Ocena interakcji leukocytów-śródbłonka w warunkach przepływu w autoperfuzyjnym teście komorowym ex vivo z mikroprzepływem

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie ex vivo tętniczo-żylnego obwodu zamkniętego w celu oceny interakcji leukocytów z cząsteczkami adhezyjnymi śródbłonka w fizjologicznych warunkach przepływu. Osiąga się to poprzez uprzednie pokrycie cienkiej szklanej komory interesującą cząsteczką adhezyjną śródbłonka. W drugim kroku rurki polietylenowe i silikonowe są podłączane do komory, a następnie chirurgicznie do myszy.

Następnie krew z tętnicy szyjnej, która może przepływać przez rurkę. A późniejsze interakcje natywnych leukocytów z komorą ze szkła powlekanego są rejestrowane w czasie rzeczywistym. Ostatecznie można obliczyć w czasie wpływ różnych zabiegów na przemieszczenie i prędkość toczenia leukocytów w interakcji z unieruchomionymi cząsteczkami adhezyjnymi.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącą techniką, taką jak analiza procytometryczna, jest to, że dzięki tej technice interakcja leukocytów z cząsteczkami śródbłonka jest oceniana w fizjologicznych warunkach przepływu. Dzień przed eksperymentem podłącz jeden centymetr rurki polietylenowej PE 10 do sześciocentymetrowego kawałka rurki silikonowej, a następnie pięć centymetrów rurki polietylenowej. Aby przygotować zestaw przewodów dla strony szyjnej zwierzęcia dla strony szyjnej, podłącz rurkę, jak właśnie pokazano, z dodaniem TTU w sześciocentymetrowej silikonowej rurce, w odległości około 1,5 centymetra od jednocentymetrowej rurki polietylenowej.

Następnie podłącz jeden koniec 10-centymetrowego kawałka silikonowej rurki do przetwornika ciśnienia i włóż koniec T rurki T po stronie tętnicy szyjnej do drugiego końca. Upewnij się, że miejsca połączeń są szczelne i szczelne. Następnie użyj jednomililitrowej strzykawki podłączonej do igły o rozmiarze 25, aby zaparzyć każdą komorę mikroprzepływową świeżo przygotowanym białkiem pokrywającym powierzchnię śródbłonka i przechowuj powlekane komory w 15-mililitrowej probówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc następnego dnia.

Aby podłączyć rurkę szyjną i szyjną do komory mikroprzepływu, podłącz po jednym centymetrowym silikonowym wężyku z każdej strony komory, a następnie uszczelnij połączenia małym prostokątnym kawałkiem paramu rozciągniętym tak, gdy rurka styka się z komorą. Za pomocą strzykawki napełnić komorę i rurkę 0,1% albuminą surowicy bydlęcej. A następnie po sprawdzeniu, czy nie ma wycieków, inkubuj w komorze przez 45 minut.

W temperaturze pokojowej pod koniec inkubacji ustabilizować komorę mikroprzepływu na płytce Petriego z małą kroplą silikonu w każdym nacięciu. Następnie podłącz rurki szyjne i szyjne z każdej strony komory. Następnie, gdy silikon wysycha, podłącz strzykawkę blokującą o grubości 60 mil wypełnioną heparyną do przetwornika ciśnienia i przepuść heparynę klasy 100 USP przez rurkę i komorę, aż nie będzie pęcherzyków powietrza.

Przed podłączeniem myszy do komory mikroprzepływu należy włączyć komputer, mikroskop i odpowiednie urządzenie rejestrujące ciśnienie. Po skonfigurowaniu oprogramowania zabezpiecz mysz w wieku od 10 do 12 tygodni. W pozycji brzusznej wykonaj nożyczkami nacięcie w okolicy szyi, a następnie wypreparuj tarczycę, aby odsłonić tchawicę i naczynia.

Oczyść tętnicę szyjną, aż zostanie całkowicie odsłonięta. Uważając, aby nie uszkodzić nerwu błędnego. Następnie przełóż zgięcie złożonego kawałka szwu pod tętnicą szyjną i przetnij szew na zgięciu.

