiełko nakrywkowe 10mm nr 0 pasuje do Olympus Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15& products_id=2</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>Numer telefonu 495101-9804-000</td><td>&nbsp; Model Stemi 2000. Wiele marek produkuje podobne przedmioty http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td></tr><tr><td>Źródło zimnego światła</td><td>Zeiss</td><td>000000-1063-182</td><td>Wiele marek produkuje podobne przedmioty http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy&nbsp;</td><td>Mikrosystemy Leica</td><td>Skontaktuj się z Leica microsystems</td><td>Leica M165-FC. Wiele marek produkuje podobne przedmioty http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td></tr> <tr><td>Inkubator Mikroskop + oprogramowanie do obrazowania</td><td>Olympus</td><td>Kontakt Olympus</td><td>Odwrócona mikrokopa zamknięta w inkubatorze Co2. Mikroskop inkubatorowy Vivaview FL z autorskim oprogramowaniem do obrazowania Metamorpoh. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0</td></tr><tr><td>Czysta ławka</td><td>Thermo Scientific</td><td>51029701</td><td>Wiele marek produkuje podobne przedmioty http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>3310</td><td>Wiele marek produkuje podobne przedmioty http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td></tr><tr><td>Okap z przepływem laminarnym</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026651</td><td>Wiele marek produkuje podobne przedmioty http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td></tr></tbody></table>

długoterminowe obrazowanie poklatkowe eksplantatów ślimaka myszy

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Tutaj prezentujemy metodę długoterminowego obrazowania poklatkowego żywych embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy. Program rozwojowy odpowiedzialny za budowę wysoce uporządkowanej, złożonej struktury ślimaka ssaków trwa około dziesięciu dni. W celu zbadania zmian w ekspresji genów w tym okresie i ich reakcji na manipulacje farmaceutyczne lub genetyczne, konieczne jest długoterminowe obrazowanie. Wcześniej obrazowanie na żywo było zazwyczaj ograniczone przez żywotność eksplantowanej tkanki w wilgotnej komorze na szczycie standardowego mikroskopu. Trudności w utrzymaniu optymalnych warunków do wzrostu kultur w odniesieniu do wilgotności i temperatury nałożyły ograniczenia na długość eksperymentów obrazowych. Mikroskop zintegrowany ze zmodyfikowanym inkubatorem do hodowli tkankowych zapewnia doskonałe środowisko do długotrwałego obrazowania na żywo. W tej metodzie pokazujemy, jak ustalić embrionalne eksplantaty ślimaka myszy i jak używać mikroskopu inkubatora do przeprowadzania obrazowania poklatkowego przy użyciu zarówno jasnego pola, jak i mikroskopii fluorescencyjnej w celu zbadania zachowania typowego eksplantatu ślimakowego w dniu embrionalnym (E) 13 i Sox2, markera komórek prosensorycznych ślimaka, przez 5 dni.

Prezentujemy tutaj zestaw zdjęć (Rysunek 1) oraz film (Rysunek 2) obrazujące wzrost typowego organotypowego eksplantu ślimaka w przypadku wysiania go w stadium E13.5. Do wizualizacji regionu prosensorycznego wykorzystano mysz reporterową Sox2. Film ilustruje, że ślimak ulega wzrostowi, konwergencji i elongacji, przy czym komórki w bocznej części zielonej domeny Sox2 nie wydają się dzielić w miarę rozszerzania się otaczającej je tkanki. Jest to cecha charakterystyczna dl...

Obrazowanie na żywo ślimaka embrionalnego ssaka jest wyzwaniem, ponieważ procesy rozwojowe przebiegają w tempie czasowym przez dziesięć dni. W tym miejscu przedstawiamy metodę hodowli, a następnie obrazowania embrionalnej tkanki eksplantatu ślimaka pobranej od fluorescencyjnej myszy reporterowej w ciągu pięciu dni.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe eksplantatów ślimaka myszy

