Name: System pływacki raków: praktyczny przewodnik po rozwarstwieniu rdzenia nerwowego i zewnątrzkomórkowych zapisach wzorca motorycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Poznaj technikę rozwarstwienia rdzenia nerwowego raka i rejestracji wzorca motorycznego płetw brzusznych. Ta metoda elektrofizjologiczna umożliwia badanie koordynacji generatorów wzorców centralnych w układzie nerwowym skorupiaków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Josowi Burgertowi za pomoc przy niektórych figurach. Jesteśmy wdzięczni Ingo Selbachowi (i grupie "Edelkrebsprojekt NRW") za jego wysiłki na rzecz zaopatrzenia laboratorium w zwierzęta doświadczalne. Dziękujemy Annie C. Schneider za korektę pierwszych wersji rękopisu. Badania te były wspierane przez grant Emmy Noether DFG SM 206/3-1 oraz grant na rozpoczęcie studiów Uniwersytetu w Kolonii dla kobiet.

Niniejsza procedura sekcji jest zgodna z Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich z dnia 22nd września 2010 r. (2010/63/EU).
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Pozyskać raki, Pacifastacus leniusculus (Dana), obu płci o rozmiarze ≥8 cm. Upewnić się, że zwierzęta są żywotne, a odwłok i odnóża brzuszne są nieuszkodzone.</li>
	<li>Należy starannie sprawdzić pancerz, upewniając się, że kutykula jest twarda i sztywna. Zwierzęta w fazie przed- i popierścieniowaniu mają miękki pancerz i nie nadają się do eksperymentów, ponieważ podczas procesu linienia zmienia się wiele parametrów (np. spadek aktywności lokomocyjnej).</li>
	<li>Przygotować wszystkie narzędzia i materiały wykorzystywane podczas sekcji, przypinania i odsłaniania sznura nerwowego, przedstawione na Rysunku 2 oraz wymienione w dołączonych suplementach.</li>
</ol>
<img alt="Układ mikroskopowy z narzędziami do mikrodysekcji; obejmuje stereomikroskop, skalpel i szalkę Petriego." src="/files/ftp_upload/52109/52109fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Materiały i narzędzia używane do dysekcji, przypinania i usuwania osłon sznura nerwowego.
(1) duże wiadro wypełnione lodem; (2) sól fizjologiczna dla raków; (3) dozownik soli fizjologicznej; (4) mikroskop sekcyjny; (5) naczynie sekcyjne; (6) mocne nożyczki; (7) pęseta (8) nożyczki sprężynowe; (9) szalka Petri wyłożona przezroczystym Sylgardem; (10) szpilki mocujące; (11) zimne źródło światła.
2. Sekcja makroskopowa
<ol>
	<li>Zanurzyć zwierzę w lodzie na 15 - 20 min w celu znieczulenia. Pierwszą część sekcji przeprowadzić na blacie laboratoryjnym w pobliżu zlewu, ponieważ obejmuje ona etap eksanguinacji, a preparat musi być regularnie płukany solą fizjologiczną dla raków podczas procedury.</li>
	<li>Trzymając zwierzę stroną brzuszną do góry, za pomocą mocnych nożyczek odciąć obie szczypce u ich nasady w pobliżu klatki piersiowej (Rysunek 3-1). Usunąć lewy i prawy uropod (Rysunek 3-2).</li>
	<li>Umieścić zwierzę stroną brzuszną do góry w naczyniu sekcyjnym wyłożonym czarnym sylgardem. Unieść cefalotoraks, wsuwając pod niego lód, i przypiąć odwłok w miejscu telsonu (Rysunek 4A).</li>
	<li>Napełnić dozownik ok. 60 ml schłodzonej soli fizjologicznej dla raków. Przepłukać raka zimną solą fizjologiczną przez otwór po szczypcach (Rysunek 4B). Nadmiar soli fizjologicznej wypłynie przez nacięcia w uropodach. Podczas eksanguinacji przykryć raka lodem.</li>
	<li>Zdekapitować zwierzę jednym poprzecznym cięciem tuż za oczami, używając mocnych nożyczek (Rysunek 5A). Usunąć wszystkie odnóża kroczące w pobliżu stawów nasadowych, zgodnie z Rysunkiem 5B.</li>
	<li>Odizolować odwłok z ostatnimi segmentami torakalnymi od reszty cefalotoraksu. Wykonać pierwsze cięcie na poziomie drugiej pary odnóży kroczących (segment torakalny 3), wsuwając końcówkę nożyczek w otwór drugiej nogi kroczącej i tnąc aż do przeciwległej strony (Rysunek 6A-1).</li>
	<li>Przedłużyć to pierwsze cięcie na obie strony przez cefalotoraks (Rysunek 6A-2).</li>
	<li>Rozwarć zwierzę, aby odsłonić organy wewnętrzne. Przesunąć wyraźnie widoczną gruczoł trawienny (Rysunek 6B-3) do przedniej części preparatu i za pomocą pęsety usunąć organy rozrodcze z jamy brzusznej.</li>
	<li>Usunąć przednią część cefalotoraksu (Rysunek 6C). Wykonać cięcia boczne, aby usunąć boczne części karapaksy pokrywające skrzela po obu stronach pozostałego toraksu (Rysunek 6D-4). Usunąć skrzela i wypłukać preparat zimną solą fizjologiczną.</li>
	<li>Kontynuować sekcję, wykonując cięcie wzdłuż całej długości płytki sternalnej, jak wskazano na Rysunku 6E-5. Wykonać to cięcie w maksymalnych pozycjach bocznych między pleuronem a pleuropodami (Rysunek 6E, czerwone oznaczenia). Powtórzyć to samo cięcie po drugiej stronie. Wypłukać preparat zimną solą fizjologiczną.</li>
	<li>Pozostałą część sekcji przeprowadzić pod mikroskopem sekcyjnym. Umieścić odwłok raka stroną brzuszną do góry w naczyniu sekcyjnym wyłożonym czarnym sylgardem i wypełnionym solą fizjologiczną dla raków w ilości pokrywającej preparat. 
	UWAGA: Następne kroki (2.12–4.8) zawierają instrukcje kierunkowe przeznaczone dla osób praworęcznych. W kolejnych krokach (2.12-6.8) ważne jest regularne wymienianie soli fizjologicznej dla raków co 20-30 min na zimną sól, aby utrzymać układ nerwowy w dobrym stanie.</li>
	<li>Utrzymać preparat za pomocą szpilek entomologicznych z tyłu przy telsonie i z przodu przy pozostałościach karapaksy. Umieścić preparat tak, aby telson był skierowany w lewo i znajdował się równolegle do krawędzi stołu.</li>
	<li>Używając grubej pęsety w lewej ręce, chwycić preparat przez otwór po nodze kroczącej (Rysunek 7A) i rozciągnąć go (Rysunek 7B, biała strzałka). Zidentyfikować dwie duże grzbietowe pasma mięśni zginaczy (Rysunek 7B-1 oraz C-1) i odciąć ich brzuszną podstawę, jak pokazano na Rysunku 7B.</li>
	<li>Zidentyfikować tętnicę sternalną (Rysunek 7C-2), która schodzi z części grzbietowej (serca) do brzusznej w 4tym segmencie torakalnym. Tętnica ta znajduje się bezpośrednio nad sznurem nerwowym (Rysunek 7C-3), zanim przejdzie pod niego, tworząc tętnicę brzuszną.</li>
	<li>Przeciąć tętnicę sternalną. Jak pokazano na Rysunku 7C, najpierw unieść tętnicę jednym ramieniem nożyczek i przeciąć ją dopiero wtedy, gdy widoczny będzie położony brzusznie sznur nerwowy.</li>
	<li>Utrzymać grzbietowe mięśnie zginacze z przodu (po prawej stronie). Należy to zrobić w maksymalnym rozciągnięciu za pomocą szpilek, aby nie zasłaniały widoczności, a preparat pozostał rozciągnięty. Po unieruchomieniu grzbietowych pasm mięśniowych (Rysunek 8-1) widoczne są pierwsze zwoje brzuszne A1 i A2 wraz z powiązanymi nerwami N1, N2 i N3 (Rysunek 8).</li>
	<li>Używając pęsety w lewej ręce, chwycić preparat w jednym z otworów po odnóżach kroczących. Podczas kolejnych kroków sekcji delikatnie ciągnąć, aby utrzymać preparat w rozwartej pozycji.</li>
	<li>Przeciąć nerwy N3 w miejscu najdalej oddalonym od sznura nerwowego (Rysunek 8-3).</li>
	<li>Odciąć mięśnie zginacze blisko apodemy brzusznej, jak pokazano na Rysunku 8-4. Należy uważać, aby nie uszkodzić sznura nerwowego ani nerwów N2.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 2.18 i 2.19 dla nerwów N3 i mięśni zginaczy pozostałych zwojów brzusznych od A2 do A5.</li>
	<li>Przy ostatnim zwoju brzusznym A6 odciąć grzbietowe mięśnie zginacze od apodemy brzusznej; preparat powinien wyglądać tak, jak na Rysunku 9.</li>
	<li>Przeciąć płytkę sternalną za nerwami A6 (Rysunek 9-1) i zachować część brzuszną (Rysunek 9-2). Odrzucić część grzbietową z mięśniami zginaczami (Rysunek 9-3). Utrzymać płytkę sternalną z przodu szpilkami przez otwory po odnóżach kroczących oraz z tyłu przy A6.</li>
</ol>
3. Precyzyjna sekcja
<ol>
	<li>Umieść preparat pod mikroskopem tak, aby część przednia była skierowana w głąb, a część tylna w stronę krawędzi stołu.</li>
	<li>Użyj pincety, jak pokazano na Rysunku 10A, aby usunąć najbardziej przednie części sternów cefalotorakalnych. 
	UWAGA: Zwoje piersiowe i powiązane z nimi nerwy są częściowo przykryte przez mięśnie nóg i sterny cefalotorakalne. Sterny cefalotorakalne tworzą szkielet, który oddziela od siebie bocznie położone jamy nóg chodnych oraz od jamy przyśrodkowej, w której znajduje się brzuszny sznur nerwowy.</li>
