Name: Nowatorski model in vitro do badania interakcji między ludzką krwią pełną a śródbłonkiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Poznaj nowatorski model in vitro do badania interakcji między ludzką krwią pełną a śródbłonkiem. Ta metoda umożliwia ocenę aktywacji koagulacji i rekrutacji leukocytów w warunkach ludzkich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych (90293501, A0290401, A0290402), Siódmego Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej na podstawie umowy o grant nr 602699 (DIREKT), Fundacji NovoNordisk, Fundacji Gurli i Edwarda Brunnbergów, Stem Therapy, Fundacji Vleugel i Fundacji Ake Wiberg.

UWAGA: Krew została pobrana od zdrowych osób za pomocą otwartego systemu nakłucia żyły za zgodą Komisji Etycznej w Uppsali (Zezwolenie nr 2008/264).
1. Komórki rozsiewające
<ol>
	<li>Hodowla pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) w temperaturze 37 °C w 5% CO2 w kolbach T75 pokrytych 1% żelatyną o pH PBS 7,4.</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z kolby T75 zawierającej HUVEC (lub inny rodzaj pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka) i przemyć komórki 2,1 mM EDTA w PBS pH 7,4. Odłączyć komórki, dodając 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubując przez 2 - 3 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zebrać komórki, przepłukując kolbę 9 ml 10% FBS w PBS o pH 7,4 i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml. Wiruj komórki w temperaturze 735 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce mikronaczyniowej do wzrostu komórek śródbłonka (EC GMMV) i policzyć komórki w komorze Bürkera. Wysiewać 21 000 komórek/cm2 w 1-dołkowych szkiełkach hodowlanych i inkubować w temperaturze 37 °C. HUVEC będzie zlewać się po 1-2 dniach hodowli. Codziennie monitoruj morfologię i konfluencję komórek pod mikroskopem świetlnym.</li>
</ol>
2. Przygotowanie krwi pełnej
<ol>
	<li>Wszystkie sztuczne powierzchnie, które będą miały kontakt z krwią, należy przygotować podwójną warstwę unieruchomionej heparyny (CHS) zgodnie z zaleceniami producenta. Materiały powlekane CHS chronione przed kurzem mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy bez utraty funkcji.</li>
	<li>Użyj nakłucia żyły w systemie otwartym, aby pobrać krew od zdrowego dawcy na krótko (<30 min) przed rozpoczęciem eksperymentu w komorze śródbłonka krwi. Połączyć igłę podskórną (18 G x 50 mm) z silikonową rurką pokrytą CHS (średnica wewnętrzna: 2 mm) przed ostrożnym pobraniem krwi do probówki o pojemności 50 ml z powłoką CHS. Uzupełnij krew heparyną niefrakcjonowaną, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,75 j.m./ml. Delikatnie wymieszaj krew, odwracając probówkę 2-3 razy.</li>
</ol>
3. Model komory śródbłonka krwi
<ol>
	<li>Wykonać komory krwionośne (Rysunek 1A; widok z góry) z akrylowego polimetakrylanu metylu (PMMA) składające się z dwóch cylindrów (wysokość 8 mm i promień 9 mm), które są przyklejone do szkiełka PMMA (25 x 75 mm). Dopasuj krawędzie cylindrów skierowane do góry za pomocą gumowych pierścieni uszczelniających o przekroju okrągłym, aby uszczelnić komorę krwi względem szkiełek ze szklanymi szkiełkami z hodowanymi komórkami śródbłonka (rysunek 1B). Następnie obrócić komory krwi połączone ze szkiełkiem hodowlanym z komórkami śródbłonka w pozycji pionowej (ryc. 1C).</li>
	<li>Za pomocą końcówki pipety z powłoką CHS przenieś 1,5 ml krwi do każdej komory pokrytej CHS, uważając, aby nie aktywować krwi.</li>
	<li>Przenieść 1 ml krwi do probówek mikrowirówkowych zawierających 30 μl 0,34 MK 3EDTA, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 mMK 3EDTA w celu oznaczenia początkowych stężeń białek osocza przy użyciu testu immunoenzymatycznego (ELISA). Ostrożnie wymieszaj krew i trzymaj probówki na lodzie.</li>
	<li>Usuń plastikowe ścianki szkiełek do hodowli komórkowych zgodnie z instrukcjami producenta i ostrożnie umyj komórki w PBS o pH 7,4. Upewnij się, że następnie usunąłeś jak najwięcej płynu ze szkiełek. Nie pozwól, aby komórki wyschły.</li>
	<li>Umieść szkiełko na komorach krwi, tak aby komórki były skierowane w stronę krwi. Zabezpiecz szkiełko, umieszczając zacisk wokół komory komórek śródbłonka krwi. Użyj plastikowego szkiełka dla dodatkowego wsparcia, aby uniknąć pęknięcia szkiełka do hodowli komórkowych podczas umieszczania zacisku.</li>
	<li>Zamocować komorę komórek śródbłonka krwi na obracającym się kole (o średnicy 40 cm) umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Obracaj każdą komorę na kole z prędkością 0,5 x g przez 30 minut.</li>
	<li>Po inkubacji zdemontuj komorę komórek śródbłonka krwi. Umyj szkiełka hodowlane w PBS pH 7,4 i utrwal komórki w lodowatym 1% paraformaldehydzie (PFA) przez 10 minut. Przenieść 1 ml krwi z każdej komory do probówek mikrowirówkowych zawierających 30 μl 0,34 MK 3EDTA, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 mMK 3EDTA i delikatnie wymieszać probówki. Trzymaj probówki na lodzie.</li>
	<li>Odwirować probówki o stężeniu 4,560 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść osocze krwi do nowych probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -70 °C do czasu dalszej analizy.</li>
</ol>
4. Analiza interakcji śródbłonka krwi
<ol>
	<li>Wykonaj barwienie immunofluorescencyjne za pomocą mysiego anty-ludzkiego CD16, a następnie wtórnego kozła anty-mysiego Alexa 488 i falloidyny-TexasRed. Wykonuj każdy etap barwienia przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i myj szkiełka w PBS pH 7,4 między każdym etapem. Przeciwbarwić jądra DAPI przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Analizuj składniki krwi związane z komórkami śródbłonka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w połączeniu z analizą obrazu za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak CellProfiler.</li>
	<li>Określić ilościowo reakcje w komorze krwi za pomocą testu ELISA trombina-antytrombina (TAT) zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi próbek osocza.</li>
	<li>Użyj odpowiednich narzędzi statystycznych, np. niesparowanego testu t, aby przeanalizować dane.</li>
</ol>

