Ocena interakcji leukocytów-śródbłonka w warunkach przepływu w autoperfuzyjnym teście komorowym ex vivo z mikroprzepływem
30 grudnia 2014
Tutaj prezentujemy protokół, który pozwala badaczowi ocenić dynamikę rekrutacji leukocytów ex vivo poprzez podłączenie komory pokrytej cząsteczkami adhezyjnymi pochodzącymi ze śródbłonka do układu krążenia myszy. Metoda ta ma istotne zalety, ponieważ pozwala na ocenę leukocytów we względnych warunkach biologicznych.
Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie ex vivo tętniczo-żylnego obwodu zamkniętego w celu oceny interakcji leukocytów z cząsteczkami adhezyjnymi śródbłonka w fizjologicznych warunkach przepływu. Osiąga się to poprzez uprzednie pokrycie cienkiej szklanej komory interesującą cząsteczką adhezyjną śródbłonka. W drugim kroku rurki polietylenowe i silikonowe są podłączane do komory, a następnie chirurgicznie do myszy.
Następnie krew z tętnicy szyjnej, która może przepływać przez rurkę. A późniejsze interakcje natywnych leukocytów z komorą ze szkła powlekanego są rejestrowane w czasie rzeczywistym. Ostatecznie można obliczyć w czasie wpływ różnych zabiegów na przemieszczenie i prędkość toczenia leukocytów w interakcji z unieruchomionymi cząsteczkami adhezyjnymi.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącą techniką, taką jak analiza procytometryczna, jest to, że dzięki tej technice interakcja leukocytów z cząsteczkami śródbłonka jest oceniana w fizjologicznych warunkach przepływu. Dzień przed eksperymentem podłącz jeden centymetr rurki polietylenowej PE 10 do sześciocentymetrowego kawałka rurki silikonowej, a następnie pięć centymetrów rurki polietylenowej. Aby przygotować zestaw przewodów dla strony szyjnej zwierzęcia dla strony szyjnej, podłącz rurkę, jak właśnie pokazano, z dodaniem TTU w sześciocentymetrowej silikonowej rurce, w odległości około 1,5 centymetra od jednocentymetrowej rurki polietylenowej.
Następnie podłącz jeden koniec 10-centymetrowego kawałka silikonowej rurki do przetwornika ciśnienia i włóż koniec T rurki T po stronie tętnicy szyjnej do drugiego końca. Upewnij się, że miejsca połączeń są szczelne i szczelne. Następnie użyj jednomililitrowej strzykawki podłączonej do igły o rozmiarze 25, aby zaparzyć każdą komorę mikroprzepływową świeżo przygotowanym białkiem pokrywającym powierzchnię śródbłonka i przechowuj powlekane komory w 15-mililitrowej probówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc następnego dnia.
Aby podłączyć rurkę szyjną i szyjną do komory mikroprzepływu, podłącz po jednym centymetrowym silikonowym wężyku z każdej strony komory, a następnie uszczelnij połączenia małym prostokątnym kawałkiem paramu rozciągniętym tak, gdy rurka styka się z komorą. Za pomocą strzykawki napełnić komorę i rurkę 0,1% albuminą surowicy bydlęcej. A następnie po sprawdzeniu, czy nie ma wycieków, inkubuj w komorze przez 45 minut.
W temperaturze pokojowej pod koniec inkubacji ustabilizować komorę mikroprzepływu na płytce Petriego z małą kroplą silikonu w każdym nacięciu. Następnie podłącz rurki szyjne i szyjne z każdej strony komory. Następnie, gdy silikon wysycha, podłącz strzykawkę blokującą o grubości 60 mil wypełnioną heparyną do przetwornika ciśnienia i przepuść heparynę klasy 100 USP przez rurkę i komorę, aż nie będzie pęcherzyków powietrza.
