Długoterminowe obrazowanie poklatkowe eksplantatów ślimaka myszy

Ogólnym celem tej procedury jest zobrazowanie embrionalnego ślimaka pobranego od fluorescencyjnej myszy reporterowej w 30-minutowych odstępach przez pięć dni. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie embrionalnego ślimaka dnia 13 od fluorescencyjnych myszy reporterowych. Następnie ślimak jest hodowany in vitro.

Następnie hodowle ślimakowe explan umieszcza się w mikroskopie inkubatora. Na koniec przeprowadzana jest zautomatyzowana procedura obrazowania i obrazowany jest ślimak E. Ostatecznie długoterminowe obrazowanie poklatkowe kultur ślimaka explan może być wykorzystane do pokazania ruchów morfogenetycznych nabłonka ślimaka jako całości, a także zmian w ekspresji genów reporterowych w czasie oraz skutków wolno działających środków farmakologicznych.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ręczne fotografowanie kultur funduszy X w czasie, jest to, że system ten jest całkowicie zautomatyzowany. Pozwala to na zebranie większej liczby punktów czasowych i zapewnia, że ten sam obszar ślimaka lub zestaw komórek jest obrazowany w tej samej orientacji w każdym punkcie czasowym, a wszystko to podczas wzrostu w inkubatorze do hodowli tkanek o nieregularnych kształtach. Po uzupełnieniu zmodyfikowanego przez KO podłoża orła lub DMEM i roztworu soli balansowej Hanka lub HBSS zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym.

Pod okapem z przepływem laminarnym użyj pięciu mililitrów DMEM uzupełnionego unsu do ponownego zawieszenia, 200 mikrolitrów pipety substratu z membrany podstawnej 150 mikrolitrów do środka każdej 10-milimetrowej studzienki naczynia hodowlanego ze szklanym dnem o średnicy 35 milimetrów. Inkubować przez 40 minut w inkubatorze CO2 w temperaturze 35 stopni Celsjusza. Aby przygotować stanowisko pracy i narzędzia, włącz czystą ławkę z przepływem laminarnym i użyj 70% etanolu, aby ją spryskać i namoczyć kleszcze, łyżki i czarne naczynie pokryte silikonem.

Na czystym stanowisku pracy należy zbierać zarodki o odpowiedniej ciąży w lodzie. Zimny HBSS uzupełniony 1%hałdami. Za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego zidentyfikuj zarodki, które wykazują aktywność reporterową na zewnątrz lub w obrębie widocznego narządu i przenieś je do świeżego, lodowatego HBSS z 1% hałdami do zbierania kości skroniowych, używając chłodnego źródła światła i cienkich kleszczy.

Pracuj szybko, aby przypiąć kręgi szyjne i poniżej szczęki, aby zebrać głowy. Po pobraniu głów zarodków zgodnie z protokołem tekstowym należy ostrożnie otworzyć czaszkę, następnie usunąć przycięcie mózgu z przodu głowy i przenieść tylną czaszkę do naczynia ze świeżym lodem. Zimny. HBSS, ostrożnie wypreparuj kości skroniowe w kształcie orzeszków ziemnych, uważając, aby układ przedsionkowy pozostał nienaruszony.

Aby wypreparować ślimak, przenieś kości skroniowe do naczynia pokrytego czarnym elastomerem silikonowym w lodowatych stosach HBSS. Przypnij przedsionkową część kości, wkładając szpilki pod skosem, aby ustabilizować kość skroniową i stworzyć miejsce na kleszcze. Następnie ostrożnie usuń chrząstkę otaczającą ślimak, wkładając jeden krawat kleszczyków do chrząstki na zewnętrznej krawędzi podstawy ślimaka i przycinając otwór w chrząstce.

Przypiąć poziomo w poprzek góry i po przekątnej i ostrożnie zdjąć przednią część kapsułki. Włóż ząbek kleszczy między pozostałą chrząstkę a kanalik i delikatnie odetnij pozostałą chrząstkę. Wierzchołkowa powierzchnia ślimaka jest teraz odsłonięta.

Zaczynając od podstawy, złap obszar, w którym dach kanału styka się z nabłonkiem ślimaka i otwórz przewód ślimakowy. W razie potrzeby delikatnie zdejmij listwę dachową, aż zostanie całkowicie usunięta. Odetnij wszelkie części membrany pozostawione po środkowej stronie kanału.

Następnie należy oczyścić przewód z nadmiaru tkanki mezenchymalnej i odłączyć przewód od układu przedsionkowego do implantów hodowlanych. Umieść jedną powierzchnię luminalną w środku naczynia hodowlanego ze szkła pokrytego podłożem. Ostrożnie odciągnij płyn i pozostaw na dwie minuty.

