Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie potencjalnych kluczowych regulatorów samoodnawiania i różnicowania mysich komórek EML przy użyciu technologii sekwencjonowania RNA. Osiąga się to poprzez pierwsze oddzielenie ujemnych komórek EML CD 34 i ujemnych komórek EML CD 34 ujemnych na podstawie markerów powierzchniowych. Drugim krokiem jest wyizolowanie mRNA, przekształcenie mRNA w cDNA i przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania.

Następnie biblioteka DNA poddawana jest sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości. Ostatnim krokiem jest analiza wyników sekwencjonowania i poszukiwanie różnie wyrażonych czynników transkrypcyjnych. Ostatecznie technologia sekwencjonowania RNA jest wykorzystywana do pokazania czynników transkrypcyjnych o zróżnicowanej ekspresji w komórkach EML z ujemnym CD 34 i ujemnym z ujemnym CD 34

Główną zaletą sekwencjonowania RNA w porównaniu z innymi metodami ekspresji G prolenu, takimi jak mikropromieniowanie, jest to, że ma wyższą czułość, dokładność i szerszy zakres dynamiki oraz nie opiera się na istniejących wcześniej informacjach o adnotacji genów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie komórek macierzystych, takie jak kluczowe czynniki transkrypcyjne regulujące samoodnawianie i różnicowanie komórek. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób krwi, ponieważ lepsze zrozumienie kluczowego regulatora kontrolującego hematopoetyczne komórki prekursorowe, samoodnawianie się i różnicowanie może prowadzić do opracowania skutecznych metod leczenia.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ do analizy sekwencjonowania potrzebne są różne narzędzia bioinformatyczne. Nerka chomika lub komórki BHK do zbierania czynników komórek macierzystych są hodowane w pożywce dmem zawierającej 10% FBS w kolbie o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Gdy komórki osiągną 80 do 90% zbieżności oczu trypsyny i zbierz je przez wirowanie w temperaturze 200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, wyrzuć snat i ponownie zawieś paletę komórek w 10 mililitrach świeżej pożywki do hodowli komórkowych BHK.

Przenieś dwa mililitry zawiesiny komórek do nowej kolby o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych za pomocą aplikacji i dodaj 48 mililitrów świeżej hodowli komórkowej BHK. Pożywka do kultury kolbowej. Ogniwa BHK przez dwa dni.

Po dwóch dniach zebrać pożywkę hodowlaną i przepuścić ją przez filtr punktowy 45 mikrometrów. Przechowuj pożywkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Mysie komórki erytroidalne, szpikowe i limfocytarne lub EML używane w tym protokole są hodowane w zawiesinie w pożywce podstawowej EML zawierającej pożywkę do hodowli komórek BHK w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

Utrzymuj komórki EML w niskiej gęstości komórek z gęstością szczytową mniejszą niż 600 000 komórek na mililitr. Dziel komórki co dwa do trzech dni w stosunku od jednego do pięciu pasaży do komórek delikatnie, ale nie dłużej niż przez 10 pokoleń, aby zubożyć komórki dodatnie w linii. Zebrać komórki EML przez odwirowanie w temperaturze 200 g przez pięć minut.

Przemyć komórki raz PBS i ponownie odwirować po odrzuceniu supernatantu. Ponownie zawieś komórki w PBS i policz komórki za pomocą hemocytometru. Liczba komórek jest potrzebna do określenia stężenia przeciwciał w kolejnym kroku.

Wyizoluj komórki liniowo ujemne lub liniowo ujemne za pomocą koktajlu przeciwciał liniowych i systemu sortowania komórek aktywowanych magnetycznie zgodnie z instrukcjami producenta. Aby rozpocząć tę procedurę, wiruj komórki ujemne w temperaturze 200 G przez pięć minut. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą PBS i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.

Umyj komórki dwukrotnie za pomocą bufora faksu. Po drugim praniu granulować komórki w temperaturze 200 G przez pięć minut. Oznacz pięć mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1.5 mililitra numerami odpowiednio 1, 2, 3, 4 i pięć.

Ponownie zawiesić ogniwa z buforem o odpowiedniej objętości faktów do stężenia 1 miliona komórek na 100 mikrolitrów. Następnie podajcie 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej z pięciu probówek do mikrowirówek. Dodać jeden mikrogram przeciwciała przeciw myszom CD 34 FE do probówki pierwszej i drugiej.

Wymieszaj probówki, delikatnie inkubuj wszystkie probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę w ciemności. Następnie dodaj punkt 25 mikrogramów antyki sprzężonej z PE, jedno przeciwciało i 20 mikrolitrów linii sprzężonej z PC. Koktajl przeciwciał do dwóch jeden, dodać punkt 25 mikrogramów przeciwciała antyca sprzężonego z PE do probówki trzeciej i 20 mikrolitrów linii sprzężonej z PC.

Przeciwciała koktajlowe do probówki czwartej. Delikatnie wymieszaj probówki i inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dodatkowe 30 minut w ciemności. Po 30 minutach dodaj 300 mikrolitrów buforu faksu do wszystkich probówek i wiruj komórki w temperaturze 200 G przez pięć minut.

