Name: Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: Odkryj analizę sekwencjonowania RNA do identyfikacji czynników transkrypcyjnych w komórkach EML myszy. Ta metoda pozwala badać mechanizmy samoodnawiania i różnicowania komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JQW, SZ, SD i KC są wspierane przez granty z National Institutes of Health i Staman Ogilvie Fund - Memorial Hermann Foundation.

1. Hodowla komórek EML i separacja komórek Lin-CD34+ oraz Lin-CD34- przy użyciu systemu magnetycznego sortowania komórek oraz metody sortowania komórek aktywowanego fluorescencją
<ol>
	<li>Przygotowanie pożywki do hodowli komórek nerek młodej chomika (BHK) w celu pozyskania czynnika wzrostu komórek macierzystych:
	<ol>
		<li>Hodować komórki BHK w pożywce DMEM zawierającej 10% FBS w kolbie 25 cm2 (Tabela 1) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórek.</li>
		<li>Gdy komórki osiągną 80-90% konfluencji, przemyć je raz 10 ml PBS. Do monowarstwy dodać 5 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA i inkubować komórki przez 1-5 min w temperaturze pokojowej (RT), aż do ich odklejenia.</li>
		<li>Delikatnie pipetować roztwór w górę i w dół, aby rozbić agregaty komórek. Do kolby dodać 5 ml kompletnej pożywki DMEM, aby zatrzymać działanie trypsyny. Zebrać komórki poprzez wirowanie przy 200 x g przez 5 min w RT.</li>
		<li>Usunąć pożywkę i resuspendować osad komórkowy w 10 ml świeżej pożywki do hodowli komórek BHK.</li>
		<li>Przenieść 2 ml zawiesiny komórkowej z kroku 1.1.4 do nowej kolby 75 cm2 i dodać do niej 48 ml świeżej pożywki do hodowli komórek BHK.</li>
		<li>Hodować komórki BHK przez dwa dni i zebrać pożywkę hodowlaną. Przefiltrować pożywkę przez filtr 0,45 μm. Przechowywać pożywkę w temperaturze -20 °C do dalszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla komórek EML:
	<ol>
		<li>Hodować komórki EML (w zawiesinie) w podstawowej pożywce EML zawierającej pożywkę do hodowli komórek BHK (Tabela 1) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórek.</li>
		<li>Utrzymywać niską gęstość komórek EML (0,5-5 x 105 komórek/ml), tak aby gęstość szczytowa nie przekraczała 6 x 105 komórek/ml. Przesiewać komórki co 2-3 dni w stosunku 1:5. Przesiewać komórki EML delikatnie i utylizować hodowlę po 10 pasażach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuwanie komórek z dodatnimi markerami linii (lineage positive):
	<ol>
		<li>Zebrać komórki EML poprzez wirowanie przy 200 x g przez 5 min i przemyć je raz PBS. Zebrać komórki poprzez wirowanie przy 200 x g przez 5 min.</li>
		<li>Resuspendować komórki w PBS i policzyć je za pomocą hemocytometru. Ustalić stężenie przeciwciał w kolejnym etapie separacji komórek w zależności od liczby komórek (należy odnieść się do instrukcji dostarczonych przez producenta systemu izolacji komórek).</li>
		<li>Wyizolować komórki ujemne pod kątem markerów linii (Lin-) przy użyciu koktajlu przeciwciał lineage (koktajl przeciwciał monoklonalnych sprzężonych z biotyną: CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1(Ly-6G/C), 7-4 i Ter-119) oraz magnetycznego systemu sortowania komórek (MACS) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Separacja komórek Lin-CD34+ i Lin-CD34-:
	<ol>
		<li>Odwirować komórki Lin- z kroku 1.3.3 przy 200 x g przez 5 min. Resuspendować osad komórkowy w PBS i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Przemyć komórki dwukrotnie buforem FACS i odwirować przy 200 x g przez 5 min.</li>
		<li>Oznaczyć pięć probótek do mikrowirowania o pojemności 1,5 ml numerami od 1 do 5. Resuspendować komórki w 100 µl buforu FACS na 106 komórek (106 komórek na probówkę).</li>
		<li>Do probótek 1 i 2 dodać 1 µg przeciwciała Anti-Mouse CD34 FITC i delikatnie wymieszać zawartość probótek.</li>
		<li>Inkubować wszystkie probówki w temperaturze 4 °C przez 1 h w ciemności.</li>
		<li>Do probówki 1 dodać 0,25 µg przeciwciała Anti-Sca1 sprzężonego z PE oraz 20 µl przeciwciał z koktajlu Lineage sprzężonych z APC; do probówki 3 dodać 0,25 µg przeciwciała Anti-Sca1 sprzężonego z PE, a do probówki 4 dodać 20 µl przeciwciał z koktajlu Lineage sprzężonych z APC.</li>
		<li>Delikatnie wymieszać wszystkie probówki i inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez dodatkowe 30 min w ciemności.</li>
		<li>Dodać do komórek 300 µl buforu FACS i odwirować przy 200 x g przez 5 min.</li>
		<li>Przemyć komórki trzykrotnie 500 µl buforu FACS.</li>
		<li>Resuspendować osad komórkowy w 500 µl buforu FACS.</li>
		<li>Wykorzystać komórki z probówek 2, 3, 4 i 5 do ustawienia kompensacji. Wyizolować komórki Lin-SCA+CD34+ oraz Lin-SCA-CD34- z probówki 1 za pomocą FACS Aria.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie RNA i konstrukcja biblioteki do sekwencjonowania wysokoprzepustowego
<ol>
	<li>Izolacja, analiza jakości i kwantyfikacja RNA:
	<ol>
		<li>Wyodrębnić całkowite RNA z komórek Lin-CD34+ oraz Lin-CD34- odpowiednio przy użyciu TRIzol, zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Usunąć zanieczyszczone DNA przy użyciu doksyrybonukleazy I (DNase I), postępując zgodnie z protokołem producenta. Opcjonalnie, na tym etapie RNA można przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania.</li>
		<li>Ocenić jakość całkowitego RNA za pomocą Bioanalizatora zgodnie z instrukcjami dostawcy. Należy użyć próbek RNA z numerem integralności RNA (RIN) większym niż 9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konstrukcja biblioteki i sekwencjonowanie wysokoprzepustowe: 
	UWAGA: Niniejszy protokół opisuje RNA-Seq z wykorzystaniem platformy Illumina. W przypadku innych platform sekwencjonowania wymagane są inne metody przygotowania bibliotek.
	<ol>
		<li>Do przygotowania biblioteki użyć od 0,1 do 4 µg wysokiej jakości całkowitego RNA na próbkę. Zazwyczaj z 105 komórek EML można wyodrębnić 2 µg całkowitego RNA.</li>
		<li>Użyć systemu przygotowania próbek do sekwencjonowania RNA w celu oczyszczania i fragmentacji RNA, syntezy pierwszej i drugiej nici cDNA, naprawy końców, adenylacji końców 3’, ligacji adapterów i amplifikacji PCR, postępując zgodnie ze szczegółowymi standardowymi procedurami z instrukcji dostawcy.
		<ol>
			<li>Przeprowadzić pozytywną selekcję mRNA PolyA za pomocą magnetycznych kulek oligo-dT i sfragmentować mRNA.</li>
			<li>Przeprowadzić odwrotną transkrypcję z użyciem randomowych starterów w celu otrzymania cDNA, a następnie zsyntezować drugą nić cDNA, aby uzyskać dwuniciowe cDNA.</li>
			<li>Usunąć nawisy 3' i uzupełnić nawisy 5' za pomocą polimerazy DNA. Zaadenylować końce 3', aby zapobiec ligacji fragmentów cDNA między sobą.</li>
			<li>Dodać multipleksowe adaptery indeksujące do obu końców dscDNA. Przeprowadzić PCR w celu wzbogacenia fragmentów DNA.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zmierzyć stosunek A260/A280 za pomocą spektrofotometru w celu uzyskania informacji o stężeniu biblioteki.</li>
		<li>Ocenić jakość biblioteki i zmierzyć zakres wielkości fragmentów DNA za pomocą Bioanalizatora.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza danych
W celu uzyskania informacji na temat oprogramowania wykorzystanego w tej części, prosimy zapoznać się z (Tabelą 2).
<ol>
	<li>Przetwarzanie plików danych do dalszej analizy:
	<ol>
		<li>Konwersja pliku .bcl (base call file) na plik .fastq przy użyciu oprogramowania CASAVA (Illumina, wersja 1.8.2).
		<ol>
			<li>Uruchom „Terminal” w systemie Linux. Przejdź do folderu danych zawierającego plik z maszyny do sekwencjonowania Illumina HiSeq2000. Zakładając, że folder z wynikami to „NASboy1/JiaqianLabData/HiSeq_RUN/2013_07_11/130627_SN860_0309_A_2013-166_H0PW9ADXX/”, wpisz polecenie przedstawione na Rysunku S1A i wejdź do folderu danych.</li>
			<li>Zainstaluj CASAVA 1.8.2 w systemie Linux. Zakładając, że folder wyjściowy to „Unaligned”, użyj polecenia z Rysunku S1B, aby przygotować plik konfiguracyjny do konwersji. Użyj opcji --fastq-cluster-count 0, aby zapewnić utworzenie tylko jednego pliku .fastq dla każdej próbki. Wygenerowany plik .fastq jest w formacie .gz. Rozpakuj go do dalszej analizy (Rysunek S1B).</li>
			<li>Po wygenerowaniu folderu „Unaligned”, przejdź do folderu „Unaligned” (Rysunek S1C).</li>
			<li>Użyj polecenia z Rysunku S1D, aby rozpocząć proces konwersji. Parametr „-j” określa liczbę rdzeni CPU, które zostaną wykorzystane.</li>
			<li>Po zakończeniu procesu konwersji przez system, przejdź do folderu z wynikami wewnątrz folderu „Unaligned” (Rysunek S1E).</li>
			<li>Użyj polecenia z Rysunku S1F, aby rozpakować plik .fastq.gz do pliku .fastq w folderze każdej próbki.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie nowych transkryptów i ocena poziomu ekspresji przy użyciu Tuxedo Suite26:
