Name: Mikroskopia elektronowa wysokiej rozdzielczości systemu wydzielania Helicobacter pylori Cag typu IV pili wytwarzanego w różnych warunkach dostępności żelaza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji systemu wydzielania Cag-T4SS w bakterii Helicobacter pylori przy użyciu wysokorozdzielczej mikroskopii elektronowej. Technika ta pozwala badać wpływ dostępności żelaza na produkcję pili i mechanizmy chorobotwórcze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Departament Spraw Weteranów Career Development Award 1IK2BX001701 oraz nagrodę CTSA UL1TR000445 od National Center for Advancing Translational Sciences. Wyłączną odpowiedzialność za jego treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Center for Advancing Translational Sciences lub National Institutes of Health. Eksperymenty ze skaningową mikroskopią elektronową przeprowadzono częściowo dzięki wykorzystaniu wspólnego zasobu VUMC Cell Imaging Shared Resource, wspieranego przez granty NIH CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 i EY08126.

1. Wzrost H. pylori w różnych warunkach dostępności żelaza i współkultury z ludzkimi komórkami nabłonka żołądka
<ol>
	<li>Do tych badań należy wybrać szczep PMSS1 H. pylori, ponieważ ma on nienaruszoną wyspę patogenności cag i wyraża funkcjonujący system wydzielania typu IV. Wykorzystać również izogeniczny mutant cagE (PMSSI ΔcagE) jako kontrolę negatywną. Hoduj bakterie na płytkach TSA uzupełnionych 5% krwią owczą (płytki agarowe z krwią) przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2, 
	UWAGA: Przygotuj odczynniki i zbierz materiały zgodnie z opisem w Tabeli materiałów i sprzętu. Końcowe stężenia dla każdego odczynnika są podane w nawiasach.</li>
	<li>Zeskrobać bakterie z płytki za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką i zaszczepić w zmodyfikowanym bulionie z brucelozy przygotowanym ze składników (patrz Tabela Materiałów i Sprzętu) i uzupełnionym cholesterolem. Inkubować kultury przez noc w temperaturze 37 °C w powietrzu wypełniającym 5% CO2 z wytrząsaniem przy 200 obrotach na minutę (obr./min). 
	UWAGA: Cholesterol stosuje się zamiast płodowej surowicy bydlęcej ze względu na fakt, że surowica jest złożona; Zawiera liczne źródła składników odżywczych żelaza, takich jak hem, który powoduje zmienność wyników.</li>
	<li>W dniu hodowli bakteryjnej wysiewaj ludzkie komórki nabłonka żołądka AGS (ATCC CRL-1739) na szkiełka nakrywkowe traktowane poli-D-lizyną w 12-dołkowych płytkach (około 1 x 105 komórek na dołek).</li>
	<li>Następnego dnia rozcieńczyć kultury bakteryjne do OD600 0,3 w zmodyfikowanym bulionie z brucelozy samodzielnie lub uzupełnionym 100 μM FeCl3, 200 μM dipirydylu (syntetyczny chelator żelaza) lub 200 μM dipirydylu plus 250 μM FeCl3. Inkubować te kultury przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w powietrzu wypełniającym 5% CO2 z wytrząsaniem przy 200 obr./min.</li>
	<li>Odwirować bakterie przy 1,000 x g w celu zebrania komórek i usunięcia supernatantów przed ponownym zawieszeniem w równej objętości świeżego zmodyfikowanego bulionu z brucelozy uzupełnionego cholesterolem. Zmierz OD600 w hodowli (OD600 = 1,0 = 5,5 x 108 komórek/ml) i dodaj bakterie do komórek nabłonka w wielokrotności infekcji (MOI) 20:1. Wykonaj seryjne rozcieńczenia i umieść komórki bakteryjne na płytkach agaru z krwią, aby ocenić żywotność komórek bakteryjnych.</li>
	<li>Inkubować kohodowle ludzkich komórek nabłonka żołądka H. pylori i AGS przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 w warunkach statycznych przed wykonaniem przygotowania próbki za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM).</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki SEM do wizualizacji H. pylori Cag-T4SS Pili
<ol>
	<li>Usunąć kokultury H. pylori i AGS z inkubatora i zdekantować supernatant kultur (z wyjątkiem testu IL-8 ELISA). Delikatnie przemyć trzy razy 0,05 M buforem kakodylanu sodu (pH 7,4). Utrwalaj próbki przez 2-4 godziny w temperaturze pokojowej w roztworze 2,0% paraformaldehydu, 2,5% aldehydu gluterowego i 0,05 M buforu kakodylanu sodu. Po utrwaleniu pierwotnym przepłukać próbki trzykrotnie 0,05 M buforem kakodylanu sodu.</li>