	<li>Przetnij mięśnie pomiędzy pozostałymi strukturami egzoszkieletu, zgodnie ze wskazówkami na Rysunku 10B-1 i B2. Użyj pincety, aby uchwycić i unieść przedni koniec brzusznego sznura nerwowego (Rysunek 10C). 
	UWAGA: Sznur nerwowy zostanie uszkodzony w tym procesie, dlatego należy unikać wielokrotnego chwytania go pincetą.</li>
	<li>Przetnij bocznie nerwy piersiowe, jednocześnie unosząc sznur nerwowy (Rysunek 10C-3). Pozostaw te nerwy w odpowiedniej długości do przypięcia. Usuń ściśniętą część łańcucha zwojów, którą uchwycono pincetą, odcinając wszystkie tkanki przed T4 (Rysunek 10C-4).</li>
	<li>Umieść preparat częścią przednią po lewej stronie i ustaw ostrość na A1. Przetnij nerwy N1 i N2 segmentu A1 na odpowiednią długość (maks. 1 cm), aby umożliwić ich przypięcie.</li>
	<li>Ustaw ostrość na A2 i zidentyfikuj nerwy N1, N2 i N3 tego segmentu (Rysunek 11). Nerwy N1 zwojów brzusznych A2-A5 znajdują się pomiędzy dwiema kutykularnymi fałdami sternów w każdym segmencie (Rysunek 11A-1) i są przykryte mięśniami. Wykonaj jedno cięcie wzdłuż tylnej kutykularnej fałdy sternum. Rozpocznij od bocznej krawędzi odwłoka i kieruj się ku linii środkowej, jak pokazano na Rysunku 11A.</li>
	<li>Jeśli docelowy nerw N1 jest nadal przykryty tkanką, jak pokazano na Rysunku 11B (czerwona strzałka), przetnij wiązkę mięśniową, ale tym razem przed obiema kutykularnymi fałdami sternów i nerwem N1 (Rysunek 11B-2).</li>
	<li>Przetnij nerw N1 jak najdalej dystalnie (Rysunek 11C-3). Nerw N1 jest w pełni widoczny, a możliwe jest zidentyfikowanie gałęzi przedniej i tylnej (Rysunek 11C).</li>
	<li>Przejdź do przeciwległego nerwu N1 i najpierw przetnij mięśnie wzdłuż tylnej kutykularnej fałdy sternum, zaczynając od strony przyśrodkowej, w pobliżu zwoju (Rysunek 11D). Jeśli nerw jest nadal przykryty tkanką, przetnij wiązkę mięśniową, ale tym razem przed obiema kutykularnymi fałdami sternów i nerwem N1, analogicznie do Rysunku 11B-2. Przetnij nerw N1 jak najdalej dystalnie.</li>
	<li>Przetnij nerwy N2 tego zwoju na odpowiednią długość (ok. 0,5 cm) do przypięcia.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.7-3.11 dla nerwów segmentów A3-A5.</li>
	<li>Przetnij nerwy zwoju A6 jak najdalej dystalnie (Rysunek 12A). Użyj pincety, aby uchwycić kilka nerwów A6, unieść ten zwój i rozpocząć izolowanie łańcucha zwojów od płyty sternalnej.</li>
	<li>Podnosząc sznur nerwowy, delikatnie pociągnij go w kierunku przednim, jak zademonstrowano na Rysunku 12B (biała strzałka). W miarę unoszenia poszczególnych zwojów usuwaj tętnicę brzuszną, która może być przytwierdzona do strony brzusznej sznura nerwowego (Rysunek 12C). Kontynuuj tę sekwencję (delikatnego) pociągania i cięcia, aż sznur nerwowy zostanie całkowicie odizolowany.</li>
	<li>Przenieś odizolowany łańcuch zwojów do szalki Petriego wyłożonej przezroczystym sylgardem i wypełnionej roztworem soli fizjologicznej dla raka (Rysunek 12D).</li>
</ol>
4. Przytwierdzanie sznura nerwowego do szalki Petriego
UWAGA: Do unieruchomienia sznura nerwowego należy użyć małych szpilek wyciętych z drutu ze stali nierdzewnej (patrz materiały uzupełniające). Pęsetą należy dotykać wyłącznie zakończenia nerwu, unikając uciskania konektywów lub zwojów.
<ol>
	<li>Przytwierdź łańcuch zwojów szpilkami w linii prostej, delikatnie go rozciągając.</li>
	<li>Ułóż sznur nerwowy w szalce Petriego stroną grzbietową do góry (Rysunek 13, czarna linia). Stronę brzuszną zwojów można rozpoznać po wypukłości; strona grzbietowa jest płaska. Przytwierdź nerwy piersiowe do boków szalki. Kontynuuj z nerwami A6, rozciągając sznur nerwowy wzdłuż jego osi podłużnej.</li>
	<li>Przytwierdź szpilkami nerwy A1 pod kątem 90° względem sznura nerwowego.</li>
	<li>Przejdź do A2 i przytwierdź nerwy N2 pod kątem 35–45° względem sznura nerwowego (Rysunek 1A).</li>
	<li>Rozdziel gałęzie przednia i tylna nerwów N1 przed ich przytwierdzeniem, zgodnie z instrukcją na Rysunku 14. Użyj dwóch par precyzyjnych pęset, aby jedną pęsetą chwycić gałąź przednią, a drugą gałąź tylną nerwu N1. Należy uważać, aby chwytać jedynie najbardziej dystalne końce gałęzi nerwowych. Następnie ostrożnie je rozciągnij.</li>
	<li>Przytwierdź gałąź przednią nerwu N1 pod kątem 90° względem sznura nerwowego (Rysunek 1A). Przytwierdź gałąź tylną nerwu N1 pomiędzy przednią gałęzią N1 a nerwem N2.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.4–4.6 dla nerwów zwojów A3–A5. Podczas unieruchamiania sznura nerwowego rozciągaj go zarówno w kierunku podłużnym, jak i poprzecznym.</li>
</ol>
5. Usuwanie osłonek z zwojów
<ol>
	<li>Ustaw preparat w taki sposób, aby dłonie eksperymentatora zawsze spoczywały na stabilnej powierzchni, co zapobiegnie drżeniu. Aby odsłonić zwoje, oświetl sznur nerwowy od dołu.</li>
	<li>Skup się na dowolnym zwoju brzusznym od A1 do A5. Używając precyzyjnych nożyczek sprężynowych, wykonaj niewielkie cięcie boczne przez osłonkę zwoju, za zwojem i pomiędzy nerwami N2 a N3 (Rycina 15A czerwona strzałka).</li>
	<li>Chwyć osłonkę zwoju za pomocą bardzo precyzyjnej pęsety i przetnij ją poprzecznie nad koneksjami, jak pokazano na Rycynie 15A-1. Należy uważać, aby nie ścisnąć ani nie przeciąć sznura nerwowego nożyczkami.</li>
	<li>Nadal trzymając i unosząc osłonkę zwoju pęsetą, kontynuuj cięcie wzdłuż bocznych krawędzi zwoju (Rycina 15B-2 i -3). Usuń osłonkę. Alternatywnie przypnij ją po obu stronach koneksji w taki sposób, aby była unieruchomiona, ale sznur nerwowy nie był uciśnięty.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.2-5.4 dla wszystkich zwojów brzusznych od A1 do A5.</li>
	<li>Odsłoń zwoje piersiowe oraz zwój A6 w podobny sposób. Aby odsłonić A6, zacznij przed zwojem i posuwaj się w kierunku tylnym. Przypnij osłonkę zwoju A6 do tylnego końca łańcucha zwojów.</li>
</ol>
6. Pozakomórkowe rejestracje z neuronów ruchowych
<ol>
	<li>Przygotować wszystkie narzędzia i materiały wykorzystywane do rejestracji zewnątrzkomórkowej przedstawione na Rysunku 16B i wymienione w suplementach. Przegląd układu rejestracyjnego pokazano na Rysunku 16A. Uruchomić całą aparaturę elektroniczną wykorzystywaną w tym eksperymencie (Rysunek 16C), aby wzmacniacze mogły się rozgrzać przez co najmniej 30 min przed rozpoczęciem pomiarów. Włączyć komputer i uruchomić oprogramowanie do rejestracji.</li>
	<li>Umieścić łańcuch zwojów na stole mikroskopowym i oświetlić od dołu. Wprowadzić elektrodę rejestrującą do sylgardu w pobliżu docelowego nerwu, a elektrodę referencyjną w pozycji bliskiej, ale bocznej względem zwojów (Rysunek 17A i B). Zagiąć docelowy nerw wokół elektrody rejestrującej (Rysunek 17C).</li>
	<li>Lekko naciągnąć nerw, aby zapewnić kontakt między elektrodą a nerwem, i przypiąć go do boku (Rysunek 17D). Przymocować kable elektrod do stołu mikroskopowego za pomocą plasteliny, aby pozostały w pożądanej pozycji.</li>
	<li>Użyć strzykawki wypełnionej wazeliną i igły o rozmiarze 20 G (z zaokrągloną końcówką) (Rysunek 17E-3), aby odizolować docelowy nerw od roztworu kąpielowego. Najpierw nanieść odrobinę wazeliny na sylgard wokół elektrody rejestrującej. Wynikiem jest warstwa wazeliny pokrywająca sylgard w sąsiedztwie elektrody rejestrującej (Rysunek 17E-4). Należy uważać, aby nie nanosić wazeliny bezpośrednio na nerw i unikać pęcherzyków powietrza w tej warstwie.</li>
	<li>Uszczelnić elektrodę rejestrującą wazeliną z każdej strony aż do poziomu powierzchni soli fizjologicznej (Rysunek 17F).</li>
	<li>Powtórzyć tę procedurę dla wszystkich docelowych nerwów, których aktywność ma być monitorowana.</li>
	<li>Rozpocząć rejestrację. Użyć trybu akwizycji ciągłej lub bezprzerwowej oraz częstotliwości próbkowania 5 kHz. Ustawić wzmacniacz zewnątrzkomórkowy zgodnie z następującymi parametrami: wzmocnienie 1 000 (wzmocnienie sygnału 1 000 razy; należy pamiętać o uwzględnieniu tego parametru wzmocnienia w ustawieniach oprogramowania do akwizycji) oraz zakres filtra pasmowo-przepustowego od 300 Hz (odcięcie dolne) do 2 000 Hz (odcięcie górne).</li>
</ol>

