Name: Obrazowanie na żywo interakcji między komórkami immunologicznymi i przednowotworowymi przy użyciu indukowalnego systemu ekspresji Gal4/UAS w skórze larw danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo interakcji komórek immunologicznych z przednowotworowymi w skórze larw danio pręgowanego przy użyciu indukowalnego systemu KalTA4-ERT2/UAS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Wellcome Trust Sir Henry Dale Fellowship dla Y. F. 100104/Z/12/Z.
Chcielibyśmy podziękować doktorowi Carlowi Tuckerowi i zespołowi obiektu rybnego w Instytucie Badań Medycznych Królowej Uniwersytetu w Edynburgu. Chcielibyśmy podziękować Michaelowi Millarowi z zakładu immunohistologii i obrazowania Centrum Medycyny Rozrodu MRC Uniwersytetu w Edynburgu za wsparcie.
Dziękujemy Prof. Dr. Matthiasowi Hammerschmidtowi i Dr. Heiko Loehrowi z Instytutu Biologii Rozwojowej Uniwersytetu w Kolonii za dostarczenie wektora wejściowego p5E-krt4. Chcielibyśmy również podziękować dr Dirkowi Siegerowi z Centrum Neuroregeneracji Uniwersytetu w Edynburgu za dostarczenie wektora docelowego pDestTol2CG.

Następujące procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z Ustawą o Zwierzętach (Procedurach Naukowych) z 1986 roku.
1. Przygotowanie plazmidowego DNA do mikroiniekcji
<ol>
	<li>Oczyść plazmid pTol2-krt4:KalTA4-ERT2; cmlc2: eGFP z komercyjnym zestawem do oczyszczania plazmidowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta i rozcieńczyć DNA plazmidu do końcowego stężenia roztworu podstawowego 100 ng / μl.</li>
	<li>Linearyzować transpozazę zawierającą plazmid pT3TS/Tol214 przez trawienie restrykcyjne BamHI, zgodnie z protokołem producenta. Ten krok może zostać przedłużony z dnia na dzień. Wytrącić zlinearyzowane DNA przez ekstrakcję fenolem/chloroformem, zgodnie ze standardowym protokołem.</li>
	<li>In vitro transkrybować mRNA transpozazy ze zlinearyzowanego plazmidu za pomocą komercyjnego zestawu do transkrypcji dla dużych ilości ograniczonego RNA zgodnie z instrukcjami producenta, rozcieńczyć i podwielokrotnić do końcowego stężenia roztworu podstawowego 100 ng / μl w wodzie wolnej od nukleaz. Zapewnić jakość oczyszczonego RNA za pomocą natywnej elektroforezy w żelu agarozowym 1-2% TAE (40 mM Tris, 20 mM kwasu octowego, 1 mM EDTA) w żelu agarozowym (80-120 V). Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Mikroiniekcja plazmidowego DNA w celu przejściowej ekspresji genów
<ol>
	<li>Przygotować płytkę do wstrzykiwań z agarozą, aby przytrzymać zapłodnione komórki jajowe podczas wstrzykiwania. Wlej płyn 3% agarozy do szalki Petriego o średnicy 90 mm. Pozostaw agarozę do ostygnięcia do temperatury 40-50 °C i dodaj klinowatą formę do mikroiniekcji TU-1 na płynną agarozę. Po stwardnieniu w temperaturze pokojowej odstaw agarozę w temperaturze 4 °C na 30 minut przed wyjęciem formy. Formy do mikroiniekcji należy przechowywać w temperaturze 4 °C i użyć ponownie.</li>
	<li>Przygotować porcję roztworu do wstrzykiwań. Wykonaj następujące czynności na lodzie. Odpipetować 1 μl plazmidowego DNA (końcowe stężenie 10 ng/μl), 2 μl mRNA transpozazy (końcowe stężenie 20 ng/μl), 2 μl 10 mg/μl izotiocyjanianu rodaminy-dekstranu, 2 μl 5x roztwór Danieau (290 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 2 mM MgSO4, 3 mM Ca(NO3)2, 25 mM HEPES, pH 7,6) do końcowej objętości 10 μl w wodzie wolnej od nukleaz.</li>
	<li>Przygotować igły z kapilar ze szkła borokrzemianowego o średnicy 1 mm zawierających włókno wewnętrzne, pociągając kapilarnę w przeciwnych kierunkach za pomocą ściągacza do mikropipet. Użyj następującego programu: ciepło 530, ciągnięcie 200, prędkość 80 i czas 150.</li>
	<li>Napełnić jedną igłę 2 μl roztworu do wstrzykiwań (przechowywanego na lodzie). Unikaj pęcherzyków, ostrożnie wyjmując końcówkę mikroładowarki, jednocześnie uwalniając roztwór do kapilary. Ostrożnie przełam końcówkę igły kleszczami.</li>
	<li>Reguluj wielkość kropli za pomocą pneumatycznej pompy pico. Zmierzyć średnicę/objętość kropli (V = 4/3πr3) i dostosować wielkość kropli za pomocą mikrometru okularowego pod stereoskopem w dimetylopolisiloksan. Zalecamy 100 μm, co odpowiada 0,5 nl. Zapewnia to jednolite i powtarzalne stężenia na każdy wstrzyknięty zarodek. Miareczkować wstrzykiwane stężenie i dostosowywać do każdego konstruktu i preparatu plazmidowego.</li>
	<li>Umieścić zygoty (Rysunek 1A) otrzymane ze skrzyżowania Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 15 z Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg 16 w formach płytki wtryskowej za pomocą pastety o pojemności 3 ml. W międzyczasie należy trzymać końcówkę wcześniej przygotowanej igły do wstrzykiwań w dimetylopolisiloksan, aby uniknąć wysychania i krzepnięcia roztworu.</li>
	<li>Wstrzyknąć wcześniej zmierzoną kroplę (100 μm odpowiadającą 0,5 nl) pod stereoskopem przez kosmówkę do blastodysku17, przed pierwszym rozszczepieniem (ryc. 1A). Iniekcja do stadium jednokomórkowego zwiększa potencjał równomiernego rozmieszczenia plazmidowego DNA i RNA w rozwijającej się masie komórkowej oraz możliwość transmisji w linii zarodkowej. Warto zauważyć, że ekspresja konstruktów częściej ma tendencję do mozaiki.</li>
</ol>
3. Warunkowa transformacja komórek skóry przez 4-hydroksytamoksyfen (4-OHT)
<ol>
	<li>Przenieść wstrzyknięte zarodki do 0,3 x roztworu Danieau i utrzymywać je w temperaturze 28,5 °C w inkubatorze. Usuń niezapłodnione jaja z naczynia na etapiekuli 17. Jednocześnie wstrzykiwany izotiocyjanian rodaminy B może być stosowany jako kontrola iniekcji pod fluorescencyjnym stereoskopem.</li>
	<li>Badania przesiewowe zarodków w temperaturze 24 hpf (godz. po zapłodnieniu) pod kątem ekspresji eGFP w sercu. Kontynuuj hodowlę zarodków danio pręgowanego z dodatnim wynikiem cpl do 72 hpf. Uważnie monitoruj jakość wody (0,3x Danieau).</li>
	<li>Usuń kosmówkę tych zarodków, które się nie wykluły, za pomocą kleszczy w temperaturze 72 hpf. Ostrożnie szturchnij kosmówkę 1 kleszczem i rozsuń ją za pomocą drugiego. Wybierz zarodki do ekspresji lysC:dsRed2 za pomocą fluorescencyjnego stereoskopu.</li>
	<li>Dodać 10 μl 10 mM zapasu (Z)-4-hydroksytamoksyfenu do 20 ml 0,3 x roztworu Danieau (końcowe stężenie 5 μM). Roztwór indukcyjny 4-OHT należy stosować do jednej standardowej szalki Petriego (90 mm) na partię 40-60 zarodków.</li>
	<li>Przenieść zarodki na nową szalkę Petriego zawierającą 20 ml świeżo przygotowanego roztworu indukcyjnego. 4-OHT musi być przechowywany i przetwarzany w ciemności. Pierwsze oznaki odciągania pokarmu można wykryć 2 godziny po rozpoczęciu indukcji. Etap indukcji można przedłużyć z dnia na dzień, pamiętając, że początkowe interakcje między komórką gospodarza a komórką przednowotworową mogą wystąpić już kilka godzin po leczeniu.</li>
</ol>
4. Montowanie i obrazowanie na żywo larw danio pręgowanego
<ol>
	<li>Przygotuj szalkę Petriego o średnicy 60 mm, wprowadzając otwór o średnicy 18-20 mm. Użyj smaru silikonowego o wysokiej próżni, aby przykryć i uszczelnić otwór na zewnętrznym dnie szalki Petriego szkłem nakrywkowym o średnicy 25 mm (Rysunek 1B).</li>
	<li>Przygotować 1% agarozę o niskiej temperaturze topnienia (LMP). Przechowywać jedną probówkę 1,5 ml agarozy LMP w temperaturze 37 °C w bloku grzewczym.</li>
	<li>Wstępny wybór Tg(krt4:KalTA4-ERT2; Bezzałogowy statek powietrzny:eGFP-HRASG12V; larwy lisC: dsRed2) dla zielonych fluorescencyjnych komórek skóry i ekspresji wrodzonych komórek odpornościowych dsRed2 dodatnich, pod fluorescencyjnym stereoskopem. Znieczulić larwy przez dodanie 1 ml 0,4% tricainy18 do 20 ml roztworu indukcyjnego.</li>
	<li>Przenieś wstępnie wybrane larwy z pastetą do płynnej agarozy LMP. Pozwól larwom zanurzyć się w agarozie LMP i przenieś je na szkło nakrywkowe (ryc. 1B). Zorientuj zarodki pod stereoskopem. Larwy należy umieścić bezpośrednio na szkle, aby zmniejszyć odległość roboczą (do 6 larw).</li>
	<li>Przykryj agarozę LMP roztworem indukcji zawierającym trikainę po jej stwardnieniu (strzałka Rysunek 1B).</li>
	<li>Zobrazuj osadzone larwy za pomocą mikroskopu konfokalnego z odwróconym fluorescencyjnym, skaningowym lub wirującym dyskiem. Użyj obiektywu 40X lub 63X, ponieważ obiektywy o dużej odległości roboczej umożliwiają ustawienie ostrości przez całe larwy.</li>
</ol>

