Name: Monitorowanie aktywności PAD4 w oparciu o fluorescencję za pomocą analogu substratu profluorescencyjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj fluorescencyjną metodę pomiaru aktywności PAD4 z wykorzystaniem analogu substratu ZR Co. Technika umożliwia szybkie badanie enzymu w warunkach wysokoprzepustowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Lehigh University Start-up Package. Dziękujemy dr Walterowi Fastowi za dostarczenie plazmidu GST-PAD4 do ekspresji białek.

1. Transformacja, ekspresja i oczyszczanie PAD4
<ol>
	<li>W przypadku transformacji PAD4 przekształć plazmid pGEX zawierający fuzję PAD4 GST w chemicznie kompetentne komórki E. Coli (BL21(DE3)) do ekspresji białka, stosując następującą procedurę. Przygotuj chemicznie kompetentne (chlorek wapnia) komórki E. Coli (BL21(DE3)) zgodnie ze standardowymi protokołami.
	<ol>
		<li>Rozmrozić 50 μl wcześniej przygotowanych chemicznie kompetentnych komórek BL21(DE3) na lodzie i wymieszać z 1 μl plazmidu pGEX zawierającego gen PAD4 w probówce hodowlanej o pojemności 5 ml. Inkubuj mieszaninę na lodzie przez 10 minut, delikatnie wstrząsając co 2 minuty.</li>
		<li>Poddaj komórki szokowi termicznemu, umieszczając mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 40 sekund. Natychmiast umieść mieszaninę komórka-plazmid z powrotem na lodzie na 2 minuty, aby umożliwić komórkom regenerację. Dodaj 1 ml sterylnego bulionu LB do mieszaniny i umieść na lodzie na 1 min.</li>
		<li>Inkubować komórki poddane szokowi cieplnemu w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 250 obr./min przez 1 godzinę. Pobrać pipetą 75 μl przekształconych komórek na płytkę agarową odporną na ampicylinę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 godzin. Przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrażenie PAD4.
	<ol>
		<li>Pobrać 1 kolonię komórek BL21(DE3) z płytki agarowej ampicyliny i umieścić w 5 ml LB zawierającego 1x ampicylinę. Umieścić w inkubatorze i wstrząsnąć O/N w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przenieść 5 ml LB (startera) do 1 l sterylnego LB zawierającego 1x trójwodzian ampicyliny (MW 403,45 g/mol). Umieść wzrost w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 37 °C. Monitoruj OD600 wzrostu. Gdy wzrost osiągnie OD600 równe 0,3, przenieś wzrost do inkubatora z wytrząsaniem o temperaturze 16 °C.</li>
		<li>Po osiągnięciu OD600 0,6 indukuj komórki 0,3 mM izopropylotioagalaktozydu (IPTG, MW 238,30 g/mol). Pozostawić komórki do wstrząsania przez 15 godzin w temperaturze 16 °C.</li>
		<li>Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 000 x g przez 20 minut w temperaturze 0 °C. Odlać supernatant i przechowywać granulki w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie PAD4
	<ol>
		<li>Zawiesić osad zawierający wyrażony PAD4 w komórkach BL21(DE3) w buforze 50 mM NaCl (MW 58,44 g/mol), 300 mM NaH2PO4 (MW 119,98 g/mol), 10 mM Imidazol (MW 68,077 g/mol), 0,1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF, MW 174,94 g/mol) i 1 mM ditiotreitolu (DTT, 154,25 g/mol), pH = 8,0.</li>
		<li>Lizować komórki za pomocą sonikacji przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Po sonikacji odwirować lizat komórkowy przy 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze 0 °C. Odlać i zachować supernatant. Dozować supernatant z kulkami agarozy glutationu (GSH) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Spuścić supernatant z kulek/kolumny GST za pomocą grawitacji. Przepłukać kulki 4 x 25 ml 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH = 8,0) w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Elute PAD4 z 2 x 10 ml buforem elucyjnym, 50 mM tris (hydroksymetylo)aminometan (zasada Tris, MW 121,14 g/mol), 10 mM glutation (GSH, MW 307,32 g/mol), pH = 8,0.</li>
		<li>Zagęścić PAD4 za pomocą odciętych probówek wirówkowych o mocy 100 tys. MW i odwirować przy 4 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Podwielokrotność białka rozprowadzić na 200 μl objętości w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,0 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów podstawowych dla
<ol>
	<li>Odważyć chlorek sodu (NaCl, MW 58,44 g/mol) i przygotować 2 M roztwór. Wymieszaj roztwór, aż będzie klarowny.</li>
	<li>Odważyć tris(hydroksymetylo)aminometan (zasada Tris, MW 121,14 g/mol) i przygotować 2 M roztwór o pH = 8,0. Wymieszaj roztwór, aż będzie klarowny.</li>
	<li>Odważyć dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2 2H2O, MW 147,01 g/mol) i przygotować 500 mM roztwór. Wymieszaj roztwór, aż będzie klarowny.</li>
	<li>Odważyć tris(2-karboksyetylo)fosfinę (TCEP, MW 250,19 g/mol) i przygotować roztwór o stężeniu 200 mM. Wymieszać roztwór do uzyskania klarowności i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Odważyć ditiotreitol (DTT, MW 154,25 g/mol) i przygotować 1 M roztwór. Wymieszać roztwór do uzyskania klarowności i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować 0,5% roztwór Triton X-100.</li>
	<li>Odważyć kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA, MW 292,24 g/mol) i przygotować 100 mM roztwór. Wymieszaj roztwór, aż będzie klarowny.</li>
	<li>Odważyć chlorowodorek Z-Arg-Arg-7-amido-4-metylokoumaryny (ZRcoum, MW 621,69 g/mol) i przygotować 10 mM roztwór w dimetylosulfotlenku (DMSO).</li>
</ol>
3. Test PAD4 w temperaturze 37 °C
<ol>
	<li>Z 10 mM wywaru ZRcoum przygotuj 125 μM roztwór ZRcoum w wodzie. Ten roztwór 125 μM ZRcoum będzie roztworem A.</li>
	<li>Przygotuj bufor 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl2, 6,25 mM DTT i 5 μM PAD4 (pH = 8,0). Będzie to rozwiązanie B.</li>
	<li>Przygotuj bufor 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl2 i 6,25 mM DTT (pH = 8,0). Będzie to rozwiązanie C.</li>
	<li>Odważyć krystaliczną trypsynę (z trzustki bydlęcej) i przygotować 10 mg/ml w 100 mM EDTA. Wymieszać roztwór do uzyskania klarowności i przechowywać w temperaturze -20 °C. Będzie to rozwiązanie D.</li>
	<li>Zaopatrzyć się w płytkę 96-dołkową i wyznaczyć liczbę studzienek kontrolnych (bez PAD4) i studzienek testowych (+ PAD4).</li>
	<li>Odpipetować 160 μl roztworu B do studzienek testowych i pipetować 160 μl roztworu C do studzienek kontrolnych. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Pobrać pipetą 40 μl roztworu A do wszystkich studzienek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut.</li>
	<li>Odpipetować 10 μl dH2O do połowy studzienek kontrolnych i połowy studzienek testowych. Do drugiej połowy studzienek kontrolnych i prób kontrolnych odpipetować 10 μl roztworu D. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Uzyskaj odczyt fluorescencji na czytniku multimodalnym o długości fali wzbudzenia 345 nm i długości fali emisji 465 nm.</li>
</ol>
4. Test PAD4 w RT
<ol>
	<li>Z 10 mM wywaru ZRcoum przygotować 50 μM roztwór ZRcoum w wodzie. Ten roztwór 50 μM ZRcoum będzie roztworem A.</li>
	<li>Przygotuj bufor 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100 i 8 μM PAD4 (pH = 8,0). Będzie to rozwiązanie B.</li>