Przed podłączeniem myszy do komory mikroprzepływu należy włączyć komputer, mikroskop i odpowiednie urządzenie rejestrujące ciśnienie. Po skonfigurowaniu oprogramowania zabezpiecz mysz w wieku od 10 do 12 tygodni. W pozycji brzusznej wykonaj nożyczkami nacięcie w okolicy szyi, a następnie wypreparuj tarczycę, aby odsłonić tchawicę i naczynia.
Oczyść tętnicę szyjną, aż zostanie całkowicie odsłonięta. Uważając, aby nie uszkodzić nerwu błędnego. Następnie przełóż zgięcie złożonego kawałka szwu pod tętnicą szyjną i przetnij szew na zgięciu.
Tak więc pod tętnicą znajdują się dwa kawałki szwu. Zapętl każdy szew w węzły bez zaciskania, a następnie w ten sam sposób umieść szwy na lewą żyłę szyjną. Gdy szwy szyjne są na miejscu, wstrzyknij jeden mililitr heparyny do mięśnia IP myszy.
Po wstrzyknięciu należy zacisnąć górny szew na tętnicy szyjnej i umieścić zacisk naczynia jak najniżej na odsłoniętym odcinku tętnicy. Użyj kleszczy, aby przytrzymać tętnicę za górny szew, a następnie użyj cienkich mikronożyczek, aby wykonać małe nacięcie około jednej ósmej obwodu tętnicy w pobliżu górnego szwu. Teraz wprowadź rurkę tętnicy szyjnej za pomocą uchwytu rurki przez nacięcie wykonane w tętnicy i przepuść ją w dół przez dolny szew.
Następnie zawiąż dolny szew, a następnie górny. Tak więc tętnica jest uszczelniona wokół rurki, tworząc kilka węzłów, aby zapewnić szczelne uszczelnienie. Po powtórzeniu tej samej procedury dla rurki szyjnej, bez zacisku naczynia, tymczasowo otwórz zacisk naczynia na rurce tętnicy szyjnej, aby przetestować przepływ.
Jeśli nie ma wycieków, przesuń mysz do mikroskopu i podłącz rurkę żyły szyjnej i szyjnej do rurki komory mikroprzepływu, aby zarejestrować prędkość toczenia leukocytów przez komorę mikroprzepływu. Całkowicie zwolnij zacisk tętnicy szyjnej, aby napełnić komorę. Pozwól krwi krążyć przez trzy do pięciu minut, aby warunki przepływu się ustabilizowały.
W międzyczasie wyreguluj stolik mikroskopu tak, aby komora znajdowała się na poziomie obiektywu mikroskopu, a jej krawędź była równoległa do okna nagrywania wideo na ekranie. Następnie zbuduj szalkę Petriego z wodą o temperaturze pokojowej, a następnie opuść obiektyw 10 x zanurzenie w wodzie do naczynia, aby komórki przepływające przez komorę były widoczne, dostosowując natężenie światła zgodnie z potrzebami, aby symulować średnie fizjologiczne ciśnienie przepływu, wyreguluj zacisk na rurce, aby przetwornik odczytywał stałe 30 milimetrów słupa rtęci. Następnie naciśnij start, aby zainicjować rejestrację zarówno transportu leukocytów, jak i ciśnienia, przy pierwszym upływie czasu blisko końca szyjnego komory i przesuwając się pod prąd w kierunku końca szyjnego, aż do zakończenia.
Po zakończeniu nagrywania zamknij zawór w miejscu wejściowym, aby zatrzymać przepływ krwi i w razie potrzeby wymień komorę na nową komorę pokrytą inną cząsteczką adhezyjną. Podczas każdego nagrania w komorze widoczne są tylko oddziałujące leukocyty. Na przykład na każdym z tych obrazów białe groty strzałek wskazują pojedyncze leukocyty, które zostały przechwycone przez interesującą nas cząsteczkę adhezyjną i które toczą się wzdłuż komory wśród innych swobodnie płynących komórek.