<ol><li>Kajita, M., Sugimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamin+acts+as+a+key+regulator+in+epithelial+defence+against+transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Filamin acts as a key regulator in epithelial defence against transformed cells.</a> Nature communications. 5, 4428(2014).</li>
<li>Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+innate+immune+cell+sensing+of+transformed+cells+in+zebrafish+larvae%3A+parallels+between+tumor+initiation+and+wound+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation.</a> PLoS Biology. 8 (12), e1000562(2010).</li>
<li>Feng, Y., Renshaw, S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Tumor+Initiation+in+Zebrafish+Larvae+Reveals+a+Trophic+Role+for+Leukocyte-Derived+PGE+2%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Tumor Initiation in Zebrafish Larvae Reveals a Trophic Role for Leukocyte-Derived PGE 2.</a> Current Biology. 22 (13), 1253-1259 (2012).</li>
<li>Halpern, M. E., Rhee, J., Goll, M. G., Akitake, C. M., Parsons, M., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gal4%2FUAS+transgenic+tools+and+their+application+to+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish.</a> Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).</li>
<li>Gong, Z., Ju, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics+an+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Developmental Dynamics an Official Publication of the American Association of Anatomists. 223 (2), 204-215 (2002).</li>
<li>Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13365-13370 (2009).</li>
<li>Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Cre+recombinase+activity+by+mutated+estrogen+receptor+ligand-binding+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 237 (3), 752-757 (1997).</li>
<li>Gerety, S. S., Breau, M. a, Sasai, N., Xu, Q., Briscoe, J., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+transgene+expression+system+for+zebrafish+and+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An inducible transgene expression system for zebrafish and chick.</a> Development. 140 (10), 2235-2243 (2013).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113(2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Cell+Extrusion+from+the+Epidermis+of+Developing+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (52), e2689(2011).</li>
<li>Kague, E., Weber, C., Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+Zebrafish+Transgenesis+for+Evaluating+Enhancer+Sequences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences.</a> J. Vis. Exp. (41), e1722(2010).</li>
<li>Balciuniene, J., Gene Balciunas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+Using+Gal4+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Trapping Using Gal4 in Zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (79), e50113(2013).</li>
<li>Balciunas, D., Wangensteen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genetics. 2 (11), e169(2006).</li>
<li>Santoriello, C., Gennaro, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kita+driven+expression+of+oncogenic+HRAS+leads+to+early+onset+and+highly+penetrant+melanoma+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Kita driven expression of oncogenic HRAS leads to early onset and highly penetrant melanoma in zebrafish.</a> PloS One. 5 (12), e15170(2010).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42(2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics+%3A+an+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">THE ZEBRAFISH BOOK: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).</li>
<li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics+%3A+an+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>MultiSite Gateway Three- Fragment Vector Construction Kit. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Protocols+and+Product+Manuals%22">Protocols and Product Manuals</a>. 12537-023, Invitrogen life technologies. (2010).</li>
<li>Petersen, L. K., Stowers, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gateway+MultiSite+Recombination+Cloning+Toolkit%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Gateway MultiSite Recombination Cloning Toolkit).</a> PLoS ONE. 6 (9), e10(2011).</li>
<li>Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Gateway+to+MultiSite+Gateway+in+one+recombination+event%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event.</a> BMC Molecular Biology. 7, 46(2006).</li>
<li>Robertson, D. W., Katzenellenbogen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+the+%28E%29+and+%28Z%29+isomers+of+the+antiestrogen+tamoxifen+and+its+metabolite%2C+hydroxytamoxifen%2C+in+tritium-labeled+form%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of the (E) and (Z) isomers of the antiestrogen tamoxifen and its metabolite, hydroxytamoxifen, in tritium-labeled form.</a> The Journal of Organic Chemistry. 47 (12), 2387-2393 (1982).</li>
<li>Murphy, C., Langan-Fahey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+of+hydroxylated+metabolites+of+tamoxifen+that+control+the+proliferation+of+estrogen-responsive+T47D+breast+cancer+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships of hydroxylated metabolites of tamoxifen that control the proliferation of estrogen-responsive T47D breast cancer cells in vitro.</a> Molecular. 38 (5), 737-743 (1990).</li>
<li>Furr, B. J. A., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pharmacology+and+clinical+uses+of+tamoxifen%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">The pharmacology and clinical uses of tamoxifen.</a> Pharmacology & Therapeutics. 25 (2), 127-205 (1984).</li>
<li>Akerberg, A. a, Stewart, S., Stankunas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Control+of+Transgene+Expression+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Control of Transgene Expression in Zebrafish.</a> PloS One. 9 (3), e92217(2014).</li>
<li>Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally-controlled+site-specific+recombination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Temporally-controlled site-specific recombination in zebrafish.</a> PloS One. 4 (2), e4640(2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podczas embriogenezy i rozwoju larwalnego zarodkowa skóra danio pręgowanego składa się z dwóch warstw nabłonkowych, warstwy powierzchownej zwanej perydermą i warstwy keratynocytów podstawnych, które są przyczepione do leżącej poniżej błony podstawnej19 (ryc. 1C, a). Przedstawiony tutaj protokół opisuje prostą metodę warunkowego wywoływania transformacji komórek przednowotworowych w powierzchownej warstwie skóry larw danio pręgowanego i pozwala na późniejszą analizę interakcji z wrodzonymi komórkami odpornościowymi za pomocą obrazowania na żywo. Podstawowe metodologie w naszym protokole są zgodne z dobrze znanymi technikami danio pręgowanego 9-13, a nasz protokół można łatwo dostosować i zmodyfikować.
Zastosowany tutaj promotor krt4 5 napędza ekspresję KalTA4-ERT2 specyficznie w najbardziej zewnętrznej warstwie skóry (Figura 1C, b). Jednak modułowa strategia klonowania MultiSite Gateway, używana do generowania konstrukcji krt4:KalTA4-ERT2 (Rysunek 1D, a), zapewnia możliwość sklonowania dowolnego interesującego promotora przed KalTA4-ERT2 w jednym kroku klonowania. Adaptacja przedstawionej tu metody jest zatem możliwa dla większości tkanek w okresie embriogenezy i stadiów larwalnych. Dostępność sekwencji promotorowych jest tym czynnikiem ograniczającym. Co więcej, prawie każdy gen będący przedmiotem zainteresowania sklonowany za UAS może ulegać warunkowej nadekspresji na różnych etapach rozwoju przy użyciu kontrolowanej przestrzennie i czasowo ekspresji KalTA4-ERT2 . W związku z tym nasz protokół może być dostosowany do przeprowadzania warunkowej ekspresji genów w dowolnej tkance będącej przedmiotem zainteresowania larw danio pręgowanego, w sposób mozaikowy. Można również zoptymalizować ustawienie mikroskopu, aby na żywo obrazować głębsze tkanki, takie jak wątroba czy trzustka.