<ol><li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+Mice+and+Not+Men%3A+Differences+between+Mouse+and+Human+Immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology.</a> J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).</li>
<li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li>
<li>Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+model+to+study+interaction+between+whole+blood+and+biomaterials.+Studies+of+platelet+and+coagulation+activation+acid+the+effect+of+aspirin%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin.</a> Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).</li>
<li>Doctor, A., Spinella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Processing+and+Storage+on+Red+Blood+Cell+Function+In%5BTitle%5D)+AND+%22Vivo.+Semin+Perinatol%22%5BJournal%5D)">Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In.</a> Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).</li>
<li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+heparin+surface+concentration+and+antithrombin+binding+capacity+as+evaluated+with+human+non-anticoagulated+blood+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro.</a> J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).</li>
<li>Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+blood+compatibility+of+materials%2C+cells%2C+and+tissues%3A+basic+concepts%2C+test+models%2C+and+practical+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+dynamics+of+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal dynamics of the endothelium.</a> J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).</li>
<li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).</li>
<li>Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+stimulated+with+tumor+necrosis+factor-alpha+express+varying+amounts+of+tissue+factor+resulting+in+inhomogenous+fibrin+deposition+in+a+native+blood+flow+system.+Effects+of+thrombin+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors.</a> J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).</li>
<li>Esmon, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+circuits+in+thrombosis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Molecular circuits in thrombosis and inflammation.</a> Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).</li>
<li>Rosenberg, R. D., Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular-Bed%E2%80%93Specific+Hemostasis+and+Hypercoagulable+States%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Vascular-Bed–Specific Hemostasis and Hypercoagulable States.</a> N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wielokrotne interakcje między krwią a ścianą naczynia są zwykle utrzymywane w stanie spoczynku ze względu na nieadhezyjny i przeciwzakrzepowy charakter śródbłonka. 7 Podczas stanów patologicznych obejmujących stan zapalny śródbłonek jest aktywowany, co skutkuje wzrostem ekspresji receptora adhezyjnego8 i zmniejszoną zdolnością do hamowania hemostazy. 9 Aktywacja systemów kaskadowych we krwi z kolei wzmacnia trombogenność śródbłonka, powodując dalszą zakrzepicę i rekrutację leukocytów. 10 Aby lepiej zrozumieć te delikatne interakcje między komórkami śródbłonka a krwią pełną, opracowaliśmy nowatorską metodę in vitro , w której hodowane komórki śródbłonka są umieszczane w kontakcie z krwią pełną. Według naszej wiedzy, nasza konfiguracja jest pierwszą, która pokazuje komórki śródbłonka inkubowane z pełną ludzką krwią bez lub z bardzo małą ilością antykoagulantu przez dłuższy czas.
Czułość tego systemu jest możliwa dzięki nakłuciu dożylnemu w systemie otwartym w połączeniu z ochronną warstwą unieruchomionej heparyny na wszystkich powierzchniach mających kontakt z krwią. Zastosowanie systemu otwartego podczas pobierania krwi zmniejsza aktywację systemów kaskadowych podczas nakłucia żyły, umożliwiając jednocześnie zastosowanie samodzielnie określonej ilości antykoagulantu. Dostępne na rynku probówki z ewakuowaną krwią mogą być jednak używane w zależności od zamierzonych punktów końcowych badania. Końcowe stężenie antykoagulantu dodawanego do większości dostępnych na rynku probówek z systemem zamkniętym może hamować wrażliwe i w inny sposób trudne do zbadania interakcje w konfiguracji. 6 Ochronna powierzchnia heparyny dodatkowo eliminuje aktywację krwi poprzez kontakt powierzchniowy z jakimikolwiek powierzchniami innymi niż komórki śródbłonka. 5 Rzeczywiście, inkubacja krwi pełnej uzupełnionej niewielką ilością niefrakcjonowanej heparyny w komorze bez ochrony CHS powodowała tworzenie się skrzepów.
Pęcherzyk powietrza wewnątrz komory umożliwia mieszanie krwi podczas inkubacji z komórkami śródbłonka. Aby ocenić wpływ wielkości pęcherzyków powietrza, użyliśmy dwóch różnych objętości krwi. W tym modelu zmierzyliśmy podobne poziomy TAT niezależnie od wielkości pęcherzyków powietrza w komorach inkubowanych z HUVEC. TAT został jednak zwiększony dzięki mniejszemu rozmiarowi pęcherzyków powietrza w komorach w pełni poddanych działaniu CHS. To, zgodnie z wcześniej opisanymi właściwościami komórek śródbłonka11, wskazuje na wpływ regulacyjny na zwiększoną aktywację krzepnięcia dostarczanej przez komórki śródbłonka, której brakuje w obojętnej komorze CHS. Pęcherzyk powietrza w systemie wytwarza przepływ po obróceniu komory. Rozmiar pęcherzyka będzie miał wpływ na siły w tym systemie obrotowym. Pokazują to nasze wyniki na rysunku 2D , gdzie mniejszy pęcherzyk tworzy wyższe wartości TAT, co oznacza zmniejszoną siłę działającą na krew, tj. ruch krwi w komorze jest mniejszy, a tym samym aktywacja systemu kaskadowego następuje w większym stopniu. Należy wspomnieć, że w tym systemie tworzymy przepływ wirujący, który będzie miał różną prędkość w poprzek komory, przy czym największa prędkość będzie przebiegać wzdłuż ścianek, a najmniejsza w środku. Nie jest to oczywiście optymalne środowisko pod względem naprężeń przepływowych i ścinających dla komórek śródbłonka, ale nadal mamy system dający stabilne i powtarzalne wyniki. Bardziej optymalne warunki obejmowałyby krążący przepływ laminarny przy braku turbulencji. Nie jest to jednak możliwe w przedstawionym tu modelu i według naszej wiedzy taki system nie jest obecnie dostępny. Chociaż na rynku dostępnych jest kilka układów mikroprzepływowych, które nie są możliwe do połączenia z pełną krwią bez dodatku antykoagulantu lub z niskim poziomem dodanego do systemu, co nie umożliwia właściwej czułej oceny interakcji między wszystkimi składnikami obecnymi we krwi i komórkach śródbłonka.
Ponadto zaobserwowano 2-krotny wzrost rekrutacji komórek krwi w kierunku HUVEC aktywowanego TNFα w połączeniu z podwojonym tworzeniem TAT niezależnie od objętości krwi. Weryfikuje to stabilność systemu modelowego, a także pokazuje możliwość zastosowania aktywowanego śródbłonka w połączeniu z krwią pełną. W przyszłości komora komórek śródbłonka krwi może być wykorzystywana do badania rekrutacji komórek krwi w kierunku aktywowanych komórek śródbłonka za pomocą różnych markerów ulegających ekspresji na komórkach w różnych warunkach i na różnych etapach aktywacji. Ponadto model może być stosowany w połączeniu ze środkami farmakologicznymi w celu oceny wpływu na stany zapalne.
Podsumowując, pokazujemy ogromne korzyści płynące z połączenia modelu komorowego z ludzką krwią i komórkami naczyniowymi w celu stworzenia kompletnego systemu in vitro dla człowieka do wykonywania odpowiednich badań chorób naczyniowych.