	<ol>
		<li>Mapowanie odczytów RNA-Seq typu paired-end do referencyjnego genomu myszy (UCSC wersja mm9, pobrana ze strony <a href="http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html" target="_blank">http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html</a>) przy użyciu oprogramowania Tophat (wersja 1.3.3)27, które wykorzystuje maper odczytów Bowtie (wersja 0.12.7)28. Tophat jest uruchamiany z opcją „-no-novel-juncs” w celu poprawy dokładności szacowania poziomu ekspresji.
		<ol>
			<li>Umieść pliki .fastq w folderze, w którym zostanie przeprowadzony proces mapowania. Zakładając, że dla próbki sekwencjonowania paired-end istnieją 2 pliki .fastq (zmianione nazwy na Example1.read1, Example1.read2), użyj polecenia z Rysunku S2, aby wykonać mapowanie (dostosuj parametry do ustawień systemu). Parametr „-p” określa liczbę rdzeni CPU, które zostaną wykorzystane. Parametry „–r” oraz „–mate-std-dev” można uzyskać z kontroli jakości (QC) biblioteki lub wywnioskować z podzbioru zmapowanych odczytów (Rysunek S2).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Asemblacja zmapowanych odczytów w transkrypty RNA przy użyciu oprogramowania Cufflinks (wersja 1.3.0)29. Uruchom Cufflinks, korzystając z pliku adnotacji znanych genów (ten sam plik .gtf, którego użyto w Tophat) oraz pliku .bam wygenerowanego przez Tophat.
		<ol>
			<li>Po zakończeniu pracy programu Tophat, w tym samym folderze użyj polecenia z Rysunku S3A, aby uruchomić cufflinks w celu konstrukcji transkryptomu i oszacowania poziomu ekspresji transkryptów. Plik „mm9_repeatMasker.gtf” oraz pliki sekwencji genomu w folderze „GenomeSeqMM9” można pobrać z przeglądarki UCSC Genome Browser.</li>
			<li>Wynikowe pliki genes.expr i transcripts.expr zawierają wartości ekspresji genów i transkryptów (izofom). Skopiuj i wklej zawartość plików do pliku Excel i przetwórz je za pomocą aplikacji arkusza kalkulacyjnego (Rysunek S3B).</li>
			<li>Użyj polecenia z Rysunku S3C, aby porównać wynikowy plik „transcripts.gtf” z referencyjnym plikiem „mm9_genes.gtf” w celu zidentyfikowania nowych transkryptów.</li>
			<li>Wynikowy plik .tmap zawiera wynik porównania. Skopiuj i wklej zawartość pliku do pliku Excel i przetwórz go za pomocą aplikacji arkusza kalkulacyjnego. Transkrypty z kodem klasy „u” mogą być uznane za „nowe” w porównaniu z dostarczonym referencyjnym plikiem .gtf (Rysunek S3D). 
			UWAGA: Dla ułatwienia dalszej analizy ustaw wartości FPKM na 0,1, jeśli wartości te są niższe niż 0,1. 
			UWAGA: Kroki 3.2.3 - 3.2.6 są opcjonalne dla osób chcących poprawić dokładność szacowania ekspresji nowych transkryptów. Zajmie to znacznie więcej czasu, ponieważ mapowanie i konstrukcja transkryptomu muszą być uruchomione więcej niż raz.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uruchom Tophat z domyślnymi parametrami, a następnie uruchom cufflinks, aby wygenerować plik .gtf, używając polecenia z Rysunku S3E.</li>
		<li>Porównaj wynikowy plik .gtf z referencyjnym plikiem genomu .gtf, używając polecenia z Rysunku S3F.</li>
		<li>Przeanalizuj wynikowy plik .tmap zgodnie z opisem w kroku 3.2.2.4. Skopiuj i wklej zawartość pliku do pliku Excel i przetwórz go za pomocą aplikacji arkusza kalkulacyjnego. Transkrypty z kodem klasy „u” mogą być uznane za „nowe” w porównaniu z dostarczonym referencyjnym plikiem .gtf.</li>
		<li>Po wykonaniu kroku 3.2.5 w folderze znajduje się plik .combined.gtf, który może służyć jako referencyjny plik .gtf. Można przeprowadzić drugie uruchomienie Tophat i cufflinks zgodnie z opisem w kroku 3.2.1 i 3.2.2, aby uzyskać dokładniejsze oszacowanie FPKM dla nowych transkryptów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie genów różnicowo wyrażonych przy użyciu pakietu DESeq30.
	<ol>
		<li>Wejściem dla DESeq jest tabela surowych zliczeń odczytów (raw read counts). Aby uzyskać taką tabelę, użyj skryptu htseq-count dołączonego do pakietu Python HTSeq, który można pobrać ze strony internetowej HTSeq (<a href="http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html" target="_blank">http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html</a>).
		<ol>
			<li>Upewnij się, że programy samtools, python i htseq-count są zainstalowane w systemie. Uzyskaj surowe liczby zliczeń odczytów z wyników tophat, używając polecenia z Rysunku S4A.</li>
			<li>Przygotuj pliki „Raw_Count_Table.txt” i „ExperimentDesign.txt” w programie Excel. Skopiuj i zapisz zawartość w formacie .txt dla pakietu R DESeq (Rysunek S4B).</li>
			<li>Zainstaluj program R w systemie. W terminalu wpisz „R” i naciśnij ENTER. Pojawi się komunikat na ekranie, jak pokazano na Rysunku S4C.</li>
			<li>Wczytaj pliki „Raw_Count_Table.txt” i „ExperimentDesign.txt” do programu R, używając polecenia z Rysunku S4D.</li>
			<li>Załaduj pakiet DESeq, używając polecenia z Rysunku S4E.</li>
			<li>Zdefiniuj warunki jako czynniki (factors) w programie R (Rysunek S4F).</li>
			<li>Użyj polecenia z Rysunku S4G, aby przeprowadzić test dwumianowy ujemny na znormalizowanej tabeli zliczeń.</li>
			<li>Użyj polecenia z Rysunku S4H, aby wyeksportować istotne geny różnicowo wyrażone do pliku .csv.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyszukiwanie wartości FPKM czynników transkrypcyjnych (TFs) w próbkach za pomocą programu Excel. Wykonaj część wspólną tabeli genów DE i tabeli TFs. Geny należące do obu tabel są różnicowo wyrażonymi czynnikami transkrypcyjnymi.
	<ol>
		<li>Wejdź na stronę <a href="http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php" target="_blank">http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php</a> i pobierz dane o czynnikach transkrypcyjnych. Następnie wyszukaj różnicowo wyrażone czynniki transkrypcyjne w programie Excel (Rysunek S5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie pliku .bigwig do wizualizacji w przeglądarce genomu UCSC.
	<ol>
		<li>Pobierz pakiet oprogramowania „bedtools” ze strony <a href="https://github.com/arq5x/bedtools2" target="_blank">https://github.com/arq5x/bedtools2</a> i zainstaluj oprogramowanie w systemie31. Pobierz narzędzie UCSC „bedGraphToBigWig” ze strony <a href="http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/" target="_blank">http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/</a> i zainstaluj oprogramowanie w systemie.</li>
		<li>W folderze zawierającym plik .bam użyj polecenia z Rysunku S6A, aby przekonwertować plik .bam wygenerowany przez tophat na plik .bed.</li>
		<li>Po utworzeniu pliku .bed użyj polecenia z Rysunku S6B, aby wygenerować plik .bigwig. Plik „ChromInfo.txt” można pobrać z następnego adresu URL: <a href="http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/chromInfo.txt.gz" target="_blank">http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/chromInfo.txt.gz</a>.</li>
		<li>Przeglądaj niestandardową ścieżkę (custom track) w przeglądarce UCSC Genome Browser. Odwiedź stronę <a href="http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html</a>, aby dowiedzieć się, jak wyświetlić niestandardową ścieżkę w przeglądarce genomu UCSC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Przebieg analizy danych sekwencjonowania DNA; kroki w wierszu poleceń dla generowania plików fastq, konfiguracja HiSeq." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina S1"> 
Rycina S1: Konwersja pliku .bcl do pliku .fastq przy użyciu oprogramowania CASAVA.
<img alt="Wiersz poleceń Tophat dla wyrównania danych RNA-Seq w eksperymencie bioinformatycznym." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek S2"> 
Rysunek S2: Mapowanie odczytów do genomu referencyjnego przy użyciu Tophat.
<img alt="Analiza ekspresji genów; polecenia Cufflinks i Cuffcompare oraz TopHat, wyniki w arkuszu kalkulacyjnym." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina S3"> 
Rycina S3: Detekcja nowych transkryptów i szacowanie poziomu ekspresji.
<img alt="Proces analizy różnicowej ekspresji genów z wykorzystaniem R i DESeq; konfiguracja wiersza poleceń i tabeli." fo:content-width="3.4in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina S4"> 
Rycina S4: Wyznaczanie genów o różnicowej ekspresji przy użyciu pakietu DESeq.
<img alt="Tabela bazy danych czynników transkrypcyjnych zwierząt; symbole genów, próbki, analiza zmian krotności." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina S5"> 
Rycina S5: Identyfikacja różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych.
<img alt="Polecenia konwersji BAM do BED i BED do BigWig; schemat procesu transformacji danych." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina S6"> 
Rycina S6: Konwersja wyników mapowania do wizualizacji danych.

