Name: Technika rozszerzania starterów oparta na fluorescencji w celu określenia punktów wyjściowych transkrypcji i miejsc cięcia RNaz in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Poznaj metodę rozszerzania starterów opartą na fluorescencji do identyfikacji punktów startowych transkrypcji i miejsc cięcia RNA in vivo w bakteriach. Technika wykorzystuje zautomatyzowany sekwenator żelowy do szybkiej analizy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Anne Wochele za jej pomoc w laboratorium i Verze Augsburger za pomoc z automatycznym sekwencerem żelowym. Dziękujemy Deutsche Forschungsgemeinschaft za dofinansowanie w formie dotacji BE4038/2 i BE4038/5 w ramach "programów priorytetowych" SPP1316 i SPP1617.

<ol><li>Simpson, C. G., Brown, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+extension+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Primer extension assay.</a> Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).</li>
<li>Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescently+labeled+oligonucleotide+extension%3A+a+rapid+and+quantitative+protocol+for+primer+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension.</a> Biotechniques. 35, 90-94 (2003).</li>
<li>Schuster, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mazEF+Toxin-Antitoxin+Homologue+from+Staphylococcus+equorum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum.</a> J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).</li>
<li>Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+paralogous+yefM-yoeB+loci+from+Staphylococcus+equorum+encode+functional+toxin-antitoxin+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems.</a> Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea.</a> Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).</li>
<li>Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+are+ubiquitous+and+versatile+modulators+of+prokaryotic+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate.</a> FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).</li>
<li>Goeders, N., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+as+multilevel+interaction+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems.</a> Toxins. 6, 304-324 (2014).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+interferases%2C+sequence-specific+endoribonucleases+from+the+toxin-antitoxin+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+molecular+biology+and+translational+science%22%5BJournal%5D)">mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems.</a> Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).</li>
<li>Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+MazF-bs+%28EndoA%29+is+a+UACAU-specific+mRNA+interferase%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase.</a> FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Staphylococcus+aureus+MazF+specifically+cleaves+a+pentad+sequence%2C+UACAU%2C+which+is+unusually+abundant+in+the+mRNA+for+pathogenic+adhesive+factor+SraP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP.</a> J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA+interferases%2C+MazF-mt3+and+MazF-mt7+from+Mycobacterium+tuberculosis+target+unique+pentad+sequences+in+single-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA.</a> Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).</li>
<li>Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+MazFSa%2C+an+endoribonuclease+from+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus.</a> J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).</li>
<li>Marmur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+the+isolation+of+deoxyribonucleic+acid+from+micro-organisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms.</a> J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).</li>
<li>Emory, S. A., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ompA+5%27+untranslated+RNA+segment+functions+in+Escherichia+coli+as+a+growth-rate-regulated+mRNA+stabilizer+whose+activity+is+unrelated+to+translational+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency.</a> J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).</li>
<li>Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+promoters+for+the+ompA+gene+which+encodes+a+major+outer+membrane+protein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli.</a> Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).</li>
<li>Schleifer, K. H., Kilpper-Bälz, R., Devriese, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+arlettae+sp.+nov.%2C+S.+equorum+sp.+nov.+and+S.+kloosii+sp.+nov.%3A+Three+New+Coagulase-Negative%2C+Novobiocin-Resistant+Species+from+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals.</a> Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 Forthcoming.</li>
<li>Yu, H., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+HIV-1+and+avian+myeloblastosis+virus+reverse+transcriptase+fidelity+on+RNA+and+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates.</a> J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).</li>
<li>Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+the+use+of+radioactivity+by+fluorescence+for+biochemical+studies+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA.</a> RNA. 13, 2042-2050 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia, co mogłoby stanowić konflikt interesów.

Wydłużenie startera fluorescencyjnego jest prostą i szybką metodą określania końców 5' RNA, zarówno w celu identyfikacji przetwarzania TSP, jak i wtórnego przetwarzania RNA. Dzięki zastosowaniu starterów fluorescencyjnych, reakcje mogą być zapoczątkowane i przebiegać bez dodatkowych środków ostrożności (w przeciwieństwie do starterów znakowanych radioaktywnie). Ponieważ próbki są wykrywane za pomocą fluorescencji, można je obrazować w trakcie elektroforezy, co pozwala na szybką analizę w porównaniu z metodami radioaktywn...