	<li>Wykonać wtórne utrwalanie przy użyciu 0,1% tetratlenku osmu w 0,05 M buforze kakodylanu sodu w dwóch sekwencyjnych 10-minutowych etapach utrwalania. Po wtórnym utrwaleniu próbki należy trzykrotnie przepłukać 0,05 M buforem kakodylanu sodu.</li>
	<li>Po pierwotnym i wtórnym utrwaleniu próbki należy odwodnić przez sekwencyjne przemywanie rosnącym stężeniem etanolu, zgodnie z tabelą 1.</li>
	<li>Po odwodnieniu etanolu wykonaj trzy sekwencyjne płukanie ciekłym dwutlenkiem węgla. Następnie wysuszyć próbki w punkcie krytycznym za pomocą suszarki do punktu krytycznego w temperaturze 31,1 ºC i ciśnieniu 1073 PSI.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na aluminiowych klockach próbki SEM i pomaluj cienką linią srebra koloidalnego na krawędzi próbki, aby uzyskać odpowiednie uziemienie i uniknąć ładowania podczas obrazowania SEM.</li>
	<li>Pokryj próbki 5 nm złotem-palladem za pomocą maszyny do napylania w celu zwiększenia sygnału elektronów wtórnych próbki i efektu krawędzi.</li>
</ol>
3. Parametry obrazowania dla analiz SEM o wysokiej rozdzielczości
<ol>
	<li>Przeglądaj próbki za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z emisją polową (FEG-SEM).</li>
	<li>Obraz w trybie wysokiej próżni w odległości roboczej 5-10 mm.</li>
	<li>Ustawić napięcie przyspieszające na 5 kV.</li>
	<li>Ustaw rozmiar plamki na 2-2,5.</li>
	<li>Przechyl próbkę w zakresie 15-25 stopni, aby uzyskać lepszy widok na granicę faz gospodarz-patogen</li>.
	<li>Priorytetowo należy traktować obrazowanie bakterii przylegających do krawędzi komórek nabłonka w celu oglądania w dużym powiększeniu, ponieważ te obszary interakcji gospodarz-patogen są wzbogacone o bakterie tworzące pilusy.</li>
</ol>
4. Analizy statystyczne do oceny kwantyfikacji pili
<ol>
	<li>Analizuj pili H. pylori Cag-T4SS za pomocą oprogramowania ImageJ, aby określić ilościowo liczbę pilusów / komórkę, a także procent komórek wykazujących fenotyp piliowany zgodnie z poniższymi instrukcjami.</li>
	<li>Otwórz pliki z mikrografami w oprogramowaniu ImageJ. Zidentyfikuj pilusy jako struktury utworzone między komórką bakteryjną a komórką gospodarza, o jednolitej szerokości (10-13 nm) i długości (60-150 nm). 
	UWAGA: Struktura pilusa jest obecna w szczepach bakteryjnych WT, ale nieobecna w szczepach izogenicznych, takich jak zmutowane szczepy ΔcagE, które zawierają inaktywację w genie kodującym główną ATPazę, która napędza zespół pilusa wydzielania typu IV.</li>
	<li>Skalibruj narzędzie pomiarowe, rysując linię za pomocą narzędzia do linii prostej, a następnie klikając zakładkę "Analizuj". Wybierz "Ustaw skalę" z menu rozwijanego i wprowadź wartość paska powiększenia w polu oznaczonym "Znana odległość" i ustaw jednostkę długości na odpowiednie ustawienie (nm). Kliknij "OK".</li>
	<li>Zmierz pilusy Cag-T4SS za pomocą narzędzia linii prostej, aby narysować na długości lub szerokości pilusa, a następnie naciśnij "Ctrl-M", aby zmierzyć każdy pilus. Obserwuj okno dialogowe z zmierzonymi wartościami. Zapisz te wartości lub skopiuj i wklej do programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych.</li>
	<li>Użyj wcześniej ustalonych parametrów długości i szerokości24, zignoruj cechy, które nie pasują do profilu Cag-T4SS. Następnie określ ilościowo liczbę pilusów na podstawie wartości, które mieszczą się w granicach szerokości 10-13 nm i długości 60-150 nm.</li>
	<li>Przeanalizuj ilościowo pilusy statystycznie za pomocą dwustronnego testu t Studenta za pomocą oprogramowania GraphPad Prism.</li>
</ol>
5. Opcjonalnie: Ocena wydzielania IL-8 pod kątem korelacji z produkcją pilusa
<ol>
	<li>Używając supernatantów z kroku 2.1, wykonaj test ELISA IL-8 zgodnie z instrukcjami producenta dołączonymi do zestawu (patrz tabela materiałów i wyposażenia).</li>
	<li>Przeanalizuj IL-8 wydzielaną przez komórki gospodarza i oblicz procentową indukcję IL-8 w odniesieniu do WT PMSS1 hodowanego w samym pożywce. Wykonuj analizę statystyczną za pomocą dwustronnego testu t Studenta przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism.</li>
</ol>

