Nowatorski model in vitro do badania interakcji między ludzką krwią pełną a śródbłonkiem
21 listopada 2014
Brakuje dostępu do wiarygodnych modeli do badania interakcji naczyniowych krwi u ludzi. Przedstawiamy model in vitro hodowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka w połączeniu z ludzką krwią pełną w celu zbadania interakcji komórkowych zarówno we krwi (ELISA), jak i w przedziale naczyniowym (mikroskopia).
Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie interakcji między krwią a komórkami śródbłonka przy użyciu nowego testu komory śródbłonka krwi. Osiąga się to poprzez pobranie krwi od zdrowego ochotnika za pomocą nakłucia żyły w systemie otwartym. W drugim etapie krew jest ostrożnie nakładana na komory krwionośne pokryte powierzchnią heparyny w połączeniu z szkiełkami posianymi do hodowli komórek śródbłonka.
Następnie te komory komórek śródbłonka krwi są delikatnie obracane, aby ułatwić interakcję między krwią a komórkami śródbłonka. Ostatecznie interakcje międzykomórkowe między krwią a komórkami śródbłonka i wynikającą z tego produkcję kompleksu trombiny antytrombinowej można ocenić odpowiednio za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej i Elizy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak te wykorzystujące modele zwierzęce, jest to, że tutaj system modelu ludzkiego może być wykorzystany do zbadania choroby naczyniowej przed rozpoczęciem eksperymentu.
Połącz igłę podskórną o rozmiarze 18 z kawałkiem silikonowej rurki pokrytej heparyną o średnicy wewnętrznej o średnicy wewnętrznej. Powierzchnie z tworzywa sztucznego są pokryte heparyną, aby zapobiec niespecyficznej aktywacji krzepnięcia. Na przykład na tym zdjęciu w tej niepokrytej komorze wyraźnie widać skrzep.
Po 30 minutach kontaktu z krwią, potraktowanie komory powierzchnią heparyny chroni krew przed niekontrolowaną aktywacją, zapewniając, że wyniki są spowodowane interakcjami komórek śródbłonka z krwią. Dopiero po podłączeniu rurki ostrożnie pobrać próbkę krwi od zdrowego dawcy przez nakłucie dożylne w systemie otwartym do 50-mililitrowej probówki pokrytej powierzchniowo heparyną. Uzupełnij pobraną krew niefrakcjonowaną heparyną, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,75 IU na mililitr i odwróć probówkę dwa do trzech razy w celu delikatnego wymieszania.
W celu analizy początkowego stężenia białka we krwi, ostrożnie wymieszaj jeden mililitr krwi na probówkę w mikroprobówkach wirówkowych zawierających 30 mikrolitrów 10 milimolowych K trzy EDTA i umieść probówki na lodzie. Następnie użyj końcówki pipety pokrytej powierzchniowo heparyną, aby przenieść 1,5 mililitra krwi do każdej komory komórek śródbłonka krwi pokrytej heparyną, uważając, aby krew płynęła powoli i bez tworzenia pęcherzyków, aby uniknąć aktywacji. Następnie usuń plastikowe ścianki ze szkiełek do hodowli komórek śródbłonka zgodnie z instrukcjami producenta i delikatnie umyj komórki śródbłonka.
W przypadku PBS usuwamy jak najwięcej popłuczyny z komórek, nie dopuszczając do wyschnięcia kultur i umieszczamy szkiełka na komorach krwionośnych tak, aby komórki były skierowane w stronę krwi. Następnie za pomocą plastikowych zjeżdżalni dla dodatkowego wsparcia. Aby uniknąć pęknięcia szkiełek do hodowli komórkowych, umieść zacisk wokół każdej komory komórek śródbłonka krwi, aby zabezpieczyć szkiełka.
Teraz obracaj komory na obracającym się kole w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza o temperaturze 0,5 G przez 30 minut. Po obróceniu zdemontuj komory komórek śródbłonka krwi, umyj szkiełka hodowli komórkowych w PBS i utrwal komórki w lodowatym 1% paraldehydzie przez 10 minut. Na koniec, w celu oceny stężenia aktywowanego białka krwi, wymieszaj jeden mililitr krwi z każdej komory w mikroprobówkach wirówkowych zawierających 30 mikrolitrów 0,34 mola K trzy EDTA i umieść probówki na lodzie na maksymalnie jedną godzinę.