Rozszerzanie startera1 jest metodą molekularną służącą do określania końców 5’ specyficznych cząsteczek RNA z rozdzielczością do jednego nukleotydu. Przewagą nad innymi metodami, takimi jak 5’-RACE (szybka amplifikacja końców cDNA), jest krótki czas analizy oraz możliwość łatwego badania mieszaniny cząsteczek RNA o różnej długości.
Metoda ta polega na poddaniu cząsteczek RNA reakcjom odwrotnej transkrypcji z użyciem specyficznych fluorescencyjnych starterów, co prowadzi do wytworzenia fragmentów cDNA o określonych długościach. Cząsteczki cDNA te są rozdzielane równolegle z tradycyjnymi reakcjami sekwencjonowania metodą Sangera2 na denaturujących żelach poliakrylamidowych i mogą być wykrywane dzięki ich fluorescencji wynikającej z zastosowania starterów znakowanych fluorescencyjnie. Następnie długości fragmentów cDNA są oceniane poprzez porównanie ich z drabiną sekwencjonującą, co umożliwia mapowanie końców 5’ RNA.
Tradycyjnie reakcje wydłużania starterów stosuje się wraz z izotopami promieniotwórczymi w celu wykrywania cząsteczek cDNA na kliszach rentgenowskich. Ze względu na zagrożenia dla zdrowia, problemy z utylizacją odpadów oraz łatwość obsługi, nowsze protokoły wykorzystują fluorescencję do detekcji wydłużenia starterów za pomocą automatycznych sekwenatorów, mimo że ich czułość jest nieco niższa. Dzięki zastosowaniu starterów znakowanych fluorescencyjnie można pominąć powtarzalną procedurę znakowania radioizotopowego, ponieważ startery fluorescencyjne są stabilne przez długi czas (w naszych doświadczeniach przez ponad rok).
Opisana tutaj metoda wykorzystuje zautomatyzowany sekwenator żelowy, jednak po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji do separacji i detekcji cDNA można użyć również sekwenatorów kapilarnych3. Równoległy charakter analizy żelowej umożliwia wykrycie nawet niewielkiej ilości rozszczepienia lub przetwarzania RNA. Kolejną zaletą jest wysoka rozdzielczość tej metody, która pozwala na wykrycie rozszczepienia lub przetwarzania terminalnego nawet jednej zasady.
W odniesieniu do wykrywania rozszczepienia lub procesowania RNA, zazwyczaj wyróżnia się dwa różne typy wydłużania starterów. W jednym przypadku obróbka enzymatyczna jest przeprowadzana in vitro z użyciem oczyszczonego RNA i oczyszczonego enzymu, natomiast w drugim procesowanie zachodzi in vivo, a następnie oczyszcza się otrzymane RNA. W obu przypadkach RNA poddawane jest wydłużaniu starterów przeprowadzanemu in vitro, jednak w zależności od źródła RNA, metodę tę nazywa się wydłużaniem starterów in vitro lub in vivo. W prezentowanym tutaj protokole skupiamy się wyłącznie na wydłużaniu starterów in vivo ze względu na łatwość zastosowania (brak konieczności użycia oczyszczonych białek) oraz możliwość jednoczesnego określenia punktów startu transkrypcji i procesowania. Niemniej jednak wydłużanie starterów in vitro jest w zasadzie organizowane w ten sam sposób, a niniejszy protokół może służyć jako punkt wyjścia.
Metoda przedstawiona w niniejszym materiale może być zastosowana do wielu gatunków bakterii, o ile umożliwiają one przygotowanie kwasów nukleinowych o wysokiej czystości i wysokiej wydajności.
Badania w naszym laboratorium koncentrują się na zakresie regulacyjnym systemów toksyna-antytoksyna (TA-)4,5, w których szeroko stosowana jest metoda przedłużania startera. Systemy TA- to niewielkie elementy genetyczne występujące w genomach prokariotycznych, składające się ze stabilnego i endogennie aktywnego białka toksycznego oraz zazwyczaj niestabilnego białka lub RNA antytoksyny, która przeciwdziała toksyczności6,7. Aktywność toksyny jest czasem wywierana poprzez hamowanie replikacji, syntezy ściany komórkowej lub inne mechanizmy, lecz najczęściej odbywa się to poprzez aktywność RNazy8,9. Zazwyczaj specyficzność RNazy określa się poprzez przeprowadzenie różnych testów, z których jednym jest metoda przedłużania startera. Reakcje przedłużania startera są dobrze dostosowane do tego zastosowania, ponieważ mieszaninę fragmentów przeciętych i pełnowymiarowych można analizować jednocześnie w celu wyznaczenia ich końców 5’. Dzięki zastosowaniu mieszanych analiz przedłużania startera in vitro oraz in vivo można określić specyficzne cięcie RNazy toksyny, np. specyficzność sekwencji10-13.
<img alt="Schemat metody elongacji startera: izolacja RNA, odwrotna transkrypcja, sekwencjonowanie metodą Sangera, elektroforeza w żelu." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przegląd procedury elongacji startera. Hodowle bakteryjne są inkubowane i traktowane zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi. Z komórek ekstrahuje się całkowite RNA, które następnie traktuje się DNazą I w celu usunięcia śladów DNA i poddaje reakcji odwrotnej transkrypcji z użyciem specyficznych dla celu fluorescencyjnych starterów DNA, co prowadzi do otrzymania cDNA. DNA genomowe lub plazmidy są ekstrahowane i następnie wykorzystywane w fluorescencyjnych reakcjach sekwencjonowania metodą Sangera w celu porównania wielkości z fragmentami cDNA. Produkty elongacji startera są rozdzielane wraz z produktami sekwencjonowania metodą Sangera w denaturującym żelu poliakryloamidowym z mocznikiem i analizowane za pomocą zautomatyzowanego lasera i mikroskopu. Zasada sekwencjonowania, która pokrywa się z prążkiem cDNA, stanowi ostatnią zasadę 5’ końca cDNA (niebieska strzałka). Więcej informacji w Fekete, et al. 3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Przegląd całej procedury wydłużania startera przedstawiono na Rysunku 1. W skrócie: komórki bakteryjne są hodowane, zbierane, a następnie pellet komórkowy poddawany lizie w celu ekstrakcji RNA. Oczyszczone RNA traktuje się DNazą I, aby usunąć ślady cząsteczek DNA, które mogłyby służyć jako matryce dla odwrotnej transkryptazy. Do RNA dodaje się specyficzne fluorescencyjne startery, które hybrydyzują z regionem zainteresowania, a następnie podlegają odwrotnej transkrypcji, w wyniku czego powstaje jednoniciowe komplementarne DNA (cDNA). Drabina sekwencyjna jest tworzona metodą tradycyjnego sekwencjonowania Sangera z wykorzystaniem fluorescencyjnych starterów i rozdzielana na denaturującym żelu poliakrylamidowym wraz z fragmentami cDNA powstałymi w wyniku wydłużania startera. Uzyskany żel analizuje się poprzez porównanie prążków fluorescencyjnych, co pozwala na identyfikację interesujących końców 5’. Punkty rozpoczęcia transkrypcji oraz miejsca procesowania są następnie oceniane indywidualnie poprzez porównania sekwencji.

