Wstęp do neuronauki komórkowej i molekularnej
Najprostsze odruchy, jak i najwznioszejsze przeżycia emocjonalne, mają swoje źródło w strukturach molekularnych, genetycznych i komórkowych mózgu. Jako jedna z najnowszych dziedzin neuronauki, neuronauka komórkowa i molekularna wykorzystuje biologię molekularną do badania wpływu genów, cząsteczek sygnałowych i morfologii komórek na układ nerwowy
W niniejszym materiale zostaną przedstawione przełomowe odkrycia w tej dziedzinie, omówione kluczowe pytania badawcze z zakresu neuronauki komórkowej i molekularnej, a na koniec zaprezentowano kilka wiodących metod, które można zastosować w celu znalezienia odpowiedzi na te pytania.
Zacznijmy od przyjrzenia się naukowym korzeniom tej stosunkowo młodej dziedziny.
Zanim pojawiły się techniki molekularne, wczesną historią neuronauki dominowali anatomowie i biolodzy komórkowi.
Jednak w latach 30. XX wieku napływ fizyków, chemików i teoretyków w szeregi biologów zapoczątkował rewolucję molekularną, której kulminacją było odkrycie struktury DNA przez Watsona i Cricka oraz sformalizowanie dogmatu centralnego, wyjaśniającego sposób, w jaki DNA koduje białka pełniące funkcję jednostek operacyjnych komórek. Po raz pierwszy neuronaukowcy mogli zbadać rolę konkretnych genów i białek w funkcjonowaniu układu nerwowego.
Na przykład w latach 60. XX wieku Seymour Benzer zdołał powiązać zmiany behawioralne u muszek owocowych z konkretnymi mutacjami genetycznymi, identyfikując kluczowe geny ekspresjonowane w neuronach kontrolujących zachowanie, takich jak lokomocja.
W tym samym okresie Eric Kandel wykazał, że złożone procesy, takie jak uczenie się, również mają podstawy molekularne. Wykorzystując morskiego mięczaka Aplysia, przeanalizował on ekstrakty z tkanki neuronalnej i wskazał na wewnątrzkomórkową cząsteczkę sygnałową cAMP jako element szlaku krytycznego dla procesu uczenia się.
Następnie, w latach 80. XX wieku, członkowie laboratorium Shosaku Numy jako pierwsi sklonowali kluczowe cząsteczki odpowiedzialne za funkcje neuronów, takie jak napięciowo zależny kanał sodowy. Analizy domen funkcjonalnych w obrębie tych dużych białek błonowych pozwoliły od tego czasu lepiej zrozumieć, w jaki sposób kontrola przepływu jonów prowadzi do pobudzenia neuronu.
Kolejnym ważnym odkryciem w zakresie molekularnych mechanizmów komunikacji neuronalnej było odkrycie Thomasa Sudhofa z lat 90. XX wieku, który wykazał, że jony wapnia zmieniają kształt białek kotwiczących pęcherzyki wypełnione neuroprzekaźnikami do błony komórkowej, co wyjaśniło, w jaki sposób potencjały czynnościowe prowadzą do precyzyjnie zsynchronizowanego uwalniania sygnałów chemicznych do synapsy.
Od neurofizjologii po behawioryzm – odkrycia w dziedzinie molekularnej neuronauki poszerzyły naszą wiedzę w wielu dyscyplinach nauk o mózgu.
Pomimo tej owocnej historii, wciąż pozostaje wiele do odkrycia! Przejrzyjmy pytania, które są obecnie stawiane w laboratoriach.
Jeden z obszarów badań dotyczy tego, które geny wpływają na funkcje neuronów. Na przykład wiadomo, że ekspansje nukleotydowe w określonych genach są zaangażowane w kilka chorób charakteryzujących się stopniowym pogarszaniem stanu zdrowia neuronów, takich jak choroba Huntingtona.
Inna grupa badanych genów koduje czynniki transkrypcyjne: białka regulujące ekspresję określonych genów. Identyfikacja celów DNA dla czynników transkrypcyjnych specyficznych dla układu nerwowego może zapewnić nam lepszy wgląd w program genetyczny, który umożliwia nam myślenie.
Z kolei neuronaukowcy mogą pytać o to, w jaki sposób cząsteczki regulują zachowanie neuronów. Mogą na przykład badać mechanizmy molekularne regulujące ruch jonów przez błonę komórkową, co skutkuje propagacją potencjałów czynnościowych. Badania w tym zakresie dostarczyły nam środków znieczulających, takich jak lidokaina, która blokuje określone kanały jonowe i zatrzymuje przekazywanie sygnałów bólowych do mózgu.