<ol><li>Cover, T. L., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori in health and disease.</a> Gastroenterology. (6), 1863-1873 (2009).</li>
<li>Sycuro, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+crosslinking+relaxation+promotes+Helicobacter+pylori%27s+helical+shape+and+stomach+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan crosslinking relaxation promotes Helicobacter pylori's helical shape and stomach colonization.</a> Cell. 141 (5), 822-833 (2010).</li>
<li>Kodaman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Helicobacter+pylori+coevolution+shapes+the+risk+of+gastric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human and Helicobacter pylori coevolution shapes the risk of gastric disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (4), 1455-1460 (2014).</li>
<li>Tegtmeyer, N., Wessler, S., Backert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cag-pathogenicity+island+encoded+type+IV+secretion+system+in+Helicobacter+pylori+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Role of the cag-pathogenicity island encoded type IV secretion system in Helicobacter pylori pathogenesis.</a> FEBS J. 278 (8), 1190-1202 (2011).</li>
<li>Fischer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+molecular+mode+of+action+of+the+Helicobacter+pylori+Cag+type+IV+secretion+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Assembly and molecular mode of action of the Helicobacter pylori Cag type IV secretion apparatus.</a> FEBS J. 278 (8), 1203-1212 (2011).</li>
<li>Odenbreit, S., Puls, J., Sedlmaier, B., Gerland, E., Fischer, W., Haas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+Helicobacter+pylori+CagA+into+gastric+epithelial+cells+by+type+IV+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translocation of Helicobacter pylori CagA into gastric epithelial cells by type IV secretion.</a> Science. 287 (5457), 1497-1500 (2000).</li>
<li>Bourzac, K., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori-host+cell+interactions+mediated+by+type+IV+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori-host cell interactions mediated by type IV secretion.</a> Cell Microbiol. 7 (7), 911-919 (2005).</li>
<li>Bronte-Tinkew, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+cytoxin-associated+gene+A+activates+the+signal+transducer+and+activator+of+transcription+3+pathway+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori cytoxin-associated gene A activates the signal transducer and activator of transcription 3 pathway in vitro and in vivo.</a> Cancer Res. 69 (2), 632-639 (2009).</li>
<li>Johnson, E. M., Gaddy, J. A., Cover, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+Helicobacter+pylori+triggered+by+contact+with+gastric+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell.+Infect.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Alterations in Helicobacter pylori triggered by contact with gastric epithelial cells.</a> Front. Cell. Infect. Microbiol. (2), 17(2012).</li>
<li>Rohde, M., Puls, J., Buhrdorf, R., Fischer, W., Haas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+sheathed+surface+organelle+of+the+Helicobacter+pylori+cag+type+IV+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel sheathed surface organelle of the Helicobacter pylori cag type IV secretion system.</a> Mol. Microbiol. 49 (1), 219-234 (2003).</li>
<li>Cover, T. L., Peek, R. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet%2C+microbial+virulence+and+Helicobacter+pylori+induced+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Diet, microbial virulence and Helicobacter pylori induced gastric cancer.</a> Gut Microbes. 4 (6), 482-493 (2013).</li>
<li>Queiroz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+gastric+IL-1%CE%B2+concentration+and+iron+deficiency+parameters+in+Helicobacter+pylori+infected+children%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased gastric IL-1β concentration and iron deficiency parameters in Helicobacter pylori infected children.</a> PLoS One. 8 (2), 57420(2013).</li>
<li>Harris, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori-associated+hypochlorhydria+and+development+of+iron+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori-associated hypochlorhydria and development of iron deficiency.</a> J. Clin. Pathol. 66 (4), 343-347 (2013).</li>
<li>Noto, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+deficiency+accelerates+Helicobacter+pylori-induced+carcinogenesis+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Iron deficiency accelerates Helicobacter pylori-induced carcinogenesis in rodents and humans.</a> J. Clin. Invest. 123 (1), 479-492 (2013).</li>
<li>Tan, S., Noto, J. M., Romero-Gallo, J., Peek, R. M. Jr, Amieva, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+perturbs+iron+trafficking+in+the+epithelium+to+grow+on+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori perturbs iron trafficking in the epithelium to grow on the cell surface.</a> PLoS Pathog. 7 (5), (2011).</li>
<li>Danielli, A., Roncarati, D., Delany, I., Chiarini, V., Rappouli, R., Scarlato, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dissection+of+the+Helicobacter+pylori+Fur+regulatory+circuit+by+genome-wide+location+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">In vivo dissection of the Helicobacter pylori Fur regulatory circuit by genome-wide location analysis.</a> J. Bacteriol. 188 (13), 4654-4662 (2006).</li>
<li>Pich, O. Q., Carpenter, B. M., Gilbreath, J. J., Merrell, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+Helicobacter+pylori+Fur-regulated+promoters+reveals+a+Fur+box+core+sequence+and+novel+Fur-regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of Helicobacter pylori Fur-regulated promoters reveals a Fur box core sequence and novel Fur-regulated genes.</a> Mol. Microbiol. 84 (5), 921-941 (2012).</li>
<li>Cassat, J. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+in+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Iron in infection and immunity.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).</li>
<li>Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions+in+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions in urinary tract infection.</a> Nat. Rev. Urol. 7 (8), 430-441 (2010).</li>
<li>Brickman, T. J., Cummings, C. A., Liew, S. Y., Relman, D. A., Armstrong, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+iron+starvation+response+in+Bordatella+pertussis+provides+new+insights+into+siderophore+utilization+and+virulence+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the iron starvation response in Bordatella pertussis provides new insights into siderophore utilization and virulence gene expression.</a> J. Bacteriol. 193 (18), 4798-4812 (2011).</li>
<li>Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+factors+associated+with+disease+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori factors associated with disease development.</a> Gastroenterology. 113 (6), 21-28 (1997).</li>
<li>Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+requirements+and+antibiotic+resistance+patterns+of+Helicobacter+species+in+chemically+defined%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined.</a> J. Clin. Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).</li>
<li>Senkovich, O., Ceaser, S., McGee, D. J., Testerman, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+host+iron+utilization+mechanisms+of+Helicobacter+pylori+revealed+with+iron-deficient+chemically+defined+media%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Unique host iron utilization mechanisms of Helicobacter pylori revealed with iron-deficient chemically defined media.</a> Infect. Immun. 78 (5), 1841-1849 (2010).</li>
<li>Shaffer, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+exploits+a+unique+repertoire+of+type+IV+secretion+system+components+for+pilus+assembly+at+the+bacteria-host+cell+interface%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori exploits a unique repertoire of type IV secretion system components for pilus assembly at the bacteria-host cell interface.</a> PLoS Pathog. 7 (9), (2011).</li>
<li>Barrozo, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+plasticity+in+the+type+IV+secretion+system+of+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Functional plasticity in the type IV secretion system of Helicobacter pylori.</a> PLoS Pathog. 9 (2), (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Żelazo jest niezbędnym mikroelementem dla większości form życia, w tym patogenów bakteryjnych. W celu ograniczenia żywotności inwazyjnych mikroorganizmów, kręgowce są gospodarzami sekwestracji żelaza w procesie znanym jako "odporność odżywcza"18. W odpowiedzi na to patogeny bakteryjne ewoluowały, aby wykorzystywać żelazo jako globalną cząsteczkę sygnałową do wyczuwania otoczenia i regulowania opracowywania cech wirulencji, takich jak systemy pozyskiwania żelaza, toksyny i maszyneria wydzielania toksyn19,2...