Metody analizy oddziaływań naczyniowo-krwawych w chorobach układu sercowo-naczyniowego zazwyczaj opierają się na eksperymentalnych badaniach na zwierzętach. Wyniki uzyskane w badawczych modelach zwierzęcych mogą jednak mieć niewielkie znaczenie lub nie mieć go wcale w odniesieniu do chorób ludzi.1,2 W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na dobre i niezawodne modele in vitro do badania oddziaływań komórkowych pomiędzy komponentem krwi a komórkami śródbłonka naczyniowego w systemie przypominającym ludzki. Opracowaliśmy zatem model komory z komórkami śródbłonka krwi. Opiera się on na wcześniej opisanym modelu stosowanym do badania oddziaływań między biomateriałami a pełną krwią ludzką.3 W przeciwieństwie do innych układów in vitro, w których zazwyczaj dostępna jest ograniczona liczba oczyszczonych komponentów, t.j. trombocytów, leukocytów lub komórek śródbłonka, niniejszy model obejmuje wszystkie komponenty występujące w naczyniu krwionośnym.
Konstrukcja modelu komory z komórkami śródbłonka naczyniowego została zaprojektowana w taki sposób, aby umożliwić wykorzystanie świeżo pobranej krwi ludzkiej z niewielką ilością dodanego przeciwkrzepliwego leku lub całkowicie bez niego. Krew przechowywana przez dłuższy czas ulega tzw. uszkodzeniom magazynowym, w których rozpad erytrocytów może zakłócać subtelne interakcje między krwią a komórkami śródbłonka.4
Aby uniknąć powstawania skrzepów podczas manipulacji pełną krwią ex vivo, wymagane są albo wysokie dawki przeciwzakrzepowych, albo zastosowanie materiałów nieaktywujących w całym obszarze kontaktu z krwią. Ponieważ powierzchnie nieaktywujące są rzadko spotykane w środowisku laboratoryjnym, materiały można alternatywnie wyposażyć w ochronną warstwę unieruchomionej heparyny. Ochronna warstwa unieruchomionej heparyny (dalej określana jako powierzchnia heparynowa Corline (CHS)) może być naniesiona na większość materiałów, tworząc powierzchnię, na której kontakt z krwią nie powoduje aktywacji kaskady krzepnięcia.5 Dzięki wyposażeniu komór w CHS, model komory komórek śródbłonka naczyniowego umożliwia stosowanie bardzo niskich stężeń przeciwzakrzepowych w krwi. Uniknięcie dodawania wysokich stężeń przeciwzakrzepowych w modelu komory śródbłonka naczyniowego pozwala na badanie subtelnych interakcji wewnątrz naczynia krwionośnego, które w przeciwnym razie mogłyby zostać zamaskowane.6
Model komory z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych składa się z dwóch komór utworzonych przez przymocowanie plastikowych cylindrów (wysokość: 8 mm; promień: 9 mm) do plastikowego szkiełka mikroskopowego. Górne krawędzie cylindrów są wyposażone w rowki, w których znajdują się gumowe pierścienie O-ring służące do uszczelnienia komór przy szkiełku do hodowli komórkowej. Komory są wypełnione krwią tylko częściowo, ponieważ powietrze pozostawione wewnątrz utrzymuje krew w ruchu podczas późniejszej rotacji komór w pozycji pionowej (Rysunek 1).
Aby ocenić funkcjonalność modelu, przeprowadzono eksperymenty z wykorzystaniem komory całkowicie pokrytej CHS lub ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC). Przebadano dwie oddzielne objętości krwi i zmierzono tworzenie kompleksów trombiny z antytrombiną (TAT), będących pośrednim markerem krzepnięcia, za pomocą testu ELISA. Następnie, poprzez analizę obrazu, oceniono wpływ objętości krwi oraz stymulowanych czynnikiem martwicy nowotworu (TNFα) komórek śródbłonka na rekrutację leukocytów.
<img alt="Etapy przygotowania rozmazu krwi, schemat; obejmuje przygotowanie szkiełka, rozprzestrzenianie próbki i szczegóły rotacji." src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Konfiguracja modelu komory komórek śródbłonka naczyniowego. (A) Schematyczny rysunek komory krwi wykonanej z PMMA widziany z góry. (B) Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka są hodowane na szkiełkach z komorą jednodobową. Świeża ludzka krew pełna jest dodawana do dwóch komór na szkiełku mikroskopowym. Komory oraz wszystkie materiały używane do manipulacji krwią są pokryte ochronną powłoką HS. Po usunięciu ścianek szkiełka do hodowli komórkowej, komórki są ustawiane przylegać do krwi, a system zostaje zamknięty za pomocą zacisków. (C) Komory komórek śródbłonka są następnie inkubowane w rotacji w temperaturze 37 °C. Następnie reakcje w przedziale krwi można analizować metodą ELISA, a komórki śródbłonka analizować za pomocą mikroskopii.