<ol><li>Chambers, S. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+aging%3A+wrinkles+in+stem+cell+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell aging: wrinkles in stem cell potential.</a> Stem Cell Rev. 3, 201-211 (2007).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tcf7+is+an+important+regulator+of+the+switch+of+self-renewal+and+differentiation+in+a+multipotential+hematopoietic+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line.</a> PLoS genetics. 8, (2012).</li>
<li>Ye, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+interactions+in+EML+cell+stimulation+by+stem+cell+factor+and+IL-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Complex interactions in EML cell stimulation by stem cell factor and IL-3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4882-4887 (2011).</li>
<li>Tsai, S., Bartelmez, S., Sitnicka, E., Collins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphohematopoietic+progenitors+immortalized+by+a+retroviral+vector+harboring+a+dominant-negative+retinoic+acid+receptor+can+recapitulate+lymphoid%2C+myeloid%2C+and+erythroid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Lymphohematopoietic progenitors immortalized by a retroviral vector harboring a dominant-negative retinoic acid receptor can recapitulate lymphoid, myeloid, and erythroid development.</a> Genes Dev. 8, 2831-2841 (1994).</li>
<li>Weiler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D3%3A+a+gene+induced+during+myeloid+cell+differentiation+of+Linlo+c-Kit%2B+Sca-1%28%2B%29+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">D3: a gene induced during myeloid cell differentiation of Linlo c-Kit+ Sca-1(+) progenitor cells.</a> Blood. 93, 527-536 (1999).</li>
<li>Ye, Z. J., Kluger, Y., Lian, Z., Weissman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+precursor+cells+in+a+multipotential+hematopoietic+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two types of precursor cells in a multipotential hematopoietic cell line.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18461-18466 (2005).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Chu, Y., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing%3A+platform+selection%2C+experimental+design%2C+and+data+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acid+therapeutics%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing: platform selection, experimental design, and data interpretation.</a> Nucleic acid therapeutics. 22, 271-274 (2012).</li>
<li>Hornett, E. A., Wheat, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+RNA-Seq+analysis+in+non-model+species%3A+assessing+transcriptome+assemblies+as+a+scaffold+and+the+utility+of+evolutionary+divergent+genomic+reference+species%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative RNA-Seq analysis in non-model species: assessing transcriptome assemblies as a scaffold and the utility of evolutionary divergent genomic reference species.</a> BMC genomics. 13, 361(2012).</li>
<li>Eswaran, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+cancer+reveals+novel+splicing+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of cancer reveals novel splicing alterations.</a> Scientific reports. 3, 1689(2013).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transcriptomes+during+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+revealed+by+short%2C+long%2C+and+paired-end+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamic transcriptomes during neural differentiation of human embryonic stem cells revealed by short, long, and paired-end sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5254-5259 (2010).</li>
<li>Loraine, A. E., McCormick, S., Estrada, A., Patel, K., Qin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+of+Arabidopsis+pollen+uncovers+novel+transcription+and+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq of Arabidopsis pollen uncovers novel transcription and alternative splicing.</a> Plant physiology. 162, 1092-1109 (2013).</li>
<li>Edgren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+fusion+genes+in+breast+cancer+by+paired-end+RNA-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Identification of fusion genes in breast cancer by paired-end RNA-sequencing.</a> Genome biology. 12, 6(2011).</li>
<li>Ilott, N. E., Ponting, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+long+non-coding+RNAs+using+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Predicting long non-coding RNAs using RNA sequencing.</a> Methods. 63, 50-59 (2013).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+novel+long+non-coding+RNAs+based+on+RNA-Seq+data+of+mouse+Klf1+knockout+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Prediction of novel long non-coding RNAs based on RNA-Seq data of mouse Klf1 knockout study.</a> BMC bioinformatics. 13, 331(2012).</li>
<li>Luo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+analysis+using+the+Illumina+microRNA-Seq+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform.</a> Methods in molecular biology. 822, 183-188 (2012).</li>
<li>Bolduc, F., Hoareau, C., St-Pierre, P., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+sequencing+of+the+siRNAs+associated+with+peach+latent+mosaic+viroid+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In-depth sequencing of the siRNAs associated with peach latent mosaic viroid infection.</a> BMC molecular biology. 11, 16(2010).</li>
<li>Chepelev, I., Wei, G., Tang, Q., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+single+nucleotide+variations+in+expressed+exons+of+the+human+genome+using+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Detection of single nucleotide variations in expressed exons of the human genome using RNA-Seq.</a> Nucleic acids research. 37, 106(2009).</li>
<li>Djari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-based+single+nucleotide+polymorphism+discovery+in+bovine+muscle+using+next-generation+transcriptomic+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Gene-based single nucleotide polymorphism discovery in bovine muscle using next-generation transcriptomic sequencing.</a> BMC genomics. 14, 307(2013).</li>
<li>Murphy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+studies+using+microarrays%3A+principles%2C+problems%2C+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+physiology+education%22%5BJournal%5D)">Gene expression studies using microarrays: principles, problems, and prospects.</a> Advances in physiology education. 26, 256-270 (2002).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+characterization+of+spinal+cord+injury+transcriptome+in+acute%2Fsubacute+phases%3A+a+resource+for+understanding+the+pathology+at+the+systems+level%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+one%22%5BJournal%5D)">RNA-seq characterization of spinal cord injury transcriptome in acute/subacute phases: a resource for understanding the pathology at the systems level.</a> PLoS one. 8, 72567(2013).</li>
<li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome research. 18, 1509-1517 (2008).</li>
<li>Ramskold, D., Kavak, E., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+analyze+gene+expression+using+RNA-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">How to analyze gene expression using RNA-sequencing data.</a> Methods in molecular biology. 802, 259-274 (2012).</li>
<li>Glenn, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+guide+to+next-generation+DNA+sequencers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">Field guide to next-generation DNA sequencers.</a> Mol Ecol Resour. 11, 759-769 (2011).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nature protocols. 7, 562-578 (2012).</li>
<li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat%3A+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome biology. 10, 25(2009).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nature. 28, 511-515 (2010).</li>
<li>Anders, S., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+analysis+for+sequence+count+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Differential expression analysis for sequence count data.</a> Genome biology. 11, 106(2010).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li>
<li>Cheranova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+analysis+of+transcriptomes+in+thrombin-treated+and+control+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">RNA-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Zhang, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnimalTFDB%3A+a+comprehensive+animal+transcription+factor+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">AnimalTFDB: a comprehensive animal transcription factor database.</a> Nucleic acids research. 40, 144-149 (2012).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+transcribed+loci+in+ENCODE+regions+using+RACE+sequencing+reveals+extensive+transcription+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of transcribed loci in ENCODE regions using RACE sequencing reveals extensive transcription in the human genome.</a> Genome Biol. 9, 3(2008).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+RT-PCR+recovery+of+full-length+cDNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Large-scale RT-PCR recovery of full-length cDNA clones.</a> Biotechniques. 36, 690-696 (2004).</li>
<li>Wu, J. Q., Shteynberg, D., Arumugam, M., Gibbs, R. A., Brent, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+rat+genes+by+TWINSCAN+gene+prediction%2C+RT-PCR%2C+and+direct+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of rat genes by TWINSCAN gene prediction, RT-PCR, and direct sequencing.</a> Genome Res. 14, 665-671 (2004).</li>
<li>Dewey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+novel+human+genes+through+simultaneous+gene+prediction+in+human%2C+mouse%2C+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of novel human genes through simultaneous gene prediction in human, mouse, and rat.</a> Genome Res. 14, 661-664 (2004).</li>
<li>Wu, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWu%2C+J+%22Characterize+Mammalian+Transcriptome+Complexity%22">Characterize Mammalian Transcriptome Complexity</a>. , LAP Lambert Academic Publishing. (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Transkryptom ssaków jest bardzo złożony34-38. Technologia RNA-Seq odgrywa coraz ważniejszą rolę w badaniach nad analizą transkryptomu, wykrywaniem nowych transkryptów i odkrywaniem zmienności pojedynczych nukleotydów itp. Ma wiele zalet w porównaniu z innymi metodami analizy ekspresji genów. Jak wspomniano we wprowadzeniu, pokonuje artefakty hybrydyzacji mikromacierzy i może być używany do identyfikacji nowych transkryptów de novo. Jednym z ograniczeń sekwencjonowania RNA jest stosunk...