<ol><li>Hughes, G. M., Wiersma, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Co-Ordination+of+Swimmeret+Movements+in+the+Crayfish%2C+Procambarus-Clarkii+%28Girard%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">The Co-Ordination of Swimmeret Movements in the Crayfish, Procambarus-Clarkii (Girard).</a> J Exp Biol. 37 (4), 657-670 (1960).</li>
<li>Mulloney, B., Smarandache, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifty+Years+of+CPGs%3A+Two+Neuroethological+Papers+that+Shaped+the+Course+of+Neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fifty Years of CPGs: Two Neuroethological Papers that Shaped the Course of Neuroscience.</a> Front Behav Neurosci. 4, 45(2010).</li>
<li>Murchison, D., Chrachri, A., Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Separate+Local+Pattern-Generating+Circuit+Controls+the+Movements+of+Each+Swimmeret+in+Crayfish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophys%22%5BJournal%5D)">A Separate Local Pattern-Generating Circuit Controls the Movements of Each Swimmeret in Crayfish.</a> J Neurophys. 70 (6), 2620-2631 (1993).</li>
<li>Mulloney, B., Hall, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+crayfish+abdominal+ganglia.+III.+Swimmeret+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Functional organization of crayfish abdominal ganglia. III. Swimmeret motor neurons.</a> J Comp Neurol. 419 (2), 233-243 (2000).</li>
<li>Davis, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lobster+Righting+Responses+and+Their+Neural+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Ser+B-Bio%22%5BJournal%5D)">Lobster Righting Responses and Their Neural Control.</a> Proc R Soc Ser B-Bio. 170 (1021), 435-456 (1968).</li>
<li>Mulloney, B., Smarandache-Wellmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+the+crustacean+swimmeret+system%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of the crustacean swimmeret system.</a> Prog Neurobiol. 96 (2), 242-267 (2012).</li>
<li>Huxley, T. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuxley%2C+TH+%22The+crayfish%3A+An+introduction+to+the+study+of+zoology%22">The crayfish: An introduction to the study of zoology</a>. , MIT Press. Cambridge, MA. (1980).</li>
<li>Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Wright, T. M., Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+types+of+nonspiking+interneurons+in+local+pattern-generating+circuits+of+the+crayfish+swimmeret+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Five types of nonspiking interneurons in local pattern-generating circuits of the crayfish swimmeret system.</a> J Neurophys. 110 (2), 344-357 (2013).</li>
<li>Skinner, F. K., Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersegmental+coordination+of+limb+movements+during+locomotion%3A+mathematical+models+predict+circuits+that+drive+swimmeret+beating%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intersegmental coordination of limb movements during locomotion: mathematical models predict circuits that drive swimmeret beating.</a> J Neurosci. 18 (10), 3831-3842 (1998).</li>
<li>Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((During+fictive+locomotion%2C+graded+synaptic+currents+drive+bursts+of+impulses+in+swimmeret+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">During fictive locomotion, graded synaptic currents drive bursts of impulses in swimmeret motor neurons.</a> J Neurosci. 23 (13), 5953-5962 (2003).</li>
<li>Smarandache-Wellmann, C., Grätsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+coordination+in+distributed+neural+circuits%3A+Encoding+coordinating+information%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of coordination in distributed neural circuits: Encoding coordinating information.</a> J Neurosci. 34 (16), 5627-5639 (2014).</li>
<li>Mulloney, B., Hall, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+commissural+interneurons+integrate+information+from+intersegmental+coordinating+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Local commissural interneurons integrate information from intersegmental coordinating interneurons.</a> J Comp Neurol. 466 (3), 366-376 (2003).</li>
<li>Mulloney, B., Harness, P. I., Hall, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursts+of+information%3A+Coordinating+interneurons+encode+multiple+parameters+of+a+periodic+motor+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Bursts of information: Coordinating interneurons encode multiple parameters of a periodic motor pattern.</a> J Neurophys. 95 (2), 850-861 (2006).</li>
<li>Smarandache, C., Hall, W. M., Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+Rhythmic+Motor+Activity+by+Gradients+of+Synaptic+Strength+in+a+Neural+Circuit+That+Couples+Modular+Neural+Oscillators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coordination of Rhythmic Motor Activity by Gradients of Synaptic Strength in a Neural Circuit That Couples Modular Neural Oscillators.</a> J Neurosci. 29 (29), 9351-9360 (2009).</li>
<li>Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Coordination+in+Distributed+Neural+Circuits%3A+Decoding+and+Integration+of+Coordinating+Information%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Coordination in Distributed Neural Circuits: Decoding and Integration of Coordinating Information.</a> J Neurosci. 34 (3), 793-803 (2014).</li>
<li>Chrachri, A., Neil, D., Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-Dependent+Responses+of+2+Motor+Systems+in+the+Crayfish%2C+Pacifastacus+leniusculus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">State-Dependent Responses of 2 Motor Systems in the Crayfish, Pacifastacus leniusculus.</a> J Comp Physiol A. 175 (3), 371-380 (1994).</li>
<li>Chrachri, A., Neil, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+and+Synchronization+between+2+Abdominal+Motor+Systems+in+Crayfish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Interaction and Synchronization between 2 Abdominal Motor Systems in Crayfish.</a> J Neurophys. 69 (5), 1373-1383 (1993).</li>
<li>Skinner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structure+of+the+4th+Abdominal-Ganglion+of+the+Crayfish%2C+Procambarus-Clarki+%28Girard%29+II.+Synaptic+Neuropils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) II. Synaptic Neuropils.</a> J Comp Neurol. 234 (2), 182-191 (1985).</li>
<li>Skinner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structure+of+the+4th+Abdominal-Ganglion+of+the+Crayfish%2C+Procambarus-Clarki+%28Girard%29+I.+Tracts+in+the+Ganglionic+Core%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) I. Tracts in the Ganglionic Core.</a> J Comp Neurol. 234 (2), 168-181 (1985).</li>
<li>Mulloney, B., Tschuluun, N., Hall, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architectonics+of+crayfish+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Techniq%22%5BJournal%5D)">Architectonics of crayfish ganglia.</a> Microsc Res Techniq. 60 (3), 253-265 (2003).</li>
<li>Braun, G., Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+modulation+of+the+swimmeret+motor+system+in+crayfish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Cholinergic modulation of the swimmeret motor system in crayfish.</a> J Neurophys. 70 (6), 2391-2398 (1993).</li>
<li>Davis, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motoneuron+Morphology+and+Synaptic+Contacts+-+Determination+by+Intracellular+Dye+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motoneuron Morphology and Synaptic Contacts - Determination by Intracellular Dye Injection.</a> Science. 168 (3937), 1358-1360 (1970).</li>
<li>Altman, J. S., Tyrer, N. M. Filling Selected Neurons with Cobalt through Cut Axons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+JS+%22Neuroanatomical+Techniques%22">Neuroanatomical Techniques</a>. Strausfeld, N. J., Miller, T. A. , Springer. New York, NY. 373-402 (1980).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Anatomia raków i ich zwojów brzusznych została opisana wcześniej 5, 18, 19, 20 i zaleca się zapoznanie się z nimi przed preparacją, aby uniknąć przecięcia ważnych nerwów.
Bardzo ważne jest, aby utrzymywać preparat w temperaturze poniżej 23 °C, aby zapobiec degradacji izolowanego rdzenia nerwowego. Można to łatwo osiągnąć, wymieniając roztwór do kąpieli co 20–30 minut zimną solą fizjologiczną z raków. W takich warunkach łańcuch zwojów może być używany do eksperymentów elektrofizjolog...

