Wprowadzenie do neuronauki komórkowej i molekularnej

Najprostsze odruchy do najbardziej wysublimowanych przeżyć emocjonalnych są zakorzenione w molekularnych, genetycznych i komórkowych strukturach mózgu. Jako jedna z najnowszych dziedzin neuronauki, neuronauka komórkowa i molekularna wykorzystuje biologię molekularną do badania, w jaki sposób geny, cząsteczki sygnałowe i morfologia komórkowa wpływają na układ nerwowy

Ten film przedstawi przełomowe odkrycia w tej dziedzinie, odpowie na kluczowe pytania w badaniach neurobiologii komórkowej i molekularnej, a na koniec zaprezentuje kilka ważnych metod, które można zastosować, aby odpowiedzieć na te pytania.

Zacznijmy od spojrzenia wstecz na naukowe korzenie tej stosunkowo młodej dziedziny.

Zanim pojawiły się techniki molekularne, anatomowie i biolodzy komórkowi zdominowali wczesną historię neuronauki.

Jednak w latach trzydziestych XX wieku napływ fizyków, chemików i teoretyków w szeregi biologów rozpoczął rewolucję molekularną, której kulminacją było odkrycie przez Watsona i Cricka struktury DNA i sformalizowanie centralnego dogmatu, który wyjaśniał, w jaki sposób DNA koduje białka, które działają jako jednostki funkcjonalne komórek. Po raz pierwszy neurobiolodzy byli w stanie zbadać rolę, jaką określone geny i białka odgrywają w funkcjonowaniu układu nerwowego.

Na przykład w latach sześćdziesiątych Seymour Benzer był w stanie powiązać zmiany behawioralne u muszek owocowych z określonymi mutacjami genetycznymi, identyfikując kluczowe geny wyrażane w neuronach kontrolujących zachowanie, takie jak lokomocja.

W tym samym okresie Eric Kandel wykazał, że złożone procesy, takie jak uczenie się, mają również podłoże molekularne. Używając morskiego mięczaka Aplysia, przeanalizował ekstrakty z tkanki neuronalnej i zasugerował, że wewnątrzkomórkowa cząsteczka sygnalizacyjna cykliczny AMP jest w szlaku krytycznym dla uczenia się.

Następnie, w latach osiemdziesiątych, członkowie laboratorium Shosaku Numy jako pierwsi sklonowali kluczowe cząsteczki w funkcjonowaniu neuronów, takie jak kanał sodowy bramkowany napięciem. Od tego czasu analizy domen funkcjonalnych w tych dużych białkach błonowych poszerzyły naszą wiedzę na temat tego, w jaki sposób kontrola ruchów jonów prowadzi do wyzwalania neuronów.

Inne ważne odkrycie w mechanizmach molekularnych stojących za komunikacją neuronalną miało miejsce w latach 90., kiedy Thomas Sudhof odkrył, że jony wapnia zmieniają kształt białek, które zakotwiczają pęcherzyki wypełnione neuroprzekaźnikami w błonie komórkowej, wyjaśniając, w jaki sposób potencjały czynnościowe prowadzą do precyzyjnie czasowego uwalniania sygnałów chemicznych do synapsy.

Od neurofizjologii po zachowanie, odkrycia w neuronauce molekularnej poprawiły nasze zrozumienie wielu dyscyplin neuronaukowych.

Pomimo tej owocnej historii, wciąż jest wiele do nauczenia się! Przyjrzyjmy się kilku pytaniom, które są dziś zadawane w laboratoriach.

Jednym z obszarów badań jest pytanie, które geny wpływają na funkcje neuronów. Na przykład, ekspansje nukleotydów w określonych genach są znane z udziału w kilku chorobach charakteryzujących się stałym pogarszaniem się zdrowia neuronów, takich jak choroba Huntingtona.

Inna grupa badanych genów koduje czynniki transkrypcyjne: białka, które regulują ekspresję określonych genów. Identyfikacja celów DNA czynników transkrypcyjnych specyficznych dla układu nerwowego może dać nam lepszy wgląd w program genetyczny, który zmusza nas do myślenia.

Alternatywnie, neuronaukowcy mogą zapytać, w jaki sposób cząsteczki regulują zachowanie neuronów. Na przykład mogą badać maszynerię molekularną, która reguluje ruchy jonów przez błonę komórkową, co prowadzi do propagacji potencjałów czynnościowych. Badania dostarczyły nam środków znieczulających, takich jak lidokaina, która blokuje określone kanały jonowe i zatrzymuje przekazywanie sygnałów bólowych do mózgu.

Alternatywnie, naukowcy mogą zbadać miejsca interakcji między neuronami, znane jako synapsa. W tym miejscu mogą zapytać, jakie cząsteczki są zaangażowane w zachowanie integralności synapsy i jak te połączenia można przywrócić w stanach chorobowych.

Plastyczność neuronalna to zdolność układu nerwowego do chemicznej i fizycznej adaptacji w odpowiedzi na doświadczenie. Niektóre badania w tej dziedzinie koncentrują się na zależnych od doświadczenia zmianach morfologicznych w skomplikowanych strukturach neuronalnych, znanych jako altany dendrytyczne, które tworzą synapsy poprzez wysoce dynamiczne struktury zwane kolcami dendrytycznymi. Inni są zainteresowani tym, w jaki sposób doświadczenie może modyfikować rozkład receptorów neuroprzekaźników na błonach synaptycznych, co może wzmocnić moc sygnalizacyjną synapsy w zjawisku znanym jako długoterminowe wzmocnienie lub LTP.

Jak widać, neuronaukowcy komórkowi i molekularni podchodzą do neurobiologii z mikroskopowego punktu widzenia, ale zakres procesów, które badają, jest szeroki.