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ogólnym celem tej procedury jest zobrazowanie embrionalnego ślimaka pobranego od fluorescencyjnej myszy reporterowej w 30-minutowych odstępach przez pięć dni. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie embrionalnego ślimaka dnia 13 od fluorescencyjnych myszy reporterowych. Następnie ślimak jest hodowany in vitro.Następnie hodowle ślimakowe explan umieszcza się w mikroskopie inkubatora. Na koniec przeprowadzana jest zautomatyzowana procedura obrazowania i obrazowany jest ślimak E. Ostatecznie długoterminowe obrazowanie poklatkowe kultur ślimaka explan może być wykorzystane do pokazania ruchów morfogenetycznych nabłonka ślimaka jako całości, a także zmian w ekspresji genów reporterowych w czasie oraz skutków wolno działających środków farmakologicznych.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ręczne fotografowanie kultur funduszy X w czasie, jest to, że system ten jest całkowicie zautomatyzowany. Pozwala to na zebranie większej liczby punktów czasowych i zapewnia, że ten sam obszar ślimaka lub zestaw komórek jest obrazowany w tej samej orientacji w każdym punkcie czasowym, a wszystko to podczas wzrostu w inkubatorze do hodowli tkanek o nieregularnych kształtach. Po uzupełnieniu zmodyfikowanego przez KO podłoża orła lub DMEM i roztworu soli balansowej Hanka lub HBSS zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym.Pod okapem z przepływem laminarnym użyj pięciu mililitrów DMEM uzupełnionego unsu do ponownego zawieszenia, 200 mikrolitrów pipety substratu z membrany podstawnej 150 mikrolitrów do środka każdej 10-milimetrowej studzienki naczynia hodowlanego ze szklanym dnem o średnicy 35 milimetrów. Inkubować przez 40 minut w inkubatorze CO2 w temperaturze 35 stopni Celsjusza. Aby przygotować stanowisko pracy i narzędzia, włącz czystą ławkę z przepływem laminarnym i użyj 70% etanolu, aby ją spryskać i namoczyć kleszcze, łyżki i czarne naczynie pokryte silikonem.Na czystym stanowisku pracy należy zbierać zarodki o odpowiedniej ciąży w lodzie. Zimny HBSS uzupełniony 1%hałdami. Za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego zidentyfikuj zarodki, które wykazują aktywność reporterową na zewnątrz lub w obrębie widocznego narządu i przenieś je do świeżego, lodowatego HBSS z 1% hałdami do zbierania kości skroniowych, używając chłodnego źródła światła i cienkich kleszczy.Pracuj szybko, aby przypiąć kręgi szyjne i poniżej szczęki, aby zebrać głowy. Po pobraniu głów zarodków zgodnie z protokołem tekstowym należy ostrożnie otworzyć czaszkę, następnie usunąć przycięcie mózgu z przodu głowy i przenieść tylną czaszkę do naczynia ze świeżym lodem. Zimny. HBSS, ostrożnie wypreparuj kości skroniowe w kształcie orzeszków ziemnych, uważając, aby układ przedsionkowy pozostał nienaruszony.Aby wypreparować ślimak, przenieś kości skroniowe do naczynia pokrytego czarnym elastomerem silikonowym w lodowatych stosach HBSS. Przypnij przedsionkową część kości, wkładając szpilki pod skosem, aby ustabilizować kość skroniową i stworzyć miejsce na kleszcze. Następnie ostrożnie usuń chrząstkę otaczającą ślimak, wkładając jeden krawat kleszczyków do chrząstki na zewnętrznej krawędzi podstawy ślimaka i przycinając otwór w chrząstce.Przypiąć poziomo w poprzek góry i po przekątnej i ostrożnie zdjąć przednią część kapsułki. Włóż ząbek kleszczy między pozostałą chrząstkę a kanalik i delikatnie odetnij pozostałą chrząstkę. Wierzchołkowa powierzchnia ślimaka jest teraz odsłonięta.Zaczynając od podstawy, złap obszar, w którym dach kanału styka się z nabłonkiem ślimaka i otwórz przewód ślimakowy. W razie potrzeby delikatnie zdejmij listwę dachową, aż zostanie całkowicie usunięta. Odetnij wszelkie części membrany pozostawione po środkowej stronie kanału.Następnie należy oczyścić przewód z nadmiaru tkanki mezenchymalnej i odłączyć przewód od układu przedsionkowego do implantów hodowlanych. Umieść jedną powierzchnię luminalną w środku naczynia hodowlanego ze szkła pokrytego podłożem. Ostrożnie odciągnij płyn