W przepływie krwi można zobaczyć wspólny artefakt na zewnątrz komory z dużymi ciemnymi kulami na wszystkich obrazach, co może pomóc widzowi docenić ruch leukocytów w odniesieniu do ustalonego punktu. Wykres przedstawia końcowy wykres danych. Zaobserwowano, że pierwszy eksperymentalny zabieg zmniejsza prędkość toczenia widoczną jako przesunięcie w lewo, a drugi eksperymentalny zabieg zwiększa prędkość pojawiającą się jako przesunięcie w prawo, zarówno w porównaniu z kontrolną prędkością toczenia w połączeniu z tą procedurą.
Inne metody, takie jak znakowanie leukocytów i vivo x Viva, można wykorzystać do uzyskania dalszych odpowiedzi na inne pytania, takie jak udział niektórych podtypów leukocytów w progresji choroby.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół oceny dynamiki rekrutacji leukocytów ex vivo przy użyciu komory mikroprzepływowej połączonej z układem krwionośnym myszy. Metoda ta umożliwia obserwację w czasie rzeczywistym oddziaływań leukocytów z cząsteczkami adhezyjnymi śródbłonka w fizjologicznych warunkach przepływu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Biologia naczyń krwionośnych
Wprowadzenie
- Rekrutacja leukocytów ma kluczowe znaczenie dla odpowiedzi odpornościowej.
- Zrozumienie oddziaływań między leukocytami a śródbłonkiem może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
- Istniejące techniki mogą nie odzwierciedlać w sposób dokładny warunków fizjologicznych.
- Niniejszy protokół ma na celu wyeliminowanie tych ograniczeń.
Cel badania
- Opracowanie metody do oceny dynamiki leukocytów w czasie rzeczywistym.
- Ocena wpływu różnych zabiegów na zachowanie leukocytów.
- Pogłębienie wiedzy na temat interakcji leukocytów w warunkach przepływu.
Zastosowane metody
- Powlekanie szklanej komory cząsteczkami adhezyjnymi śródbłonka.
- Podłączenie komory do układu krążenia myszy.
- Infuzja krwi i rejestracja oddziaływań leukocytów.
- Analiza prędkości toczenia i przemieszczania się leukocytów.
Główne wyniki
- Osiągnięto wizualizację interakcji leukocytów w czasie rzeczywistym.
- Ilościowo określono prędkość toczenia oraz przemieszczenie leukocytów.
- Metoda wykazała przewagę nad tradycyjnymi technikami.
- Z powodzeniem utrzymano fizjologiczne warunki przepływu.
Wnioski
- Niniejszy protokół przedstawia niezawodną metodę badania dynamiki leukocytów.
- Można go zastosować w przypadku różnych terapii wpływających na zachowanie leukocytów.
- Technika ta pogłębia naszą wiedzę na temat odpowiedzi immunologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Badanie oddziaływań leukocytów z endotelium w warunkach fizjologicznego przepływu jest kluczowe dla minimalizacji ryzyka związanego z celami terapeutycznymi w chorobach zapalnych oraz dla weryfikacji hipotez mechanistycznych we wczesnej fazie odkrywania leków. Ten test z wykorzystaniem autoperfuzyjnej komory mikroprzepływowej ex vivo umożliwia kwantyfikację prędkości toczenia się leukocytów w czasie rzeczywistym, zapewniając wiarygodną wartość prognostyczną w walidacji celu i wspierając decyzje typu go/no-go w programach przedklinicznych. Dzięki zachowaniu naturalnej funkcji leukocytów i uniknięciu artefaktów wynikających z manipulacji ex vivo, metoda ta zwiększa ciągłość translacyjną od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez ocenę ekspresji funkcjonalnej cząsteczek adhezyjnych leukocytów pod wpływem fizjologicznego naprężenia ścinającego.
- Wartość operacyjna: Umożliwienie biologicznej redukcji ryzyka poprzez bezpośredni pomiar prędkości toczenia się leukocytów jako funkcjonalnego odczytu aktywności cząsteczek adhezyjnych.