Zakażenie H. pylori jest istotnym czynnikiem ryzyka raka żołądka1. Jednak wyniki choroby są różne i zależą od wielu czynników, takich jak genetyka gospodarza, różnorodność genetyczna szczepów H. pylori i elementy środowiskowe, takie jak dieta gospodarza11. Wcześniejsze doniesienia wykazały, że istnieje korelacja między zakażeniem H. pylori, niedoborem żelaza (mierzonym obniżonym stężeniem ferrytyny i hemoglobiny we krwi) a zwiększoną produkcją cytokin prozapalnych, w tym wydzielaniem IL-8, co ostatecznie prowadzi do zwiększonej progresji choroby żołądka12. Ostre zakażenie H. pylori jest również związane z hipochlorhydrią, która upośledza zdolność gospodarza do wchłaniania żelaza odżywczego i ostatecznie prowadzi do zmian w homeostazie żelaza13. Te odkrycia kliniczne sugerują, że dostępność żelaza w niszy żołądkowej może być ważnym czynnikiem wpływającym na wynik choroby. W rzeczywistości modele zwierzęce zakażenia H. pylori wykazały, że niskie spożycie żelaza w diecie zaostrzachoroby żołądka. Obniżony poziom żelaza u tych zwierząt wymaga, aby H. pylori indukował reakcję pozyskiwania żelaza w celu uzyskania żelaza potrzebnego do replikacji bakterii. H. pylori ma zdolność do zaburzania transportu żelaza w komórkach gospodarza, aby ułatwić replikację bakterii w sposób zależny od CagA15. Co ciekawe, wykazano, że wyspa patogenności cag jest regulowana przez reagujący na żelazo czynnik transkrypcyjny Fur16,17. Ponadto szczepy Cag+ są związane ze zwiększonym stanem zapalnym i chorobami żołądka, takimi jak rak1. Odkrycia te wspierają model, w którym H. pylori zmienia ekspresję Cag-T4SS w celu uzyskania żelaza z komórek gospodarza, które znajdują się w środowisku zubożonym w żelazo, co prowadzi do zaostrzenia choroby. 
Dwa czynniki, które zwiększają stan zapalny i zachorowalność, to ekspresja Cag i niskie spożycie żelaza w diecie. Fakty te potwierdzają hipotezę, że zmniejszona dostępność żelaza zwiększa produkcję pilusów Cag-T4SS na granicy patogenów gospodarza, co skutkuje gorszą chorobą żołądka11-14. Celem metody przedstawionej w tym artykule jest ustalenie roli żelaza mikroskładnikowego w regulacji biogenezy pilusa Cag-T4SS. W poprzedniej pracy zastosowaliśmy dwa podejścia do obserwacji zależnego od żelaza wzrostu ekspresji Cag-T4SS. Po pierwsze, przeanalizowano szczepy wyjściowe pochodzące od zwierząt utrzymywanych na diecie o wysokiej i niskiej zawartości żelaza i ujawniono, że szczepy dietetyczne o niskiej zawartości żelaza wytwarzały więcej pilusów Cag-T4SS niż szczepy dietetyczne o wysokiej zawartości żelaza14. Po drugie, hodowla szczepu H. pylori 7.13 in vitro w warunkach obfitości żelaza skutkowała zmniejszeniem tworzenia pilusów, podczas gdy komórki hodowane w obecności chelatora żelaza wytwarzały znacznie więcej pilusów. 
Kontynuujemy badania nad zależną od żelaza regulacją fenotypu pili Cag-T4SS i oferujemy następujący zoptymalizowany protokół i reprezentatywne wyniki przeprowadzone z dodatkowym szczepem Helicobacter pylori, PMSS1. Uzasadnieniem dla rozwoju tej techniki było skorelowanie zwiększonej aktywności Cag-T4SS w warunkach ograniczenia żelaza ze zwiększonym tworzeniem pilusa Cag-T4SS. Szersze implikacje i zastosowanie tej techniki zapewni zoptymalizowane warunki hodowli, które spowodują zwiększoną produkcję pili Cag-T4SS. Test ten będzie przydatny dla badaczy dążących do określenia składu i architektury Cag-T4SS poprzez wzbogacenie tej ważnej cechy powierzchni bakteryjnej. Przygotowanie i wizualizacja próbki za pomocą mikroskopii elektronowej z emisją polową ma wiele zalet w porównaniu z alternatywnymi technikami, takimi jak metody mikroskopii świetlnej do wizualizacji Cag-T4SS i będzie odpowiednia dla badaczy zainteresowanych badaniem regulacji tej organelli10.