Hematopoetyczne komórki macierzyste to rzadkie komórki krwi, które znajdują się głównie w niszy dorosłego szpiku kostnego. Są odpowiedzialne za produkcję komórek niezbędnych do uzupełnienia krwi i układu odpornościowego1. Jako rodzaj komórek macierzystych, HSC są zdolne zarówno do samoodnawiania, jak i różnicowania. Wyjaśnienie mechanizmów, które kontrolują decyzję o losie HSC, w kierunku samoodnawiania się lub różnicowania, dostarczy cennych wskazówek na temat manipulacji HSC w badaniach nad chorobami krwi i zastosowaniach klinicznych2. Jednym z problemów, z którymi borykają się naukowcy, jest to, że HSC mogą być utrzymywane i namnażane in vitro w bardzo ograniczonym zakresie; Zdecydowana większość ich potomstwa jest częściowo zróżnicowana w kulturze2.
Aby zidentyfikować kluczowe regulatory, które kontrolują procesy samoodnawiania się i różnicowania w skali całego genomu, użyliśmy mysiej prymitywnej linii komórek progenitorowych hematopoetycznych EML jako systemu modelowego. Ta linia komórkowa pochodziła z mysiego szpiku kostnego3,4. Karmione różnymi czynnikami wzrostu komórki EML mogą różnicować się w komórki erytroidalne, szpikowe i limfoidalne in vitro5. Co ważne, ta linia komórkowa może być rozmnażana w dużych ilościach w pożywce hodowlanej zawierającej czynnik komórek macierzystych (SCF) i zachowująca przy tym swoją multipotencjalność. Komórki EML można podzielić na subpopulacje samoodnawiających się komórek Lin-SCA+CD34+ i częściowo zróżnicowanych komórek Lin-SCA-CD34- opartych na markerach powierzchniowych CD34 i SCA6. Podobnie jak krótkoterminowe HSC, komórki SCA+CD34+ są zdolne do samoodnawiania. Po leczeniu SCF komórki Lin-SCA+CD34+ mogą szybko zregenerować mieszaną populację komórek Lin-SCA+CD34+ i Lin-SCA-CD34- i kontynuować proliferację6. Obie populacje mają podobną morfologię i podobne poziomy mRNA c-kit i białka6. Komórki Lin-SCA-CD34- są zdolne do namnażania się w pożywkach zawierających IL-3 zamiast SCF3. Ujawnienie kluczowych regulatorów wpływających na decyzję dotyczącą losu komórek EML pozwoli lepiej zrozumieć mechanizmy komórkowe i molekularne we wczesnej fazie rozwoju podczas hematopoezy.
W celu zbadania podstawowych różnic molekularnych między samoodnawiającymi się komórkami Lin-SCA+CD34+ a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-SCA-CD34, użyliśmy RNA-Seq do identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji. W szczególności skupiamy się na czynnikach transkrypcyjnych, ponieważ czynniki transkrypcyjne mają kluczowe znaczenie w określaniu losu komórki. RNA-Seq to niedawno opracowane podejście, które wykorzystuje możliwości technologii sekwencjonowania nowej generacji (NGS) do profilowania i ilościowego określania RNA transkrybowanych z genomu7,8. Krótko mówiąc, całkowity RNA jest poli-A wybrany i pofragmentowany jako początkowa matryca. Matryca RNA jest następnie przekształcana w cDNA za pomocą odwrotnej transkryptazy. Aby zmapować transkrypty RNA o pełnej długości, ważne jest użycie nienaruszonego, niezdegradowanego RNA do budowy biblioteki cDNA. W celu sekwencjonowania do obu końców cDNA dodaje się określone sekwencje adapterów. Następnie, w większości przypadków, cząsteczki cDNA są amplifikowane metodą PCR i sekwencjonowane w sposób wysokoprzepustowy.
Po sekwencjonowaniu, wynikowe odczyty mogą być dostosowane do genomu referencyjnego i bazy danych transkryptomu. Zliczana jest liczba odczytów, które są mapowane do genu referencyjnego, a informacje te można wykorzystać do oszacowania poziomu ekspresji genu. Odczyty mogą być również składane de novo bez genomu referencyjnego, co umożliwia badanie transkryptomów w organizmach niemodelowych9. Technologia sekwencjonowania RNA została również wykorzystana do wykrywania izoform splicingu10-12, nowych transkryptów13 i fuzji genów14. Oprócz wykrywania genów kodujących białka, RNA-Seq może być również używany do wykrywania nowych i analizowania poziomu transkrypcji niekodujących RNA, takich jak długie niekodujące RNA15,16, mikroRNA17, siRNA itp.18. Ze względu na dokładność tej metody, została ona wykorzystana do wykrywania zmian pojedynczych nukleotydów19,20.
Przed pojawieniem się technologii sekwencjonowania RNA, mikromacierz była główną metodą używaną do analizy profilu ekspresji genów. Wstępnie zaprojektowane sondy są syntetyzowane, a następnie mocowane do stałej powierzchni, tworząc szkiełko21 mikromacierzy. mRNA jest ekstrahowane i przekształcane w cDNA. Podczas procesu odwrotnej transkrypcji znakowane fluorescencyjnie nukleotydy są włączane do cDNA, a cDNA może być hybrydyzowane na szkiełkach mikromacierzy. Intensywność sygnału zebranego z określonego miejsca zależy od stopnia wiązania cDNA z konkretną sondą w tym miejscu21. W porównaniu z technologią RNA-Seq, mikromacierz ma kilka ograniczeń. Po pierwsze, mikromacierz opiera się na istniejącej już wiedzy na temat adnotacji genów, podczas gdy technologia RNA-Seq jest w stanie wykryć nowe transkrypty na stosunkowo wysokim poziomie tła, co ogranicza jej zastosowanie, gdy poziom ekspresji genów jest niski. Poza tym technologia RNA-Seq ma znacznie większy dynamiczny zakres detekcji (8000 razy)7, podczas gdy ze względu na tło i nasycenie sygnałów, dokładność mikromacierzy jest ograniczona zarówno dla genów o wysokiej, jak i niskiej ekspresji7,22. Wreszcie, sondy mikromacierzowe różnią się wydajnością hybrydyzacji, co sprawia, że wyniki są mniej wiarygodne przy porównywaniu względnych poziomów ekspresji różnych transkryptów w jednej próbce23. Chociaż RNA-Seq ma wiele zalet w porównaniu z mikromacierzami, jego analiza danych jest złożona. Jest to jeden z powodów, dla których wielu badaczy nadal używa mikromacierzy zamiast sekwencji RNA. Do przetwarzania i analizy danych RNA-Seq potrzebne są różne narzędzia bioinformatyczne24.
Wśród kilku platform sekwencjonowania nowej generacji (NGS), 454, Illumina, SOLID i Ion Torrent są najczęściej używane. 454 była pierwszą komercyjną platformą NGS. W przeciwieństwie do innych platform sekwencjonowania, takich jak illumina i SOLID, platforma 454 generuje dłuższą długość odczytu (średnio 700 odczytów podstawowych)25. Dłuższe odczyty są lepsze do wstępnej charakterystyki transkrypcji ze względu na ich wyższą wydajność składania25. Główną wadą platformy 454 jest jej wysoki koszt w przeliczeniu na megabazę sekwencji. Platformy Illumina i SOLID generują odczyty o zwiększonej liczbie i krótkich długościach. Koszt za megabazę sekwencji jest znacznie niższy niż w przypadku platformy 454. Ze względu na dużą liczbę krótkich odczytów dla platform Illumina i SOLID, analiza danych jest znacznie bardziej intensywna obliczeniowo. Cena instrumentu i odczynników do sekwencjonowania dla platformy Ion Torrent jest tańsza, a czas sekwencjonowania krótszy25. Jednak poziom błędów i koszt na megabazę sekwencji są wyższe w porównaniu z platformami Illumina i SOLID. Różne platformy mają swoje zalety i wady i wymagają różnych metod analizy danych. Platformę należy wybrać w oparciu o cel sekwencjonowania i dostępność finansowania.
W tym artykule bierzemy jako przykład platformę Illumina RNA-Seq. Wykorzystaliśmy komórkę EML jako system modelowy do zbadania kluczowych regulatorów samoodnawiania i różnicowania komórek EML oraz zapewniliśmy szczegółowe metody budowy biblioteki RNA-Seq i analizy danych do obliczania poziomu ekspresji i wykrywania nowych transkryptów. Wykazaliśmy w naszej poprzedniej publikacji, że badanie sekwencyjne RNA w systemie modelowymEML 2, w połączeniu z testem funkcjonalnym (np. knockdown shRNA) zapewnia potężne podejście do zrozumienia molekularnego mechanizmu wczesnych stadiów różnicowania układu krwiotwórczego i może służyć jako model do analizy samoodnawiania się i różnicowania komórek w ogóle.