Po ostatnim płukaniu umyć ogniwa trzykrotnie 500 mikrolitrami buforu faksu. Resus zawiesić każdą komórkę w 500 mikrolitrach bufora faksu, wyizolować lin ujemne SCA dodatnie CD 34 dodatnie i lin ujemne SCA ujemne CD 34 ujemne w probówce pierwszej przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Całkowite RNA ekstrahuje się z lin ujemnych CD 34 dodatnich i lin ujemnych CD 34 ujemnych za pomocą triolu, a zanieczyszczone DNA usuwa się za pomocą nukleazy dezoksyrybo.

Postępując zgodnie z protokołem producenta, oceń jakość całkowitego RNA za pomocą bioanalizatora zgodnie z instrukcjami producenta, do ekstrakcji mRNA i późniejszych procedur budowy biblioteki używa się tylko próbek RNA o liczbie integralności RNA lub RIN większej niż dziewięć. Ten rysunek przedstawia wynik wysokiej jakości próbki RNA o RIN równym 9,4. Zastosowany tutaj protokół budowy biblioteki jest specyficzny dla platformy sekwencjonowania RNA Illumina i wykorzystuje zestaw do przygotowania próbki RNA.

Postępuj zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta, ponieważ w tym filmie pokazane są tylko wybrane kroki. Zacznij od pozytywnego wyboru poli MNA za pomocą kulek magnetycznych oligo DT. Następnie fragmentuj poli mRNA, wykonaj odwrotną transkrypcję za pomocą losowych starterów, aby przekształcić mRNA w CD NA. Następnie zsyntetyzowana druga nić CD NA jest wykorzystywana do generowania dwuniciowego DNA.

Następnie trzy główne zwisy są usuwane, a pięć głównych zwisów jest wypełnianych denatem polimerazy DNA. Trzy pierwsze końce do fragmentów CD NA od podwiązania do siebie. Dodaj adaptery indeksowania multipleksu do obu końców dwużyłowej płyty CD NA w celu sekwencjonowania.

Na koniec wykonaj PCR w celu wzbogacenia CD NA o fragmenty za pomocą spektrofotometru, zmierz absorbancję dwa 60 w stosunku do absorbancji dwóch 80 amplifikowanego DNA. Aby uzyskać informacje o stężeniu biblioteki, należy ocenić jakość biblioteki i zmierzyć zakres wielkości fragmentów DNA za pomocą bioanalizatora. Metody analizy danych sekwencjonowania RNA znajdują się w dołączonym tekście protokołu i obejmują przetwarzanie plików danych do dalszej analizy, wykrywanie nowych transkryptów i ocenę poziomu ekspresji, wykrywanie genów o zróżnicowanej ekspresji i identyfikowanie czynników transkrypcyjnych o zróżnicowanej ekspresji.

Komórki EML ujemne pod względem linii barwiono przeciwciałami anty CD 34 antica one i koktajlem linii oraz lin ujemnymi czaszkowo-dodatnimi CD 34 dodatnimi i lin ujemnymi sca. Ujemne komórki CD 34 oddzielono wyłącznie za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie. Komórki Lin ujemne bramkowano w celu analizy ekspresji SCA one i CD 34.

Po zakończeniu budowy biblioteki zaobserwowano dwie populacje komórek EML. Wielkość fragmentów DNA w bibliotece sprawdzono za pomocą bioanalizatora. Te reprezentatywne dane pokazują dobrą jakość biblioteki, ale rozmiar fragmentu osiąga szczyt na poziomie około 300 par zasad.

Algorytm D-E-S-E-Q został wykorzystany do analizy ekspresji różnicowej, ze szczególnym uwzględnieniem czynników transkrypcyjnych o zróżnicowanej ekspresji, ponieważ czynniki transkrypcyjne mają kluczowe znaczenie dla oznaczania siarczanów. Znaleziono czynniki transkrypcyjne, które zmieniają się ponad 1,5 razy między lin ujemnym CD 34 dodatnim a lin ujemnym CD 34 ujemnym i pokazanym na tej mapie cieplnej. Warto zauważyć, że względny poziom ekspresji TCF siedem w ujemnych komórkach CD 34 jest ponad 100 razy wyższy niż w ujemnych komórkach CD 34 lin.

W związku z tym TCF seven został wybrany do dalszej analizy immunoprecypitacji i sekwencjonowania chromatyny oraz testów funkcjonalnych w celu potwierdzenia jego funkcji w regulacji samoodnawiania i różnicowania w komórkach EML. Po opanowaniu biblioteka RNA może zostać zakończona w ciągu kilku dni, a cała procedura może zostać zakończona w ciągu około miesiąca, jeśli zostanie wykonana prawidłowo po jej opracowaniu. Technologia ta utorowała drogę naukowcom, którzy chcą badać różnicową ekspresję genów między różnymi typami komórek i tkankami, takimi jak limfocyty B i złośliwe komórki B.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o użyciu wysokiego CAR TRNA, ponieważ jest to podstawa całej procedury chorego RNA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś lepiej zrozumieć, jak zidentyfikować kluczowe regulatory kontrolujące odnowę i różnicowanie komórek EML.