<table><tbody><tr><td>Modyfikowany bulion</td><td></td><td></td><td></td>z brucelozy</tr><tr><td>Pepton z kazeiny (10 g/L)</td><td>Sigma</td><td>70172</td><td></td></tr><tr><td>Trawienie trawienne tkanek zwierzęcych (10 g/L)</td><td>Sigma</td><td>70174</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy (2 g/L)</td><td>Sigma</td><td>92144</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza (1 g/L)</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (5 g/L)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol (250X) (4 ml/L)</td><td>Life Technologies</td><td>12531018</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek żelaza (100 lub 250 uM)</td><td>Sigma</td><td>157740-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dipirydyl (200 uM)</td><td>Sigma</td><td>D216305-100G</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI+HEPES (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>22400-121</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu ( 100 ml/L)</td><td>Life Technologies</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>Preparat</td><td></td><td></td><td></td>do mikroskopii elektronowej</tr><tr><td>Paraformaldehyd (2,0% wodny)</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd gluterowy (2,5% wodny)</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Kakodylan sodu (0,05 M)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Tetroksynek osmu (0,1% wodny)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (absolutny)</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Farba ze srebra</td><td>koloidalnego Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>Kikuty próbek SEM</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>Sciences 75220</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Thermo Fisher</td><td>08-774-383</td><td></td></tr><tr><td>IL-8 Ocena</td><td></td><td></td><td></td>wydzielania</tr><tr><td>Quantikine IL-8 Zestaw ELISA</td><td>R& Systemy D</td><td>D8000C</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopia elektronowa wysokiej rozdzielczości systemu wydzielania helicobacter pylori cag typu iv pili wytwarzanego w różnych warunkach dostępności żelaza