<table><tbody><tr><td>Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)</td><td>PromoCell</td><td>C-12200</td><td>Można użyć dowolnego innego rodzaju pierwotnej ludzkiej komórki śródbłonka.</td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka MV (ECGM MV)PromoCell</td><td></td> <td>C-22120</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-2500</td><td>Przygotuj 1% żelatyny w PBS, inkubuj 5 ml w T75 przez 15 minut i usuń przed hodowlą komórek.</td></tr><tr><td>Laboratorium Badań Enzymatycznych</td> <td>TAT ELISA</td>.<td>TAT-EIA-C</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD16</td><td>DAKO</td><td>F7011</td><td>Rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Kozioł anty-mysz Alexa 488</td><td>Sondy molekularne</td><td>A11001</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr>Czerwone <td>sondy molekularne</td><td>falloidyny-Texas</td><td>A22287</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>DAPI</td><td>D1306</td><td>Rozcieńczenie 10 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td>Sigma E-6758</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco Life Tecnologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>1-dołkowe szkiełka do hodowli komórkowych</td><td>BD Falcon</td><td>354101</td><td></td></tr><tr><td>Komory krwionośne</td><td>NA</td><td></td><td>NA Komora krwi może być wykonana z PMMA lub innego tworzywa sztucznego, które jest w stanie bind CHS</td></tr><tr><td>Clamps</td><td>Office Depot</td><td>2052204</td><td></td></tr><tr><td>Corline Heparyna Powierzchnia (CHS)</td><td>Corline Systems AB</td><td>945-00</td><td></td></tr><tr><td>Igła podskórna</td><td>Terumo</td><td>NN-1850R</td><td>Rozmiar: 18 G x 5 mm</td></tr><tr><td>Heparyna niefrakcjonowana (UFH)</td><td>Leo Pharma</td><td>585679</td><td></td></tr><tr><td>K3EDTA</td><td>Alfa Aesar 1709958</td><td></td><td>Przygotuj roztwór podstawowy 0,34 M w milliQ H2O</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Nikon</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Broad Institute</td><td>CellProfiler</td><td>Dostępne za darmo pod adresem www.cellprofiler.org</td></tr></tbody></table>