Pleopody raka służą do kontroli postawy i poruszają się rytmicznie, gdy zwierzęta płyną do przodu, wentylują swoje nory lub gdy samice napowietrzają jaja 5, 6. Pleopody raka sygnałowego, Pacifastacus leniusculus, występują w parach od drugiego do piątego segmentu odwłosa, z jedną kończyną po każdej stronie odwłosa 7. Ośrodkowy układ nerwowy samodzielnie generuje rytmiczny wzorzec ruchowy, który napędza ruch pleopodów zarówno u całego zwierzęcia, jak i w preparacie izolowanego sznura nerwowego. W przypadku braku sprzężenia zwrotnego z receptorów lub sygnałów zstępujących, generowany rytmiczny wzorzec ruchowy nazywany jest lokomocją fikcyjną 1, 2. W systemie pleopodów wzorzec ruchowy ten nie różni się pod żadnym względem od aktywności pleopodów mierzonej u całego zwierzęcia.
Ruch każdej odnóży pływakowych (swimmerets) jest sterowany przez mikroobwód, który znajduje się w jednym odpowiadającym mu hemiganglionie i jest do niego ograniczony 1 - 3. W każdym mikroobwodzie znajduje się jądro generujące wzorzec, które składa się z pięciu zidentyfikowanych niekolczastych interneuronów. Można je funkcjonalnie scharakteryzować jako inhibitory fazy pchnięcia (Inhibitor of Power Stroke, IPS) lub inhibitory fazy powrotu (Inhibitor of Return Stroke, IRS) 8. Interneurony IPS i IRS nie są oscylatorami endogennymi; ich naprzemienna aktywność jest napędzana przez wzajemne hamowanie 9. Ponieważ interneurony te bezpośrednio hamują neurony ruchowe odnóży pływakowych, generowany jest naprzemienny ruch PS-RS 10. Lokomocja wymaga jednak nie tylko generowania aktywności, ale także koordynacji różnych niezależnych mikroobwodów. W systemie odnóży pływakowych taka koordynacja jest zapewniana przez koordynujący mikroobwód, który gwarantuje, że kończyny są aktywne w odpowiednich momentach. Mikroobwód ten tworzą trzy zidentyfikowane neurony w każdym segmencie 11-15.
Niniejszy protokół po raz pierwszy przedstawia szczegółowy przewodnik po sekcji w celu wyizolowania łańcucha zwojów (od T4 do A6, Rysunek 1). Pokazujemy, jak przytwierdzić wyizolowany brzuszny sznur nerwowy i usunąć osłonkę z każdego zwoju. W tak przygotowanym izolowanym układzie nerwowym neurony odpowiedzialne za ruchy pływaków są gotowe do wykorzystania w eksperymentach elektrofizjologicznych i morfologicznych. Druga część protokołu prezentuje główne cechy wzorca ruchowego pływaków. Obejmuje ona instrukcję krok po kroku dotyczącą pozakomórkowej rejestracji aktywności neuronów ruchowych pływaków. Aksony neuronów ruchowych RS przebiegają przez przednią gałąź nerwu N1, natomiast aksony neuronów ruchowych PS przebiegają przez tylną gałąź tego samego nerwu (Rysunek 1) 4. W związku z tym ich aktywność można rejestrować z tych gałęzi za pomocą różnicowych elektrod szpilkowych.
<img alt="Schemat anatomiczny Hydra oraz zdjęcie przedstawiające czułki i rozmieszczenie nerwów do badań strukturalnych." fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig1highres.jpg" width="200" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Izolowany układ nerwowy od zwoju piersiowego 4 (T4) do zwoju brzusznego 6 (A6) oraz jego schematyczna ilustracja. T4: zwój piersiowy 4; T5: zwój piersiowy 5; A1, A2 … A6 zwój brzuszny 1, zwój brzuszny 2 … zwój brzuszny 6; N1: nerw N1; N2: nerw N2; N3: nerw N3; PS: ruch roboczy (power-stroke); RS: ruch powrotny (return-stroke). Skróty kierunków: A = przedni; P = tylny.
Przedstawiona procedura sekcji oraz technika elektrofizjologiczna są odpowiednie dla studentów studiów licencjackich i mogą stanowić uzupełnienie praktycznych kursów fizjologii. Izolowany łańcuch zwojów był wykorzystywany w wielu eksperymentach do badania funkcji układu nerwowego, koordynacji lub modulacji mikroobwodów płetw pływanych 6, a także neuronalnej kontroli adaptacyjnego zachowania podczas lokomocji 16, 17. System płetw pływanych raków zapewnia zatem ogromną liczbę interesujących możliwości dydaktycznych i szkoleniowych, które rozpoczynają się od sekcji brzusznego sznura nerwowego raka i pozakomórkowej rejestracji fikcyjnego wzorca ruchowego.