<table><tbody><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Hodowla komórek BHK</td></tr><tr><td>Anty-Myszy CD34 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0341-81</td><td>Sortowanie FACS</td></tr><tr><td>Anty-mysie Ly-6A/E (Sca-1) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5981-81</td><td>Sortowanie FACS</td></tr><tr><td>Koktajl przeciwciał APC Mouse Lineage BD</td><td>Biosciences</td><td>558074</td><td>sortowanie FACS</td></tr><tr><td>Sortownik komórek BD FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td>Oferta specjalna sysmtem</td><td>FACS sortowanie</td></tr><tr><td>Corning&trade; Kolby poddane hodowli komórkowych 75 cm2</td><td>Corning incorporated</td><td>430641</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Corning&trade; Kolby poddane działaniu hodowli komórkowych 25 cm2</td><td>Corning wbudowana</td><td>430639</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I, stopień amplifikacji</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td>Przygotowanie biblioteki</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td>Hodowla komórkowa BHK</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>HI FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16140071</td><td>Hodowla komórkowa BHK</td></tr><tr><td>Surowica końska</td><td>Invitrogen</td><td>16050-122</td><td>Hodowla komórek EML</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>HyClone</td><td>SH30228.02</td><td>Hodowla komórek EML</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Zestaw do zmniejszania liczby komórek linii, mysz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>Izolacja komórek ujemnych w linii</td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoVue Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9569-62</td><td>Kontrola jakości</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; Napco i handel; 8000 Inkubatory CO2 z płaszczem wodnym</td><td>Thermo Scientific</td><td>15-497-002</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Hodowla komórkowa EML</td></tr><tr><td>TRIzol&reg; Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>Ekstrakcja RNA</td></tr><tr><td>TruSeq&trade; Zestaw do przygotowania próbek RNA v2 -Zestaw B (48 rxn)</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2002</td><td>Przygotowanie biblioteki</td></tr><tr><td>2100 Elektroanalizator Bioanalizator Instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td>Kontrola jakości</td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>0,45 i mikro; m Filtry strzykawkowe</td><td>Nalgene</td><td>190-2545</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr></tbody></table>

identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych eml za pomocą analizy sekwencjonowania rna

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) są stosowane klinicznie w leczeniu transplantacyjnym w celu odbudowy układu krwiotwórczego pacjenta w wielu chorobach, takich jak białaczka i chłoniak. Wyjaśnienie mechanizmów kontrolujących samoodnawianie i różnicowanie HSC jest ważne dla zastosowania HSC do zastosowań badawczych i klinicznych. Nie jest jednak możliwe uzyskanie dużej ilości HSC ze względu na ich niezdolność do namnażania się in vitro. Aby pokonać tę przeszkodę, użyliśmy linii komórkowej pochodzącej ze szpiku kostnego myszy, linii komórkowej EML (erytroidalnej, mieloidalnej i limfocytowej), jako systemu modelowego dla tego badania.
Sekwencjonowanie RNA (RNA-Seq) jest coraz częściej używane do zastępowania mikromacierzy w badaniach ekspresji genów. Przedstawiamy tutaj szczegółową metodę wykorzystania technologii RNA-Seq do zbadania potencjalnych kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie komórek EML. Protokół przedstawiony w niniejszym dokumencie jest podzielony na trzy części. Pierwsza część wyjaśnia, jak hodować komórki EML i oddzielać komórki Lin-CD34+ i Lin-CD34-. Druga część protokołu oferuje szczegółowe procedury przygotowania całkowitego RNA i późniejszej budowy biblioteki do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Ostatnia część opisuje metodę analizy danych RNA-Seq i wyjaśnia, jak wykorzystać dane do identyfikacji czynników transkrypcyjnych o zróżnicowanej ekspresji między komórkami Lin-CD34+ i Lin-CD34-. Zidentyfikowano najbardziej znaczące czynniki transkrypcyjne o zróżnicowanej ekspresji, które są potencjalnymi kluczowymi regulatorami kontrolującymi samoodnawianie i różnicowanie komórek EML. W części poświęconej dyskusji w tym artykule zwracamy uwagę na kluczowe kroki prowadzące do pomyślnego przeprowadzenia tego eksperymentu.
Podsumowując, ten artykuł oferuje metodę wykorzystania technologii RNA-Seq do identyfikacji potencjalnych regulatorów samoodnawiania i różnicowania w komórkach EML. Kluczowe zidentyfikowane czynniki są poddawane dalszej analizie funkcjonalnej in vitro i in vivo.

W celu analizy genów o różnej ekspresji w komórkach EML Lin-CD34+ oraz Lin-CD34- wykorzystaliśmy technologię RNA-Seq. Rysunek 1 przedstawia schemat blokowy przeprowadzonych procedur. Po izolacji komórek z negatywnym markerem linii za pomocą magnetycznego sortowania komórek, oddzieliliśmy komórki Lin-SCA+CD34+ oraz Lin-SCA-CD34- przy użyciu urządzenia FACS Aria. Komórki EML wzbogacone w frakcję Lin- znakowano przeciwciałami anty-CD34, anty-Sca1 oraz koktajlem przeciwciał przeciwko markerom linii. Do anali...

Sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne zostały wykorzystane do identyfikacji znacząco i różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych w subpopulacjach Lin-CD34+ i Lin-CD34- mysich komórek EML. Te czynniki transkrypcyjne mogą odgrywać ważną rolę w określaniu przełączania między samoodnawiającymi się komórkami Lin-CD34 + a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-CD34.

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie potencjalnych kluczowych regulatorów samoodnawiania i różnicowania mysich komórek EML przy użyciu technologii sekwencjonowania RNA. Osiąga się to poprzez pierwsze oddzielenie ujemnych komórek EML CD 34 i ujemnych komórek EML CD 34 ujemnych na podstawie markerów powierzchniowych. Drugim krokiem jest wyizolowanie mRNA, przekształcenie mRNA w cDNA i przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania.Następnie biblioteka DNA poddawana jest sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości. Ostatnim krokiem jest analiza wyników sekwencjonowania i poszukiwanie różnie wyrażonych czynników transkrypcyjnych. Ostatecznie technologia sekwencjonowania RNA jest wykorzystywana do pokazania czynników transkrypcyjnych o zróżnicowanej ekspresji w komórkach EML z ujemnym CD 34 i ujemnym z ujemnym CD 34.Główną zaletą sekwencjonowania RNA w porównaniu z innymi metodami ekspresji G prolenu, takimi jak mikropromieniowanie, jest to, że ma wyższą czułość, dokładność i szerszy zakres dynamiki oraz nie opiera się na istniejących wcześniej informacjach o adnotacji genów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie komórek macierzystych, takie jak kluczowe czynniki transkrypcyjne regulujące samoodnawianie i różnicowanie komórek. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób krwi, ponieważ lepsze zrozumienie kluczowego regulatora kontrolującego hematopoetyczne komórki prekursorowe, samoodnawianie się i różnicowanie może prowadzić do opracowania skutecznych metod leczenia.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ do analizy sekwencjonowania potrzebne są różne narzędzia bioinformatyczne. Nerka chomika lub komórki BHK do zbierania czynników komórek macierzystych są hodowane w pożywce dmem zawierającej 10% FBS w kolbie o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Gdy komórki osiągną 80 do 90% zbieżności oczu trypsyny i zbierz je przez wirowanie w temperaturze 200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, wyrzuć snat i ponownie zawieś paletę komórek w 10 mililitrach świeżej pożywki do hodowli komórkowych BHK.Przenieś dwa mililitry zawiesiny komórek do nowej kolby o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych za pomocą aplikacji i dodaj 48 mililitrów świeżej hodowli komórkowej BHK. Pożywka do kultury kolbowej. Ogniwa BHK przez dwa dni.Po dwóch dniach zebrać pożywkę hodowlaną i przepuścić ją przez filtr punktowy 45 mikrometrów. Przechowuj pożywkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Mysie komórki erytroidalne, szpikowe i limfocytarne lub EML używane w tym protokole są hodowane w zawiesinie w pożywce podstawowej EML zawierającej pożywkę do hodowli komórek BHK w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.Utrzymuj komórki EML w niskiej gęstości komórek z gęstością szczytową mniejszą niż 600 000 komórek na mililitr. Dziel komórki co dwa do trzech dni w stosunku od jednego do pięciu pasaży do komórek delikatnie, ale nie dłużej niż przez 10 pokoleń, aby zubożyć komórki dodatnie w linii. Zebrać komórki EML przez odwirowanie w temperaturze 200 g przez pięć minut.Przemyć komórki raz PBS i ponownie odwirować po odrzuceniu supernatantu. Ponownie zawieś komórki w PBS i policz komórki za pomocą hemocytometru. Liczba komórek jest potrzebna do określenia stężenia przeciwciał w kolejnym kroku.Wyizoluj komórki liniowo ujemne lub liniowo ujemne za pomocą koktajlu przeciwciał liniowych i systemu sortowania komórek aktywowanych magnetycznie zgodnie z instrukcjami producenta. Aby rozpocząć tę procedurę, wiruj komórki ujemne w temperaturze 200 G przez pięć minut. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą PBS i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.Umyj komórki dwukrotnie za pomocą bufora faksu. Po drugim praniu granulować komórki w temperaturze 200 G przez pięć minut. Oznacz pięć mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1.5 mililitra numerami odpowiednio 1, 2, 3, 4 i pięć.Ponownie zawiesić ogniwa z buforem o odpowiedniej objętości faktów do stężenia 1 miliona komórek na 100 mikrolitrów. Następnie podajcie 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej z pięciu probówek do mikrowirówek. Dodać jeden mikrogram przeciwciała przeciw myszom CD 34 FE do probówki pierwszej i drugiej.Wymieszaj probówki, delikatnie inkubuj wszystkie probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę w ciemności. Następnie dodaj punkt 25 mikrogramów antyki sprzężonej z PE, jedno przeciwciało i 20 mikrolitrów linii sprzężonej z PC. Koktajl przeciwciał do dwóch jeden, dodać punkt 25 mikrogramów przeciwciała antyca sprzężonego z PE do probówki trzeciej i 20 mikrolitrów linii sprzężonej z PC.Przeciwciała koktajlowe do probówki czwartej. Delikatnie wymieszaj probówki i inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dodatkowe 30 minut w ciemności. Po 30 minutach dodaj 300 mikrolitrów buforu faksu do wszystkich probówek i wiruj komórki w temperaturze 200 G przez pięć minut.Po ostatnim płukaniu umyć ogniwa trzykrotnie 500 mikrolitrami buforu faksu. Resus zawiesić każdą komórkę w 500 mikrolitrach bufora faksu, wyizolować lin ujemne SCA dodatnie CD 34 dodatnie i lin ujemne SCA ujemne CD 34 ujemne w probówce pierwszej przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Całkowite RNA ekstrahuje się z lin ujemnych CD 34 dodatnich i lin ujemnych CD 34 ujemnych za pomocą triolu, a zanieczyszczone DNA usuwa się za pomocą nukleazy dezoksyrybo.Postępując zgodnie z protokołem producenta, oceń jakość całkowitego RNA za pomocą bioanalizatora zgodnie z instrukcjami producenta, do ekstrakcji mRNA i późniejszych procedur budowy biblioteki używa się tylko próbek RNA o liczbie integralności RNA lub RIN większej niż dziewięć. Ten rysunek przedstawia wynik wysokiej jakości próbki RNA o RIN równym 9,4. Zastosowany tutaj protokół budowy biblioteki jest specyficzny dla platformy sekwencjonowania RNA Illumina i wykorzystuje zestaw do przygotowania próbki RNA.Postępuj zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta, ponieważ w tym filmie pokazane są tylko wybrane kroki. Zacznij od pozytywnego wyboru poli MNA za pomocą kulek magnetycznych oligo DT. Następnie fragmentuj poli mRNA, wykonaj odwrotną transkrypcję za pomocą losowych starterów, aby przekształcić mRNA w CD NA. Następnie zsyntetyzowana druga nić CD NA jest wykorzystywana do generowania dwuniciowego DNA.Następnie trzy główne zwisy są usuwane, a pięć głównych zwisów jest wypełnianych denatem polimerazy DNA. Trzy pierwsze końce do fragmentów CD NA od podwiązania do siebie. Dodaj adaptery indeksowania multipleksu do obu końców dwużyłowej płyty CD NA w celu sekwencjonowania.Na koniec wykonaj PCR w celu wzbogacenia CD NA o fragmenty za pomocą spektrofotometru, zmierz absorbancję dwa 60 w stosunku do absorbancji dwóch 80 amplifikowanego DNA. Aby uzyskać informacje o stężeniu biblioteki, należy ocenić jakość biblioteki i zmierzyć zakres wielkości fragmentów DNA za pomocą bioanalizatora. Metody analizy danych sekwencjonowania RNA znajdują się w dołączonym tekście protokołu i obejmują przetwarzanie plików danych do dalszej analizy, wykrywanie nowych transkryptów i ocenę poziomu ekspresji, wykrywanie genów o zróżnicowanej ekspresji i identyfikowanie czynników transkrypcyjnych o zróżnicowanej ekspresji.Komórki EML ujemne pod względem linii barwiono przeciwciałami anty CD 34 antica one i koktajlem linii oraz lin ujemnymi czaszkowo-dodatnimi CD 34 dodatnimi i lin ujemnymi sca. Ujemne komórki CD 34 oddzielono wyłącznie za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie. Komórki Lin ujemne bramkowano w celu analizy ekspresji SCA one i CD 34.Po zakończeniu budowy biblioteki zaobserwowano dwie populacje komórek EML. Wielkość fragmentów DNA w bibliotece sprawdzono za pomocą bioanalizatora. Te reprezentatywne dane pokazują dobrą jakość biblioteki, ale rozmiar fragmentu osiąga szczyt na poziomie około 300 par zasad.Algorytm D-E-S-E-Q został wykorzystany do analizy ekspresji różnicowej, ze szczególnym uwzględnieniem czynników transkrypcyjnych o zróżnicowanej ekspresji, ponieważ czynniki transkrypcyjne mają kluczowe znaczenie dla oznaczania siarczanów. Znaleziono czynniki transkrypcyjne, które zmieniają się ponad 1,5 razy między lin ujemnym CD 34 dodatnim a lin ujemnym CD 34 ujemnym i pokazanym na tej mapie cieplnej. Warto zauważyć, że względny poziom ekspresji TCF siedem w ujemnych komórkach CD 34 jest ponad 100 razy wyższy niż w ujemnych komórkach CD 34 lin.W związku z tym TCF seven został wybrany do dalszej analizy immunoprecypitacji i sekwencjonowania chromatyny oraz testów funkcjonalnych w celu potwierdzenia jego funkcji w regulacji samoodnawiania i różnicowania w komórkach EML. Po opanowaniu biblioteka RNA może zostać zakończona w ciągu kilku dni, a cała procedura może zostać zakończona w ciągu około miesiąca, jeśli zostanie wykonana prawidłowo po jej opracowaniu. Technologia ta utorowała drogę naukowcom, którzy chcą badać różnicową ekspresję genów między różnymi typami komórek i tkankami, takimi jak limfocyty B i złośliwe komórki B.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o użyciu wysokiego CAR TRNA, ponieważ jest to podstawa całej procedury chorego RNA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś lepiej zrozumieć, jak zidentyfikować kluczowe regulatory kontrolujące odnowę i różnicowanie komórek EML.