	<li>Przygotuj bufor składający się ze 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP i 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Będzie to rozwiązanie C.</li>
	<li>Odważyć krystaliczną trypsynę (z trzustki bydlęcej) i przygotować 10 mg/ml w 100 mM EDTA. Wymieszać roztwór do uzyskania klarowności i przechowywać w temperaturze -20 °C. Będzie to rozwiązanie D.</li>
	<li>Zaopatrzyć się w płytkę 384-dołkową i wyznaczyć studzienki kontrolne (bez PAD4) i studzienki testowe (+ PAD4).</li>
	<li>Odpipetować 25 μl roztworu B do studzienek testowych i pipetą 25 μl roztworu C do studzienek kontrolnych. Pozostawić bufor z/bez PAD4 do inkubacji w studzienkach przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pobrać pipetą 25 μl roztworu C do wszystkich studzienek i inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odpipetować 10 μl dH2O do połowy studzienek kontrolnych i połowy studzienek testowych. Do drugiej połowy studzienek kontrolnych i prób kontrolnych odpipetować pipetą 10 μl roztworu D. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Uzyskaj odczyt fluorescencji na czytniku multimodalnym o długości fali wzbudzenia 345 nm i długości fali emisji 465 nm.</li>
</ol>
5. Testy kursu czasowego PAD4 w temperaturze 37 °C i RT
<ol>
	<li>Z 10 mM wywaru ZRcoum przygotuj 125 μM roztwór ZRcoum w wodzie. Ten roztwór 125 μM ZRcoum będzie roztworem A.</li>
	<li>Przygotuj bufor 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl2, 6,25 mM DTT i 5 μM PAD4 (pH = 8,0). Będzie to rozwiązanie B.</li>
	<li>Odważyć krystaliczną trypsynę (z trzustki bydlęcej) i przygotować 10 mg/ml w 100 mM EDTA. Wymieszać roztwór do uzyskania klarowności i przechowywać w temperaturze -20 °C. Będzie to rozwiązanie C.</li>
	<li>Uzyskać 2 płytki 96-dołkowe i odpipetować 160 μl roztworu B do # liczby dołków (# dołków zależy od liczby punktów czasowych).</li>
	<li>Inkubować jedną 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C. Drugą 96-dołkową płytkę inkubować w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odpipetować 40 μl roztworu A do wszystkich studzienek na obu płytkach 96-dołkowych i natychmiast odpipetować 10 μl roztworu C do studzienek t = 0 min. Kontynuuj dodawanie 10 μl roztworu C w określonych punktach czasowych, aż wszystkie studzienki zostaną ugaszone.</li>
	<li>Uzyskaj odczyt fluorescencji na czytniku multimodalnym o długości fali wzbudzenia 345 nm i długości fali emisji 465 nm.</li>
</ol>
6. Test hamowania PAD4 w RT
<ol>
	<li>Z 10 mM wywaru ZRcoum przygotować 83 μM roztwór ZRcoum w wodzie. Ten roztwór 83 μM ZRcoum będzie roztworem A.</li>
	<li>Odważyć Cl-amidynę (MW 424,8 g/mol) i przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 100 μM. Będzie to rozwiązanie B.</li>
	<li>Przygotuj bufor 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100 i 8 μM PAD4 (pH = 8,0). Będzie to rozwiązanie C.</li>
	<li>Przygotuj bufor składający się ze 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP i 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Będzie to rozwiązanie D.</li>
	<li>Odważyć krystaliczną trypsynę (z trzustki bydlęcej) i przygotować 10 mg/ml w 100 mM EDTA. Wymieszać roztwór do uzyskania klarowności i przechowywać w temperaturze -20 °C. Będzie to Rozwiązanie E.</li>
	<li>Zaopatrzyć się w płytkę 384-dołkową i wyznaczyć studzienki kontrolne (bez PAD4), studzienki testowe (+ PAD4) i studzienki inhibicyjne (PAD4 + Cl-amidyna).</li>
	<li>Odpipetować 25 μl roztworu C do studzienek testowych i pipetą 25 μl roztworu D do studzienek kontrolnych. Pozostawić bufor z/bez PAD4 do inkubacji w studzienkach przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pobrać pipetą 10 μl roztworu B do studzienek inhibicyjnych i inkubować przez 20 minut w temperaturze RTe.</li>
	<li>Odpipetować 15 μl roztworu A do wszystkich studzienek i inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odpipetować 10 μl roztworu E do wszystkich studzienek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Uzyskaj odczyt fluorescencji na czytniku multimodalnym o długości fali wzbudzenia 345 nm i długości fali emisji 465 nm.</li>
</ol>
7. Surowy test lizatu komórkowego w RT
<ol>
	<li>Po pobraniu komórek z PAD4 1 L wzrostu, ponownie zawieś komórki w 10 ml 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF, MW 174,94 g/mol) i 1 mM ditiotreitolu (DTT, 154,25 g/mol), pH = 8,0.</li>
	<li>Lizować komórki poprzez sonikację przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować lizat komórkowy przy 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze 0 °C. Zagęścić klarowny supernatant do połowy objętości przez odwirowanie przy 4 000 obr./min w temperaturze 4 °C przy użyciu probówek wirówkowych o mocy 100 tys. MW.</li>
	<li>Z 10 mM wywaru ZRcoum przygotować 250 μM roztwór ZRcoum w wodzie. Ten roztwór 250 μM ZRcoum będzie roztworem A.</li>
	<li>Przygotować bufor 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2 i 2 mM TCEP (pH = 8,0). Będzie to rozwiązanie B.</li>
	<li>Odważyć krystaliczną trypsynę (z trzustki bydlęcej) i przygotować 10 mg/ml w 100 mM EDTA. Wymieszać roztwór do uzyskania klarowności i przechowywać w temperaturze -20 °C. Będzie to rozwiązanie C.</li>
	<li>Uzyskać czarną płytkę 384-dołkową i wyznaczyć studzienki kontrolne (bez lizatu komórkowego) i studzienki testowe (+ lizat komórkowy).</li>
	<li>Odpipetować 100 μl roztworu B do wszystkich studzienek i odpipetować 60 μl lizatu komórkowego do studzienek testowych. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pobrać pipetą 40 μl roztworu A do wszystkich studzienek i inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odpipetować pipetą 10 μl roztworu C do wszystkich studzienek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Uzyskaj odczyt fluorescencji na czytniku multimodalnym o długości fali wzbudzenia 345 nm i długości fali emisji 465 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+protein+language+using+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interpreting the protein language using proteomics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).</li>
<li>Sims, R. J. 3rd, Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+a+code+embedded+in+proteins+that+is+based+on+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).</li>
<li>Pandey, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+to+study+genes+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proteomics to study genes and genomes.</a> Nature. 405, 837-846 (2000).</li>
<li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+language+of+chromatin+regulation+during+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The complex language of chromatin regulation during transcription.</a> Nature. 447, 407-412 (2007).</li>
<li>Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+switches+and+modification+cassettes+in+histone+biology+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond.</a> Nature. 425, 475-479 (2003).</li>
<li>Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+chromatin-binding+modules+interpret+histone+modifications%3A+lessons+from+professional+pocket+pickers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).</li>