- Wartość prognostyczna: Wsparcie selekcji projektów w portfolio poprzez kwantyfikację zaangażowania celu oraz efektów mechanistycznych związków immunomodulujących w systemie odpowiadającym kondycjom chorobowym.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne do dalszych badań przesiewowych poprzez ustalenie bazowych profili interakcji leukocytów w warunkach kontrolowanego przepływu.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane, powtarzalne wyniki ilościowe (prędkość toczenia, przemieszczenie), umożliwiając rzetelną ocenę związków w ramach poszczególnych serii badań.
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy do testowania wielu cząsteczek adhezyjnych lub kandydatów terapeutycznych w spójnym środowisku fizjologicznym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje istotność w kontekście choroby poprzez wykorzystanie natywnych leukocytów krwi obwodowej od znieczulonych myszy, co pozwala na zachowanie stanów komórkowych zbliżonych do warunków in vivo.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej poprzez pomiar wyników funkcjonalnych, które można bezpośrednio przełożyć na punkty końcowe w mikroskopii intravitalnej.
- Łagodzenie ryzyka: Pozwala na podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju w oparciu o analizę ryzyka poprzez identyfikację związków zmieniających oddziaływania leukocytarno-śródbłonkowe w warunkach przepływu przed kosztownymi badaniami in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu po identyfikację wiodących związków – umożliwiając redukcję ryzyka mechanistycznego przed przesiewami fenotypowymi lub przedklinicznymi badaniami skuteczności.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez kwantyfikację dynamiki adhezji leukocytów w warunkach przepływu fizjologicznego, co redukuje niejednoznaczność w analizie mechanizmów.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanemu powlekaniu komory i stabilizacji przepływu, co gwarantuje powtarzalne pomiary interakcji leukocytów.
- Analityka: Generuje ilościowe wyniki (prędkość toczenia, przemieszczenie) za pomocą analizy w programie ImageJ, umożliwiając obiektywne porównanie efektów traktowania w różnych warunkach doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Zapewniają ciągłość przedkliniczną poprzez wykorzystanie natywnych populacji leukocytów, co zachowuje istotność fizjologiczną dla ekstrapolacji do modeli zapalenia in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku narzędzie do przesiewania wielu celów lub związków, co redukuje konieczność redundantnego opracowywania modeli i zwiększa efektywność przepływu pracy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez pomiar funkcjonalnego zachowania leukocytów pod wpływem naprężenia ścinającego, co redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich uzyskiwanych w testach statycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki kontrolowanym warunkom przepływu (30 mmHg) oraz obrazowaniu w czasie rzeczywistym, co minimalizuje zmienność między eksperymentami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie wczesnych wglądów mechanistycznych, co zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach programów dotyczących chorób zapalnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia ustalanie priorytetów z uwzględnieniem ryzyka poprzez kwantyfikację efektów modulacji celu, wspierając decyzje o dalszym rozwoju oparte na danych w liniach badawczych nad immunomodulacją.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy z zakresu mikrochirurgii, mikroskopii witalnej oraz regulacji ciśnienia hemodynamicznego w celu utrzymania stabilnych obwodów tętniczo-żylnych ex vivo.
- Zależny od specjalistycznego instrumentarium, w tym przetwornika ciśnienia, regulatora przepływu Harvard Apparatus oraz obiektywu imersyjnego do wizualizacji leukocytów.
- Wymaga standaryzacji protokołów powlekania komory, przygotowania rurek oraz procedur heparynizacji pomiędzy zespołami w celu zapewnienia spójnego przepływu fizjologicznego.
- Obejmuje kwestie adaptacyjne podczas testowania różnych cząsteczek adhezyjnych śródbłonka lub podtypów leukocytów, co wymaga walidacji wydajności i specyficzności powlekania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują złożoność techniczną chirurgicznej kanulacji naczyń oraz konieczność stosowania modeli mysich utrzymywanych w znieczuleniu, co może ograniczać wydajność badań.