<table><tbody><tr><td>4-kanałowy wzmacniacz zewnątrzkomórkowy: MA 102&nbsp;</td><td>Wzmacniacz</td><td>Elektroniklabor, Zoologie, Universit&auml; t zu K&ouml; ln, Niemcy</td><td></td></tr><tr>stół<td>powietrzny</td><td></td><td>Technical Manufacturing Corporation (TMC) jednostka AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA</td><td>63-534</td></tr><tr><td>Axon Digidata 1440A</td><td>Digitizer</td><td>Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA</td><td>DD1440A</td></tr><tr><td>duże wiadro&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampex & Clampfit</td><td>pClamp 10, oprogramowanie do rejestracji i analizy</td><td>Molecular Devices Design, Union City, CA</td><td>pClamps 10 Standardowe</td></tr><tr><td>źródło zimnej lampy</td><td>z elastycznym światłowodem (wiązka światłowodowa)&nbsp;</td><td>Mikroskopy Euromex holandia, Arnhem, BD</td><td>LE.5211 & Komputer i monitor LE.5235</td></tr><tr><td></td><td>wyposażony w oprogramowanie rejestrujące</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>pojemnik i pipetę do odpadów płynnych&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna z raków&nbsp;</td><td>zawiera (w mM): 5,4 KCl, 2,6 MgCl2, 13,5 CaCl2 i 195 NaCl, buforowane 10 mM zasadą Tris i 4,7 mM kwasem maleinowym; napowietrzane przez 3 godziny. Dostosować przy pH 7,4.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dekstran, Texas Red (3000MW, utrwalany lizyną)</td> <td>barwnik fluorescencyjny, utrwalany lizyną</td><td>Life Technologies GmbH, Darmstadt, Niemcy</td> Naczynie rozwarstwiające <td>D3328</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>(dł. x szer. x wys.) 15x7x5 cm; wyłożone czarnym silikonem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr> do <tr><td>mocowania klatki</td><td></td><td></td><td></td>Faradaya</tr><tr><td>(biologia, Dumont #5)</td><td>Kleszcze: Biologia, końcówka 0,05 x 0,02 mm, długość 11cm, INOX</td><td>Fine Science Tools (FST), Niemcy</td><td>11252-20</td></tr><tr><td>kleszcze (biologia, Dumont #55)</td><td>Kleszcze: Biologia, końcówka 0,05 x 0,02 mm, długość 11cm, INOX</td><td>Fine Science Tools (FST), Niemcy</td><td>11255-20</td></tr><tr><td>kleszczy (elektroniczne, Dumont #5)</td><td>Kleszcze: standardowe, końcówka 0,1 x 0,06 mm, długość 11cm, INOX</td><td>Fine Science Tools (FST), Niemcy</td><td>11251-20</td></tr><tr><td>wewnątrzkomórkowe</td><td>kapilary ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna/wewnętrzna: 1mm/0,5mm), z filamentem</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>BF100-50-10</td></tr><tr><td>Leica S8 Apo StereoZoom</td><td>Mikroskop preparacyjny&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Zoom 1x - 8x</td><td>Leica, Niemcy</td><td>10446298</td></tr><tr><td>lustro</td> stołowe <td></td> mikroskopu do oświetlania preparatu od dołu <td></td><td></td></tr><tr><td>plastelina</td><td></td><td></td><td></td></tr> Mikroskop preparacyjny <tr><td></td> Olympus SZ61&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Powiększenie 0,67x - 4,5x</td><td>Olympus, Niemcy</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego&nbsp;</td><td>94 x 16 mm; podszyte przezroczystym silikonem</td><td>Greiner bio-one, Niemcy</td><td>633180</td></tr><tr><td>nożyczki pierścieniowe</td><td>ThoughCut, krawędź tnąca: ostra/, prosta: 13cm</td><td>Fine Science Tools (FST), Niemcy</td><td>14054-13</td></tr><tr><td>nożyczki sprężynowe lub alternatywa: Nożyczki sprężynowe Vannas</td><td>krawędź tnąca: 8 mm, średnica końcówki: 0,2 mm, prosta: 10 cm lub krawędź tnąca 2,5 mm, średnica końcówki 0,075 mm, prosta: 8 cm</td> Narzędzia do nauki o naczyniu (<td>FST), Niemcy</td><td>15024-10 lub&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 15000-08</td></tr><tr><td>student Vannas&nbsp; nożyczki sprężynowe lub alternatywne:&nbsp; Nożyczki sprężynowe Moria</td> krawędź <td>tnąca: 5mm, średnica końcówki: 0,35mm, prosta: 9cm lub krawędź tnąca: 5mm, średnica końcówki 0,1 mm, prosta: 8 cm</td><td>Fine Science Tools (FST), Niemcy</td><td>91500-09 lub&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 15396-00</td></tr><tr><td>sylgard</td><td>184 Baza z elastomeru silikonowego i utwardzacz; dla czarnego sylgardu dodaj węgiel aktywny</td> Strzykawka <td>Dow Corning, Midland, MI, USA</td><td></td></tr><tr><td>wypełniona wazeliną i wyposażona w igłę 20 gauche z zaokrągloną końcówką</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