<li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reading+protein+modifications+with+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).</li>
<li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403, 41-45 (2000).</li>
<li>Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD%2C+a+growing+family+of+citrullinating+enzymes%3A+genes%2C+features+and+involvement+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease.</a> Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).</li>
<li>Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrullination%3A+a+posttranslational+modification+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Citrullination: a posttranslational modification in health and disease.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).</li>
<li>Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+localization+of+peptidylarginine+deiminase+V+and+histone+deimination+in+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).</li>
<li>Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deimination+of+histone+H2A+and+H4+at+arginine+3+in+HL-60+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes.</a> Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).</li>
<li>Kearney, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+characterization+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+a+transcriptional+corepressor+implicated+in+the+onset+and+progression+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis.</a> Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).</li>
<li>Christophorou, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrullination+regulates+pluripotency+and+histone+H1+binding+to+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin.</a> Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).</li>
<li>Wang, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidylarginine+deiminases+in+citrullination%2C+gene+regulation%2C+health+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).</li>
<li>Trouw, L. A., Mahler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closing+the+serological+gap%3A+promising+novel+biomarkers+for+the+early+diagnosis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun.+Rev%22%5BJournal%5D)">Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis.</a> Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).</li>
<li>Chang, X., Fang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PADI4+and+tumourigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">PADI4 and tumourigenesis.</a> Cancer Cell Int. 10, 7(2010).</li>
<li>Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+peptidylarginine+deiminase+type+4+in+ovarian+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors.</a> Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).</li>
<li>Chang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+pathogenic+role+of+PADI4+in+oesophageal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer.</a> Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+PADI4+cooperates+with+Elk-1+to+activate+c-Fos+expression+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells.</a> PLoS Genet. 7, (2011).</li>
<li>Tanikawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+histone+modification+and+chromatin+structure+by+the+p53-PADI4+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway.</a> Nat. Commun. 3, 676(2012).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+microRNA-16+in+colon+cancer+cells+by+protein+arginine+deiminase+inhibition+causes+a+p53-dependent+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+One%22%5BJournal%5D)">The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest.</a> PLos One. 8, (2013).</li>
<li>Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+deiminase+4+%28PAD4%29%3A+Current+understanding+and+future+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Drug+Discov.+Devel%22%5BJournal%5D)">Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential.</a> Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+p53+target+gene+expression+by+peptidylarginine+deiminase+4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4.</a> Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+peptidylarginine+deiminase+%28PAD%29+inhibitors+regulate+the+autophagy+flux+and+the+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity.</a> J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).</li>
<li>Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+deiminase+4%3A+a+target+for+an+epigenetic+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).</li>
<li>Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluoroacetamidine-based+inactivator+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+design%2C+synthesis%2C+and+in+vitro+and+in+vivo+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).</li>
<li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+and+kinetic+studies+of+PADs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity and kinetic studies of PADs.</a> Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).</li>
<li>Knipp, M., Vasak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+96-well+microtiter+plate+assay+for+the+determination+of+enzymatically+formed+citrulline%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline.</a> Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).</li>
<li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluopol-ABPP+HTS+assay+to+identify+PAD+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors.</a> Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).</li>
<li>Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+citrulline%3A+development+of+a+phenylglyoxal-based+probe+to+visualize+protein+citrullination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).</li>
<li>Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+protein+arginine+deiminase+activity+by+using+fluorescence+quenching%3A+multicolor+visualization+of+citrullination%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).</li>
<li>Jones, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+screening+of+a+haloacetamidine+containing+library+to+identify+PAD4+selective+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors.</a> ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).</li>
<li>Dreyton, C. J., et al. Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).</li>
<li>Shimoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deimination+stabilizes+histone+H2A%2FH2B+dimers+as+revealed+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+functional+and+structural+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym celu z powodzeniem opracowano test oparty na fluorescencji, który monitoruje aktywność PAD4. Test okazał się niezwykle wytrzymały w wielu warunkach wysokiej przepustowości i jest również kompatybilny z lizatami całokomórkowymi37.
Powinowactwo między białkami histonowymi a otaczającymi je niciami DNA rozluźnia się w wyniku neutralizacji ładunku dodatniego w łańcuchu bocznym argininy podczas cytrulinacji. Przewidywano, że neutralizacja łańcucha bocznego argininy może być podobni...