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori to spiralna, Gram-ujemna bakteria, która kolonizuje ludzką niszę żołądkową połowy populacji ludzkiej1,2. H. pylori jest główną przyczyną raka żołądka, drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem na całym świecie3. Jednym z czynników wirulencji, który został związany ze zwiększonym ryzykiem chorób żołądka, jest wyspa patogeniczności Cag, region o długości 40 kb w chromosomie H. pylori, który koduje system wydzielania typu IV i pokrewną cząsteczkę efektorową, CagA4,5. Cag-T4SS jest odpowiedzialny za translokację CagA i peptydoglikanu do komórek nabłonka gospodarza5,6. Aktywność Cag-T4SS powoduje liczne zmiany w biologii komórki gospodarza, w tym regulację w górę ekspresji cytokin, aktywację szlaków prozapalnych, przebudowę cytoszkieletu i indukcję onkogennych sieci sygnalizacji komórkowej5-8. Cag-T4SS to maszyna makromolekularna składająca się z komponentów podzespołów obejmujących błonę wewnętrzną i zewnętrzną oraz rozciągających się na zewnątrz od komórki do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Zewnątrzkomórkowa część Cag-T4SS jest określana jako "pilus"5. Liczne badania wykazały, że pilusy Cag-T4SS powstają na granicy faz gospodarz-patogen9,10. Jednak cechy środowiskowe, które regulują biogenezę tej ważnej organelli, pozostają w dużej mierze niejasne. Niedawno informowaliśmy, że warunki niskiej dostępności żelaza zwiększają aktywność Cag-T4SS i biogenezę pilusa. Tutaj przedstawiamy zoptymalizowany protokół hodowli H. pylori w różnych warunkach dostępności żelaza przed wspólną hodowlą z ludzkimi komórkami nabłonka żołądka. Ponadto przedstawiamy kompleksowy protokół wizualizacji fenotypu hiperpiliowanego wykazywanego w warunkach ograniczenia żelaza za pomocą analiz skaningowej mikroskopii elektronowej o wysokiej rozdzielczości.

W niniejszym raporcie wykazaliśmy, że zmienna dostępność żelaza ma zdolność modulowania biogenezy pili Cag-T4SS H. pylori na styku gospodarz-patogen. W przypadku hodowli w samym medium, H. pylori tworzy średnio 3 pili/komórkę. Gdy H. pylori jest hodowany w warunkach deficytu żelaza (przy użyciu syntetycznego chelatora dipirydylu), które są subinhibicyjne dla wzrostu bakterii (Rysunek 1), bakterie wytwarzają liczne pili Cag-T4SS (~7 pili/komórkę) podczas kokultury z ludzkimi kom...

Tutaj opisujemy metodę wizualizacji onkogennych organelli bakteryjnych znanych jako System Wydzielania Cag Typu IV (Cag-T4SS). Odkryliśmy, że Cag-T4SS jest wytwarzany w różny sposób na powierzchni H. pylori w odpowiedzi na różne warunki dostępności żelaza.

Mikroskopia elektronowa wysokiej rozdzielczości systemu wydzielania Helicobacter pylori Cag typu IV pili wytwarzanego w różnych warunkach dostępności żelaza