Alternatywnie naukowcy mogą badać miejsca oddziaływania między neuronami, znane jako synapsy. Tutaj mogą pytać, jakie cząsteczki są zaangażowane w utrzymanie integralności synapsy oraz w jaki sposób połączenia te mogą zostać przywrócone w stanach chorobowych.
Plastyczność neuronalna to zdolność układu nerwowego do adaptacji chemicznej i fizycznej w odpowiedzi na doświadczenia. Niektóre badania w tej dziedzinie koncentrują się na zależnych od doświadczenia zmianach morfologicznych w rozbudowanych strukturach neuronalnych, znanych jako drzewka dendrytów, które tworzą synapsy poprzez wysoce dynamiczne struktury nazywane kolcami dendrytycznymi. Inni są zainteresowani tym, jak doświadczenie może modyfikować rozkład receptorów neurotransmiterów na błonach synaptycznych, co może wzmacniać moc sygnałową synapsy w zjawisku znanym jako długotrwałe wzmocnienie synaptyczne, czyli LTP.
Jak widać, neuronaukowcy komórkowi i molekularni podchodzą do neurobiologii z perspektywy mikroskopowej, jednak zakres badanych przez nich procesów jest niezwykle szeroki.
Po zapoznaniu się z niektórymi z fascynujących pytań, jakie stawia się w laboratoriach neuronauki komórkowej i molekularnej, przyjrzyjmy się narzędziom dostępnym do udzielenia na nie odpowiedzi.
Po pierwsze, aby zbadać genetyczną kontrolę funkcji neuronów, naukowcy dysponują bardzo skutecznymi technikami. Na przykład mikromacierze pozwalają na jednoczesne określenie poziomu ekspresji ogromnej liczby genów. Mikromacierz jest powierzchnią, do której przytwierdzono dziesiątki tysięcy krótkich fragmentów jednoniciowego DNA, tzw. sond. Materiał genetyczny wyekstrahowany z neuronu wiąże się z sondami, a markery fluorescencyjne służą do precyzyjnej wizualizacji sekwencji obecnych w próbce.
Alternatywnie, w czasie rzeczywistym lub ilościowa PCR (qPCR), wykorzystuje sprzęt umożliwiający pośredni pomiar względnej ilości specyficznych transkryptów mRNA za pomocą metody opartej na PCR. Podejście to jest niezwykle użyteczne w określaniu poziomów ekspresji poszczególnych genów.
I wreszcie, technologia transgeniczna jest istotnym narzędziem do badania funkcji genów w układzie nerwowym. Za pomocą tej metody badacze mogą tworzyć zwierzęta z usuniętymi fragmentami genomu, tzw. nokauty, lub z wprowadzonymi do kodu genetycznego zmodyfikowanymi genami, tzw. transgeniki. Tkanki układu nerwowego tych zwierząt można analizować na różne sposoby, aby określić, jak zmiany w ekspresji genów wpływają na funkcje komórkowe.
Aby badać molekularną kontrolę sygnalizacji neuronalnej, badacze często preferują analizę tkanki mózgowej poza organizmem zwierzęcia, albo w postaci małych fragmentów tkanki, albo w formie rozproszonych komórek hodowlanych in vitro nazywane pierwotnymi kulturami neuronalnymi. Jedną z zalet tego uproszczonego systemu jest możliwość efektywnej manipulacji ekspresją interesujących genów w sygnalizacji neuronalnej poprzez transfekcję. Wyniki tych manipulacji genetycznych można następnie obserwować poprzez wizualizację lokalizacji białek, analizę morfologii komórek lub rejestracje elektrofizjologiczne.
Wreszcie, gwałtowny postęp w technologiach obrazowania pozwala naukowcom badać plastyczność neuronalną w nowy, ekscytujący sposób. Na przykład badacze mogą wykorzystać mikroskopię dwufotonową do szczegółowej wizualizacji głębokich warstw żywych tkanek. Po wykonaniu „okna” w czaszce technikę tę można zastosować do obrazowania morfologii komórek mózgowych przed i po tym, jak zwierzęta przejdą określone doświadczenie, co pozwala badaczom zobaczyć, jak proces uczenia się wygląda na poziomie neuronalnym.
Narzędzia obrazowania są również wykorzystywane do badania komponentów molekularnych układu nerwowego w tkankach utrwalonych. Mikroskopia fluorescencyjna jest często stosowana w połączeniu z immunohistochemią, w której próbki barwi się przeciwciałami fluorescencyjnymi znakującymi lokalizację komórkową specyficznych białek.
Po omówieniu kluczowych pytań badawczych oraz narzędzi służących do ich rozwiązania, przyjrzyjmy się kilku zastosowaniom badań z zakresu neuronauki komórkowej i molekularnej.
Po pierwsze, stosując techniki mikromacierzy do niewielkiej populacji neuronów, badacze mogą analizować różnice w ekspresji poszczególnych genów w konkretnych podtypach neuronów. W tym przypadku z siatkówki wyizolowano pojedyncze neurony i wyekstrahowano komórkowe RNA, co pozwoliło badaczom na profilowanie ekspresji mRNA z komórek o różnych charakterystykach funkcjonalnych i morfologicznych.
Techniki molekularne można również zastosować, aby lepiej zrozumieć odpowiedź układu nerwowego na uszkodzenia. Podczas usuwania zgrubiałych zwojów tylnych korzeni nerwowych (DRG) z dorosłych myszy w celu stworzenia pierwotnych kultur neuronalnych, aksony zostają nieuchronnie przerwane. Poprzez transfekcję dysocjowanych neuronów DRG konstruktami wyciszającymi geny, możliwe jest badanie wpływu poszczególnych białek na odrastanie nowych aksonów.
Specjalistyczne techniki obrazowania mogą być wykorzystywane do badania transportu białek, takich jak receptory neurotransmiterów, do błony synaptycznej i z niej. W tym eksperymencie hodowlane neurony przeprowadzono transfekcję genem kodującym białko błonowe znakowane fluorescencyjnie. Następnie, przy użyciu mikroskopu konfokalnego, poddano fotowybieleniu niewielkie obszary błony, co oznacza zniszczenie fluoroforów w tym regionie. Przy zastosowanym tutaj schemacie wybielania, stopniowe odzyskiwanie fluorescencji, czyli FRAP, odzwierciedla transport nowych białek fluorescencyjnych do błony plazmatycznej. Szybkość tego procesu może być kwantyfikowana i porównywana w wielu różnych warunkach eksperymentalnych.
Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do neuronauki komórkowej i molekularnej. W tym filmie omówiliśmy odkrycia historyczne, dzięki którym neuronauka komórkowa i molekularna stała się dziedziną, jaką jest obecnie, niektóre kluczowe pytania badawcze w tej dziedzinie oraz techniki wykorzystywane do znalezienia odpowiedzi na te pytania.
Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie JoVE Science Education!
Neuronauka komórkowa i molekularna jest jedną z najnowszych i najszybciej rozwijających się poddyscyplin neurobiologii. Badając wpływ genów, cząstecze…
Najprostsze odruchy, jak i najwznioszejsze przeżycia emocjonalne, mają swoje źródło w strukturach molekularnych, genetycznych i komórkowych mózgu.Jako jedna z najnowszych dziedzin neuronauki, neuronauka komórkowa i molekularna wykorzystuje biologię molekularną do badania wpływu genów, cząsteczek sygnałowych i morfologii komórek na układ nerwowy
W niniejszym materiale zostaną przedstawione przełomowe odkrycia w tej dziedzinie, omówione kluczowe pytania badawcze z zakresu neuronauki komórkowej i molekularnej, a na koniec zaprezentowano kilka wiodących metod, które można zastosować w celu znalezienia odpowiedzi na te pytania.
Zacznijmy od przyjrzenia się naukowym korzeniom tej stosunkowo młodej dziedziny.
Zanim pojawiły się techniki molekularne, wczesną historią neuronauki dominowali anatomowie i biolodzy komórkowi.
Jednak w latach 30. XX wieku napływ fizyków, chemików i teoretyków w szeregi biologów zapoczątkował rewolucję molekularną, której kulminacją było odkrycie struktury DNA przez Watsona i Cricka oraz sformalizowanie dogmatu centralnego, wyjaśniającego sposób, w jaki DNA koduje białka pełniące funkcję jednostek operacyjnych komórek. Po raz pierwszy neuronaukowcy mogli zbadać rolę konkretnych genów i białek w funkcjonowaniu układu nerwowego.
Na przykład w latach 60. XX wieku Seymour Benzer zdołał powiązać zmiany behawioralne u muszek owocowych z konkretnymi mutacjami genetycznymi, identyfikując kluczowe geny ekspresjonowane w neuronach kontrolujących zachowanie, takich jak lokomocja.
W tym samym okresie Eric Kandel wykazał, że złożone procesy, takie jak uczenie się, również mają podstawy molekularne.Wykorzystując morskiego mięczaka Aplysia, przeanalizował on ekstrakty z tkanki neuronalnej i wskazał na wewnątrzkomórkową cząsteczkę sygnałową cAMP jako element szlaku krytycznego dla procesu uczenia się.
Następnie, w latach 80. XX wieku, członkowie laboratorium Shosaku Numy jako pierwsi sklonowali kluczowe cząsteczki odpowiedzialne za funkcje neuronów, takie jak napięciowo zależny kanał sodowy. Analizy domen funkcjonalnych w obrębie tych dużych białek błonowych pozwoliły od tego czasu lepiej zrozumieć, w jaki sposób kontrola przepływu jonów prowadzi do pobudzenia neuronu.
Kolejnym ważnym odkryciem w zakresie molekularnych mechanizmów komunikacji neuronalnej było odkrycie Thomasa Sudhofa z lat 90. XX wieku, który wykazał, że jony wapnia zmieniają kształt białek kotwiczących pęcherzyki wypełnione neuroprzekaźnikami do błony komórkowej, co wyjaśniło, w jaki sposób potencjały czynnościowe prowadzą do precyzyjnie zsynchronizowanego uwalniania sygnałów chemicznych do synapsy.
Od neurofizjologii po behawioryzm – odkrycia w dziedzinie molekularnej neuronauki poszerzyły naszą wiedzę w wielu dyscyplinach nauk o mózgu.
Pomimo tej owocnej historii, wciąż pozostaje wiele do odkrycia! Przejrzyjmy pytania, które są obecnie stawiane w laboratoriach.
Jeden z obszarów badań dotyczy tego, które geny wpływają na funkcje neuronów. Na przykład wiadomo, że ekspansje nukleotydowe w określonych genach są zaangażowane w kilka chorób charakteryzujących się stopniowym pogarszaniem stanu zdrowia neuronów, takich jak choroba Huntingtona.
Inna grupa badanych genów koduje czynniki transkrypcyjne: białka regulujące ekspresję określonych genów. Identyfikacja celów DNA dla czynników transkrypcyjnych specyficznych dla układu nerwowego może zapewnić nam lepszy wgląd w program genetyczny, który umożliwia nam myślenie.
Z kolei neuronaukowcy mogą pytać o to, w jaki sposób cząsteczki regulują zachowanie neuronów. Mogą na przykład badać mechanizmy molekularne regulujące ruch jonów przez błonę komórkową, co skutkuje propagacją potencjałów czynnościowych. Badania w tym zakresie dostarczyły nam środków znieczulających, takich jak lidokaina, która blokuje określone kanały jonowe i zatrzymuje przekazywanie sygnałów bólowych do mózgu.
Alternatywnie naukowcy mogą badać miejsca oddziaływania między neuronami, znane jako synapsy. Tutaj mogą pytać, jakie cząsteczki są zaangażowane w utrzymanie integralności synapsy oraz w jaki sposób połączenia te mogą zostać przywrócone w stanach chorobowych.
Plastyczność neuronalna to zdolność układu nerwowego do adaptacji chemicznej i fizycznej w odpowiedzi na doświadczenia.Niektóre badania w tej dziedzinie koncentrują się na zależnych od doświadczenia zmianach morfologicznych w rozbudowanych strukturach neuronalnych, znanych jako drzewka dendrytów, które tworzą synapsy poprzez wysoce dynamiczne struktury nazywane kolcami dendrytycznymi.Inni są zainteresowani tym, jak doświadczenie może modyfikować rozkład receptorów neurotransmiterów na błonach synaptycznych, co może wzmacniać moc sygnałową synapsy w zjawisku znanym jako długotrwałe wzmocnienie synaptyczne, czyli LTP.
Jak widać, neuronaukowcy komórkowi i molekularni podchodzą do neurobiologii z perspektywy mikroskopowej, jednak zakres badanych przez nich procesów jest niezwykle szeroki.
Po zapoznaniu się z niektórymi z fascynujących pytań, jakie stawia się w laboratoriach neuronauki komórkowej i molekularnej, przyjrzyjmy się narzędziom dostępnym do udzielenia na nie odpowiedzi.
Po pierwsze, aby zbadać genetyczną kontrolę funkcji neuronów, naukowcy dysponują bardzo skutecznymi technikami.Na przykład mikromacierze pozwalają na jednoczesne określenie poziomu ekspresji ogromnej liczby genów. Mikromacierz jest powierzchnią, do której przytwierdzono dziesiątki tysięcy krótkich fragmentów jednoniciowego DNA, tzw. sond. Materiał genetyczny wyekstrahowany z neuronu wiąże się z sondami, a markery fluorescencyjne służą do precyzyjnej wizualizacji sekwencji obecnych w próbce.
Alternatywnie, w czasie rzeczywistym lub ilościowa PCR (qPCR), wykorzystuje sprzęt umożliwiający pośredni pomiar względnej ilości specyficznych transkryptów mRNA za pomocą metody opartej na PCR. Podejście to jest niezwykle użyteczne w określaniu poziomów ekspresji poszczególnych genów.
I wreszcie, technologia transgeniczna jest istotnym narzędziem do badania funkcji genów w układzie nerwowym. Za pomocą tej metody badacze mogą tworzyć zwierzęta z usuniętymi fragmentami genomu, tzw. nokauty, lub z wprowadzonymi do kodu genetycznego zmodyfikowanymi genami, tzw. transgeniki. Tkanki układu nerwowego tych zwierząt można analizować na różne sposoby, aby określić, jak zmiany w ekspresji genów wpływają na funkcje komórkowe.
Aby badać molekularną kontrolę sygnalizacji neuronalnej, badacze często preferują analizę tkanki mózgowej poza organizmem zwierzęcia, albo w postaci małych fragmentów tkanki, albo w formie rozproszonych komórek hodowlanych in vitro nazywane pierwotnymi kulturami neuronalnymi.Jedną z zalet tego uproszczonego systemu jest możliwość efektywnej manipulacji ekspresją interesujących genów w sygnalizacji neuronalnej poprzez transfekcję. Wyniki tych manipulacji genetycznych można następnie obserwować poprzez wizualizację lokalizacji białek, analizę morfologii komórek lub rejestracje elektrofizjologiczne.
Wreszcie, gwałtowny postęp w technologiach obrazowania pozwala naukowcom badać plastyczność neuronalną w nowy, ekscytujący sposób.Na przykład badacze mogą wykorzystać mikroskopię dwufotonową do szczegółowej wizualizacji głębokich warstw żywych tkanek. Po wykonaniu „okna” w czaszce technikę tę można zastosować do obrazowania morfologii komórek mózgowych przed i po tym, jak zwierzęta przejdą określone doświadczenie, co pozwala badaczom zobaczyć, jak proces uczenia się wygląda na poziomie neuronalnym.
Narzędzia obrazowania są również wykorzystywane do badania komponentów molekularnych układu nerwowego w tkankach utrwalonych. Mikroskopia fluorescencyjna jest często stosowana w połączeniu z immunohistochemią, w której próbki barwi się przeciwciałami fluorescencyjnymi znakującymi lokalizację komórkową specyficznych białek.
Po omówieniu kluczowych pytań badawczych oraz narzędzi służących do ich rozwiązania, przyjrzyjmy się kilku zastosowaniom badań z zakresu neuronauki komórkowej i molekularnej.
Po pierwsze, stosując techniki mikromacierzy do niewielkiej populacji neuronów, badacze mogą analizować różnice w ekspresji poszczególnych genów w konkretnych podtypach neuronów. W tym przypadku z siatkówki wyizolowano pojedyncze neurony i wyekstrahowano komórkowe RNA, co pozwoliło badaczom na profilowanie ekspresji mRNA z komórek o różnych charakterystykach funkcjonalnych i morfologicznych.
Techniki molekularne można również zastosować, aby lepiej zrozumieć odpowiedź układu nerwowego na uszkodzenia. Podczas usuwania zgrubiałych zwojów tylnych korzeni nerwowych (DRG) z dorosłych myszy w celu stworzenia pierwotnych kultur neuronalnych, aksony zostają nieuchronnie przerwane. Poprzez transfekcję dysocjowanych neuronów DRG konstruktami wyciszającymi geny, możliwe jest badanie wpływu poszczególnych białek na odrastanie nowych aksonów.
Specjalistyczne techniki obrazowania mogą być wykorzystywane do badania transportu białek, takich jak receptory neurotransmiterów, do błony synaptycznej i z niej. W tym eksperymencie hodowlane neurony przeprowadzono transfekcję genem kodującym białko błonowe znakowane fluorescencyjnie. Następnie, przy użyciu mikroskopu konfokalnego, poddano fotowybieleniu niewielkie obszary błony, co oznacza zniszczenie fluoroforów w tym regionie. Przy zastosowanym tutaj schemacie wybielania, stopniowe odzyskiwanie fluorescencji, czyli FRAP, odzwierciedla transport nowych białek fluorescencyjnych do błony plazmatycznej. Szybkość tego procesu może być kwantyfikowana i porównywana w wielu różnych warunkach eksperymentalnych.
Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do neuronauki komórkowej i molekularnej. W tym filmie omówiliśmy odkrycia historyczne, dzięki którym neuronauka komórkowa i molekularna stała się dziedziną, jaką jest obecnie, niektóre kluczowe pytania badawcze w tej dziedzinie oraz techniki wykorzystywane do znalezienia odpowiedzi na te pytania.
Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie JoVE Science Education!
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Najprostsze odruchy, jak i najwznioszejsze przeżycia emocjonalne, mają swoje źródło w strukturach molekularnych, genetycznych i komórkowych mózgu. Jako jedna z najnowszych dziedzin neuronauki, neuronauka komórkowa i molekularna wykorzystuje biologię molekularną do badania wpływu genów, cząsteczek sygnałowych i morfologii komórek na układ nerwowy
W niniejszym materiale zostaną przedstawione przełomowe odkrycia w tej dziedzinie, omówione kluczowe pytania badawcze z zakresu neuronauki komórkowej i molekularnej, a na koniec zaprezentowano kilka wiodących metod, które można zastosować w celu znalezienia odpowiedzi na te pytania.
Zacznijmy od przyjrzenia się naukowym korzeniom tej stosunkowo młodej dziedziny.
Zanim pojawiły się techniki molekularne, wczesną historią neuronauki dominowali anatomowie i biolodzy komórkowi.
Jednak w latach 30. XX wieku napływ fizyków, chemików i teoretyków w szeregi biologów zapoczątkował rewolucję molekularną, której kulminacją było odkrycie struktury DNA przez Watsona i Cricka oraz sformalizowanie dogmatu centralnego, wyjaśniającego sposób, w jaki DNA koduje białka pełniące funkcję jednostek operacyjnych komórek. Po raz pierwszy neuronaukowcy mogli zbadać rolę konkretnych genów i białek w funkcjonowaniu układu nerwowego.
Na przykład w latach 60. XX wieku Seymour Benzer zdołał powiązać zmiany behawioralne u muszek owocowych z konkretnymi mutacjami genetycznymi, identyfikując kluczowe geny ekspresjonowane w neuronach kontrolujących zachowanie, takich jak lokomocja.
W tym samym okresie Eric Kandel wykazał, że złożone procesy, takie jak uczenie się, również mają podstawy molekularne. Wykorzystując morskiego mięczaka Aplysia, przeanalizował on ekstrakty z tkanki neuronalnej i wskazał na wewnątrzkomórkową cząsteczkę sygnałową cAMP jako element szlaku krytycznego dla procesu uczenia się.
Następnie, w latach 80. XX wieku, członkowie laboratorium Shosaku Numy jako pierwsi sklonowali kluczowe cząsteczki odpowiedzialne za funkcje neuronów, takie jak napięciowo zależny kanał sodowy. Analizy domen funkcjonalnych w obrębie tych dużych białek błonowych pozwoliły od tego czasu lepiej zrozumieć, w jaki sposób kontrola przepływu jonów prowadzi do pobudzenia neuronu.
Kolejnym ważnym odkryciem w zakresie molekularnych mechanizmów komunikacji neuronalnej było odkrycie Thomasa Sudhofa z lat 90. XX wieku, który wykazał, że jony wapnia zmieniają kształt białek kotwiczących pęcherzyki wypełnione neuroprzekaźnikami do błony komórkowej, co wyjaśniło, w jaki sposób potencjały czynnościowe prowadzą do precyzyjnie zsynchronizowanego uwalniania sygnałów chemicznych do synapsy.
Od neurofizjologii po behawioryzm – odkrycia w dziedzinie molekularnej neuronauki poszerzyły naszą wiedzę w wielu dyscyplinach nauk o mózgu.
Pomimo tej owocnej historii, wciąż pozostaje wiele do odkrycia! Przejrzyjmy pytania, które są obecnie stawiane w laboratoriach.
Jeden z obszarów badań dotyczy tego, które geny wpływają na funkcje neuronów. Na przykład wiadomo, że ekspansje nukleotydowe w określonych genach są zaangażowane w kilka chorób charakteryzujących się stopniowym pogarszaniem stanu zdrowia neuronów, takich jak choroba Huntingtona.
Inna grupa badanych genów koduje czynniki transkrypcyjne: białka regulujące ekspresję określonych genów. Identyfikacja celów DNA dla czynników transkrypcyjnych specyficznych dla układu nerwowego może zapewnić nam lepszy wgląd w program genetyczny, który umożliwia nam myślenie.
Z kolei neuronaukowcy mogą pytać o to, w jaki sposób cząsteczki regulują zachowanie neuronów. Mogą na przykład badać mechanizmy molekularne regulujące ruch jonów przez błonę komórkową, co skutkuje propagacją potencjałów czynnościowych. Badania w tym zakresie dostarczyły nam środków znieczulających, takich jak lidokaina, która blokuje określone kanały jonowe i zatrzymuje przekazywanie sygnałów bólowych do mózgu.
Alternatywnie naukowcy mogą badać miejsca oddziaływania między neuronami, znane jako synapsy. Tutaj mogą pytać, jakie cząsteczki są zaangażowane w utrzymanie integralności synapsy oraz w jaki sposób połączenia te mogą zostać przywrócone w stanach chorobowych.
Plastyczność neuronalna to zdolność układu nerwowego do adaptacji chemicznej i fizycznej w odpowiedzi na doświadczenia. Niektóre badania w tej dziedzinie koncentrują się na zależnych od doświadczenia zmianach morfologicznych w rozbudowanych strukturach neuronalnych, znanych jako drzewka dendrytów, które tworzą synapsy poprzez wysoce dynamiczne struktury nazywane kolcami dendrytycznymi. Inni są zainteresowani tym, jak doświadczenie może modyfikować rozkład receptorów neurotransmiterów na błonach synaptycznych, co może wzmacniać moc sygnałową synapsy w zjawisku znanym jako długotrwałe wzmocnienie synaptyczne, czyli LTP.
Jak widać, neuronaukowcy komórkowi i molekularni podchodzą do neurobiologii z perspektywy mikroskopowej, jednak zakres badanych przez nich procesów jest niezwykle szeroki.
Po zapoznaniu się z niektórymi z fascynujących pytań, jakie stawia się w laboratoriach neuronauki komórkowej i molekularnej, przyjrzyjmy się narzędziom dostępnym do udzielenia na nie odpowiedzi.
Po pierwsze, aby zbadać genetyczną kontrolę funkcji neuronów, naukowcy dysponują bardzo skutecznymi technikami. Na przykład mikromacierze pozwalają na jednoczesne określenie poziomu ekspresji ogromnej liczby genów. Mikromacierz jest powierzchnią, do której przytwierdzono dziesiątki tysięcy krótkich fragmentów jednoniciowego DNA, tzw. sond. Materiał genetyczny wyekstrahowany z neuronu wiąże się z sondami, a markery fluorescencyjne służą do precyzyjnej wizualizacji sekwencji obecnych w próbce.
Alternatywnie, w czasie rzeczywistym lub ilościowa PCR (qPCR), wykorzystuje sprzęt umożliwiający pośredni pomiar względnej ilości specyficznych transkryptów mRNA za pomocą metody opartej na PCR. Podejście to jest niezwykle użyteczne w określaniu poziomów ekspresji poszczególnych genów.
I wreszcie, technologia transgeniczna jest istotnym narzędziem do badania funkcji genów w układzie nerwowym. Za pomocą tej metody badacze mogą tworzyć zwierzęta z usuniętymi fragmentami genomu, tzw. nokauty, lub z wprowadzonymi do kodu genetycznego zmodyfikowanymi genami, tzw. transgeniki. Tkanki układu nerwowego tych zwierząt można analizować na różne sposoby, aby określić, jak zmiany w ekspresji genów wpływają na funkcje komórkowe.
Aby badać molekularną kontrolę sygnalizacji neuronalnej, badacze często preferują analizę tkanki mózgowej poza organizmem zwierzęcia, albo w postaci małych fragmentów tkanki, albo w formie rozproszonych komórek hodowlanych in vitro nazywane pierwotnymi kulturami neuronalnymi. Jedną z zalet tego uproszczonego systemu jest możliwość efektywnej manipulacji ekspresją interesujących genów w sygnalizacji neuronalnej poprzez transfekcję. Wyniki tych manipulacji genetycznych można następnie obserwować poprzez wizualizację lokalizacji białek, analizę morfologii komórek lub rejestracje elektrofizjologiczne.
Wreszcie, gwałtowny postęp w technologiach obrazowania pozwala naukowcom badać plastyczność neuronalną w nowy, ekscytujący sposób. Na przykład badacze mogą wykorzystać mikroskopię dwufotonową do szczegółowej wizualizacji głębokich warstw żywych tkanek. Po wykonaniu „okna” w czaszce technikę tę można zastosować do obrazowania morfologii komórek mózgowych przed i po tym, jak zwierzęta przejdą określone doświadczenie, co pozwala badaczom zobaczyć, jak proces uczenia się wygląda na poziomie neuronalnym.
Narzędzia obrazowania są również wykorzystywane do badania komponentów molekularnych układu nerwowego w tkankach utrwalonych. Mikroskopia fluorescencyjna jest często stosowana w połączeniu z immunohistochemią, w której próbki barwi się przeciwciałami fluorescencyjnymi znakującymi lokalizację komórkową specyficznych białek.
Po omówieniu kluczowych pytań badawczych oraz narzędzi służących do ich rozwiązania, przyjrzyjmy się kilku zastosowaniom badań z zakresu neuronauki komórkowej i molekularnej.
Po pierwsze, stosując techniki mikromacierzy do niewielkiej populacji neuronów, badacze mogą analizować różnice w ekspresji poszczególnych genów w konkretnych podtypach neuronów. W tym przypadku z siatkówki wyizolowano pojedyncze neurony i wyekstrahowano komórkowe RNA, co pozwoliło badaczom na profilowanie ekspresji mRNA z komórek o różnych charakterystykach funkcjonalnych i morfologicznych.
Techniki molekularne można również zastosować, aby lepiej zrozumieć odpowiedź układu nerwowego na uszkodzenia. Podczas usuwania zgrubiałych zwojów tylnych korzeni nerwowych (DRG) z dorosłych myszy w celu stworzenia pierwotnych kultur neuronalnych, aksony zostają nieuchronnie przerwane. Poprzez transfekcję dysocjowanych neuronów DRG konstruktami wyciszającymi geny, możliwe jest badanie wpływu poszczególnych białek na odrastanie nowych aksonów.
Specjalistyczne techniki obrazowania mogą być wykorzystywane do badania transportu białek, takich jak receptory neurotransmiterów, do błony synaptycznej i z niej. W tym eksperymencie hodowlane neurony przeprowadzono transfekcję genem kodującym białko błonowe znakowane fluorescencyjnie. Następnie, przy użyciu mikroskopu konfokalnego, poddano fotowybieleniu niewielkie obszary błony, co oznacza zniszczenie fluoroforów w tym regionie. Przy zastosowanym tutaj schemacie wybielania, stopniowe odzyskiwanie fluorescencji, czyli FRAP, odzwierciedla transport nowych białek fluorescencyjnych do błony plazmatycznej. Szybkość tego procesu może być kwantyfikowana i porównywana w wielu różnych warunkach eksperymentalnych.
Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do neuronauki komórkowej i molekularnej. W tym filmie omówiliśmy odkrycia historyczne, dzięki którym neuronauka komórkowa i molekularna stała się dziedziną, jaką jest obecnie, niektóre kluczowe pytania badawcze w tej dziedzinie oraz techniki wykorzystywane do znalezienia odpowiedzi na te pytania.
Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie JoVE Science Education!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is cellular and molecular neuroscience?
Cellular and molecular neuroscience is a subdiscipline that leverages molecular biology to explore how genes, signaling molecules, and cellular morphology influence the nervous system. It combines techniques from molecular biology with neuroscience to understand normal brain function and pathological conditions. This field emerged in the 1930s when physicists, chemists, and theoreticians joined biologists, enabling investigation of specific genes and proteins in nervous system function.
Q2: How do microarrays measure gene expression in neurons?
Microarrays are surfaces with tens of thousands of single-stranded DNA probes attached. Genetic material extracted from neurons binds to these probes, and fluorescent markers visualize which sequences are present. This technique allows simultaneous quantification of expression across a huge number of genes, making it powerful for profiling neuronal subtypes and identifying differences in gene expression patterns.
Q3: What role do calcium ions play in neurotransmitter release?
Calcium ions alter the shape of proteins that anchor neurotransmitter-filled vesicles to the cell membrane. This discovery by Thomas Sudhof in the 1990s explained how action potentials lead to precisely timed release of chemical signals into the synapse. Understanding this molecular mechanism revealed the link between neuronal electrical activity and chemical communication between neurons.
Q4: How do researchers study neuronal plasticity using imaging?
Two-photon microscopy allows visualization of deep layers in living tissues with great detail. After creating a window in the skull, researchers can image brain cell morphology before and after animals undergo experiences, revealing what learning looks like at the neuronal level. This imaging approach enables direct observation of experience-dependent changes in dendritic arbors and synaptic structures.
Q5: What is transfection and why is it useful in neuronal research?
Transfection is a method to efficiently manipulate gene expression in neurons by introducing modified genetic material into cells. Researchers use transfection to study molecular control of neuronal signaling in primary neuronal cultures grown in vitro. Results can be observed through protein localization visualization, cell morphology analysis, or electrophysiological recordings to determine how genetic changes affect cellular function.
Q6: How do voltage-gated sodium channels relate to neuronal firing?
Voltage-gated sodium channels are key molecules in neuron function that control ion movements across the cell membrane. When these channels were first cloned in the 1980s, analysis of their functional domains improved understanding of how ion movement regulation leads to neuron firing. This discovery was foundational to understanding the molecular basis of neuronal electrical activity and action potential propagation.
Q7: What does FRAP reveal about protein transport in neurons?
FRAP, or fluorescence recovery after photobleaching, measures protein transport to and from synaptic membranes. Cultured neurons are transfected with fluorescently tagged membrane proteins, then small membrane regions are photobleached to destroy fluorophores. Progressive fluorescence recovery reflects transport of new proteins into the plasma membrane, and the rate of movement can be quantified and compared across experimental conditions.
Rozdziały w tym filmie
0:00
Overview
0:53
The History of Molecular Neuroscience
3:26
Key Questions
5:49
Prominent Methods
9:02
Applications
10:55
Summary