Duża liczba białek ssaków jest silnie modyfikowana przez działanie enzymów po biosyntezie białek przez rybosom. Te modyfikacje potranslacyjne (PTM) mogą znacznie zwiększyć funkcjonalną różnorodność proteomu poprzez zmianę rozmiaru, ładunku, struktury i stanu oligomeryzacji (między innymi) białek1-3. W rezultacie zmiana struktury białka może prowadzić do konsekwencji fizjologicznych, takich jak degradacja białka, różnicowanie komórkowe, sygnalizacja, modulacja ekspresji genów i interakcje białko-białko. Podczas gdy modyfikacje te są powszechne w dużym odsetku wszystkich ludzkich białek, końcowe końce białek histonowych podlegają niezwykle dużej liczbie modyfikacji kowalencyjnych4. Białka histonowe to rodzina białek strukturalnych, które ułatwiają kondensację genomowego DNA. Kowalencyjne modyfikacje nieustrukturyzowanych ogonów histonowych są przeprowadzane i regulowane przez szereg enzymów, które mogą katalizować kowalencyjną modyfikację reszt (pisarzy), odwracać te same modyfikacje (gumki) i rozróżniać zmiany drukowane na ogonach histonów (czytniki)5-7. W rzeczywistości większość znanych PTM można zaobserwować w tym krótkim segmencie histonu, w tym metylację, fosforylację, acetylację, sumoilację, ubikwitynację i cytrulinację8.
Cytrulinacja polega na przemianie peptydylo-argininy w peptydylo-cytrulinę kodowaną przez RNA(Rysunek 1A). Białka odpowiedzialne za neutralizację łańcucha bocznego należą do rodziny białek PAD (p eptide arginine deiminase), z których wszystkie są enzymami zależnymi od wapnia. 9,10. Do tej pory opisano pięciu członków rodziny PAD (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 i PAD6). Wydaje się, że każdy członek tej rodziny celuje w odrębne białka komórkowe, a także wykazuje unikalne profile dystrybucji tkanek. PAD4 jest jedynym członkiem tej rodziny białek, o którym wiadomo, że jest zlokalizowany w jądrze za pomocą sekwencji lokalizacji jądrowej11. W związku z tym wykazano, że iminuje szereg celów jądrowych, w tym łańcuchy boczne argininy na N-końcowych ogonach histonów H2A reszty argininy 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17 i H3R26) i H4 (H4R3)12,13. Podczas gdy każdy z izoenzymów PAD ma specyficzne i krytyczne funkcje fizjologiczne, PAD4 zyskał znacznie więcej uwagi ze względu na jego rolę w wielu procesach zachodzących u ludzi zarówno w chorych, jak i zdrowych komórkach. Niedawno wykazano, że PAD4 jest członkiem sieci transkrypcyjnej pluripotencji14. Wykazano, że zarówno poziomy ekspresji, jak i aktywność PAD4 są podwyższone podczas przeprogramowania i stanów pluripotencjalnych w stanie podstawowym u myszy. Kontrolując regulację genów komórek macierzystych, PAD4 może zachować kluczową rolę w wydajności przeprogramowania komórkowego. PAD4 bierze również udział w tworzeniu zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili, które po związaniu patogenów umożliwiają ich usunięcie z systemu. Hipercytrulinacja białek histonowych przez PAD4 indukuje dekondensację chromatyny, która służy jako materiał bazowy do enkapsulacji bakterii chorobotwórczych przez pułapkę zewnątrzkomórkową, zapobiegając w ten sposób infekcjom bakteryjnym15,16.
Dodatkowo, stwierdzono, że PAD4 odgrywa aktywną rolę w wielu chorobach człowieka. Wcześniej wykazano, że nieprawidłowa ekspresja PAD4 jest związana z wystąpieniem i nasileniem reumatoidalnego zapalenia stawów, choroby Alzheimera, choroby Parkinsona i stwardnienia rozsianego17. W rzeczywistości obecność przeciwciał przeciwko cytrulinowanym białkom jest jednym z najbardziej wiarygodnych i ostatecznych biomarkerów diagnostycznych i prognostycznych. Podobnie, rozregulowaną aktywność PAD4 zaobserwowano ostatnio w wielu nowotworach u ludzi, w tym w raku jajnika, piersi, płuc i przełyku19-22. Wykazano, że związek między PAD4 a rakiem jest pośredniczony przez onkogen ELK1 lub przez białko supresorowe guza p5322,23, a wcześniejsze prace sugerowały, że PAD4 może być nowym przeciwnowotworowym celem terapeutycznym17,24,25. Jako badanie potwierdzające zasadę, wykazano, że wyczerpanie PAD4 poprzez shRNA w linii komórkowej raka jelita grubego HCT116 jest wystarczające do wywołania apoptozy i zatrzymania cyklu komórkowego26. Niedawno opracowany nieodwracalny inhibitor PAD4 doprowadził do siedemdziesięcioprocentowego zmniejszenia masy guza u myszy27. Co ciekawe, hamowanie PAD4 wydawało się działać jak terapia celowana, która skutkowała selektywnym zabijaniem komórek rakowych przy jednoczesnym oszczędzaniu komórek nieprzekształconych.
Użycie małych cząsteczek do wyłączenia funkcji PAD4 może okazać się potężną nową strategią do celowania w komórki rakowe lub do wzmocnienia istniejących chemioterapeutyków przeciwnowotworowych28. Niestety, silny odwracalny inhibitor PAD4 nie został jeszcze odkryty. Wiele inhibitorów kowalencyjnych zostało opracowanych przy użyciu uchwytu chloro/fluoroimidynowego, który naśladuje substrat argininy27,29,30 i okazał się praktycznym narzędziem w zrozumieniu roli PAD4 zarówno w zdrowych, jak i chorych komórkach. Jednak cząsteczki te hamują wszystkie aktywne PAD o podobnej sile. Dlatego kluczowe znaczenie ma łatwy test, który informuje o aktywności PAD4. Do tej pory opisano testy PAD4, które łączą uwalnianie amoniaku z reakcji z odczytem kolorymetrycznym31, wykorzystują fluorescencyjnie znakowany analog substratu chloroamidyny do testu polaryzacji fluorescencji32, opierają się na reakcji wspomaganej kwasem między glioksalem a cytruliną33 i łączą aktywność PAD4 z etapem wygaszania fluorescencji34. Spośród nich tylko strategia haloacetamidyny z modyfikatorem kowalencyjnym okazała się kompatybilna z wysokoprzepustowymi platformami przesiewowymi32,35,36. Opisujemy łatwy test oparty na fluorescencji, który wiarygodnie mierzy aktywność PAD4. Test, który wykazuje silny stosunek sygnału do szumu, szybkość analizy i solidność pomiaru, ma potencjał do odkrycia naprawdę silnego i selektywnego inhibitora PAD4.