Opisaliśmy tutaj jedną aplikację wykorzystującą protokół, podobnie można nadekspresję innych modulatorów stanu zapalnego za pomocą tego protokołu do badania regulacji odpowiedzi zapalnych, ponieważ można łatwo obrazować na żywo zmiany behawioralne neutrofili i makrofagów po indukcji i zatrzymaniu ekspresji kandydującego modulatora stanu zapalnego. Co więcej, dostosowany protokół byłby również korzystny dla tych, którzy chcą śledzić ruchy komórek i zmiany zachowania podczas różnych etapów morfogenezy tkanek i tworzenia narządów, a wreszcie na żywo obrazować interakcję interakcji wrodzonych komórek odpornościowych z innymi specyficznymi liniami komórkowymi, które mogą być celem indukowalnego systemu ekspresji KalTA4-ERT2 / UAS.
Użyliśmy wektora pDestTol2CG z danio pręgowanego Tol2kit20–23 , który zawiera kasetę cmlc2: eGFP-pA (ryc. 1D, a), która umożliwia późniejszą selekcję zarodków przez zielone fluorescencyjne serca dodatnie jako marker selekcyjny20 , który upraszcza proces badań przesiewowych F0. Stabilna insercja genu otoczonego transpozonem do genomu jest ułatwiona przez jednoczesne wstrzyknięcie plazmidowego DNA wraz z mRNA transpozy. Przygotowanie plazmidowego DNA i mRNA transpozazy do mikroiniekcji przebiega zgodnie ze standardowymi protokołami. Jednak udana integracja konstruktu z genomem zależy od transpozycji opartej na Tol214. Podkreśla to szczególną uwagę, jaką należy zwrócić na pracę na lodzie w sterylnych warunkach, aby uniknąć zanieczyszczeń i degradacji przez RNazy i DNazy. Mikroiniekcja do zarodków w stadium jednokomórkowym jest solidną i dobrze ugruntowaną techniką badań nad zyskiem i utratą funkcji u danio pręgowanego9,10. Chociaż dobrze wyszkolona osoba może z łatwością wstrzyknąć do żółtka ponad 1000 zarodków w ciągu 1 godziny, wstrzyknięcie do blastodysku (ryc. 1A, gwiazdka) wymaga większego doświadczenia i treningu. Kluczowe znaczenie podczas tej procedury ma obchodzenie się z igłą. Igła musi być bardzo cienka, aby wniknąć w komórkę bez uszkodzeń, a zatem musi być złamana tylko na samym końcu. Ważne jest, aby regularnie kontrolować i mierzyć wielkość kropli podczas wstrzyknięcia, aby zagwarantować równomierne wstrzyknięcie do każdego zarodka. Ostrożnie obchodzona igła może być używana do obracania zarodka. Jest to często potrzebne, aby znaleźć blastodysk i optymalny kąt penetracji.
Stężenie DNA i mRNA transpozazy używane do wstrzykiwań prawie na pewno wpływa na wydajność ekspresji. Wyższe dawki mogą prowadzić do zwiększenia odsetka komórek wykazujących ekspresję transgenu, ale przy wyższych stężeniach DNA (>50 ng/μl) i mRNA transpozazy (>100 ng/μl) pojawia się również potencjalne skutki toksyczne wśród wstrzykniętych zarodków. Opowiadamy się za użyciem mRNA transpozazy 10 ng/μl DNA i transpozazy 20 ng/μl do iniekcji, co odpowiada 50 pg plazmidowego DNA i 100 pg RNA na wstrzyknięty zarodek. 100% zarodków, którym wstrzyknięto te stężenia, rozwija się normalnie, a od 40 do 70% wykazuje ekspresję eGFP-HRASG12V po indukcji 4-OHT, w zależności od skuteczności wstrzyknięcia do pojedynczej komórki. Wśród zarodków dodatnich zwykle znajdujemy około 30%, które mają 1-10 klonów, 40% ma 10-50 klonów, a 30% ma więcej niż 50 klonów. Ze względu na nasze cele badawcze opowiadamy się za wykorzystaniem zarodków z mniejszą liczbą klonów wykazujących ekspresję eGFP-HRASG12V. Do naszych przejściowych eksperymentów wybieramy zarodki z 10-50 klonami. Do produkcji transgenicznych ryb założycielskich zalecamy wybieranie tylko zarodków z zarówno eGFP dodatnim markerem sercowym, jak i dużą liczbą dodatnich klonów eGFP-HRASG12V w ich naskórku.
(Z)-4-hydroksytamoksyfen ulega interkonwersji cis-trans (E-Z) pod wpływem światła24. Stwierdzono, że izomer cis (E) jest 100 razy mniej antyestrogenny niż jego trans odpowiednik25,26. Dlatego należy unikać ekspozycji na światło. Roztwór podstawowy 4-OHT rozpuszczony w etanolu może być przechowywany w temperaturze -20 °C w ciemności przez długi okres czasu. Zalecamy użycie pudełka do ochrony szalek Petriego przed światłem podczas indukcji docelowego genu w inkubatorze i transportu. Chociaż obszar obrazowania jest bardzo mały, a ekspozycja 4-OHT na światło UV jest zredukowana do minimum, zaleca się stałą wymianę roztworu indukcyjnego co 2 godziny podczas obrazowania przez dłuższy czas, aby utrzymać maksymalny poziom ekspresji. 4-OHT skutecznie przenika przez kosmówkę i najbardziej zewnętrzne warstwy skóry podczas embriogenezy danio pręgowanego, dzięki czemu może bardzo szybko indukować ekspresję genów. Emisję eGFP możemy łatwo zaobserwować po 2 godzinach od indukcji i doniesiono, że pierwsze oznaki ekspresji genu docelowego można zaobserwować po 1 godzinie, a plateau po 3 godzinach leczenia8. Różnice mogą wynikać z innego promotora zastosowanego w naszym badaniu. Ponieważ wcześniej informowano, że leczenie 4-OHT jest zależne od dawki8,27, zdecydowaliśmy się użyć najwyższego zgłoszonego stężenia 5 μM, aby osiągnąć solidne i powtarzalne poziomy ekspresji w naszym przejściowym podejściu. Powinno to zagwarantować, że wszystkie komórki przenoszące transgen będą indukować ekspresję genu docelowego.
Należy wziąć pod uwagę, że przedstawione tutaj podejście przejściowe może prowadzić do różnych poziomów ekspresji ze względu na możliwość wielokrotnych i losowych zdarzeń insercji genomu. Co więcej, zastosowanie mRNA transpozazy w transgenicznym tle Tol2 Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 może prowadzić do potencjalnych transpozycji transgenu UAS, co może skutkować wyciszeniem lub zakłóceniem genu. Ponieważ jednak przedstawiona tutaj metoda jest podejściem przejściowym, wstępna selekcja zarodków po wstrzyknięciu jest obowiązkowa. Wiele laboratoriów odkryło, że sekwencje UAS mają tendencję do wyciszania u transgenicznego potomstwa, stąd wstrzykiwanie pTol2-krt4:KalTA4-ERT2; cmlc2: konstrukt eGFP do zarodków Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 może nie być tak wydajny, jak wstrzyknięcie konstruktu UAS do Tg(krt4:KalTA4-ERT2; cmlc2:GFP) zarodków. Zastosowanie stabilnej linii transgenicznej Tg(krt4:KalTA4-ERT2) skrzyżowanej z Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 pozwoli na precyzyjne monitorowanie kinetyki włączania/wyłączania aktywacji genu 4-OHT zależnej od dawki w czasie.
Krytycznym etapem podczas montowania larw jest przeniesienie do agarozy LMP i na szkło nakrywkowe (ryc. 1B). Istnieje tylko krótki czas na temperaturę agarozy cieczy LMP, który pozwala na bezpieczne przenoszenie i orientację wstępnie wybranych larw bez szkody dla ryb przez szok cieplny lub stwardnienie żelu. Larwy należy ustawić bezpośrednio na szkle nakrywkowym, aby zmniejszyć odległość roboczą do późniejszej analizy mikroskopowej. Ponieważ może to być czynnikiem ograniczającym podczas mikroskopii, wybór odpowiednich obiektywów jest obowiązkowy. Po zamontowaniu larwa może być utrzymywana od kilku godzin do dni.
Przedstawiona w niniejszym artykule warunkowość systemu modelowego pozwala na wielokrotną transformację poprzez aktywację transgenu przez 4-OHT. System ekspresji zależy od obecności 4-OHT, a zatem kontrolowana przez KalTA4 ekspresja genu będącego przedmiotem zainteresowania jest odwracalna (Figura 1D, b). W przeciwieństwie do systemu Cre-ERT2/Lox, który ułatwia nieodwracalną rekombinację genomową28, KalTA4-ERT2/UAS może być aktywowany i dezaktywowany po dodaniu lub usunięciu 4-OHT, a ten potencjał wielokrotnej indukcji stanowi przewagę tej techniki nad systemem Cre-ERT2/Lox. Jednak wymóg stałego poziomu 4-OHT jest ograniczeniem, jeśli eksperyment musi zostać przedłużony z dni do tygodni.

