Mikroskopia elektronowa wysokiej rozdzielczości systemu wydzielania Helicobacter pylori Cag typu IV pili wytwarzanego w różnych warunkach dostępności żelaza

Procedura uwidacznia nadmierną produkcję PII układu wydzielania CAG typu czwartego, która zachodzi w warunkach ograniczenia zawartości żelaza w warunkach ograniczenia żelaza w warunkach ograniczenia żelaza. Drugim krokiem jest wspólna hodowla h pylori z komórkami nabłonka żołądka. Następnie przetworzyć próbki z kokultury do skaningowej mikroskopii elektronowej.

Ostatecznie skaningowa mikroskopia elektronowa o wysokiej rozdzielczości stosowana w celu wykazania zwiększonej produkcji CAG w systemie wydzielania czwartego oka w warunkach ograniczenia żelaza. Technika opisana w tym manuskrypcie jest ważna dla chorób związanych z odźwiernikiem, takich jak rak żołądka, ponieważ system wydzielania CAG typu czwartego wiąże się ze zwiększonym ryzykiem negatywnych wyników choroby. W ten sposób lepiej rozumiemy regulację tej ważnej powierzchni bakteryjnej.

Organelle mogą ujawnić nowe cele chemioterapeutyczne Zaletą skaningowej mikroskopii elektronowej o wysokiej rozdzielczości w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia fluorescencyjna, jest to, że można uwidocznić pojedynczą tabletkę wydzielania typu czwartego. Osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie mikroskopii elektronowej, mają problemy z procedurą, szczególnie z mokrą chemią, ponieważ wymaga ona starannego wyczucia czasu i delikatnej ręki na krwi. Rosną płytki agarowe.

H Pylori PMs, S one bakteria i jej izogeniczny mutant CAG e, który nie ma działającego systemu wydzielania typu czwartego. Zaszczep kultury i zmodyfikowany bulion Ella uzupełniony cholesterolem, aby rósł przez noc. Następnie wysiewa się ludzkie komórki nabłonka żołądka GS na szkiełkach nakrywkowych traktowanych polilizyną w 12-dołkowych płytkach w celu uzyskania różnych warunków dostępności żelaza.

Rozcieńczyć h pylori do gęstości optycznej 600 0,3 w samym zmodyfikowanym bulionie bru. Pożywka zawierająca 100 mikromolowców chlorku żelaza, 200 mikromolowych czerpaków syntetycznego chelatora żelaza lub 200 mikromolowców czerpaka oraz 200 mikromolowców kultury chlorku żelaza. Próbki przez cztery godziny odwirowują bakterie w temperaturze 1000 Gs, a Resus zawiesza granulki w równej objętości świeżego zmodyfikowanego bulionu bru uzupełnionego cholesterolem.

Zmierz gęstość bakterii. Następnie zainfekuj komórki nabłonkowe h pylori przy wielokrotności infekcji 20 do jednego. Wykonaj seryjne rozcieńczenia i umieść komórki bakteryjne na płytkach z agarem z krwią.

Aby ocenić żywotność komórek bakteryjnych, umieść kultury CO w inkubatorze do hodowli komórkowych na cztery godziny. Zdekantować supernatant z kultur h pylori I i GS co. Delikatnie przemyj przylegające komórki trzykrotnie 0,05-molowym buforem sodu.

Następnie utrwal próbki przez dwie do czterech godzin w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj próbki trzykrotnie 0,05 molowym buforem sodowym ca coate. W celu wtórnego utrwalenia dodać 0,1% tetratlenku osmu w 0,05 molowym buforze sodowym w dwóch sekwencyjnych 10-minutowych krokach utrwalania.

Następnie po trzech płukaniach odwodnić próbki zwiększonym stężeniem etanolu. Umieść próbki w suszarce w punkcie krytycznym, a następnie napełnij komorę ciekłym dwutlenkiem węgla. Etanol jest usuwany z komory, a komora jest ponownie napełniana ciekłym dwutlenkiem węgla.

Próbka jest następnie przenoszona do punktu krytycznego 31,1 stopnia Celsjusza i 1073 PSI, teraz zamontuj szkiełka pokrywy na aluminiowych króćcach próbki SEM i pomaluj cienką linię srebra koloidalnego na krawędzi próbki w celu uziemienia. Podczas obrazowania SEM, przy użyciu maszyny do napylania napylania, pokryj próbki pięcioma nanometrami złotego palladu, aby zwiększyć wtórny sygnał elektronowy próbki i efekt krawędzi. Zbadaj próbki za pomocą obrazu z mikroskopu elektronowego skaningowego z pistoletem do emisji w trybie wysokiej próżni w odległości roboczej od pięciu do 10 milimetrów.

Ustaw napięcie przyspieszające na pięć kilowoltów. Następnie ustaw rozmiar plamki na dwa do 2,5. Teraz przechyl próbkę w zakresie od 15 do 25 stopni, aby uzyskać lepszy widok interfejsu patogenu gospodarza w celu oglądania w dużym powiększeniu.

Nadaj priorytet obrazowaniu bakterii, przylegaj do krawędzi komórek nabłonka, aby uzyskać PI życie rozgrzewające bakterie wzbogacone w interakcje z patogenami gospodarza. Otwórz pliki mikrograficzne w oprogramowaniu obrazu J. Zidentyfikuj pi li, gdy między komórką bakteryjną a komórką gospodarza tworzą się struktury o jednolitej szerokości od 10 do 13 nanometrów i długości od 60 do 150 nanometrów.

Skalibruj narzędzie pomiarowe, rysując linię za pomocą narzędzia linii prostej, a następnie klikając kartę analizy z menu rozwijanego. Wybierz opcję Ustaw skalę i wprowadź wartość paska powiększenia w obszarze znanej odległości i ustaw jednostkę długości na nanometr. Następnie kliknij OK.

Teraz użyj narzędzia do linii prostej, aby narysować długość lub szerokość pilotów, a następnie naciśnij kontrolkę M, aby zmierzyć każdego pilota i zapisać zmierzone wartości w programie arkusza kalkulacyjnego. Użyj wcześniej ustalonych parametrów długości i szerokości, aby zignorować cechy, które nie pasują do profilu systemu wydzielania CAG typu czwartego. Następnie określ ilościowo liczbę PI I na podstawie wartości, które mieszczą się w zakresie, przeanalizowano statystycznie, kwantyfikacja PI LI za pomocą dwustronnego testu T-studenta.

W tym eksperymencie h pylori hodowano w warunkach zubożenia w żelazo przy użyciu syntetycznego chelatora dip parital w stężeniach, które nie hamują znacząco wzrostu. Bakterie wytwarzały liczne PII układu wydzielania CAG typu czwartego podczas wspólnej hodowli z ludzkimi komórkami żołądka. I odwrotnie, gdy obecne jest egzogenne źródło odżywczego żelaza, tworzenie PII systemu wydzielania CAG typu czwartego jest hamowane.

Kwantyfikacja PII na granicy patogenów gospodarza ujawnia, że w warunkach ograniczenia żelaza h pylori wykazuje dwukrotny wzrost oka PI systemu wydzielania CAG typu czwartego, procent komórek pilesowanych wzrasta o 11% w porównaniu z komórkami hodowanymi w samym pożywce. Co ciekawe, chociaż aktywność układu wydzielania CAG typu czwartego, mierzona przez wydzielanie IL 8 gospodarza, jest zwiększona w warunkach ograniczenia żelaza i stłumiona w warunkach nadmiernej dostępności żelaza, wymiary PI LI pozostają spójne we wszystkich warunkach dostępności żelaza. Zgodnie z udziałem CAG typu czwartego, dostępność żelaza nie zmienia biogenezy PI LI na powierzchni mutanta CAG e Po jego rozwoju.

Ta technika SEM utorowała drogę naukowcom zajmującym się systemem wydzielania CAG typu czwartego do zbadania lokalizacji białek. W odniesieniu do typu CAG cztery poduszki systemu sekrecji. Niedawno odkryto, że białko efektorowe CAG a lokalizuje się na końcówce pigułki wydzielania typu czwartego.