nowatorski model in vitro do badania interakcji między ludzką krwią pełną a śródbłonkiem

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

Większości znanych chorób towarzyszą zaburzenia układu sercowo-naczyniowego. Badania nad złożonością wzajemnie oddziałujących szlaków aktywowanych podczas patologii sercowo-naczyniowych są jednak ograniczone ze względu na brak solidnych i fizjologicznie istotnych metod. W celu modelowania patologicznych zdarzeń naczyniowych opracowaliśmy test in vitro do badania interakcji między śródbłonkiem a krwią pełną. Test składa się z pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka, które mają kontakt z ludzką krwią pełną. Metoda wykorzystuje natywną krew bez antykoagulantu lub z bardzo małą jego ilością, umożliwiając badanie delikatnych interakcji między składnikami molekularnymi i komórkowymi obecnymi w naczyniu krwionośnym.
Zbadaliśmy funkcjonalność testu, porównując aktywację krzepnięcia przez różne objętości krwi inkubowane z ludzkimi komórkami śródbłonka żyły pępowinowej lub bez nich (HUVEC). Podczas gdy większa objętość krwi przyczyniała się do zwiększenia tworzenia kompleksów trombinowo-antytrombinowych (TAT), obecność HUVEC powodowała zmniejszoną aktywację krzepnięcia. Ponadto zastosowaliśmy analizę obrazu przyłączania leukocytów do HUVEC stymulowanego czynnikiem martwicy nowotworu (TNFα) i stwierdziliśmy, że obecność komórek CD16 + jest znacznie wyższa na komórkach stymulowanych TNFα w porównaniu z komórkami niestymulowanymi po kontakcie z krwią. Podsumowując, test może być stosowany do badania patologii naczyniowych, w których interakcje między śródbłonkiem a przedziałem krwi są zaburzone.