Przerost potomstwa komórek prenowotworowych w normalnym arkuszu nabłonka silnie zależy od interakcji z jego mikrośrodowiskiem. Interakcja z tkanką gospodarza będzie prawdopodobnie głównym wyznacznikiem tego, czy komórka przednowotworowa jest w stanie stworzyć niszę klonalną, aby dalej rozwijać się w pełnoobjawowego raka. Pomimo swojego znaczenia w rozwoju, ta początkowa faza progresji raka jest niedostępna w większości powszechnie stosowanych systemów modelowych, in vivo.
Danio rerio, danio pręgowany, jest dobrze znanym organizmem modelowym do badań obrazowych na żywo ze względu na jego przejrzystość w trakcie rozwoju, możliwość manipulacji genetycznych i dostępność leków rozpuszczalnych w wodzie. Ostatnie badania z wykorzystaniem modelu larwalnego danio pręgowanego, powodującego nadekspresję ludzkiego onkogenu HRASG12V w celu transformacji komórek nabłonkowych, wykazały, że sygnały pochodzące z komórek gospodarza, w szczególnościH2O2, prowadzą do rekrutacji wrodzonych komórek odpornościowych. Co ciekawe, wykazano, że zrekrutowane komórki odpornościowe, neutrofile i makrofagi, odgrywają troficzną rolę we wspieraniu proliferacji komórek przednowotworowych2,3.
Aby zrozumieć wczesne zdarzenia inicjacji i progresji nowotworu, jak również wkład reakcji zapalnej, trzeba być w stanie zobrazować te zdarzenia od najwcześniejszego punktu czasowego. Dlatego konieczne jest kontrolowanie przemian komórkowych w sposób czasowy i specyficzny dla tkanki. Wykorzystujemy system Gal4 / UAS, który został z powodzeniem zaadaptowany z Drosophila4 do warunkowej ekspresji ludzkiego onkogenu HRASG12V pod kontrolą specyficznego dla skóry promotora keratyny 4 (krt4)5. Zmodyfikowana wersja aktywatora transkrypcyjnego Gal4, a mianowicie KalTA46, umożliwia ekspresję HRASG12V pod kontrolą sekwencji aktywującej przed prądem (UAS). Aby warunkowo indukować ekspresję aktywatora transkrypcji, KalTA4 został połączony ze zmutowaną domeną wiążącą ligand ludzkiego receptora estrogenowego α (ERT2)7, który wiąże specyficznie 4-hydroksytamoksyfen (4-OHT)1. W przypadku braku 4-OHT ERT2 jest wiązany w cytoplazmie przez białka szoku cieplnego. Po związaniu 4-OHT białka szoku cieplnego dysocjują, umożliwiając translokację jądrową KalTA4-ERT2, a następnie aktywację interesującego genu kontrolowanego przez UAS8 (Figura 1C, b). Ponieważ ten system ekspresji zależy od obecności 4-OHT, kontrolowana przez KalTA4 ekspresja genu będącego przedmiotem zainteresowania jest odwracalna. W przeciwieństwie do układu Cre-ERT2/Lox, który prowadzi do nieodwracalnego zdarzenia rekombinacji, indukcja aktywacji transkrypcyjnej przez KalTA4-ERT2 jest odwracalna przez dodanie lub usunięcie 4-OHT.
Następujący protokół pozwala na warunkową transformację komórek skóry u larw danio pręgowanego i późniejsze monitorowanie interakcji z wrodzonymi komórkami odpornościowymi poprzez fluorescencyjną ekspresję białka. Podstawowe metodologie zastosowane w tym protokole są podobne do niektórych powszechnie stosowanych technik w społeczności danio pręgowanego9–13.
Generowanie i kombinacyjne wykorzystanie linii transgenicznych wraz z mikroiniekcją konstruktów transgenicznych umożliwia przejściowe podejście do przekształcania tylko pojedynczych komórek w sposób mozaikowy. Przepuszczalność tlenu przez zarodkową i larwalną skórę danio pręgowanego zwiększa możliwość prowadzenia poklatkowych badań obrazowych na żywo za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości z godzin do dni. Co więcej, jego dostępność dla leków rozpuszczalnych w wodzie umożliwi przyszłe badania mechanistyczne i monitorowanie zdarzeń biologicznych w komórkach in vivo, co może prowadzić do lepszego zrozumienia najwcześniejszych etapów rozwoju raka.
Ten protokół może być dostosowany do przeprowadzania warunkowej ekspresji genów w dowolnej tkance u larw danio pręgowanego, w sposób mozaikowy. Można również zoptymalizować ustawienie mikroskopu, aby na żywo obrazować głębsze tkanki inne niż skóra.