identification-key-factors-regulating-self-renewal-differentiation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano protokół ex vivo służący do generowania dojrzałych ludzkich erytrocytów z hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych. Dodatkowo opisano wydajną metodę dostarczania lentiwirusowego w celu wyciszenia czynnika transkrypcyjnego TAL1 w pierwotnych komórkach erytroidalnych. Wydajność dostarczania genów za pomocą lentiwirusów została zademonstrowana z wykorzystaniem wirusów ekspresyjących GFP.

Lentiwirusowy wyciszanie genów podczas erytropoezy ex vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Test ekspresji genów jednokomórkowych jest potrzebny do zrozumienia heterogeniczności komórek macierzystych.

Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR

Manipulowanie czasową ekspresją genów w różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych (ESC) można osiągnąć za pomocą indukowalnych systemów genetycznych. Jednak wytwarzanie tych linii komórkowych jest kosztowne i czasochłonne. Protokół ten zapewnia szybką ekspresję transgenu w różnicujących się komórkach pochodzących z ES, a następnie analizę dalszego różnicowania układu krwiotwórczego.

Zakażenie retrowirusowe mysich embrionalnych komórek ciała zarodkowego pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do analizy różnicowania układu krwiotwórczego

Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje indukcję programu hemogennego w mysich fibroblastach embrionalnych poprzez nadekspresję minimalnego zestawu czynników transkrypcyjnych. Technologia ta może zostać przełożona na system ludzki, aby zapewnić platformy do przyszłych badań nad hematopoezą, chorobami hematologicznymi i przeszczepem krwiotwórczych komórek macierzystych.

Przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy za pomocą czynników transkrypcyjnych w celu wywołania programu hemogennego

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), używane do różnicowania hPSC na hematopoetyczne komórki progenitorowe CD34+. Metoda ta wykorzystuje specyficzną dla etapu manipulację kanoniczną sygnalizacją WNT w celu określenia komórek wyłącznie do ostatecznego lub pierwotnego programu krwiotwórczego.

Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki immunofenotypowej i indukowanego cytokinami różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej do czterech linii szpikowych. Zastosowania tego protokołu obejmują badania nad wpływem mutacji choroby szpikowej lub małych cząsteczek na różnicowanie szpiku komórek CD34+.

Różnicowanie szpikowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej

Przedstawiona tutaj jest stopniowa procedura różnicowania in vitro ludzkich pierwotnych keratynocytów poprzez hamowanie kontaktu, a następnie charakterystykę na poziomie molekularnym za pomocą analizy sekwencyjnej RNA.

Charakterystyka różnicowania in vitro ludzkich keratynocytów pierwotnych za pomocą analizy RNA-Seq

Przedstawiamy krok po kroku protokół izolacji długoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych (LT-HSC) i krótkoterminowych komórek macierzystych (ST-HSC) za pomocą systemu reporterowego Hoxb5.

Metoda izolacji długotrwałych i krótkoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych

Modelowanie erytropoezy daje cenną szansę na zrozumienie biologicznego znaczenia aktorów w tym procesie i ocenę nowych podejść terapeutycznych, które mogą złagodzić wady różnicowania. W tym miejscu opisujemy prostą i niezawodną metodę skutecznego różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ ex vivo.

Kompleksowy proces oceny skuteczności erytropoezy u ludzi in vitro i ex vivo

Odkryj analizę sekwencjonowania RNA do identyfikacji czynników transkrypcyjnych w komórkach EML myszy. Ta metoda pozwala badać mechanizmy samoodnawiania i różnicowania komórek macierzystych.

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

Przeglądaj więcej filmów