Konieczność powlekania CHS
Aby zmierzyć reakcje w krwi pełnej specyficzne dla tych wywoływanych przez komórki śródbłonka, wszystkie materiały użyte do komory z komórkami śródbłonka krwi muszą zostać pokryte warstwą CHS przed użyciem. Rycina 2A (po lewej) przedstawia niepokrywaną komorę po 30 min kontaktu z krwią, w której widoczny jest wyraźny skrzep. Z kolei opracowanie komory za pomocą CHS (Rycina 2A, po prawej) chroni krew przed niekontrolowaną aktywacją, zapewniając, że wyniki wynikają z oddziaływań między komórkami śródbłonka a krwią.
Wpływ objętości krwi w komorze
Aktywacja krzepnięcia jest bardziej prawdopodobna w krwi stojącej, ponieważ zwiększa się prawdopodobieństwo oddziaływania między aktywowanymi czynnikami krzepnięcia. W modelu komory z komórkami śródbłonka naczyniowego krew pozostaje w ruchu dzięki cyrkulacji pęcherzyka powietrza wewnątrz komory. Aby określić wpływ zmian objętości krwi, a tym samym wielkości pęcherzyka powietrza, komorę powleczoną CHS połączono ze szkiełkiem przedmiotowym powleczonym CHS, które testowano z 1,5 ml lub 1,75 ml krwi pełnej przez 30 min. Objętość krwi bez ruchu wywołanego przez pęcherzyk powietrza jest 2,5 raza większa, gdy do komory dodano 1,75 ml krwi, w porównaniu do sytuacji, gdy użyto 1,5 ml krwi (Rysunek 2B). Zmierzone wartości TAT sugerowały zwiększone tworzenie TAT przy zwiększonej objętości krwi (Rysunek 2D). Gdy HUVEC (Rysunek 2C) inkubowano z 1,5 lub 1,75 ml krwi pełnej, nie odnotowano różnicy między obiema grupami, co sugeruje, że komórki śródbłonka mogą modulować aktywację krzepnięcia (Rysunek 2D).
Wpływ TNFα na rekrutację komórek krwi i aktywację krzepnięcia
Aby zbadać wpływ TNFα na rekrutację leukocytów, komórki HUVEC poddano działaniu 20 ng/ml TNFα na 4 h przed kontaktem z krwią. Kontakt z krwią – w ilości 1,5 ml lub 1,75 ml – kontynuowano przez 30 min, po czym szkiełka z hodowlą barwiono pod kątem obecności CD16 (Rycyna 2F), wykonano obrazowanie i ilościowo określono liczbę komórek CD16+. Rekrutacja komórek CD16+ wzrosła znacząco po traktowaniu TNFα (Rycyna 2E) z 100 do 256 komórek CD16+/mm2 (p &lt; 0,0001) przy użyciu 1,5 ml krwi oraz ze 172 do 378 (P &lt; 0,0001) przy użyciu 1,75 ml krwi. Tworzenie kompleksów TAT zmierzono w odpowiadających im próbkach osocza krwi inkubowanej z komórkami traktowanymi TNFα lub nietraktowanymi (Rycyna 2G). Komórki stymulowane TNFα wywołały około dwukrotny wzrost liczby kompleksów TAT w porównaniu z komórkami nietraktowanymi.
<img alt="Odpowiedź HUVEC na CHS i TNFα; schematy, mikroskopia, analiza poziomów TAT i CD16." src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Funkcjonalność modelu komory komórek śródbłonka naczyniowego. (A) Komory z CHS lub bez CHS inkubowano z pełną krwią. Bez CHS po 30 min utworzył się skrzep. Pomiar kompleksów trombiny-antytrombiny (TAT), pośredniego markera krzepnięcia, w krwi inkubowanej bez CHS wyniósł &gt; 6 000 μg/ml. (B) Objętość krwi, która nie jest wprawiana w ruch przez rotującą pęcherzykową warstwę powietrza, zmienia się w zależności od objętości dodanej krwi. Przy dodaniu 1,5 ml krwi objętość ta wynosi 0,3 ml, natomiast przy dodaniu 1,75 ml wzrasta do 0,74 ml. (C) Obrazy HUVEC wykonane za pomocą mikroskopii kontrastowej wykazują typową morfologię komórek śródbłonka w formie konfluencyjnej monowarstwy przed kontaktem z krwią. (D) Wartości TAT dla komór całkowicie pokrytych CHS wykazują niewielką różnicę przy dodaniu różnych objętości krwi. Dodanie 1,5 ml krwi skutkowało poziomem 35 ± 11 μg/ml (n = 7) w porównaniu do 1,75 ml, co skutkowało poziomem 85 ± 70 μg/ml TAT (n = 8). Różnica ta znika, gdy HUVEC są inkubowane z tymi samymi objętościami krwi: 66 ± 55 μg/ml dla 1,5 ml (n = 5) i 66 ± 29 μg/ml dla 1,75 ml (n = 7). (E) Ilościowe oznaczenie liczby komórek CD16+ obecnych na nieustymulowanych lub stymulowanych TNFα HUVEC po kontakcie z krwią. Liczba komórek CD16+ jest znacząco zwiększona w komórkach stymulowanych TNFα inkubowanych z 1,5 ml (bazalnie: 100 ± 40 komórek/mm; TNFα: 256 ± 121 komórek/mm) lub 1,75 ml (bazalnie: 172 ± 67 komórek/mm; TNFα: 378 ± 185 komórek/mm) pełnej krwi. (F) Reprezentatywne obrazy nieustymulowanych i stymulowanych TNFα HUVEC barwionych falloidyną (czerwony), CD16 (zielony) i DAPI (niebieski). Pasek skali = 250 μm. (G) Tworzenie kompleksów TAT jest w przybliżeniu dwukrotnie większe w komórkach stymulowanych TNFα w porównaniu do komórek nieleczonych inkubowanych z krwią (1,5 ml: 2,1 ± 0,1 razy więcej TAT, n = 3; 1,75 ml: 1,7 ± 1,0 razy więcej TAT, n = 4). Wszystkie wartości przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe; wartości p obliczono za pomocą nieparzystych testów t. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Brakuje dostępu do wiarygodnych modeli do badania interakcji naczyniowych krwi u ludzi. Przedstawiamy model in vitro hodowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka w połączeniu z ludzką krwią pełną w celu zbadania interakcji komórkowych zarówno we krwi (ELISA), jak i w przedziale naczyniowym (mikroskopia).

Nowatorski model in vitro do badania interakcji między ludzką krwią pełną a śródbłonkiem