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

Procedura uwidacznia nadmierną produkcję PII układu wydzielania CAG typu czwartego, która zachodzi w warunkach ograniczenia zawartości żelaza w warunkach ograniczenia żelaza w warunkach ograniczenia żelaza. Drugim krokiem jest wspólna hodowla h pylori z komórkami nabłonka żołądka. Następnie przetworzyć próbki z kokultury do skaningowej mikroskopii elektronowej.Ostatecznie skaningowa mikroskopia elektronowa o wysokiej rozdzielczości stosowana w celu wykazania zwiększonej produkcji CAG w systemie wydzielania czwartego oka w warunkach ograniczenia żelaza. Technika opisana w tym manuskrypcie jest ważna dla chorób związanych z odźwiernikiem, takich jak rak żołądka, ponieważ system wydzielania CAG typu czwartego wiąże się ze zwiększonym ryzykiem negatywnych wyników choroby. W ten sposób lepiej rozumiemy regulację tej ważnej powierzchni bakteryjnej.Organelle mogą ujawnić nowe cele chemioterapeutyczne Zaletą skaningowej mikroskopii elektronowej o wysokiej rozdzielczości w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia fluorescencyjna, jest to, że można uwidocznić pojedynczą tabletkę wydzielania typu czwartego. Osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie mikroskopii elektronowej, mają problemy z procedurą, szczególnie z mokrą chemią, ponieważ wymaga ona starannego wyczucia czasu i delikatnej ręki na krwi. Rosną płytki agarowe.H Pylori PMs, S one bakteria i jej izogeniczny mutant CAG e, który nie ma działającego systemu wydzielania typu czwartego. Zaszczep kultury i zmodyfikowany bulion Ella uzupełniony cholesterolem, aby rósł przez noc. Następnie wysiewa się ludzkie komórki nabłonka żołądka GS na szkiełkach nakrywkowych traktowanych polilizyną w 12-dołkowych płytkach w celu uzyskania różnych warunków dostępności żelaza.Rozcieńczyć h pylori do gęstości optycznej 600 0,3 w samym zmodyfikowanym bulionie bru. Pożywka zawierająca 100 mikromolowców chlorku żelaza, 200 mikromolowych czerpaków syntetycznego chelatora żelaza lub 200 mikromolowców czerpaka oraz 200 mikromolowców kultury chlorku żelaza. Próbki przez cztery godziny odwirowują bakterie w temperaturze 1000 Gs, a Resus zawiesza granulki w równej objętości świeżego zmodyfikowanego bulionu bru uzupełnionego cholesterolem.Zmierz gęstość bakterii. Następnie zainfekuj komórki nabłonkowe h pylori przy wielokrotności infekcji 20 do jednego. Wykonaj seryjne rozcieńczenia i umieść komórki bakteryjne na płytkach z agarem z krwią.Aby ocenić żywotność komórek bakteryjnych, umieść kultury CO w inkubatorze do hodowli komórkowych na cztery godziny. Zdekantować supernatant z kultur h pylori I i GS co. Delikatnie przemyj przylegające komórki trzykrotnie 0,05-molowym buforem sodu.Następnie utrwal próbki przez dwie do czterech godzin w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj próbki trzykrotnie 0,05 molowym buforem sodowym ca coate. W celu wtórnego utrwalenia dodać 0,1% tetratlenku osmu w 0,05 molowym buforze sodowym w dwóch sekwencyjnych 10-minutowych krokach utrwalania.Następnie po trzech płukaniach odwodnić próbki zwiększonym stężeniem etanolu. Umieść próbki w suszarce w punkcie krytycznym, a następnie napełnij komorę ciekłym dwutlenkiem węgla. Etanol jest usuwany z komory, a komora jest ponownie napełniana ciekłym dwutlenkiem węgla.Próbka jest następnie przenoszona do punktu krytycznego 31,1 stopnia Celsjusza i 1073 PSI, teraz zamontuj szkiełka pokrywy na aluminiowych króćcach próbki SEM i pomaluj cienką linię srebra koloidalnego na krawędzi próbki w celu uziemienia. Podczas obrazowania SEM, przy użyciu maszyny do napylania napylania, pokryj próbki pięcioma nanometrami złotego palladu, aby zwiększyć wtórny sygnał elektronowy próbki i efekt krawędzi. Zbadaj próbki za pomocą obrazu z mikroskopu elektronowego skaningowego z pistoletem do emisji w trybie wysokiej próżni w odległości roboczej od pięciu do 10 milimetrów.Ustaw napięcie przyspieszające na pięć kilowoltów. Następnie ustaw rozmiar plamki na dwa do 2,5. Teraz przechyl próbkę w zakresie od 15 do 25 stopni, aby uzyskać lepszy widok interfejsu patogenu gospodarza w celu oglądania w dużym powiększeniu.Nadaj priorytet obrazowaniu bakterii, przylegaj do krawędzi komórek nabłonka, aby uzyskać PI życie rozgrzewające bakterie wzbogacone w interakcje z patogenami gospodarza. Otwórz pliki mikrograficzne w oprogramowaniu obrazu J. Zidentyfikuj pi li, gdy między komórką bakteryjną a komórką gospodarza tworzą się struktury o jednolitej szerokości od 10 do 13 nanometrów i długości od 60 do 150 nanometrów.Skalibruj narzędzie pomiarowe, rysując linię za pomocą narzędzia linii prostej, a następnie klikając kartę analizy z menu rozwijanego. Wybierz opcję Ustaw skalę i wprowadź wartość paska powiększenia w obszarze znanej odległości i ustaw jednostkę długości na nanometr. Następnie kliknij OK.Teraz użyj narzędzia do linii prostej, aby narysować długość lub szerokość pilotów, a następnie naciśnij kontrolkę M, aby zmierzyć każdego pilota i zapisać zmierzone wartości w programie arkusza kalkulacyjnego. Użyj wcześniej ustalonych parametrów długości i szerokości, aby zignorować cechy, które nie pasują do profilu systemu wydzielania CAG typu czwartego. Następnie określ ilościowo liczbę PI I na podstawie wartości, które mieszczą się w zakresie, przeanalizowano statystycznie, kwantyfikacja PI LI za pomocą dwustronnego testu T-studenta.W tym eksperymencie h pylori hodowano w warunkach zubożenia w żelazo przy użyciu syntetycznego chelatora dip parital w stężeniach, które nie hamują znacząco wzrostu. Bakterie wytwarzały liczne PII układu wydzielania CAG typu czwartego podczas wspólnej hodowli z ludzkimi komórkami żołądka. I odwrotnie, gdy obecne jest egzogenne źródło odżywczego żelaza, tworzenie PII systemu wydzielania CAG typu czwartego jest hamowane.Kwantyfikacja PII na granicy patogenów gospodarza ujawnia, że w warunkach ograniczenia żelaza h pylori wykazuje dwukrotny wzrost oka PI systemu wydzielania CAG typu czwartego, procent komórek pilesowanych wzrasta o 11% w porównaniu z komórkami hodowanymi w samym pożywce. Co ciekawe, chociaż aktywność układu wydzielania CAG typu czwartego, mierzona przez wydzielanie IL 8 gospodarza, jest zwiększona w warunkach ograniczenia żelaza i stłumiona w warunkach nadmiernej dostępności żelaza, wymiary PI LI pozostają spójne we wszystkich warunkach dostępności żelaza. Zgodnie z udziałem CAG typu czwartego, dostępność żelaza nie zmienia biogenezy PI LI na powierzchni mutanta CAG e Po jego rozwoju.Ta technika SEM utorowała drogę naukowcom zajmującym się systemem wydzielania CAG typu czwartego do zbadania lokalizacji białek. W odniesieniu do typu CAG cztery poduszki systemu sekrecji. Niedawno odkryto, że białko efektorowe CAG a lokalizuje się na końcówce pigułki wydzielania typu czwartego.