Teraz, gdy znasz już niektóre z ekscytujących pytań, które są zadawane w laboratoriach neuronauki komórkowej i molekularnej, przyjrzyjmy się dostępnym narzędziom, aby na nie odpowiedzieć.

Po pierwsze, aby zbadać genetyczną kontrolę funkcji neuronów, naukowcy mają do dyspozycji kilka bardzo potężnych technik. Na przykład, mikromacierze mogą określić ilościowo ekspresję ogromnej liczby genów jednocześnie. Mikromacierz to powierzchnia, do której przyczepione są dziesiątki tysięcy fragmentów jednoniciowych "sond" DNA. Materiał genetyczny wyekstrahowany z neuronu może związać się z sondami, a markery fluorescencyjne są używane do precyzyjnej wizualizacji, które sekwencje są obecne w próbce.

Alternatywnie, PCR w czasie rzeczywistym lub ilościowy, wykorzystuje sprzęt, który może pośrednio mierzyć względną ilość określonych transkryptów mRNA za pomocą metody opartej na PCR. Takie podejście jest niezwykle przydatne do wykrywania poziomów ekspresji poszczególnych genów.

Wreszcie, co nie mniej ważne, technologia transgeniczna jest ważnym narzędziem do badania funkcji genów w układzie nerwowym. Dzięki tej metodzie naukowcy mogą produkować zwierzęta z usuniętymi częściami ich genomów, znanymi jako nokautami, lub ze zmodyfikowanymi genami wstawionymi do ich kodu genetycznego, znanymi jako transgeniki. Tkanki układu nerwowego tych zwierząt mogą być analizowane na różne sposoby, aby określić, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów wpływają na funkcję komórkową.

Aby zbadać molekularną kontrolę sygnalizacji neuronalnej, naukowcy często wolą badać tkankę mózgową poza zwierzęciem, albo w małych fragmentach tkanki, albo w zdysocjowanych komórkach wyhodowanych in vitro, zwanych pierwotnymi kulturami neuronalnymi. Jedną z zalet tego uproszczonego systemu jest możliwość efektywnego manipulowania ekspresją genów będących przedmiotem zainteresowania w sygnalizacji neuronalnej poprzez transfekcję. Wyniki tych manipulacji genetycznych można następnie zaobserwować poprzez wizualizację lokalizacji białek, analizę morfologii komórek lub zapisy elektrofizjologiczne.

Wreszcie, ogromny postęp w technologii obrazowania pozwala naukowcom badać plastyczność neuronów na nowe, ekscytujące sposoby. Na przykład, naukowcy mogą użyć mikroskopii dwufotonowej do wizualizacji głębokich warstw żywych tkanek w najdrobniejszych szczegółach. Po stworzeniu "okna" w czaszce, technika ta może być wykorzystana do zobrazowania morfologii komórek mózgowych przed i po doświadczeniu zwierząt, co pozwala naukowcom zobaczyć, jak wygląda uczenie się na poziomie neuronalnym.

Narzędzia do obrazowania są również wykorzystywane do badania składników molekularnych układu nerwowego w zachowanych tkankach. Mikroskopia fluorescencyjna jest często stosowana w połączeniu z immunohistochemią, w której próbki są barwione przeciwciałami fluorescencyjnymi, które oznaczają komórkową lokalizację określonych białek.

Po zapoznaniu się zarówno z ważnymi pytaniami, jak i narzędziami użytymi do udzielenia na nie odpowiedzi, przyjrzyjmy się niektórym zastosowaniom badań nad neurobiologią komórkową i molekularną.

Po pierwsze, stosując techniki mikromacierzy do niewielkiej populacji neuronów, naukowcy mogą zbadać różnice w ekspresji różnych genów w określonych podtypach neuronów. W tym przypadku pojedyncze neurony zostały wyizolowane z siatkówki i wyekstrahowano komórkowy RNA, co pozwoliło naukowcom sprofilować ekspresję mRNA z komórek o różnych cechach funkcjonalnych i morfologicznych.

Techniki molekularne mogą być również stosowane w celu lepszego zrozumienia reakcji układu nerwowego na uraz. Kiedy zwoje korzenia grzbietowego lub DRG są usuwane z dorosłych myszy w celu pierwotnej hodowli neuronów, aksony są koniecznie odcinane. Poprzez transfekcję zdysocjowanych neuronów DRG za pomocą konstruktów wyciszających geny, możliwe jest przetestowanie wpływu poszczególnych białek na odrastanie nowych aksonów.

Specjalistyczne techniki obrazowania można wykorzystać do zbadania, w jaki sposób białka, takie jak receptory neuroprzekaźników, są transportowane do i z błony synaptycznej. W tym eksperymencie hodowane neurony transfekowano genem kodującym fluorescencyjnie znakowane białko błonowe. Za pomocą mikroskopu konfokalnego małe obszary błony zostały następnie wybielone, co oznacza, że fluorofory w tym obszarze zostały zniszczone. Dzięki zastosowanemu tutaj schematowi wybielania, postępujące odzyskiwanie fluorescencji lub FRAP odzwierciedla transport nowych białek fluorescencyjnych do błony plazmatycznej. Szybkość, z jaką zachodzi ten ruch, może być określona ilościowo i porównana w wielu warunkach eksperymentalnych.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do neuronauki komórkowej i molekularnej. W tym filmie omówiliśmy historyczne odkrycia, które sprawiły, że neuronauka komórkowa i molekularna stała się dziedziną, którą jest dzisiaj, niektóre kluczowe pytania w tej dziedzinie oraz techniki użyte do udzielenia na nie odpowiedzi.

Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie JoVE Science Education!