<table><tbody><tr><td>LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)</td><td>Amresco</td><td>J106-2KG</td><<td>a href="http://www.amresco-inc.com/">http://www.amresco-inc.com</a></td></tr><tr><td>Ampicylina trójwodzian (białawy proszek), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP902-25&nbsp;</td><td><a href="http://www.fishersci.com/">http://www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Izopropylotioagalakton (IPTG)</td><td>Life Technogolies</td><td>15529-019</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td></tr><tr><td>Wszystkie sole buforowe&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Można kupić od Fisher Scieintifc; Firma VWR; Akros; Sigma-Aldrich; itd.</td></tr><tr><td>Protino Glutation (GSH) agaroza&nbsp;</td><td>Machery-Nagel</td><td>745500.10</td><td>Sklep pod adresem 4 &deg; C; http://www.mn-net.com/</td></tr> <tr><td>Chloroamidyna&nbsp;</td><td>Chemikalia na Kajmanach&nbsp;</td><td>10599</td><td>Przechowywać przy -20 &deg; C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Płytki MicroWell Corning/Nunclon (96 i 384)</td><td></td><td></td><td>Zakup od Corning; Oprogramowanie</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>czytnika mikropłytek Sigma-Aldrich Tecan Infinite 200 / Tecan i-control</td><td><a href="http://www.tecan.com/">www.tecan.com</a></td></tr><tr><td>Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/">http://www.perkinelmer.com</a></td></tr></tbody></table>

