System pływacki raków: praktyczny przewodnik po rozwarstwieniu rdzenia nerwowego i zewnątrzkomórkowych zapisach wzorca motorycznego

Ogólnym celem tej procedury jest wypreparowanie rdzenia nerwowego jamy brzusznej z raków w celu wykorzystania go w badaniach elektrofizjologicznych. Osiąga się to poprzez uprzednie znieczulenie raków. Następnie przeprowadza się grubą sekcję w celu odizolowania płytki brzusznej raka.

Następnie przeprowadza się drobną sekcję w celu całkowitego odizolowania ośrodkowego układu nerwowego od zwojów raic do zwojów brzusznych. Szóstka. Na koniec osłonka zwojowa jest usuwana ze wszystkich zwojów, aby ułatwić eksperymenty elektrofizjologiczne.

Ostatecznie łańcuch zwojów brzusznych jest wykorzystywany do nagrań dodatkowych lub wewnątrzkomórkowych. Badanie koordynacji centralnych generatorów wzorców lub badanie morfologii i kontekstu synaptycznego zidentyfikowanych neuronów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak zapewnienie praktycznego doświadczenia w zakresie funkcji sieci nerwowej, aby móc rejestrować zamieszanie fic FLA w izolowanym układzie nerwowym lub scharakteryzować morfologię zwojów brzusznych lub określonych neuronów.

Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w system szybkości pływania raków. Może być również stosowany do innych systemów, takich jak sieć neuronalna, która napędza zachowanie odwracania ogona u raków Praca z rakiem Pacific Stacia Linea Guus. Po znieczuleniu zwierzęcia zgodnie z protokołem tekstowym, należy przytrzymać brzuszną stroną do góry i użyć mocnych nożyczek, aby przeciąć oba pazury u nasady w pobliżu klatki piersiowej.

Następnie wyjmij lewe i prawe saszetki euro. Umieść zwierzę brzuszną stroną do góry w naczyniu preparacyjnym wyłożonym czarną sarną przed użyciem zimnej soli fizjologicznej do przeniknięcia przez otwór pazura. Następnie użyj mocnych nożyczek, aby wykonać pojedyncze poprzeczne cięcie tuż za oczami raka, aby odciąć mu głowę.

Następnie usuń wszystkie nogi do chodzenia w pobliżu stawów podstawy, aby odizolować brzuch wraz z ostatnimi segmentami klatki piersiowej od reszty klatki piersiowej. Włóż końcówkę nożyczek do otworu drugiej nogi do chodzenia i przetnij na przeciwną stronę. Po rozciągnięciu cięcia na obie strony przez klatkę piersiową i odsłonięciu niektórych narządów wewnętrznych, jak opisano w protokole tekstowym, należy usunąć przednią część klatki piersiowej.

Teraz usuń narządy wewnętrzne i spłucz zwierzę zimną solą fizjologiczną. Kontynuuj sekcję z cięciem w maksymalnej pozycji bocznej między lumonem a szczurami pływającymi na całej długości płyty mostka. Wykonaj to samo cięcie po drugiej stronie.

Umieść odwłok raka brzuszną stroną do góry w naczyniu preparacyjnym. Użyj szpilek do owadów, aby przymocować okaz z tyłu na tellsonie i z przodu na resztkach karabazy. Napełnij naczynie solą fizjologiczną z raków, tak aby przykryła próbkę.

Użyj grubych kleszczy w lewej ręce, aby złapać otwór na nogę do chodzenia i otworzyć próbkę. Zidentyfikuj duże dwa pasma mięśni zginacza grzbietowego. Napraw je i przetnij ich podstawy brzuszne, a także tętnicę mostkową.

Odsłonij pierwsze zwoje brzuszne A jeden i związane z nim nerwy N jeden N dwa. Teraz przechodzimy do drugiego segmentu brzucha. Usuń podstawę pasm mięśniowych w pobliżu podstawy brzusznej.

Zwój brzuszny A dwa jest teraz widoczny z powiązanymi nerwami N jeden, N dwa i N trzy. Przeciąć nerwy N trzy w najbardziej odległym miejscu od rdzenia nerwowego. Powtórz te kroki dla następnych trzech segmentów brzucha ze zwojami brzusznymi.

Trójka do piątki. Po dotarciu do zwoju brzusznego szóstka. Przetnij płytkę mostka z tyłu nerwów szóstki.

Przytrzymaj część brzuszną i przypnij ją. Grzbietową stroną do góry w naczyniu wypełnionym solą fizjologiczną pod mikroskopem. Użyj kleszczy, aby usunąć najbardziej przednie części rufy piersiowej głowa.

Następnie przetnij mięśnie między pozostałymi strukturami egzoszkieletowymi. Po ostrożnym uniesieniu przedniego końca brzusznego rdzenia nerwowego, przetnij nerwy piersiowe z boku. Skoncentruj się na jednym i przetnij nerwy N jeden i N dwa z jednego o długości maksymalnie jednego centymetra, aby je przypiąć.

Następnie przejdź do A dwa i zidentyfikuj N jeden, N dwa i N trzy nerwy tego segmentu. Nerwy w jednym ze zwojów brzusznych, od dwóch do pięciu. Znajdują się między dwoma kutykulami mostka w rozwinięciach w każdym segmencie i są pokryte mięśniami.