i pozostaw na dwie minuty.Następnie kroplami. Dodać 150 mikrolitrów uzupełnionego DMEM do X explan, uważając, aby go nie naruszyć, aby mógł osiąść na podłożu. Umieść naczynia ze szklanym dnem na głębokiej szalce Petriego o średnicy 12 centymetrów z małym naczyniem ze sterylną wodą, aby utrzymać wilgotność.Umieść kultury w inkubatorze o temperaturze 35 stopni Celsjusza na noc, aby plan przyczepił się do podłoża i spłaszczył się w celu wykonania obrazowania na żywo. Po wybraniu próbek użyj fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, aby ocenić stan każdego eksplantowanego ślimaka i wybierz tylko eksplantaty, w których przewód jest nienaruszony i przymocuj do szkła od podstawy do wierzchołka. Ustaw inkubator na 35 stopni Celsjusza z 5% CO2 do hodowli.Tkanka ślimaka delikatnie odessać uzupełniony DMEM z kultur i zastąpić go co najmniej 500 mikrolitrami świeżej pożywki. W przypadkach, gdy eksplan jest luźno przymocowany, odpipetować pierścień pożywki wokół krawędzi naczynia. Ten dodatkowy płyn stworzy miniaturową nawilżoną komorę bez zakłócania eksplanu, podczas gdy będzie on nadal przyczepiał się do matrycy.Mikroskop w tym przykładzie ma obrotową platformę, która mieści 8 35-milimetrowych naczyń na próbki pod pokrywą z przepływem laminarnym. Zastąp plastikowe pokrywki szklanymi pokrywkami i włóż naczynia do uchwytu na naczynia na próbki. Jeśli zachodzi konieczność zmiany pożywki w trakcie trwania eksperymentu.Aby uniknąć zakłócenia eksplanu, należy użyć osłon naczyń na zawiasach, które umożliwią otwarcie pokrywek, podczas gdy naczynie pozostaje w swoim dopasowaniu w mikroskopie, umieścić uchwyt na miskę na próbkę wewnątrz mikroskopu inkubatora, uważając, aby nie przesunąć eksplanu z dna naczynia ani nie naruszyć podłoża. Aby skonfigurować procedurę obrazowania, włącz lampę UV mikroskopu i kamerę, a następnie otwórz oprogramowanie do obrazowania. Dla każdej znajdującej się próbki należy wybrać płaszczyznę ostrości i ekspozycji obszaru obrazowania, mając na uwadze nie tylko widok planu w momencie rozpoczęcia, ale także to, jak tkanka będzie się poruszać w trakcie przebiegu.W kanale fluorescencji ustaw stos Z wyśrodkowany wokół wybranej płaszczyzny ogniskowej. Następnie ustaw częstotliwość i długość pobierania próbek dla eksperymentu. Będzie to ograniczone czasem potrzebnym na zebranie obrazów w celu wygenerowania filmu na koniec okresu poklatkowego.Użyj oprogramowania, takiego jak METAMORPH, aby otworzyć pliki obrazów dla próbki klatka po klatce. Wybierz najlepszą płaszczyznę ogniskowej do pokazania interesującej nas populacji komórek. Na koniec przekonwertuj obrazy na plik z kropką VI lub wyeksportuj je jako montaż, aby wygenerować zestaw obrazów, które można otworzyć i przeanalizować w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu lub przekonwertować na inne formaty.Pokazano tutaj film pokazujący, jak organotypowy plan ślimakowy będzie rósł po platerowaniu. Na E 13.5 użyto myszy reporterowej SOX z dwoma detektorami do wizualizacji obszaru czuciowego profesjonalisty, widzianego na zielono, gdy komórki regionów nieczuciowych dzielą się i poruszają. Nieproliferacyjny obszar czuciowy w kolorze zielonym ulega rearanżacji tkanek i zbieżnym ruchom rozciągania.Drugi eksperyment poklatkowy skupiający się na środkowej podstawie innego teleskopu ślimakowego pokazuje, że w miarę rozszerzania zalet. Region czuciowy zwęża się, gdy po raz pierwszy w hodowli. Grubość tkanki umożliwia identyfikację obszarów ekspresji, ale nie poszczególnych komórek.Jednak po trzech dniach w hodowli tkanka znacznie się spłaszczyła, co umożliwia wizualizację poszczególnych komórek fluorescencyjnych Po tej procedurze. Inne metody, takie jak barwienie immunofluorescencyjne lub ekstrakcja białek i RNA, mogą być wykonywane w celu oceny zmian w ekspresji genów na poziomie molekularnym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać sekcję i hodowlę ślimaka oraz jak używać mikroskopu inkubatora do wykonywania obrazowania na żywo na całym planie przez okres kilku dni.