monitorowanie aktywności pad4 w oparciu o fluorescencję za pomocą analogu substratu profluorescencyjnego

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Modyfikacje potranslacyjne mogą prowadzić do zmiany stanów funkcjonalnych białek poprzez zwiększenie kowalencyjnych zmian w łańcuchach bocznych wielu substratów białkowych. Ogony histonowe reprezentują jeden z najsilniej zmodyfikowanych odcinków we wszystkich ludzkich białkach. Wykazano, że deiminaza peptydylo-argininowa 4 (PAD4) przekształca reszty argininy w niekodowaną genetycznie resztę cytruliny. Niewiele opisanych do tej pory testów było operacyjnie łatwych z zadowalającą czułością. Tak więc brak odpowiednich testów prawdopodobnie przyczynił się do braku silnych niekowalencyjnych inhibitorów PAD4. W artykule opisano nowatorski test oparty na fluorescencji, który pozwala na monitorowanie aktywności PAD4. Zaprojektowano analog substratu profluorescencyjnego, aby powiązać aktywność enzymatyczną PAD4 z uwalnianiem fluorescencji po dodaniu proteazy trypsyny. Wykazano, że test jest kompatybilny z wysokoprzepustowymi warunkami przesiewowymi i ma silny stosunek sygnału do szumu. Ponadto test można również wykonać z surowymi lizatami komórkowymi zawierającymi nadmierną ekspresję PAD4.

Wstępnie wykazano, że ZRcoum może służyć do raportowania aktywności PAD4 w formacie płytek 96-dołkowych. Do dołków dodano substrat ZRcoum w obecności lub przy braku PAD4. Po 45-minutowej inkubacji w temperaturze 37 °C zmierzono fluorescencję przy użyciu filtra 340/40 – 475/15 nm (Rysunek 2A). Zgodnie z oczekiwaniami, poziomy fluorescencji pozostały niskie, ponieważ fluorofor w obrębie ZRcoum (lub cytrulinowanego ZRcoum) pozostał w stanie...

PAD4 to enzym odpowiedzialny za konwersję peptydylo-argininy do peptydylo-cytruliny. Rozregulowanie PAD4 jest związane z wieloma chorobami u ludzi. Opisano łatwy i wysokoprzepustowy, kompatybilny test PAD4 oparty na fluorescencji.