Następnie, zaczynając od bocznego brzegu brzucha, wykonaj jedno cięcie wzdłuż tylnego zagięcia kutykularnego mostka i przejdź w kierunku linii środkowej Po odkryciu N jeden zgodnie z protokołem tekstowym. W razie potrzeby przeciąć nerw tak dystalnie, jak to możliwe. Przejdź na stronę przeciwległą i zacznij izolować nerw N jeden od linii środkowej w pobliżu zwoju, idąc w kierunku bocznej krawędzi, przecinając wzdłuż tylnego owijania kutykularnego mostka.

Teraz przytnij nerwy N dwa tego ganglionu do odpowiedniej długości do przypięcia. Następnie powtórz kroki pokazane dla zwojów brzusznych. Dwójka za trójkę do piątki tak dystalnie, jak to możliwe.

Przetnij nerwy ganglionu na szóstkę. Użyj kleszczy, aby chwycić wiele nerwów szóstki, aby podnieść ganglion i zacząć izolować łańcuch zwojów od płytki mostka. Po całkowitym odizolowaniu rdzenia nerwowego przenieś łańcuch zwojów na szalkę Petriego wyłożoną przezroczystą osłoną progu i wypełnioną solą fizjologiczną za pomocą małych szpilek wyciętych z drutu ze stali nierdzewnej, delikatnie rozciągając dotyk.

Przypnij łańcuch zwojów w linii prostej ze sznurem nerwowym ułożonym grzbietowo do góry. Trzymaj tylko dwa ostatnie zwoje piersiowe i przygnij nerwy piersiowe z boku. Przypnij nerwy jedynki pod kątem 90 stopni w stosunku do rdzenia nerwowego.

Następnie przejdź do dwójki i przypnij nerwy N dwa pod kątem od 35 do 45 stopni w stosunku do rdzenia nerwowego. Gdy nerwy N jeden zostaną oddzielone i przypięte zgodnie z protokołem tekstowym, przypnij przednią gałąź nerwu N pod kątem 90 stopni do rdzenia nerwowego. Następnie przypnij tylną gałąź nerwu N jeden między przednim N jedną gałęzią a nerwem N dwoma.

Ponieważ wszystkie zwoje brzuszne muszą być osłonięte, użyj cienkich nożyczek sprężynowych, aby wykonać małe boczne nacięcie przez osłonkę zwoju za ganglionem i między nerwami N dwa i N trzy. Przeciąć poprzecznie w poprzek osłony nad łącznikiem. Następnie kontynuuj cięcie wzdłuż bocznych granic ganglionu przed usunięciem osłony.

W razie potrzeby użyj cienkich kleszczyków, aby podnieść osłonkę, aby przeprowadzić zapisy zewnątrzkomórkowe. Postępując zgodnie z ustawieniem narzędzi i odczynników wymienionych w protokole tekstowym, umieść łańcuch zwojów na stole mikroskopu i oświetl od dołu. Włóż elektrodę rejestrującą do osłony syla w pobliżu nerwu docelowego, a elektrodę odniesienia w pozycji pobliżej, ale z boku zwojów.

Następnie zegnij nerw docelowy wokół nagrania. Po rozciągnięciu i zabezpieczeniu nerwu użyj strzykawki wypełnionej wazeliną i igły z zaokrągloną końcówką o rozmiarze 20, aby odizolować nerw docelowy od roztworu do kąpieli. Powtórz to dla wszystkich nerwów, których aktywność musi być rejestrowana.

Na koniec rozpocznij nagrywanie, jak pokazano tutaj, zewnątrzkomórkowa aktywność PS ipsilateralnych neuronów ruchowych PS od dwóch do PS pięciu zaczyna się od wybuchu PS w piątce, a fala wzbudzenia rozchodzi się w kierunku przednim. Ponadto czas mierzony od początku jednego impulsu do początku następnego impulsu w każdym segmencie pozostaje stały i jest definiowany jako okres okresów rytmu i impulsu. Czas trwania może się różnić w zależności od rodzaju preparatu, ale opóźnienie fazowe między segmentami pozostaje stałe przez około jedną czwartą cyklu, niezależnie od częstotliwości rytmu.

Te wzorce koordynacyjne najlepiej widać na histogramach fazowych widocznych tutaj. Tutaj, za pomocą ostrych mikroelektrod, wewnątrzkomórkowe zapisy z dendrytów neuronów ruchowych Ps. Neurony ruchowe pokazują oscylacje w fazie poszczególnych neuronów z zewnątrzkomórkowo zarejestrowaną aktywnością wszystkich neuronów ruchowych PS tego samego zwoju krwiennego. Aby zidentyfikować neurony zarejestrowane wewnątrzkomórkowo, komórki można wypełnić za pomocą ostrych mikroelektrod i jonoforezy.

Na tym rysunku soda brzuszna dwóch neuronów ruchowych PS wypełnionych di znajduje się z tyłu podstawy nerwu N jeden. Pierwotny neuryt wystaje do przodu i rozgałęzia się w bocznej pigułce neurologicznej. Akson wystaje przez tylną gałąź nerwu N jeden do mięśni.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 45 minut do godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o regularnej wymianie soli fizjologicznej, aby utrzymać zdrową tkankę nerwową. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak wewnątrzkomórkowy zapis neuronów ruchowych lub interneuronów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak analiza komórkowego mechanizmu koordynacji, pomiar prądów jonowych lub zbadanie wpływu neuromodulatorów na rytmiczną aktywność określonych komórek.