<table><tbody><tr><td>(Z)-4-Hydroxytamoxifen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H7904</td><td>rozcieńczyć w etanolu i przechowywać w ciemności w temperaturze -20&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>20X Obiektyw</td><td>Zeiss</td><td></td><td>20X/0.5 Ph2 &infin;/0.17</td></tr><tr><td>40X Obiektyw</td><td>Zeiss</td><td></td><td>40X/1.2W Korr &infin;/0.14-0.18</td></tr><tr><td>63X Obiektyw</td><td>Zeiss</td><td></td><td>63X/1.4 Oil Ph3 &infin;/0.17</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 510 META</td></tr><tr><td>Cover szkło</td><td>VWR</td><td>631-0171</td><td>Średnica 25 mm</td></tr><tr><td>Dimetylopolisiloksan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DMPSV</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning wysokopróżniowy smar silikonowy&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MKBL4135V</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown P-97 Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments Co.</td>Program <td>P-97</td><td>: ciepło 530, ciąg 200, prędkość 80 i czas 150</td></tr><tr><td>Stereoskop fluorescencyjny&nbsp;</td><td>Kapilary ze</td> szkła brokrzemianowego Leica <td></td><td>M205 FA</td></tr><tr><td>Kwik-Fill</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Forma do mikroiniekcji TU-1</td><td>Adaptacyjne narzędzia naukowe</td><td>Końcówka do</td> mikroładowarki TU-1 <td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Axiovert 200</td></tr><tr><td>mMESSAGE Zestaw mMACHINE</td><td>Ambion</td><td>AM1348</td><td></td></tr><tr><td>Woda bez nukleaz</td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatyczna pompa piko</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>PV820&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pompa pneumatyczna</td><td>pico Warner Instruments</td><td>PLI-90A</td><td></td></tr><tr><td>pTol2-krt4:KalTA4-ERT2; cmlc2: eGFP</td><td></td><td></td><td>Dr. Thomas Ramezani / Yi Feng Lab / Uniwersytet w Edynburgu</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Quiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Izotiocyjanian rodaminy B-Dekstran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8881</td><td>10 mg / &mu; l w wodzie</td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Leica</td><td></td><td>M80</td></tr><tr><td>Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg</td><td></td><td></td><td>BMC Developmental Biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007)</td></tr><tr><td>Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006</td><td></td><td></td><td>PloS One 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010)</td></tr><tr><td>Trikaina/MS-222</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agaroza</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agaroza o niskiej temperaturze topnienia&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Phenol : Chloroform : Alkohol izoamylowy</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td>25:24:1, v/v</td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo interakcji między komórkami immunologicznymi i przednowotworowymi przy użyciu indukowalnego systemu ekspresji gal4/uas w skórze larw danio pręgowanego