Następnie kroplami. Dodać 150 mikrolitrów uzupełnionego DMEM do X explan, uważając, aby go nie naruszyć, aby mógł osiąść na podłożu. Umieść naczynia ze szklanym dnem na głębokiej szalce Petriego o średnicy 12 centymetrów z małym naczyniem ze sterylną wodą, aby utrzymać wilgotność.

Umieść kultury w inkubatorze o temperaturze 35 stopni Celsjusza na noc, aby plan przyczepił się do podłoża i spłaszczył się w celu wykonania obrazowania na żywo. Po wybraniu próbek użyj fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, aby ocenić stan każdego eksplantowanego ślimaka i wybierz tylko eksplantaty, w których przewód jest nienaruszony i przymocuj do szkła od podstawy do wierzchołka. Ustaw inkubator na 35 stopni Celsjusza z 5% CO2 do hodowli.

Tkanka ślimaka delikatnie odessać uzupełniony DMEM z kultur i zastąpić go co najmniej 500 mikrolitrami świeżej pożywki. W przypadkach, gdy eksplan jest luźno przymocowany, odpipetować pierścień pożywki wokół krawędzi naczynia. Ten dodatkowy płyn stworzy miniaturową nawilżoną komorę bez zakłócania eksplanu, podczas gdy będzie on nadal przyczepiał się do matrycy.

Mikroskop w tym przykładzie ma obrotową platformę, która mieści 8 35-milimetrowych naczyń na próbki pod pokrywą z przepływem laminarnym. Zastąp plastikowe pokrywki szklanymi pokrywkami i włóż naczynia do uchwytu na naczynia na próbki. Jeśli zachodzi konieczność zmiany pożywki w trakcie trwania eksperymentu.

Aby uniknąć zakłócenia eksplanu, należy użyć osłon naczyń na zawiasach, które umożliwią otwarcie pokrywek, podczas gdy naczynie pozostaje w swoim dopasowaniu w mikroskopie, umieścić uchwyt na miskę na próbkę wewnątrz mikroskopu inkubatora, uważając, aby nie przesunąć eksplanu z dna naczynia ani nie naruszyć podłoża. Aby skonfigurować procedurę obrazowania, włącz lampę UV mikroskopu i kamerę, a następnie otwórz oprogramowanie do obrazowania. Dla każdej znajdującej się próbki należy wybrać płaszczyznę ostrości i ekspozycji obszaru obrazowania, mając na uwadze nie tylko widok planu w momencie rozpoczęcia, ale także to, jak tkanka będzie się poruszać w trakcie przebiegu.

W kanale fluorescencji ustaw stos Z wyśrodkowany wokół wybranej płaszczyzny ogniskowej. Następnie ustaw częstotliwość i długość pobierania próbek dla eksperymentu. Będzie to ograniczone czasem potrzebnym na zebranie obrazów w celu wygenerowania filmu na koniec okresu poklatkowego.

Użyj oprogramowania, takiego jak METAMORPH, aby otworzyć pliki obrazów dla próbki klatka po klatce. Wybierz najlepszą płaszczyznę ogniskowej do pokazania interesującej nas populacji komórek. Na koniec przekonwertuj obrazy na plik z kropką VI lub wyeksportuj je jako montaż, aby wygenerować zestaw obrazów, które można otworzyć i przeanalizować w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu lub przekonwertować na inne formaty.

Pokazano tutaj film pokazujący, jak organotypowy plan ślimakowy będzie rósł po platerowaniu. Na E 13.5 użyto myszy reporterowej SOX z dwoma detektorami do wizualizacji obszaru czuciowego profesjonalisty, widzianego na zielono, gdy komórki regionów nieczuciowych dzielą się i poruszają. Nieproliferacyjny obszar czuciowy w kolorze zielonym ulega rearanżacji tkanek i zbieżnym ruchom rozciągania.

Drugi eksperyment poklatkowy skupiający się na środkowej podstawie innego teleskopu ślimakowego pokazuje, że w miarę rozszerzania zalet. Region czuciowy zwęża się, gdy po raz pierwszy w hodowli. Grubość tkanki umożliwia identyfikację obszarów ekspresji, ale nie poszczególnych komórek.

Jednak po trzech dniach w hodowli tkanka znacznie się spłaszczyła, co umożliwia wizualizację poszczególnych komórek fluorescencyjnych Po tej procedurze. Inne metody, takie jak barwienie immunofluorescencyjne lub ekstrakcja białek i RNA, mogą być wykonywane w celu oceny zmian w ekspresji genów na poziomie molekularnym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać sekcję i hodowlę ślimaka oraz jak używać mikroskopu inkubatora do wykonywania obrazowania na żywo na całym planie przez okres kilku dni.