Obrazowanie na żywo interakcji między komórkami immunologicznymi i przednowotworowymi przy użyciu indukowalnego systemu ekspresji Gal4/UAS w skórze larw danio pręgowanego
3 lutego 2015
Badanie najwcześniejszych zdarzeń progresji komórek przednowotworowych i interakcji wrodzonych komórek odpornościowych jest kluczowe dla zrozumienia i leczenia raka. W tym miejscu opisujemy metodę warunkowego wywoływania przemian komórek nabłonkowych i późniejszego obrazowania na żywo interakcji wrodzonych komórek odpornościowych z komórkami skóry wyrażającymi HRASG12V u larw danio pręgowanego.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę warunkowej indukcji transformacji komórek nabłonkowych u larw ryb zebrafish z wykorzystaniem indukowalnego 4-Hydroksytamoksyfenem (4-OHT) systemu ekspresji KalTA4-ERT2/UAS. Podejście to umożliwia precyzyjną kontrolę czasową i przestrzenną ekspresji onkogenów, co pozwala na obrazowanie na żywo interakcji komórek odporności wrodzonej z komórkami skóry wykazującymi ekspresję HRASG12V. System ten ułatwia badanie wczesnej tumorigenezy oraz odpowiedzi immunologicznej gospodarza in vivo.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia nowotworów
- Biologia rozwoju
- Immunologia
- Obrazowanie żywych komórek
Wstęp
- Zrozumienie najwcześniejszych etapów tumorigenzy jest kluczowe dla badań nad nowotworami.
- Wykazano, że komórki odporności wrodzonej pełnią rolę troficzną podczas wczesnego rozwoju guza u larw danio prążkowanego.
- Tradycyjne modele nie zapewniają precyzyjnej kontroli czasowej i przestrzennej nad indukcją onkogenów.
- Obrazowanie na żywo transformacji komórkowej i oddziaływań immunologicznych dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów tych procesów.
Cel badania
- Opracowanie odwracalnego i indukowalnego systemu transformacji komórek nabłonkowych u larw danio pręgowanego.
- Umożliwienie obrazowania na żywo oddziaływań między komórkami przekształconymi a komórkami odporności wrodzonej.
- Stworzenie platformy do badania regulacji onkogennych odpowiedzi zapalnych.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie indukowalnego 4-OHT systemu ekspresji KalTA4-ERT2/UAS u larw zebrafish.
- Warunkowa indukcja ekspresji HRASG12V w komórkach nabłonka skóry.
- Obrazowanie na żywo interakcji wrodzonych komórek odpornościowych z komórkami przekształconymi.
- Omówienie adaptacji protokołu w celu przestrzennej i czasowej kontroli ekspresji genów w różnych tkankach.
Główne wyniki
- System indukowalny umożliwia precyzyjną kontrolę nad czasem i lokalizacją transformacji komórkowej.
- Obrazowanie na żywo pozwala uchwycić natychmiastową odpowiedź immunologiczną gospodarza na pojawiające się komórki przednowotworowe.
- Metoda ta umożliwia śledzenie zarówno progresji, jak i regresji przekształconych komórek in vivo.
- Podejście to można dostosować do badań nad ektopową ekspresją genów w różnych tkankach.
Wnioski
- System KalTA4-ERT2/UAS stanowi potężne narzędzie do badania wczesnej tumorigenzy u danio pręgowanego.
- Obrazowanie na żywo interakcji układu odpornościowego z przekształconymi komórkami może ujawnić mechanizmy regulujące stan zapalny o charakterze onkogennym.
- Metoda ta zapewnia wszechstronną platformę do badania funkcji genów z precyzją czasową i przestrzenną.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Warunkowa indukcja transformacji nabłonkowej u larw rybek zebrafish z wykorzystaniem KalTA4-ERT2System UAS umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym oddziaływań między komórkami odpornościowymi wrodzonymi a komórkami przednowotworowymi. Podejście to zapewnia firmom biofarmaceutycznym R&Zespoły te dysponują potężną platformą in vivo do analizy wczesnych mechanizmów nowotworowych oraz modulacji odpornościowej. Metoda ta pozwala na uzyskanie wiarygodnych wyników prognostycznych w walidacji celów terapeutycznych i dostarcza danych niezbędnych do podejmowania decyzji z uwzględnieniem ryzyka na etapie przejścia z fazy odkrywania leków do fazy przedklinicznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach nad biofarmaceutykami&D
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków onkogennych i rekrutacji komórek odpornościowych w żywym modelu kręgowca.
- Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez wizualizację natychmiastowych odpowiedzi gospodarza na transformację przednowotworową.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celu poprzez odwracalną i przestrzennie kontrolowaną indukcję genów.
Przesiewy i rozwój testów
- Zapewnia zwalidowany system in vivo do ilościowego obrazowania oddziaływań międzykomórkowych.
- Umożliwia powtarzalną indukcję zdarzeń transformacji w celu opracowania zestandaryzowanych testów.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy poprzez dostosowanie kontroli ekspresji genów do różnych tkanek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z mechanizmami istotnymi dla choroby poprzez modelowanie wczesnej dynamiki interakcji między guzem a układem odpornościowym in vivo.
- Umożliwia zachowanie ciągłości od etapu odkryć po walidację przedkliniczną dzięki śledzeniu progresji i regresji przekształconych komórek.
- Wspiera poszukiwanie biomarkerów translacyjnych poprzez obrazowanie na żywo odpowiedzi immunologicznych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ten indukowalny model rybki zebrafish stanowi pomost między wczesnym etapem odkryć a badaniami przedklinicznymi, umożliwiając weryfikację hipotez dotyczących oddziaływań onkogennych i immunologicznych w żywym organizmie.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących funkcji onkogenów i modulacji odpornościowej w czasie rzeczywistym.
- Przesiewanie: Zapewnia ilościowe wyniki obrazowania do porównywania odpowiedzi immunologicznych w różnych warunkach.
- Analityka: Umożliwia analizę statystyczną zachowania komórek i częstotliwości interakcji.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie do mechanizmów chorób ludzkich poprzez konserwatywne szlaki sygnałowe.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje elastyczną platformę możliwą do adaptacji dla różnych celów genowych i tkanek.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu oraz zrozumienie mechanizmów interakcji między guzem a układem odpornościowym.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane, powtarzalne i skalowalne przepływy pracy w obrazowaniu żywych komórek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie wczesnych informacji mechanistycznych i ograniczanie późniejszego ryzyka biologicznego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i szlaków w procesie rozwoju w oparciu o analizę ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie genetyki rybek zebrafish, obrazowania żywych tkanek oraz indukowalnych systemów ekspresji genów.
- Wymaga dostępu do zaawansowanej infrastruktury mikroskopowej i analizy obrazu.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności protokołów indukcji i obrazowania.
- Adaptacja do innych tkanek może wymagać optymalizacji parametrów promotora i indukcji.
- Kontrola czasowa i przestrzenna jest ograniczona przez responsywność systemu oraz dostępność tkanek.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:46
Microinjection of Plasmid DNA
4:16
Conditional Skin Cell Transformation by 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)
5:34
Mounting and Live Imaging of Zebrafish Larvae
7:06
Results: Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions in Larval Zebrafish Skin
8:01
Conclusion