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Tutaj opisujemy metodę warunkowego wywoływania transformacji komórek nabłonkowych za pomocą indukowanegoprzez 4-hydroksytamoksyfen (4-OHT) systemu ekspresji KalTA4-ERT2/UAS 1 u larw danio pręgowanego, a następnie obrazowanie na żywo interakcji wrodzonych komórek odpornościowych z komórkami skóry wyrażającymiHRAS G12V. System KalTA4-ERT2/UAS jest zarówno indukowalny, jak i odwracalny, co pozwala nam indukować transformację komórek z precyzyjną rozdzielczością czasowo-przestrzenną in vivo. Daje nam to wyjątkową okazję do zobrazowania na żywo, w jaki sposób poszczególne komórki przednowotworowe oddziałują z tkankami gospodarza zaraz po ich pojawieniu się, a następnie śledzenia ich progresji i regresji. Ostatnie badania na larwach danio pręgowanego wykazały troficzną funkcję odporności wrodzonej w najwcześniejszych stadiach nowotworzenia2,3. Nasz indukowalny system pozwoliłby nam na obraz na żywo początku transformacji komórkowej i następującej po niej odpowiedzi gospodarza, co może prowadzić do ważnych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw regulacji onkogennych troficznych odpowiedzi zapalnych. Omawiamy również, w jaki sposób można dostosować nasz protokół, aby osiągnąć czasową i przestrzenną kontrolę ektopowej ekspresji genów w dowolnej tkance będącej przedmiotem zainteresowania.