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie interakcji między krwią a komórkami śródbłonka przy użyciu nowego testu komory śródbłonka krwi. Osiąga się to poprzez pobranie krwi od zdrowego ochotnika za pomocą nakłucia żyły w systemie otwartym. W drugim etapie krew jest ostrożnie nakładana na komory krwionośne pokryte powierzchnią heparyny w połączeniu z szkiełkami posianymi do hodowli komórek śródbłonka.Następnie te komory komórek śródbłonka krwi są delikatnie obracane, aby ułatwić interakcję między krwią a komórkami śródbłonka. Ostatecznie interakcje międzykomórkowe między krwią a komórkami śródbłonka i wynikającą z tego produkcję kompleksu trombiny antytrombinowej można ocenić odpowiednio za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej i Elizy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak te wykorzystujące modele zwierzęce, jest to, że tutaj system modelu ludzkiego może być wykorzystany do zbadania choroby naczyniowej przed rozpoczęciem eksperymentu.Połącz igłę podskórną o rozmiarze 18 z kawałkiem silikonowej rurki pokrytej heparyną o średnicy wewnętrznej o średnicy wewnętrznej. Powierzchnie z tworzywa sztucznego są pokryte heparyną, aby zapobiec niespecyficznej aktywacji krzepnięcia. Na przykład na tym zdjęciu w tej niepokrytej komorze wyraźnie widać skrzep.Po 30 minutach kontaktu z krwią, potraktowanie komory powierzchnią heparyny chroni krew przed niekontrolowaną aktywacją, zapewniając, że wyniki są spowodowane interakcjami komórek śródbłonka z krwią. Dopiero po podłączeniu rurki ostrożnie pobrać próbkę krwi od zdrowego dawcy przez nakłucie dożylne w systemie otwartym do 50-mililitrowej probówki pokrytej powierzchniowo heparyną. Uzupełnij pobraną krew niefrakcjonowaną heparyną, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,75 IU na mililitr i odwróć probówkę dwa do trzech razy w celu delikatnego wymieszania.W celu analizy początkowego stężenia białka we krwi, ostrożnie wymieszaj jeden mililitr krwi na probówkę w mikroprobówkach wirówkowych zawierających 30 mikrolitrów 10 milimolowych K trzy EDTA i umieść probówki na lodzie. Następnie użyj końcówki pipety pokrytej powierzchniowo heparyną, aby przenieść 1,5 mililitra krwi do każdej komory komórek śródbłonka krwi pokrytej heparyną, uważając, aby krew płynęła powoli i bez tworzenia pęcherzyków, aby uniknąć aktywacji. Następnie usuń plastikowe ścianki ze szkiełek do hodowli komórek śródbłonka zgodnie z instrukcjami producenta i delikatnie umyj komórki śródbłonka.W przypadku PBS usuwamy jak najwięcej popłuczyny z komórek, nie dopuszczając do wyschnięcia kultur i umieszczamy szkiełka na komorach krwionośnych tak, aby komórki były skierowane w stronę krwi. Następnie za pomocą plastikowych zjeżdżalni dla dodatkowego wsparcia. Aby uniknąć pęknięcia szkiełek do hodowli komórkowych, umieść zacisk wokół każdej komory komórek śródbłonka krwi, aby zabezpieczyć szkiełka.Teraz obracaj komory na obracającym się kole w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza o temperaturze 0,5 G przez 30 minut. Po obróceniu zdemontuj komory komórek śródbłonka krwi, umyj szkiełka hodowli komórkowych w PBS i utrwal komórki w lodowatym 1% paraldehydzie przez 10 minut. Na koniec, w celu oceny stężenia aktywowanego białka krwi, wymieszaj jeden mililitr krwi z każdej komory w mikroprobówkach wirówkowych zawierających 30 mikrolitrów 0,34 mola K trzy EDTA i umieść probówki na lodzie na maksymalnie jedną godzinę.Następnie, po odwirowaniu komórek, przechowuj osocze w nowych mikroprobówkach wirówkowych w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza do czasu dalszej analizy. Aktywacja czynników krzepnięcia jest bardziej prawdopodobna w przypadku zastoju krwi, ponieważ zwiększa się prawdopodobieństwo interakcji między aktywowanymi czynnikami. Rzeczywiście, objętość krwi bez ruchu pęcherzyków powietrza jest dwa i pół razy większa.Gdy do komory dodaje się 1,75 mililitra krwi w porównaniu do 1,5 mililitra krwi, zmierzone wartości antytrombiny trombiny sugerują zwiększone tworzenie antytrombiny przy zwiększonej objętości krwi. Co ciekawe, gdy ve są inkubowane z dowolną objętością krwi pełnej, nie zauważa się różnic między obiema grupami, co sugeruje, że komórki śródbłonka mogą modulować aktywację krzepnięcia w celu zbadania wpływu TNF alfa na rekrutację leukocytów. W tym eksperymencie qve traktowano 20 nanogramami na mililitr TT NF alfa na cztery godziny przed kontaktem z krwią, po czym określono ilościowo liczbę komórek CD 16 dodatnich.Rekrutacja komórek CD 16 dodatnich znacznie wzrosła po leczeniu TNF alfa ze 100 do 256 komórek CD 16 dodatnich na milimetr kwadratowy i 1,5 litra krwi oraz ze 172 do 378 i 1,75 mililitra krwi. Tworzenie kompleksów trombinowo-antytrombinowych mierzono następnie w odpowiednich próbkach osocza z krwi inkubowanej z komórkami traktowanymi TNF alfa lub nietraktowanymi. Zgodnie z oczekiwaniami, komórki stymulowane TNF alfa indukowały przybliżone podwojenie kompleksów trombiny antytrombiny w porównaniu z nieleczonymi kontrolami po jego rozwojeniu.Technika ta umożliwi naukowcom z dziedziny immunologii badanie, uzupełnianie i koagulację w modelu in vitro z wykorzystaniem ludzkich komórek pierwotnych i ludzkiej krwi pełnej.

a-novel-vitro-model-for-studying-interactions-between-human-whole

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano metodę hodowli monowarstwy komórek śródbłonka na całej wewnętrznej powierzchni 3D urządzenia mikrofluidycznego z kanałami o rozmiarze mikro-naczyniowym (&lt;30 μm). Ten model mikro-naczyniowy in vitro umożliwia badanie interakcji biofizycznych między komórkami krwi, komórkami śródbłonka a czynnikami rozpuszczalnymi w chorobach hematologicznych.