system pływacki raków: praktyczny przewodnik po rozwarstwieniu rdzenia nerwowego i zewnątrzkomórkowych zapisach wzorca motorycznego

The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Tutaj pokazujemy sekcję rdzenia nerwowego w jamie brzusznej raka. Preparat składa się z dwóch ostatnich zwojów piersiowych (T4, T5) oraz łańcucha zwojów brzusznych (A1 do A6). Ten łańcuch zwojów obejmuje część ośrodkowego układu nerwowego (OUN), która napędza skoordynowaną lokomocję pleopodów (swimmerets): układ swimmeret. Od ponad pięciu dekad wiadomo, że u raków każdy pływak jest napędzany przez swój własny, niezależny wzór generujący jądro, które generuje rytmiczną naprzemienną aktywność 1-3. Neurony ruchowe unerwiające muskulaturę każdego pływaka tworzą dwie anatomicznie i funkcjonalnie odrębne populacje 4. Jeden z nich jest odpowiedzialny za retrakcję (skok mocy, PS) pływaka. Drugi napędza protrakcję (ruch powrotny, RS) pływaka. Neurony ruchowe układu pływackiego są w stanie spontanicznie wytworzyć fikcyjny wzorzec motoryczny, który jest identyczny ze wzorcem zarejestrowanym in vivo1.
Celem tego raportu jest wprowadzenie interesującego i wygodnego systemu modelowego do badania sieci generujących rytm i koordynacji niezależnych mikroukładów dla praktycznych kursów laboratoryjnych dla studentów. Dostarczony protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące preparacji rdzenia nerwowego jamy brzusznej raka, przypinania izolowanego łańcucha zwojów, usuwania zwojów i rejestrowania fikcyjnego wzorca motorycznego pływaka zewnątrzkomórkowo z izolowanego układu nerwowego.
Dodatkowo, możemy monitorować aktywność neuronów pływaków zarejestrowanych wewnątrzkomórkowo z dendrytów. Tutaj również opisujemy pokrótce te techniki i podajemy kilka przykładów. Ponadto morfologię neuronów pływaka można ocenić za pomocą różnych technik barwienia. Tutaj podajemy przykłady wewnątrzkomórkowych (za pomocą jonoforezy) neuronów wypełnionych barwnikiem i zasypek basenów neuronów ruchowych pływaka. W naszym laboratorium używamy tego preparatu do badania podstawowych funkcji fikcyjnej lokomocji, wpływu sensorycznego sprzężenia zwrotnego na aktywność OUN oraz koordynacji między mikroobwodami na poziomie komórkowym.

Dzięki jednoczesnym rejestracjom zewnątrzkomórkowym z neuronów RS i PS, neuronów ruchowych jednego zwoju, można monitorować naprzemienną aktywność tych pul neuronów ruchowych (Rysunek 18), co reprezentuje wzorzec fikcyjnej lokomocji.
<img alt="Analiza sygnału neuronu, schemat z przebiegiem sygnału, badanie elektrofizjologiczne, aktywność neuronalna." src="/files/ftp_upload/52109/52109fig18highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 18"> 
Rycina 1...

Tutaj opisujemy sekcję rdzenia nerwowego brzucha raka. Demonstrujemy również technikę elektrofizjologiczną rejestrowania fikcyjnej lokomocji z neuronów ruchowych pływaka.

System pływacki raków: praktyczny przewodnik po rozwarstwieniu rdzenia nerwowego i zewnątrzkomórkowych zapisach wzorca motorycznego