long-term-time-lapse-imaging-of-mouse-cochlear-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje proces izolowania eksplantatów spiralnych zwojów z ucha wewnętrznego i ich wspólnej hodowli z organem Cortiego na matrycy wieloelektrodowej. Spiralne zwoje są ostrożnie ekstrahowane i dzielone na mniejsze skrawki tkanek lub eksplantaty. Te eksplantaty są hodowane w obszarze aktywnym matrycy wieloelektrodowej, aby promować wzrost procesów neuronalnych.

Hodowla eksplantatów neuronów spiralnych myszy na matrycach wieloelektrodowych

Źródło: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki. J. Vis. Exp. (2021)Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dynamiki dendrytycznej w żywych eksplantatach siatkówki myszy. Przedstawiono w nim etapy stabilizacji siatkówki pod mikroskopem konfokalnym, wykonywania obrazowania epifluorescencyjnego w celu...

Poklatkowe obrazowanie konfokalne dynamiki dendrytycznej neuronów w eksplantatach siatkówki myszy

Prezentujemy metodę, która opisuje izolację i hodowlę eksplantatów ślimaka z embrionalnego ucha wewnętrznego myszy.  Demonstrujemy również metodę transferu genów do eksplantatów ślimakowych za pomocą elektroporacji fali prostokątnej. Hodowla eksplantatów in vitro w połączeniu z techniką transferu genów umożliwia naukowcom badanie skutków zmiany ekspresji genów podczas rozwoju.

Hodowla embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy i transfer genów za pomocą elektroporacji

Przedstawiamy metodę izolowania dorosłego organu Cortiego jako trzech nienaruszonych zwojów ślimaka (wierzchołek, środek i podstawa). Demonstrujemy również procedurę barwienia immunologicznego za pomocą fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał. Razem techniki te pozwalają na badanie komórek rzęsatych, komórek podporowych i innych typów komórek znajdujących się w ślimaku.

Rozwarstwienie całej góry i immunofluorescencja ślimaka dorosłej myszy

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie przygotowania, hodowli, leczenia i barwienia immunologicznego eksplantatów ślimakowych u noworodków myszy. Technika ta może być wykorzystana jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach słuchu.

Technika eksplantatu ślimakowego u noworodków jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach słuchu

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalny protokół oceny cech morfologicznych i statusu funkcjonalnego synaps wstęgowych u normalnych myszy. Prezentowany model nadaje się również do modeli z ograniczeniami synaptopatii ślimakowej wywołanych hałasem i związanych z wiekiem. Omówiono również korelacyjne wyniki poprzednich badań na myszach.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

Ten artykuł przedstawia zmodyfikowaną metodę przygotowania powierzchni ślimaka, która wymaga odwapnienia i użycia kleju komórkowego i tkankowego do przyklejenia kawałków nabłonka ślimaka do 10 mm okrągłych szkiełek nakrywkowych do immunohistochemii u dorosłych ślimaków myszy.

Przygotowanie powierzchni ślimaka u dorosłej myszy

Tutaj prezentujemy metodę wizualizacji wychwytu 3 kDa Texas Red-labeled dextranu w słuchowych komórkach rzęsatych z funkcjonalnymi kanałami mechanotransdukcji. Ponadto dektrans o stężeniu 3–10 kDa może być stosowany do badania endocytozy we włosach i komórkach podporowych narządu Cortiego.

Znakowanie i wychwyt dekstranu w żywych i funkcjonalnych mysich komórkach rzęsatych ślimaka

W tym badaniu prezentujemy metodę obrazowania w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii konfokalnej do obserwacji komórek poruszających się w kierunku uszkodzonej tkanki poprzez inkubację ex vivo z nabłonkiem ślimaka zawierającym narząd Cortiego.

Obrazowanie poklatkowe żywych komórek in vitro w celu zbadania migracji komórek w kierunku narządu Cortiego

Obecny protokół aktualizuje poprzednie protokoły i zawiera stosunkowo proste podejścia do hodowli wysokiej jakości eksplantatów ślimakowych. Zapewnia to niezawodne pozyskiwanie danych i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości w żywych i stałych komórkach. Protokół ten wspiera trwający trend badania komórek ucha wewnętrznego.

Eksplantaty ślimakowe całego noworodka jako model in vitro

Protokół przedstawia nowe narzędzie do uproszczenia obrazowania przyżyciowego za pomocą odwróconej mikroskopii konfokalnej.

Uproszczone podejście do obrazowania przyżyciowego do długoterminowego monitorowania dynamiki tkanki nabłonkowej pod odwróconym mikroskopem konfokalnym

Poznaj metodę długoterminowego obrazowania poklatkowego eksplantatów ślimaka myszy. Technika ta umożliwia obserwację ruchów morfogenetycznych i zmian ekspresji genów reporterowych w czasie pięciodniowego eksperymentu.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe eksplantatów ślimaka myszy

Przeglądaj więcej filmów