Monitorowanie aktywności PAD4 w oparciu o fluorescencję za pomocą analogu substratu profluorescencyjnego

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest uzyskanie ilościowych informacji na temat poziomu aktywności podkładki czwartej w łatwym do odtworzenia teście wykorzystującym fluorescencję. Osiąga się to poprzez inkubację podkładki czwartej z analogiem substratu projektowego ZR Co. Białko jest inkubowane w temperaturze pokojowej lub 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić konwersję pochodnej argininy do produktu cytroliny, co powoduje kowalencyjną modyfikację substratu. Następnie do roztworu dodaje się trypsynę w celu wytworzenia różnicy sygnału fluorescencyjnego.Wyniki wskazują, że dodanie aktywnej podkładki czwartej do roztworu zawierającego prof. Substrat fluorescencyjny prowadzi do zmiany kowalencyjnej opartej na jego zmniejszonej podatności na trypsynę, a tym samym na niższe sygnały fluorescencyjne. Główną przewagą naszej techniki nad istniejącymi technikami, takimi jak ta, która dotyczy uwalniania lotnego produktu ubocznego amoniaku, jest to, że monitorujemy modyfikację podłoża za pomocą fluorescencji.Tę technikę zademonstrują Mary Saki i Jonathan Fiera z mojego laboratorium: Aby pracować z podkładką czwartą, najpierw przekształć plazmid pgx zawierający fuzję pad 4G ST w chemicznie kompetentne komórki E. coli w celu ekspresji białka podkładki czwartej wszystkie komórki na lodzie. Po drugie, wymieszaj trzecie komórki z jednym mikrolitrem plazmidu PGX zawierającego gen podkładki czwartej w pięciomililitrowej probówce hodowlanej. Inkubuj mieszaninę na lodzie przez 10 minut i delikatnie potrząsaj nią co dwie minuty.Następnie każdy z nich wstrząsa komórkami w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 40 sekund. Natychmiast po tym zasznuruj mieszaninę plazmidów komórkowych z powrotem na lodzie na dwie minuty, aby komórki mogły się zregenerować. Teraz dodaj jeden mililitr sterylnego LB i utrzymuj komórki schłodzone przez kolejną minutę.Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji należy je wprawić w drżenie z prędkością 250 obr./min, odpipetować 75 mikrolitrów przekształconych komórek na płytkę agarową odporną na ampicylinę i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 godzin. Przechowuj tę płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przenieś kolonię komórek transformujących do pięciu mililitrów LB zawierających ampicylinę. Umieść probówkę w inkubatorze i wstrząśnij przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia.Przenieś pięciomililitrową kulturę starterową do litra STO L LB zawierającego jeden x ampicylina tri. Monitoruj OD 600 komórek, gdy rosną w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy ich absorbancja osiągnie 0,3.Przenieść kolbę do pomieszczenia o temperaturze 16 stopni Celsjusza i kontynuować wstrząsanie. Monitoruj OD wzrostu. Gdy OD kultury osiągnie 0,6.Indukuj komórki za pomocą 0,3 milimolowego izopropylu THAG GTO. Pozwól komórkom wstrząsnąć przez 15 godzin w temperaturze 16 stopni Celsjusza. Ważne jest, aby upewnić się, że temperatura wzrostu wynosi 16 stopni Celsjusza przed rozpoczęciem indukcji za pomocą IPTG.Następnego dnia podaje się komórki przez odwirowanie w stężeniu 4 000 G przez 20 minut w temperaturze zero stopni Celsjusza lub bez środka SUP i przechowuje osad komórkowy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu zebrania podkładki. Cztery białka ponownie zawieszają osad komórki transformacyjnej w buforze zawierającym fenol EOL, fluorek metylu suenu i etol dihi-trzy. Następnie komórki za pomocą sonikacji przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, po sonikacji odwirowują lizaty w temperaturze 20 000 razy G przez 20 minut i w temperaturze zero stopni Celsjusza.Zbierz supinat i inkubuj je z kulkami glutationu aeros przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odcedzić supinat z kulek GST grawitacyjnie po zebraniu przepływu. Umyj koraliki cztery razy 25 mililitrami PBS w czterech stopniach Celsjusza.Następnie wymyj białko czwartej podkładki z kulek za pomocą 10 mililitrów buforu buforowego elucian koncentrat podkładki czwartej w buforze elucjańskim za pomocą probówek wirówkowych o masie cząsteczkowej 100 K. Na koniec Eloqua oczyszczona podkładka zawiera cztery białka w objętości 200 mikrolitrów do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Do tej procedury przygotuj 83 mikromolowy roztwór roboczy roztworu znakowanego ZR co A. Przygotuj również roztwory B, D i roztwór roztworu z podkładki czterech, C.In przygotowaniu roztworu E, pamiętaj o mieszaniu, aż TRIPSIN się rozpuści.Zaopatrzyć się w płytkę 384-dołkową i oznaczyć notatnik, cztery studzienki kontrolne, studzienki testowe i studzienki inhibicyjne dla podkładki czwartej oraz chloroamadyny. Następnie dodać 25 mikrolitrów roztworu C do każdej studzienki testowej i 25 mikrolitrów D do każdej kontroli. Dobrze inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Po 20 minutach dodaj 10 mikrolitrów roztworu B do studzienek inhibicyjnych i odczekaj jeszcze 20 minut. Następnie dodaj 15 mikrolitrów roztworu A do wszystkich studzienek. Następnie odczekaj 45 minut.Po 45 minutach dodaj 10 mikrolitrów roztworu E do wszystkich studzienek i odczekaj jeszcze 10 minut przed wykonaniem pomiarów fluorescencji. Na koniec użyj czytnika multimodalnego, aby zebrać dane dotyczące emisji. Zar CO inkubowano z podkładką czwartą i bez podkładki czwartej przez 45 minut bez podkładki czwartej, dodanie tripyny bez tripyny, poziom fluoru i fluorescencji wzrasta, a obecność podkładki czwartej zar jest modyfikowana, a trypsyna nie uwalnia fluoru, zmniejszając w ten sposób fluorescencję.Test przetestowano na płytkach studzienkowych o dużej gęstości w temperaturze pokojowej, aby dostosować się do procedur przesiewowych o wysokiej przepustowości w temperaturze pokojowej. Sygnały były praktycznie niezmienione w porównaniu do tych uzyskiwanych w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Reakcja przebiegała wolniej w temperaturze pokojowej.Został on ukończony w ciągu 45 minut. Stabilność czwórki PED w buforze reakcyjnym została następnie przetestowana jako wysoka stabilność jako ważna dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych przez okres 15 godzin. Nie stwierdzono utraty aktywności enzymatycznej.Hamowanie PLA 4 za pomocą chloro AMADINE wykazuje oczekiwane trendy w tych warunkach testowych w temperaturze pokojowej. Aby podważyć solidność testu PAD four zku, wykorzystano go do przetestowania surowego lizatu komórkowego komórek E. coli wykazujących ekspresję GST pad four. Podczas testowania w tych samych warunkach, co oczyszczona podkładka GST, zaobserwowano fluorescencję czwartą, zgodnie z oczekiwaniami.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyrażać aktywną podkładkę czwartą i monitorować jej aktywność za pomocą tego łatwego i niezawodnego testu opartego na fluorescencji przy użyciu substratu fluorescencyjnego prof.