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

Ogólnym celem tej procedury jest wypreparowanie rdzenia nerwowego jamy brzusznej z raków w celu wykorzystania go w badaniach elektrofizjologicznych. Osiąga się to poprzez uprzednie znieczulenie raków. Następnie przeprowadza się grubą sekcję w celu odizolowania płytki brzusznej raka.Następnie przeprowadza się drobną sekcję w celu całkowitego odizolowania ośrodkowego układu nerwowego od zwojów raic do zwojów brzusznych. Szóstka. Na koniec osłonka zwojowa jest usuwana ze wszystkich zwojów, aby ułatwić eksperymenty elektrofizjologiczne.Ostatecznie łańcuch zwojów brzusznych jest wykorzystywany do nagrań dodatkowych lub wewnątrzkomórkowych. Badanie koordynacji centralnych generatorów wzorców lub badanie morfologii i kontekstu synaptycznego zidentyfikowanych neuronów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak zapewnienie praktycznego doświadczenia w zakresie funkcji sieci nerwowej, aby móc rejestrować zamieszanie fic FLA w izolowanym układzie nerwowym lub scharakteryzować morfologię zwojów brzusznych lub określonych neuronów.Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w system szybkości pływania raków. Może być również stosowany do innych systemów, takich jak sieć neuronalna, która napędza zachowanie odwracania ogona u raków Praca z rakiem Pacific Stacia Linea Guus. Po znieczuleniu zwierzęcia zgodnie z protokołem tekstowym, należy przytrzymać brzuszną stroną do góry i użyć mocnych nożyczek, aby przeciąć oba pazury u nasady w pobliżu klatki piersiowej.Następnie wyjmij lewe i prawe saszetki euro. Umieść zwierzę brzuszną stroną do góry w naczyniu preparacyjnym wyłożonym czarną sarną przed użyciem zimnej soli fizjologicznej do przeniknięcia przez otwór pazura. Następnie użyj mocnych nożyczek, aby wykonać pojedyncze poprzeczne cięcie tuż za oczami raka, aby odciąć mu głowę.Następnie usuń wszystkie nogi do chodzenia w pobliżu stawów podstawy, aby odizolować brzuch wraz z ostatnimi segmentami klatki piersiowej od reszty klatki piersiowej. Włóż końcówkę nożyczek do otworu drugiej nogi do chodzenia i przetnij na przeciwną stronę. Po rozciągnięciu cięcia na obie strony przez klatkę piersiową i odsłonięciu niektórych narządów wewnętrznych, jak opisano w protokole tekstowym, należy usunąć przednią część klatki piersiowej.Teraz usuń narządy wewnętrzne i spłucz zwierzę zimną solą fizjologiczną. Kontynuuj sekcję z cięciem w maksymalnej pozycji bocznej między lumonem a szczurami pływającymi na całej długości płyty mostka. Wykonaj to samo cięcie po drugiej stronie.Umieść odwłok raka brzuszną stroną do góry w naczyniu preparacyjnym. Użyj szpilek do owadów, aby przymocować okaz z tyłu na tellsonie i z przodu na resztkach karabazy. Napełnij naczynie solą fizjologiczną z raków, tak aby przykryła próbkę.Użyj grubych kleszczy w lewej ręce, aby złapać otwór na nogę do chodzenia i otworzyć próbkę. Zidentyfikuj duże dwa pasma mięśni zginacza grzbietowego. Napraw je i przetnij ich podstawy brzuszne, a także tętnicę mostkową.Odsłonij pierwsze zwoje brzuszne A jeden i związane z nim nerwy N jeden N dwa. Teraz przechodzimy do drugiego segmentu brzucha. Usuń podstawę pasm mięśniowych w pobliżu podstawy brzusznej.Zwój brzuszny A dwa jest teraz widoczny z powiązanymi nerwami N jeden, N dwa i N trzy. Przeciąć nerwy N trzy w najbardziej odległym miejscu od rdzenia nerwowego. Powtórz te kroki dla następnych trzech segmentów brzucha ze zwojami brzusznymi.Trójka do piątki. Po dotarciu do zwoju brzusznego szóstka. Przetnij płytkę mostka z tyłu nerwów szóstki.Przytrzymaj część brzuszną i przypnij ją. Grzbietową stroną do góry w naczyniu wypełnionym solą fizjologiczną pod mikroskopem. Użyj kleszczy, aby usunąć najbardziej przednie części rufy piersiowej głowa.Następnie przetnij mięśnie między pozostałymi strukturami egzoszkieletowymi. Po ostrożnym uniesieniu przedniego końca brzusznego rdzenia nerwowego, przetnij nerwy piersiowe z boku. Skoncentruj się na jednym i przetnij nerwy N jeden i N dwa z jednego o długości maksymalnie jednego centymetra, aby je przypiąć.Następnie przejdź do A dwa i zidentyfikuj N jeden, N dwa i N trzy nerwy tego segmentu. Nerwy w jednym ze zwojów brzusznych, od dwóch do pięciu. Znajdują się między dwoma kutykulami mostka w rozwinięciach w każdym segmencie i są pokryte mięśniami.Następnie, zaczynając od bocznego brzegu brzucha, wykonaj jedno cięcie wzdłuż tylnego zagięcia kutykularnego mostka i przejdź w kierunku linii środkowej Po odkryciu N jeden zgodnie z protokołem tekstowym. W razie potrzeby przeciąć nerw tak dystalnie, jak to możliwe. Przejdź na stronę przeciwległą i zacznij izolować nerw N jeden od linii środkowej w pobliżu zwoju, idąc w kierunku bocznej krawędzi, przecinając wzdłuż tylnego owijania kutykularnego mostka.Teraz przytnij nerwy N dwa tego ganglionu do odpowiedniej długości do przypięcia. Następnie powtórz kroki pokazane dla zwojów brzusznych. Dwójka za trójkę do piątki tak dystalnie, jak to możliwe.Przetnij nerwy ganglionu na szóstkę. Użyj kleszczy, aby chwycić wiele nerwów szóstki, aby podnieść ganglion i zacząć izolować łańcuch zwojów od płytki mostka. Po całkowitym odizolowaniu rdzenia nerwowego przenieś łańcuch zwojów na szalkę Petriego wyłożoną przezroczystą osłoną progu i wypełnioną solą fizjologiczną za pomocą małych szpilek wyciętych z drutu ze stali nierdzewnej, delikatnie rozciągając dotyk.Przypnij łańcuch zwojów w linii prostej ze sznurem nerwowym ułożonym grzbietowo do góry. Trzymaj tylko dwa ostatnie zwoje piersiowe i przygnij nerwy piersiowe z boku. Przypnij nerwy jedynki pod kątem 90 stopni w stosunku do rdzenia nerwowego.Następnie przejdź do dwójki i przypnij nerwy N dwa pod kątem od 35 do 45 stopni w stosunku do rdzenia nerwowego. Gdy nerwy N jeden zostaną oddzielone i przypięte zgodnie z protokołem tekstowym, przypnij przednią gałąź nerwu N pod kątem 90 stopni do rdzenia nerwowego. Następnie przypnij tylną gałąź nerwu N jeden między przednim N jedną gałęzią a nerwem N dwoma.Ponieważ wszystkie zwoje brzuszne muszą być osłonięte, użyj cienkich nożyczek sprężynowych, aby wykonać małe boczne nacięcie przez osłonkę zwoju za ganglionem i między nerwami N dwa i N trzy. Przeciąć poprzecznie w poprzek osłony nad łącznikiem. Następnie kontynuuj cięcie wzdłuż bocznych granic ganglionu przed usunięciem osłony.W razie potrzeby użyj cienkich kleszczyków, aby podnieść osłonkę, aby przeprowadzić zapisy zewnątrzkomórkowe. Postępując zgodnie z ustawieniem narzędzi i odczynników wymienionych w protokole tekstowym, umieść łańcuch zwojów na stole mikroskopu i oświetl od dołu. Włóż elektrodę rejestrującą do osłony syla w pobliżu nerwu docelowego, a elektrodę odniesienia w pozycji pobliżej, ale z boku zwojów.Następnie zegnij nerw docelowy wokół nagrania. Po rozciągnięciu i zabezpieczeniu nerwu użyj strzykawki wypełnionej wazeliną i igły z zaokrągloną końcówką o rozmiarze 20, aby odizolować nerw docelowy od roztworu do kąpieli. Powtórz to dla wszystkich nerwów, których aktywność musi być rejestrowana.Na koniec rozpocznij nagrywanie, jak pokazano tutaj, zewnątrzkomórkowa aktywność PS ipsilateralnych neuronów ruchowych PS od dwóch do PS pięciu zaczyna się od wybuchu PS w piątce, a fala wzbudzenia rozchodzi się w kierunku przednim. Ponadto czas mierzony od początku jednego impulsu do początku następnego impulsu w każdym segmencie pozostaje stały i jest definiowany jako okres okresów rytmu i impulsu. Czas trwania może się różnić w zależności od rodzaju preparatu, ale opóźnienie fazowe między segmentami pozostaje stałe przez około jedną czwartą cyklu, niezależnie od częstotliwości rytmu.Te wzorce koordynacyjne najlepiej widać na histogramach fazowych widocznych tutaj. Tutaj, za pomocą ostrych mikroelektrod, wewnątrzkomórkowe zapisy z dendrytów neuronów ruchowych Ps. Neurony ruchowe pokazują oscylacje w fazie poszczególnych neuronów z zewnątrzkomórkowo zarejestrowaną aktywnością wszystkich neuronów ruchowych PS tego samego zwoju krwiennego. Aby zidentyfikować neurony zarejestrowane wewnątrzkomórkowo, komórki można wypełnić za pomocą ostrych mikroelektrod i jonoforezy.Na tym rysunku soda brzuszna dwóch neuronów ruchowych PS wypełnionych di znajduje się z tyłu podstawy nerwu N jeden. Pierwotny neuryt wystaje do przodu i rozgałęzia się w bocznej pigułce neurologicznej. Akson wystaje przez tylną gałąź nerwu N jeden do mięśni.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 45 minut do godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o regularnej wymianie soli fizjologicznej, aby utrzymać zdrową tkankę nerwową. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak wewnątrzkomórkowy zapis neuronów ruchowych lub interneuronów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak analiza komórkowego mechanizmu koordynacji, pomiar prądów jonowych lub zbadanie wpływu neuromodulatorów na rytmiczną aktywność określonych komórek.