Zygoty z krzyżówki linii Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 i Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg zostały zebrane 10-15 min po zapłodnieniu (Rycina 1A), aby uzyskać embriony w stadium 1 komórki. Po iniekcji embriony hodowano do 3 dpf, przed indukcją za pomocą 4-OHT i montażem do obrazowania na żywo (Rycina 1B). Od 2 do 6 h po indukcji zamontowane embriony umieszczano albo pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym (Rycina 2A), albo pod odwróconym mikroskopem konfokalnym (Rycina 2B-C) i obrazowano przez 2-3 h w odstępach 1,5 min. Przednowotworowe powierzchowne komórki skóry można zidentyfikować po ich bardziej zaokrąglonej morfologii w porównaniu do prawidłowych keratynocytów, a także po zielonej fluorescencji zlokalizowanego w błonie eGFP-HRASG12V. Obszary obrazowania wybrano pod kątem kolokalizacji przednowotworowych komórek skóry i komórek odporności wrodzonej (Rycina 2A grot strzałki). Ze względu na szybki proces migracji neutrofili, odstępy czasowe time-lapse wybrano w zakresie 1-1,5 min z rozmiarem kroku Z-stack wynoszącym 0,7-1,7 μm w celu uzyskania maksymalnych projekcji intensywności (Rycina 2, Film 1). Podczas obrazowania na żywo można zaobserwować szeroki wachlarz zachowań: neutrofile migrują obok i pod komórkami przednowotworowymi (Rycina 2C, Film 1), tworzą bezpośrednie kontakty z komórkami (Rycina 2B i C), usuwają szczątki komórek przednowotworowych przechodzących apoptozę (Film 1) lub aktywnie pochłaniają części komórek przednowotworowych (nie pokazano). Aby uchwycić pełne spektrum interakcji, zaleca się śledzenie ich zachowań za pomocą obrazowania na żywo w technice time-lapse.
<img alt="Schematy struktury komórkowej i ekspresji transgenicznej; obejmują ustawienie szalki Petriego, fuzję genu eGFP-HRAS." src="/files/ftp_upload/52107/52107fig1highres.jpg" width="700px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat warunkowej transformacji komórek skóry u larw danio pręgowanego. (A) Obraz zygoty danio pręgowanego Tg(UAS:eGFP-HRASG12V;lysC:dsRed2) w 10 min po zapłodnieniu (mpf). Zapłodnione jajo jest otoczone przez chorion (grot strzałki). Miejscem iniekcji jest blastodysk (gwiazdka), utworzony przez strumienie cytoplazmatyczne z żółtka (strzałka), który wyznacza biegun zwierzęcy zarodka. (B) Montaż larw danio pręgowanego. Szalka Petriego 60 mm z otworem 18-20 mm (grot strzałki), który jest uszczelniony szkiełkiem nakrywowym 25 mm. Larwy danio pręgowanego są unieruchomione i zamocowane na szkiełku nakrywowym za pomocą 1% agarozy LMP. Do pokrycia agarozy LMP używa się 0,3x roztworu Danieau (strzałka) zawierającego 5 μM 4-OHT. (C) Transformacje powierzchownych komórek skóry indukowane 4-OHT. (a) Schematyczny profil przekroju skóry larwy. Skóra embrionalna i larwalna składa się z dwóch warstw komórek nabłonkowych: powierzchownej warstwy komórek oraz bazalnej warstwy keratynocytów połączonych z leżącą poniżej błoną podstawną (BM). (b) System ekspresji przejściowej służący do indukcji preneoplastycznego klonu komórek wśród powierzchownych komórek skóry. KalTA4-ERT2 jest eksprymowany wyłącznie w zewnętrznej warstwie skóry pod kontrolą promotora krt4 (kolor żółty). Mozaikowa ekspresja KalTA4-ERT2 aktywuje kontrolowaną przez UAS (kolor niebieski) ekspresję eGFP-HRASG12V w komórkach powierzchownych, co prowadzi do powstania klonu komórek preneoplastycznych (kolor zielony). (D) Schemat systemu ekspresji przejściowej. (a) Kaseta Tol2 wektora ekspresyjnego pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP używanego przejściowo. (b) Warunkowa indukcja ekspresji aktywatora transkrypcyjnego. KalTA4 jest połączony z mutantową domeną wiążącą ligand ludzkiego receptora estrogenowego α (ERT2), który specyficznie wiąże 4-hydroksytamoksifen (4-OHT). Wobec braku 4-OHT receptor ERT2 jest związany w cytoplazmie przez białka szoku cieplnego (Hsp90). Po związaniu 4-OHT białko Hsp90 dysocjuje, co umożliwia translokację jądrową KalTA4-ERT2 i następczą aktywację kontrolowanej przez UAS ekspresji eGFP-HRASG12V. Pasek skali A = 500 μm. <a href="/files/ftp_upload/52107/52107fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna zarodka Drosophila. eGFP-HRas na zielono, lysC:dsRed na czerwono, schemat." src="/files/ftp_upload/52107/52107fig2highres.jpg" width="700px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Obrazowanie na żywo interakcji między komórkami przednowotworowymi a komórkami odporności wrodzonej. (A-C) Obrazy zarodka Tg(UAS:eGFP-HRASG12V;lysC:dsRed2) w 4 dpf, do którego w stadium jednej komórki wstrzyknięto pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP oraz mRNA transpozazy. Obrazy wykonano po 6 godzinach indukcji 4-OHT. (A) Widok boczny obszaru płetwy ogonowej 6 godzin po zabiegu, pokazujący skupiska komórek skóry wykazujących ekspresję eGFP-HRASG12V (strzałka) oraz neutrofile lysC:dsRed2+ (grot strzałki). (B-C) Reprezentatywne obrazy z filmu confocal time-lapse, pokazujące interakcje neutrofili (czerwone) z komórkami skóry wykazującymi ekspresję eGFP-HRASG12V (zielone). (B) Komórka przednowotworowa tworzy krótkie wypustki filopodialne z kontaktującym neutrofilem (grot strzałki). (C) Neutrofile (czerwone) znajdują się w bliskim kontakcie z klonem przednowotworowych komórek skóry (zielone). Pasek skali w A = 100 μm; B/C = 50 μm. <a href="/files/ftp_upload/52107/52107fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję rysunku.</a>
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52107/Video_1.mov" target="_blank">Wideo 1</a>: Obrazowanie live time-lapse oddziaływań między komórkami przednowotworowymi a komórkami odporności wrodzonej. Nagranie time-lapse zarodka Tg(UAS:eGFP-HRASG12V;lysC:dsRed2) w 4 dniu po zapłodnieniu (dpf), wstrzykniętego w stadium jednej komórki z pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP oraz mRNA transpozazy. Film z konfokalnego obrazowania time-lapse wykonany w odstępie od 6 do 9 godzin po indukcji 4-OHT, pokazujący oddziaływania neutrofili lysC:dsRed2+ (czerwone) z komórkami skóry wykazującymi ekspresję eGFP-HRASG12V (zielone). Neutrofile migrują obok i pod komórki przednowotworowe oraz usuwają szczątki komórki przednowotworowej ulegającej apoptozie. Interwały time-lapse wynoszą 1,5 min przez 3 h, z krokiem stosu Z wynoszącym 1,3 μm.