high-resolution-electron-microscopy-helicobacter-pylori-cag-type-iv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano projekt syntetycznego operonu kodującego zarówno aparat sekrecyjny, jak i monomery strukturalne włókien curli. Nadprodukcja tych amyloidów i polimerów adhezyjnych pozwala na mierzalny wzrost adhezji chassis E. coli1. Wyjaśniono proste sposoby wizualizacji i kwantyfikacji adhezji.

Inżynieria bakterii adherentnych poprzez stworzenie pojedynczego syntetycznego operonu curli

Ten artykuł ilustruje zastosowanie znakowania radiowego w pogoni za impulsami w połączeniu z fotosieciowaniem specyficznym dla danego miejsca do monitorowania interakcji między interesującym białkiem a innymi czynnikami w E. coli. W przeciwieństwie do tradycyjnych chemicznych metod sieciowania, podejście to generuje "migawki" o wysokiej rozdzielczości uporządkowanej ścieżki składania w żywej komórce.

Monitorowanie tworzenia się wydzielanego bakteryjnego czynnika wirulencji za pomocą sieciowania specyficznego dla miejsca

Ten artykuł przedstawia protokół do przetwarzania obrazów cryo-EM za pomocą pakietu oprogramowania SPHIRE. Obecny protokół może być stosowany do prawie wszystkich projektów EM pojedynczych cząstek, które są ukierunkowane na rozdzielczość bliską atomowi.

Analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu SPHIRE

Myszy stanowią nieoceniony model in vivo do badania infekcji i chorób wywoływanych przez mikroorganizmy żołądkowo-jelitowe. W tym miejscu opisano metody stosowane do badania kolonizacji bakteryjnej i zmian histopatologicznych w mysich modelach choroby związanej z Helicobacter pylori.

Mysie modele zakażenia Helicobacter i patologii żołądka

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Mycobacterium tuberculosis wykazuje zwiększoną produkcję i uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w odpowiedzi na warunki niskiego poziomu żelaza. Praca ta szczegółowo opisuje protokół generowania warunków o niskiej zawartości żelaza oraz metody oczyszczania i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków uwalnianych w odpowiedzi na niedobór żelaza.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki o ograniczonej zawartości żelaza

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Mapy krio-EM makromolekuł o wysokiej rozdzielczości można również uzyskać za pomocą mikroskopów TEM 200 kV. Protokół ten przedstawia najlepsze praktyki w zakresie ustawiania dokładnych wyrównań optyki, schematów akwizycji danych i wyboru obszarów obrazowania, które są niezbędne do pomyślnego zbierania zestawów danych o wysokiej rozdzielczości przy użyciu TEM 200 kV.

Rutynowe zbieranie zestawów danych krio-EM o wysokiej rozdzielczości przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego 200 KV

Protokół opisuje wysokoprzepustowe podejście do wyznaczania struktur białek błonowych z wykorzystaniem krio-tomografii elektronowej oraz trójwymiarowego przetwarzania obrazów. Obejmuje on szczegóły przygotowania preparatów, gromadzenia danych, ich przetwarzania i interpretacji, a kończy się opracowaniem reprezentatywnego celu dla tej metody, jakim jest glikoproteina otoczki HIV-1. Procedury obliczeniowe zostały zaprojektowane w sposób umożliwiający badaczom i studentom pracę zdalną oraz wkład w...

Wyznaczanie struktur molekularnych glikoprotein otoczki HIV z wykorzystaniem krioelektronowej tomografii i zautomatyzowanego uśredniania subtomogramów

Poznaj metodę wizualizacji systemu wydzielania Cag-T4SS w bakterii Helicobacter pylori przy użyciu wysokorozdzielczej mikroskopii elektronowej. Technika ta pozwala badać wpływ dostępności żelaza na produkcję pili i mechanizmy chorobotwórcze.

Mikroskopia elektronowa wysokiej rozdzielczości systemu wydzielania Helicobacter pylori Cag typu IV pili wytwarzanego w różnych warunkach dostępności żelaza (Wideo) | JoVE Journal

Mikroskopia elektronowa wysokiej rozdzielczości systemu wydzielania Helicobacter pylori Cag typu IV pili wytwarzanego w różnych warunkach dostępności żelaza

Przeglądaj więcej filmów