the-swimmeret-system-crayfish-practical-guide-for-dissection-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Nieinwazyjne pomiary wzorców aktywności neuronalnej u zwierząt zachowujących swobodną aktywność uzyskuje się poprzez połączenie rejestracji neurofizjologicznych z szybką wideografią.

Rejestracja aktywacji obwodów neuronalnych u zwierząt w warunkach swobodnego zachowania

Bezkręgowce wykazują autonomiczną odpowiedź typu współczulnego, podobną do tej opisanej u kręgowców. Koordynacja układów sercowo-naczyniowego i oddechowego umożliwia pomiar wskaźnika biologicznego, który pozwala ocenić stan wewnętrzny organizmu.

Pomiary częstości pracy serca i wentylacji u swobodnie poruszających się raków

Mięsień otwierający odnóża raków został zaprezentowany ze względu na jego historyczne znaczenie oraz wszechstronność eksperymentalną w badaniach nad fenotypem mięśni, fizjologią synaptyczną i plastycznością.

Historyczne ujęcie i demonstracja fizjologii złącza neuromięśniowego mięśnia otwieracza raków

Niniejszy artykuł demonstruje, jak przeprowadzać rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi synaptycznych w mięśniu prostowniku nogi chodu raka oraz w jaki sposób wizualizować zakończenia nerwowe, aby wykazać ogólne różnice morfologiczne między zakończeniami nerwowymi o wysokiej i niskiej wydajności.

Rejestracje fizjologiczne złącza nerwowo-mięśniowego o wysokiej i niskiej wydajności w mięśniu prostowniku nogi raka

Doświadczenia te prezentują prosty sposób, dzięki któremu studenci mogą zdobyć doświadczenie w badaniu struktury mięśni, odpowiedzi synaptycznych oraz wpływu gradientów jonowych i przepuszczalności na potencjały błonowe. Przedstawiono również obwód sensoryczny-OUN-motoryczny-mięśniowy, aby pokazać metodę testowania wpływu związków chemicznych na obwód neuronalny.

Potencjały błonowe, odpowiedzi synaptyczne, obwody neuronalne, neuromodulacja i histologia mięśni z wykorzystaniem raka rzecznego: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Głównym celem niniejszego eksperymentu jest zrozumienie, w jaki sposób pierwotne neurony sensoryczne przekazują informacje o ruchach i pozycjach stawów jako informacje proprioceptywne u zwierzęcia. Dodatkowym celem niniejszego raportu jest przedstawienie anatomii preparatu poprzez sekcję i obserwację neuronów pod mikroskopem stereoskopowym.

Organy receptorowe mięśni w odwłoku raków: ćwiczenie laboratoryjne dla studentów z zakresu propriocepcji

Niniejszy materiał stanowi demonstrację sposobu rozumienia błon biologicznych przy użyciu modeli elektrycznych. Przedstawiamy również procedury rejestracji potencjałów czynnościowych z brzusznego sznura nerwowego raka, przeznaczone do wykorzystania w laboratoriach dydaktycznych.

Modelowanie błon biologicznych za pomocą płytek drukowanych i pomiar sygnałów elektrycznych w aksonach: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Ten artykuł opisuje trzy preparaty układu nerwowego za pomocą pijawek: wewnątrzkomórkowy zapis z neuronów w brzusznych zwojach, hodowlę neuronów z brzusznych zwojów oraz zapis z plamy unerwionej skóry do mapowania pól czuciowych.

Zapis wewnątrzkomórkowy, mapowanie pola sensorycznego i hodowla zidentyfikowanych neuronów w pijawce, Hirudo medicinalis

Techniki fizjologiczne i anatomiczne są demonstrowane w celu rozwiązania funkcji i struktury proprioceptorów stawów oraz receptorów napięcia mięśniowego u kończyn chodzących skorupiaków.

Receptory propriocepcji i napięcia w kończynach kraba: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Ten artykuł przedstawia nieinwazyjny system biomonitoringu do ciągłego rejestrowania i analizowania aktywności serca i lokomotoryki raków. System ten składa się z czujnika optycznego bliskiej podczerwieni, modułu śledzenia wideo oraz oprogramowania do oceny bicia serca raków, które odzwierciedla ich stan fizjologiczny i charakteryzuje zachowanie raków podczas wahań bicia serca.

Ciągły nieinwazyjny pomiar czynności serca i zachowania raków

Opisujemy protokół monitorowania zmian w aktywności neuronu doprowadzającego podczas poleceń motorycznych w modelowym systemie komórek rzęsatych kręgowców.

Aktywność neuronów aferentnych tylnej linii bocznej podczas pływania u danio pręgowanego

Poznaj technikę rozwarstwienia rdzenia nerwowego raka i rejestracji wzorca motorycznego płetw brzusznych. Ta metoda elektrofizjologiczna umożliwia badanie koordynacji generatorów wzorców centralnych w układzie nerwowym skorupiaków.

System pływacki raków: praktyczny przewodnik po rozwarstwieniu rdzenia nerwowego i zewnątrzkomórkowych zapisach wzorca motorycznego (Wideo) | JoVE Journal

System pływacki raków: praktyczny przewodnik po rozwarstwieniu rdzenia nerwowego i zewnątrzkomórkowych zapisach wzorca motorycznego

Przeglądaj więcej filmów