Endotelializowane układy mikrofluidyczne do badania oddziaływań naczyniowych w chorobach hematologicznych

Aby zbadać interakcję bakterii z naczyniami krwionośnymi pod wpływem naprężeń ścinających, opisano komorę przepływową oraz model mikroskopii przyżyciowej in vivo, które pozwalają na analizę czynników bakteryjnych i gospodarza przyczyniających się do adhezji naczyniowej.

Model in vitro i in vivo do badania adhezji bakterii do ściany naczynia w warunkach przepływu

Ten protokół replikuje fizjologiczny lub patologiczny przepływ krwi in vitro, aby pomóc w określeniu odpowiedzi komórek w patologiach chorobowych. Wprowadzając komorę tłumiącą ciśnienie za pompą krwi, przepływ krwi przez naczynia krwionośne może zostać ponownie podsumowany i nałożony na monowarstwę śródbłonka naczyniowego lub kokulturę mimetyczną.

In vitro Model fizjologicznego i patologicznego przepływu krwi z zastosowaniem do badań przebudowy komórek naczyniowych

Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zostały wyhodowane do zbiegu w mikroprzepływowym urządzeniu sieciowym. Zilustrowano połączenie komórkowe śródbłonka i rozkład F-aktyny, a zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia i produkcji tlenku azotu w odpowiedzi na adenozynotrójfosforan (ATP) określono ilościowo w czasie rzeczywistym na poszczególnych poziomach komórek.

Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu

Przedstawiamy protokół do badania interakcji między ludzkim śródbłonkiem a perycytami u myszy za pomocą wariantu testu angiogenezy z zatyczką żelową macierzy.

In vivo (in vivo) Badanie interakcji śródbłonka człowieka z perycytami za pomocą testu Matrix Gel Plug u myszy

Prezentujemy model in vitro, który pozwala na badanie i analizę krzepnięcia w pełnej, nieantykoagulowanej krwi. Antykoagulacja w ustroju zależy od naturalnego działania przeciwzakrzepowego zdrowych komórek śródbłonka, a aktywacja komórek śródbłonka spowoduje krzepnięcie.

Ocena właściwości przeciwzakrzepowych i przeciwzapalnych komórek śródbłonka z wykorzystaniem hodowli komórkowej 3D i nieantykoagulowanej krwi pełnej

Ten protokół opisuje kompleksową ocenę hemokompatybilności urządzeń mających kontakt z krwią za pomocą laserowo wycinanych implantów nerwowo-naczyniowych. Model pętli przepływu ze świeżą, heparynizowaną krwią ludzką jest stosowany w celu naśladowania przepływu krwi. Po perfuzji różne markery hematologiczne są analizowane i porównywane z wartościami uzyskanymi bezpośrednio po pobraniu krwi w celu oceny hemokompatybilności badanych urządzeń.

Badanie hemokompatybilności implantów mających kontakt z krwią w modelu pętli przepływu naśladującym przepływ krwi u ludzi

Prezentujemy model choroby naczyniowej in vitro do zbadania interakcji krwi pełnej ze śródbłonkiem pochodzącym od pacjenta. System ten pozwala na badanie właściwości trombogennych pierwotnych komórek śródbłonka w różnych okolicznościach. Metoda ta jest szczególnie przydatna do oceny trombogenności in situ i terapii przeciwzakrzepowej w różnych fazach krzepnięcia.

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

Prezentowany tutaj jest protokół dla ustandaryzowanego modelu pętli hemodynamicznej in vitro. Model ten pozwala na przetestowanie hemokompatybilności probówek perfuzyjnych lub stentów naczyniowych zgodnie z normą ISO (Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna) 10993-4.

Model pętli hemodynamicznej in vitro do badania kompatybilności hemocytologicznej i aktywacji komórek gospodarza naczyniowych wyrobów medycznych

Opisano tutaj prosty proces różnicowania komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, a następnie szczegółowy protokół ich mechanicznej stymulacji. Pozwala to na badanie mechanobiologii rozwojowej komórek śródbłonka. Podejście to jest kompatybilne z dalszymi testami żywych komórek pobranych z chipa hodowlanego po stymulacji mechanicznej.

In vitro Model płodu ludzkiego naczynia na chipie do badania mechanobiologii rozwojowej

Poznaj nowatorski model in vitro do badania interakcji między ludzką krwią pełną a śródbłonkiem. Ta metoda umożliwia ocenę aktywacji koagulacji i rekrutacji leukocytów w warunkach ludzkich.

Nowatorski model in vitro do badania interakcji między ludzką krwią pełną a śródbłonkiem

Przeglądaj więcej filmów