Badanie najwcześniejszych zdarzeń progresji komórek przednowotworowych i interakcji wrodzonych komórek odpornościowych jest kluczowe dla zrozumienia i leczenia raka. W tym miejscu opisujemy metodę warunkowego wywoływania przemian komórek nabłonkowych i późniejszego obrazowania na żywo interakcji wrodzonych komórek odpornościowych z komórkami skóry wyrażającymi HRASG12V u larw danio pręgowanego.

Obrazowanie na żywo interakcji między komórkami immunologicznymi i przednowotworowymi przy użyciu indukowalnego systemu ekspresji Gal4/UAS w skórze larw danio pręgowanego

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

live-imaging-innate-immune-preneoplastic-cell-interactions-using-an

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Obumierające komórki są usuwane z tkanek nabłonkowych poprzez skoordynowany skurcz komórek sąsiednich, bez naruszania funkcji barierowej. Przejrzystość optyczna rozwijających się rybek danio przymrużonych stanowi doskonały system do wizualizacji procesu ekstruzji w żywych nabłonkach. W niniejszej pracy opisujemy metody indukcji i obrazowania ekstruzji w naskórku larw rybek danio przymrużonych z rozdzielczością komórkową.

Obrazowanie na żywo ekstruzji komórek z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego

Przezroczyste zarodki rybek danio-ostrolepisnych okazały się użytecznymi modelami gospodarzy do wizualizacji i funkcjonalnego badania oddziaływań między komórkami odporności wrodzonej a wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi, takimi jak Salmonella typhimurium oraz Mycobacterium marinum. Mikrowstrzykiwanie bakterii oraz wielobarwne obrazowanie fluorescencyjne to kluczowe techniki stosowane w modelach infekcji zarodków rybek danio-ostrolepisnych.

Zakażanie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

Szybki rozwój, niewielki rozmiar i przezroczystość danio pręgowanego stanowią ogromne zalety w badaniach nad wrodzonym immunologicznym kontrolowaniem infekcji1-4. W niniejszej pracy prezentujemy techniki zakażania larw danio pręgowanego grzybiczym patogenem Candida albicans za pomocą mikroiniekcji – metodologii wykorzystanej niedawno do wykazania roli aktywności NADPH oksydazy fagocytów w kontrolowaniu dimorfizmu grzybów5.

Nieinwazyjne obrazowanie rozsianej kandydozy u larw rybek danio

W niniejszej pracy opisujemy nowatorski wysokoprzepustowy test chemicznie indukowanego stanu zapalnego, którego celem jest identyfikacja bioaktywnych substancji immunomodulujących. Skutecznie połączyliśmy zautomatyzowaną mikroskopię z autorskimi skryptami oprogramowania, co umożliwia automatyczną kwantyfikację odpowiedzi zapalnej, a także dalsze przetwarzanie, analizę, wydobywanie i przechowywanie danych.

Usprawnianie odkrywania leków: zautomatyzowany wysokotreściowy test stanu zapalnego u rybek danio pręgowanych

Ten film demonstruje śledzenie rekrutacji leukocytów za pomocą transgenicznych larw danio pręgowanego wykazujących ekspresję fotokonwertowalnego białka zielonej fluorescencji. Wstępne wstrzyknięcie bakterii znakowanych czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym do pęcherzyka usznego i wywołanie fotokonwersji umożliwia obserwację migracji leukocytów, fagocytozy i dyspersji w organizmie, dostarczając cennych informacji na temat dynamiki odpowiedzi immunologicznej.

Śledzenie leukocytów w oparciu o fotokonwersję u transgenicznego danio pręgowanego zakażonego bakteriami

Tutaj prezentujemy protokół generowania i obrazowania zlokalizowanej infekcji bakteryjnej w pęcherzyku zewnętrznym danio pręgowanego.

Nieinwazyjne obrazowanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w modelu larwalnym zakażenia Streptococcus iniae u larwala danio pręgowanego

Tutaj pokazujemy proces tworzenia linii reportera napięcia elektrycznego komórkowego do wizualizacji rozwoju embrionalnego, ruchu i komórek nowotworowych ryb in vivo.

Wizualizacja komórkowej aktywności elektrycznej we wczesnych zarodkach i nowotworach danio pręgowanego

Tutaj opisujemy protokoły do wykonywania obrazowania na żywo i analizy ilościowej dynamiki receptorów chemoatraktantu u neutrofili danio...

Obrazowanie na żywo receptorów chemokiny w neutrofilach danio pręgowanego podczas reakcji na ranę

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Pokazujemy metodę, która wykorzystuje szybką skaningową mikroskopię konfokalną do wykonywania na żywo obrazowania komórek mikrogleju w rozwijającym się tektum wzrokowym danio pręgowanego, umożliwiając analizę dynamiki tych komórek in vivo.

Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego

Poznaj metodę obrazowania na żywo interakcji komórek immunologicznych z przednowotworowymi w skórze larw danio pręgowanego przy użyciu indukowalnego systemu KalTA4-ERT2/UAS.

Obrazowanie na żywo interakcji między komórkami immunologicznymi i przednowotworowymi przy użyciu indukowalnego systemu ekspresji Gal4/UAS w skórze larw danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie na żywo interakcji między komórkami immunologicznymi i przednowotworowymi przy użyciu indukowalnego systemu ekspresji Gal4/UAS w skórze larw danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów