Wstęp do neuronauki komórkowej i molekularnej

Najprostsze odruchy, jak i najwznioszejsze przeżycia emocjonalne, mają swoje źródło w strukturach molekularnych, genetycznych i komórkowych mózgu. Jako jedna z najnowszych dziedzin neuronauki, neuronauka komórkowa i molekularna wykorzystuje biologię molekularną do badania wpływu genów, cząsteczek sygnałowych i morfologii komórek na układ nerwowy

W niniejszym materiale zostaną przedstawione przełomowe odkrycia w tej dziedzinie, omówione kluczowe pytania badawcze z zakresu neuronauki komórkowej i molekularnej, a na koniec zaprezentowano kilka wiodących metod, które można zastosować w celu znalezienia odpowiedzi na te pytania.

Zacznijmy od przyjrzenia się naukowym korzeniom tej stosunkowo młodej dziedziny.

Zanim pojawiły się techniki molekularne, wczesną historią neuronauki dominowali anatomowie i biolodzy komórkowi.

Jednak w latach 30. XX wieku napływ fizyków, chemików i teoretyków w szeregi biologów zapoczątkował rewolucję molekularną, której kulminacją było odkrycie struktury DNA przez Watsona i Cricka oraz sformalizowanie dogmatu centralnego, wyjaśniającego sposób, w jaki DNA koduje białka pełniące funkcję jednostek operacyjnych komórek. Po raz pierwszy neuronaukowcy mogli zbadać rolę konkretnych genów i białek w funkcjonowaniu układu nerwowego.

Na przykład w latach 60. XX wieku Seymour Benzer zdołał powiązać zmiany behawioralne u muszek owocowych z konkretnymi mutacjami genetycznymi, identyfikując kluczowe geny ekspresjonowane w neuronach kontrolujących zachowanie, takich jak lokomocja.

W tym samym okresie Eric Kandel wykazał, że złożone procesy, takie jak uczenie się, również mają podstawy molekularne. Wykorzystując morskiego mięczaka Aplysia, przeanalizował on ekstrakty z tkanki neuronalnej i wskazał na wewnątrzkomórkową cząsteczkę sygnałową cAMP jako element szlaku krytycznego dla procesu uczenia się.

Następnie, w latach 80. XX wieku, członkowie laboratorium Shosaku Numy jako pierwsi sklonowali kluczowe cząsteczki odpowiedzialne za funkcje neuronów, takie jak napięciowo zależny kanał sodowy. Analizy domen funkcjonalnych w obrębie tych dużych białek błonowych pozwoliły od tego czasu lepiej zrozumieć, w jaki sposób kontrola przepływu jonów prowadzi do pobudzenia neuronu.

Kolejnym ważnym odkryciem w zakresie molekularnych mechanizmów komunikacji neuronalnej było odkrycie Thomasa Sudhofa z lat 90. XX wieku, który wykazał, że jony wapnia zmieniają kształt białek kotwiczących pęcherzyki wypełnione neuroprzekaźnikami do błony komórkowej, co wyjaśniło, w jaki sposób potencjały czynnościowe prowadzą do precyzyjnie zsynchronizowanego uwalniania sygnałów chemicznych do synapsy.

Od neurofizjologii po behawioryzm – odkrycia w dziedzinie molekularnej neuronauki poszerzyły naszą wiedzę w wielu dyscyplinach nauk o mózgu.

Pomimo tej owocnej historii, wciąż pozostaje wiele do odkrycia! Przejrzyjmy pytania, które są obecnie stawiane w laboratoriach.

Jeden z obszarów badań dotyczy tego, które geny wpływają na funkcje neuronów. Na przykład wiadomo, że ekspansje nukleotydowe w określonych genach są zaangażowane w kilka chorób charakteryzujących się stopniowym pogarszaniem stanu zdrowia neuronów, takich jak choroba Huntingtona.

Inna grupa badanych genów koduje czynniki transkrypcyjne: białka regulujące ekspresję określonych genów. Identyfikacja celów DNA dla czynników transkrypcyjnych specyficznych dla układu nerwowego może zapewnić nam lepszy wgląd w program genetyczny, który umożliwia nam myślenie.

Z kolei neuronaukowcy mogą pytać o to, w jaki sposób cząsteczki regulują zachowanie neuronów. Mogą na przykład badać mechanizmy molekularne regulujące ruch jonów przez błonę komórkową, co skutkuje propagacją potencjałów czynnościowych. Badania w tym zakresie dostarczyły nam środków znieczulających, takich jak lidokaina, która blokuje określone kanały jonowe i zatrzymuje przekazywanie sygnałów bólowych do mózgu.

Alternatywnie naukowcy mogą badać miejsca oddziaływania między neuronami, znane jako synapsy. Tutaj mogą pytać, jakie cząsteczki są zaangażowane w utrzymanie integralności synapsy oraz w jaki sposób połączenia te mogą zostać przywrócone w stanach chorobowych.

Plastyczność neuronalna to zdolność układu nerwowego do adaptacji chemicznej i fizycznej w odpowiedzi na doświadczenia. Niektóre badania w tej dziedzinie koncentrują się na zależnych od doświadczenia zmianach morfologicznych w rozbudowanych strukturach neuronalnych, znanych jako drzewka dendrytów, które tworzą synapsy poprzez wysoce dynamiczne struktury nazywane kolcami dendrytycznymi. Inni są zainteresowani tym, jak doświadczenie może modyfikować rozkład receptorów neurotransmiterów na błonach synaptycznych, co może wzmacniać moc sygnałową synapsy w zjawisku znanym jako długotrwałe wzmocnienie synaptyczne, czyli LTP.

Jak widać, neuronaukowcy komórkowi i molekularni podchodzą do neurobiologii z perspektywy mikroskopowej, jednak zakres badanych przez nich procesów jest niezwykle szeroki.

Po zapoznaniu się z niektórymi z fascynujących pytań, jakie stawia się w laboratoriach neuronauki komórkowej i molekularnej, przyjrzyjmy się narzędziom dostępnym do udzielenia na nie odpowiedzi.

Po pierwsze, aby zbadać genetyczną kontrolę funkcji neuronów, naukowcy dysponują bardzo skutecznymi technikami. Na przykład mikromacierze pozwalają na jednoczesne określenie poziomu ekspresji ogromnej liczby genów. Mikromacierz jest powierzchnią, do której przytwierdzono dziesiątki tysięcy krótkich fragmentów jednoniciowego DNA, tzw. sond. Materiał genetyczny wyekstrahowany z neuronu wiąże się z sondami, a markery fluorescencyjne służą do precyzyjnej wizualizacji sekwencji obecnych w próbce.

Alternatywnie, w czasie rzeczywistym lub ilościowa PCR (qPCR), wykorzystuje sprzęt umożliwiający pośredni pomiar względnej ilości specyficznych transkryptów mRNA za pomocą metody opartej na PCR. Podejście to jest niezwykle użyteczne w określaniu poziomów ekspresji poszczególnych genów.

I wreszcie, technologia transgeniczna jest istotnym narzędziem do badania funkcji genów w układzie nerwowym. Za pomocą tej metody badacze mogą tworzyć zwierzęta z usuniętymi fragmentami genomu, tzw. nokauty, lub z wprowadzonymi do kodu genetycznego zmodyfikowanymi genami, tzw. transgeniki. Tkanki układu nerwowego tych zwierząt można analizować na różne sposoby, aby określić, jak zmiany w ekspresji genów wpływają na funkcje komórkowe.

Aby badać molekularną kontrolę sygnalizacji neuronalnej, badacze często preferują analizę tkanki mózgowej poza organizmem zwierzęcia, albo w postaci małych fragmentów tkanki, albo w formie rozproszonych komórek hodowlanych in vitro nazywane pierwotnymi kulturami neuronalnymi. Jedną z zalet tego uproszczonego systemu jest możliwość efektywnej manipulacji ekspresją interesujących genów w sygnalizacji neuronalnej poprzez transfekcję. Wyniki tych manipulacji genetycznych można następnie obserwować poprzez wizualizację lokalizacji białek, analizę morfologii komórek lub rejestracje elektrofizjologiczne.

Wreszcie, gwałtowny postęp w technologiach obrazowania pozwala naukowcom badać plastyczność neuronalną w nowy, ekscytujący sposób. Na przykład badacze mogą wykorzystać mikroskopię dwufotonową do szczegółowej wizualizacji głębokich warstw żywych tkanek. Po wykonaniu „okna” w czaszce technikę tę można zastosować do obrazowania morfologii komórek mózgowych przed i po tym, jak zwierzęta przejdą określone doświadczenie, co pozwala badaczom zobaczyć, jak proces uczenia się wygląda na poziomie neuronalnym.

Narzędzia obrazowania są również wykorzystywane do badania komponentów molekularnych układu nerwowego w tkankach utrwalonych. Mikroskopia fluorescencyjna jest często stosowana w połączeniu z immunohistochemią, w której próbki barwi się przeciwciałami fluorescencyjnymi znakującymi lokalizację komórkową specyficznych białek.

Po omówieniu kluczowych pytań badawczych oraz narzędzi służących do ich rozwiązania, przyjrzyjmy się kilku zastosowaniom badań z zakresu neuronauki komórkowej i molekularnej.

Po pierwsze, stosując techniki mikromacierzy do niewielkiej populacji neuronów, badacze mogą analizować różnice w ekspresji poszczególnych genów w konkretnych podtypach neuronów. W tym przypadku z siatkówki wyizolowano pojedyncze neurony i wyekstrahowano komórkowe RNA, co pozwoliło badaczom na profilowanie ekspresji mRNA z komórek o różnych charakterystykach funkcjonalnych i morfologicznych.

Techniki molekularne można również zastosować, aby lepiej zrozumieć odpowiedź układu nerwowego na uszkodzenia. Podczas usuwania zgrubiałych zwojów tylnych korzeni nerwowych (DRG) z dorosłych myszy w celu stworzenia pierwotnych kultur neuronalnych, aksony zostają nieuchronnie przerwane. Poprzez transfekcję dysocjowanych neuronów DRG konstruktami wyciszającymi geny, możliwe jest badanie wpływu poszczególnych białek na odrastanie nowych aksonów.

Specjalistyczne techniki obrazowania mogą być wykorzystywane do badania transportu białek, takich jak receptory neurotransmiterów, do błony synaptycznej i z niej. W tym eksperymencie hodowlane neurony przeprowadzono transfekcję genem kodującym białko błonowe znakowane fluorescencyjnie. Następnie, przy użyciu mikroskopu konfokalnego, poddano fotowybieleniu niewielkie obszary błony, co oznacza zniszczenie fluoroforów w tym regionie. Przy zastosowanym tutaj schemacie wybielania, stopniowe odzyskiwanie fluorescencji, czyli FRAP, odzwierciedla transport nowych białek fluorescencyjnych do błony plazmatycznej. Szybkość tego procesu może być kwantyfikowana i porównywana w wielu różnych warunkach eksperymentalnych.

Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do neuronauki komórkowej i molekularnej. W tym filmie omówiliśmy odkrycia historyczne, dzięki którym neuronauka komórkowa i molekularna stała się dziedziną, jaką jest obecnie, niektóre kluczowe pytania badawcze w tej dziedzinie oraz techniki wykorzystywane do znalezienia odpowiedzi na te pytania.

Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie JoVE Science Education!