Następnie, po odwirowaniu komórek, przechowuj osocze w nowych mikroprobówkach wirówkowych w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza do czasu dalszej analizy. Aktywacja czynników krzepnięcia jest bardziej prawdopodobna w przypadku zastoju krwi, ponieważ zwiększa się prawdopodobieństwo interakcji między aktywowanymi czynnikami. Rzeczywiście, objętość krwi bez ruchu pęcherzyków powietrza jest dwa i pół razy większa.
Gdy do komory dodaje się 1,75 mililitra krwi w porównaniu do 1,5 mililitra krwi, zmierzone wartości antytrombiny trombiny sugerują zwiększone tworzenie antytrombiny przy zwiększonej objętości krwi. Co ciekawe, gdy ve są inkubowane z dowolną objętością krwi pełnej, nie zauważa się różnic między obiema grupami, co sugeruje, że komórki śródbłonka mogą modulować aktywację krzepnięcia w celu zbadania wpływu TNF alfa na rekrutację leukocytów. W tym eksperymencie qve traktowano 20 nanogramami na mililitr TT NF alfa na cztery godziny przed kontaktem z krwią, po czym określono ilościowo liczbę komórek CD 16 dodatnich.
Rekrutacja komórek CD 16 dodatnich znacznie wzrosła po leczeniu TNF alfa ze 100 do 256 komórek CD 16 dodatnich na milimetr kwadratowy i 1,5 litra krwi oraz ze 172 do 378 i 1,75 mililitra krwi. Tworzenie kompleksów trombinowo-antytrombinowych mierzono następnie w odpowiednich próbkach osocza z krwi inkubowanej z komórkami traktowanymi TNF alfa lub nietraktowanymi. Zgodnie z oczekiwaniami, komórki stymulowane TNF alfa indukowały przybliżone podwojenie kompleksów trombiny antytrombiny w porównaniu z nieleczonymi kontrolami po jego rozwojeniu.
Technika ta umożliwi naukowcom z dziedziny immunologii badanie, uzupełnianie i koagulację w modelu in vitro z wykorzystaniem ludzkich komórek pierwotnych i ludzkiej krwi pełnej.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowy model in vitro do badania interakcji między ludzką krwią a komórkami śródbłonka. Wykorzystując test z komorą śródbłonka naczyniowego, badacze mogą ocenić interakcje komórkowe oraz czynniki krzepnięcia w ludzkim systemie modelowym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia naczyniowa
- Interakcje komórkowe
- Badania krzepliwości
Wstęp
- Obecne modele służące do badania interakcji między krwią a śródbłonkiem są ograniczone.
- Istniejące metody często opierają się na modelach zwierzęcych, które mogą nie odzwierciedlać wiernie fizjologii człowieka.
- Pierwotne ludzkie komórki stanowią bardziej odpowiedni system do badań nad chorobami naczyniowymi.
- Celem badania jest poprawa zrozumienia procesów krzepnięcia i odpowiedzi immunologicznych u ludzi.
Cel badania
- Opracowanie modelu in vitro do badania interakcji między krwią a komórkami śródbłonka.
- Ocena produkcji kompleksów trombina-antytrabina.
- Ocena wpływu TNF-alpha na rekrutację leukocytów.
Zastosowane metody
- Pobieranie krwi od zdrowych ochotników za pomocą wenipunkcji.
- Nakładanie krwi na pokryte heparyną komory z kulturami komórek śródbłonka.
- Obracanie komór w celu ułatwienia oddziaływań między krwią a komórkami.
- Analiza oddziaływań za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej i testu ELISA.
Główne wyniki
- Zaobserwowano zwiększoną tworzenie kompleksów trombina-anty-trombina przy większych objętościach krwi.
- Leczenie TNF-alpha znacząco zwiększyło rekrutację komórek CD16 dodatnich.
- Model wykazał, że komórki śródbłonka mogą modulować aktywację krzepnięcia.