Tak więc pod tętnicą znajdują się dwa kawałki szwu. Zapętl każdy szew w węzły bez zaciskania, a następnie w ten sam sposób umieść szwy na lewą żyłę szyjną. Gdy szwy szyjne są na miejscu, wstrzyknij jeden mililitr heparyny do mięśnia IP myszy.

Po wstrzyknięciu należy zacisnąć górny szew na tętnicy szyjnej i umieścić zacisk naczynia jak najniżej na odsłoniętym odcinku tętnicy. Użyj kleszczy, aby przytrzymać tętnicę za górny szew, a następnie użyj cienkich mikronożyczek, aby wykonać małe nacięcie około jednej ósmej obwodu tętnicy w pobliżu górnego szwu. Teraz wprowadź rurkę tętnicy szyjnej za pomocą uchwytu rurki przez nacięcie wykonane w tętnicy i przepuść ją w dół przez dolny szew.

Następnie zawiąż dolny szew, a następnie górny. Tak więc tętnica jest uszczelniona wokół rurki, tworząc kilka węzłów, aby zapewnić szczelne uszczelnienie. Po powtórzeniu tej samej procedury dla rurki szyjnej, bez zacisku naczynia, tymczasowo otwórz zacisk naczynia na rurce tętnicy szyjnej, aby przetestować przepływ.

Jeśli nie ma wycieków, przesuń mysz do mikroskopu i podłącz rurkę żyły szyjnej i szyjnej do rurki komory mikroprzepływu, aby zarejestrować prędkość toczenia leukocytów przez komorę mikroprzepływu. Całkowicie zwolnij zacisk tętnicy szyjnej, aby napełnić komorę. Pozwól krwi krążyć przez trzy do pięciu minut, aby warunki przepływu się ustabilizowały.

W międzyczasie wyreguluj stolik mikroskopu tak, aby komora znajdowała się na poziomie obiektywu mikroskopu, a jej krawędź była równoległa do okna nagrywania wideo na ekranie. Następnie zbuduj szalkę Petriego z wodą o temperaturze pokojowej, a następnie opuść obiektyw 10 x zanurzenie w wodzie do naczynia, aby komórki przepływające przez komorę były widoczne, dostosowując natężenie światła zgodnie z potrzebami, aby symulować średnie fizjologiczne ciśnienie przepływu, wyreguluj zacisk na rurce, aby przetwornik odczytywał stałe 30 milimetrów słupa rtęci. Następnie naciśnij start, aby zainicjować rejestrację zarówno transportu leukocytów, jak i ciśnienia, przy pierwszym upływie czasu blisko końca szyjnego komory i przesuwając się pod prąd w kierunku końca szyjnego, aż do zakończenia.

Po zakończeniu nagrywania zamknij zawór w miejscu wejściowym, aby zatrzymać przepływ krwi i w razie potrzeby wymień komorę na nową komorę pokrytą inną cząsteczką adhezyjną. Podczas każdego nagrania w komorze widoczne są tylko oddziałujące leukocyty. Na przykład na każdym z tych obrazów białe groty strzałek wskazują pojedyncze leukocyty, które zostały przechwycone przez interesującą nas cząsteczkę adhezyjną i które toczą się wzdłuż komory wśród innych swobodnie płynących komórek.

W przepływie krwi można zobaczyć wspólny artefakt na zewnątrz komory z dużymi ciemnymi kulami na wszystkich obrazach, co może pomóc widzowi docenić ruch leukocytów w odniesieniu do ustalonego punktu. Wykres przedstawia końcowy wykres danych. Zaobserwowano, że pierwszy eksperymentalny zabieg zmniejsza prędkość toczenia widoczną jako przesunięcie w lewo, a drugi eksperymentalny zabieg zwiększa prędkość pojawiającą się jako przesunięcie w prawo, zarówno w porównaniu z kontrolną prędkością toczenia w połączeniu z tą procedurą.

Inne metody, takie jak znakowanie leukocytów i vivo x Viva, można wykorzystać do uzyskania dalszych odpowiedzi na inne pytania, takie jak udział niektórych podtypów leukocytów w progresji choroby.