fluorescence-based-monitoring-pad4-activity-via-pro-fluorescence

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opiszemy metodę służącą do pomiaru kinetyki transportu jonów przez białka błonowe wraz z analizą zmian konformacyjnych w konkretnych miejscach z wykorzystaniem fluorescencji w pojedynczych komórkach. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku kanałów jonowych, transporterów i pomp jonowych, a także może być wykorzystana do określenia ograniczeń odległości między podjednostkami białek.

Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Mikroskopia oparta na transferze energii fluorescencji (FRET) jest potężną techniką monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach z wykorzystaniem różnych biosensorów jako reporterów. W niniejszej pracy opisujemy sposób budowy spersonalizowanego systemu obrazowania FRET w epifluorescencji z komponentów dostępnych w handlu oraz sposób jego wykorzystania w eksperymentach FRET.

Mikroskopia FRET do monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach przy użyciu unimolekularnych biosensorów

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

W sercu, zdarzenia molekularne koordynują funkcję elektryczną i kurczliwą narządu. Zaprezentowany tu zestaw technik mikroskopii fluorescencyjnej pola lokalnego umożliwia rejestrację zmiennych komórkowych w nienaruszonych sercach. Identyfikacja mechanizmów definiujących czynność serca ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, jak serce działa w sytuacjach patologicznych.

Mikroskopia fluorescencyjna w polu lokalnym: obrazowanie sygnałów komórkowych w nienaruszonych sercach

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Tutaj opisujemy wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji, który mierzy skuteczność uszczelniania błony plazmatycznej za pomocą analiz fluorometrycznych i obrazowych w żywych komórkach. Test ten może być stosowany do badań przesiewowych leków lub genów docelowych, które regulują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej w komórkach ssaków.

Wysokoprzepustowy pomiar skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków

Aktywacja wielofunkcyjnej kinazy Ser/Thr AURKA jest charakterystyczna dla jej autofosforylacji na Thr288. Sondy fluorescencyjne polegające na FRET mogą rozróżniać między jego stanem nieaktywnym i aktywowanym. Tutaj ilustrujemy niektóre strategie inżynierii sondy, wraz z szybkim protokołem FRET, aby śledzić aktywację kinazy przez cały czas trwania mitozy.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywacji kinazy A zorzy polarnej za pomocą konformacyjnych biosensorów FRET w żywych komórkach

Obecny protokół opisuje przygotowanie próbki i analizę danych w celu ilościowego określenia fosforylacji białek za pomocą ulepszonego testu ściągania pojedynczych cząsteczek (SiMPull).

Zoptymalizowany test typu pull-down dla pojedynczych cząsteczek do ilościowego oznaczania fosforylacji białek

Protokół przedstawiony w tym badaniu ilustruje skuteczność detektora różnic cAMP In Situ w pomiarze cAMP za pomocą dwóch metod. Jedna z metod wykorzystuje 96-dołkowy spektrofotometr do odczytu płytek z ogniwami HEK-293. Druga metoda polega na demonstracji pojedynczych komórek HASM pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Dynamika cAMP w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu fluorescencyjnego detektora różnic cAMP in situ

Poznaj fluorescencyjną metodę pomiaru aktywności PAD4 z wykorzystaniem analogu substratu ZR Co. Technika umożliwia szybkie badanie enzymu w warunkach wysokoprzepustowych.

Monitorowanie aktywności PAD4 w oparciu o fluorescencję za pomocą analogu substratu profluorescencyjnego

Przeglądaj więcej filmów