- Wyniki sugerują potencjalne zastosowania w badaniach nad immunologią i chorobami naczyniowymi.
Wnioski
- Opracowany model umożliwia badanie specyficznych dla ludzi oddziaływań między krwią a śródbłonkiem.
- Technika ta może usprawnić badania nad chorobami naczyniowymi oraz odpowiedziami immunologicznymi.
- W przyszłych badaniach można wykorzystać ten model do analizy układów krzepnięcia i dopełniacza.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten model in vitro wypełnia krytyczną lukę w badaniach nad chorobami naczyniowymi, umożliwiając bezpośrednie badanie interakcji między ludzką krwią a śródbłonkiem w warunkach fizjologicznych. Dzięki zastosowaniu natywnej krwi pełnej z minimalną ilością antykoagulantu oraz pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka, test zapewnia system istotny dla człowieka do mechanistycznej minimalizacji ryzyka w odniesieniu do celów naczyniowych. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów poprzez kwantyfikację modulacji krzepnięcia oraz rekrutacji leukocytów w systemie odpowiadającym stanom chorobowym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju BioPharma
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych dotyczących śródbłonkowej modulacji szlaków krzepnięcia.
- Wartość naukowa: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez pomiar tworzenia kompleksu trombiny z antytrombiną jako funkcjonalnego wskaźnika aktywności szlaku.
- Wartość naukowa: Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka poprzez kwantyfikację rekrutacji leukocytów CD16+ pod wpływem stymulacji zapalnej.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Wartość naukowa: Generuje zestandaryzowane, ilościowe wyniki (kompleksy TAT, adhezja leukocytów) odpowiednie do standaryzacji testów.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje komory powlekane heparyną w celu zminimalizowania nieswoistej aktywacji, co poprawia powtarzalność między eksperymentami.
- Wartość operacyjna: Umożliwia skalowalne przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych dla dalszych etapów przepływów pracy w badaniach przesiewowych związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje istotną dla choroby aktywację śródbłonka (np. stymulację TNF-α) w celu badania interakcji leukocytów ze śródbłonkiem w zapaleniu naczyń krwionośnych.
- Wartość naukowa: Zapewnia ciągłość translacyjną poprzez powiązanie in vitro odczytów krzepnięcia i odpowiedzi immunologicznej z patofizjologicznymi procesami naczyniowymi.
- Wartość naukowa: Wspiera decyzje o rozwoju produktu skorygowane o ryzyko, dostarczając wglądu w mechanizmy zaburzeń w przedziale krwi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum odkryć – od walidacji celu po ocenę przedkliniczną – oferując platformę istotną dla człowieka do oceny modulacji celu naczyniowego przed optymalizacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących śródbłonkowej regulacji krzepnięcia oraz rekrutacji komórek odpornościowych.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych wyników opartych na immunofluorescencji i teście ELISA w celu oceny działania związków.
- Analityka: Umożliwia porównanie aktywacji krzepnięcia i adhezji leukocytów w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z modelami patologii naczyniowej poprzez stany aktywacji śródbłonka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania metody do badania interakcji między krwią a śródbłonkiem w odniesieniu do wielu celów naczyniowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w walidacji celów naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki ustandaryzowanym protokołom przygotowania komory i rotacji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie wczesnych informacji na temat modulacji celów naczyniowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o dane dotyczące krzepnięcia i interakcji immunologicznych istotnych dla organizmu ludzkiego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pierwotnej hodowli komórek śródbłonka oraz w pracy z pełną krwią ludzką.
- Zależność od powierzchni powlekanych heparyną i systemów kontrolowanej rotacji w celu zapobiegania artefaktowej aktywacji.
- Konieczność stosowania ustandaryzowanych protokołów pobierania, przetwarzania i analizy krwi przez wszystkie zespoły.
- Konieczność optymalizacji przy adaptacji metody do różnych typów komórek śródbłonka lub warunków stymulacji.
- Ograniczenie wynikające z krótkiego okna funkcjonalnego krwi ex vivo, co wymaga niezwłocznego przetworzenia materiału po pobraniu.
![Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54014.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.166Z&w=384&q=75)