<table><tbody><tr><td>Odwrotna transkryptaza AMV (20-25 U/&mikro; l)</td> <td>NEB / Roche</td><td>NEB: M0277-T / Roche: 10109118001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (bez RNazy)</td><td>Ambion (technologie życia)</td><td>Instrument AM2222</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep-24&nbsp;</td><td>MPBio</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>Podkłady znakowane fluorescencyjnie</td><td>Biomery</td><td>n/a</td><td>5' Modyfikacja DY-681 " zwyczajny" Oligonukleotydy DNA. Kompatybilne barwniki, takie jak LICOR IRDye 700/800, są również dostępne u innych dostawców, takich jak IDTdna.</td></tr><tr><td>Li-Cor 4200 Sequencer wraz z oprogramowaniem do zbierania danych ImagIR</td><td>Li-Cor</td><td></td><td>Produkt wycofany</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Ambion (technologie życia)</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania plazmidu</td><td>mini QIAGEN</td><td>12125</td><td></td></tr><tr><td>RapidGel-XL-40% Koncentrat</td><td>USB</td><td>US75863</td><td></td></tr><tr><td>BFOR PAMIĘCI RNA</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM7000</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Aqua-P/C/I</td><td>Carl Roth</td><td>X985.3</td><td>Alternatywa: " Kwas-fenol:Chloroform, pH 4,5 (z IAA, 125:24:1)" od Ambion (AM9720)</td></tr><tr><td>SUPERase&bull; In RNase Inhibitor</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Sequenase znakowany fluorescencyjnie zestaw do sekwencjonowania cyklu startera z 7-deaza-dGTP</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2538</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol reagent</td><td>life technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki cyrkonowe/krzemionkowe 0,1 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079101z</td><td></td></tr></tbody></table>

technika rozszerzania starterów oparta na fluorescencji w celu określenia punktów wyjściowych transkrypcji i miejsc cięcia rnaz in vivo

Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

Rozszerzenie startera oparte na fluorescencji (FPE) to metoda molekularna do określania punktów początkowych transkrypcji lub miejsc przetwarzania cząsteczek RNA. Osiąga się to poprzez odwrotną transkrypcję interesującego RNA przy użyciu specyficznych starterów znakowanych fluorescencyjnie, a następnie analizę powstałych fragmentów cDNA poprzez denaturację elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Jednocześnie na żelu przeprowadzana jest tradycyjna reakcja sekwencjonowania Sangera w celu zmapowania końców fragmentów cDNA na ich dokładne odpowiadające im zasady. W przeciwieństwie do 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), gdzie produkt musi zostać sklonowany, a wielu kandydatów zsekwencjonowanych, większość fragmentów cDNA generowanych przez wydłużenie startera może być jednocześnie wykryta w jednym przebiegu żelu. Ponadto cała procedura (od odwrotnej transkrypcji do końcowej analizy wyników) może zostać zrealizowana w ciągu jednego dnia roboczego. Dzięki zastosowaniu starterów znakowanych fluorescencyjnie można uniknąć stosowania niebezpiecznych odczynników znakowanych izotopami promieniotwórczymi, a czas przetwarzania jest skrócony, ponieważ produkty mogą być wykrywane podczas procedury elektroforezy.
W poniższym protokole opisujemy metodę rozszerzania startera fluorescencyjnego in vivo, aby niezawodnie i szybko wykryć końcówki 5' RNA, aby wydedukować punkty początkowe transkrypcji i miejsca przetwarzania RNA (np. przez składniki systemu toksyna-antytoksyna) w S. aureus, E. coli i innych bakteriach.

Jak przedstawiono na Rysunku 6, reakcję wydłużania startera można wykorzystać do określenia punktów startu transkrypcji interesujących transkryptów, co może pomóc w wywnioskowaniu regionów promotorowych (zazwyczaj identyfikowanych przez elementy -10 i -35). Najwyższy (najdłuższy) fragment cDNA reprezentuje koniec 5’ mRNA, a zatem może zostać łatwo zmapowany w porównaniu z drabiną sekwencyjną.
<img alt="transkrypcja ompA, cięcie; wynik elektroforezy żelowej; analiza ekspresji g...

Opisujemy tutaj metodę rozszerzania startera opartą na fluorescencji, aby określić punkty początkowe transkrypcji na podstawie bakteryjnych transkryptów i przetwarzania RNA in vivo za pomocą automatycznego sekwenatora żelowego.

Technika rozszerzania starterów oparta na fluorescencji w celu określenia punktów wyjściowych transkrypcji i miejsc cięcia RNaz in vivo

Fluorescence based primer extension (FPE) is a molecular method to determine transcriptional starting points or processing sites of RNA molecules. This is ...

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja transkrypcyjnych punktów początkowych i miejsc rozszczepienia RNA in vivo od bakterii za pomocą reakcji wydłużania starterów fluorescencyjnych. Osiąga się to poprzez wczesną hodowlę bakterii, takich jak E. coli lub S. aria, i wyizolowanie cząsteczek RNA. Następnie RNA jest poddawane odwrotnej transkrypcji przy użyciu specyficznych starterów fluorescencyjnych i odwrotnej transkryptazy, w wyniku czego powstają fragmenty CD NA.Następnie DNA lub plazmidy są izolowane z komórek bakteryjnych, a z matrycy DNA za pomocą zestawu do sekwencjonowania tworzona jest fluorescencyjna drabinka sekwencjonowania Sangera. Na koniec fragmenty CDNA i drabinki sekwencjonowania są rozdzielane i jednocześnie wykrywane w żelu poliakrylowym za pomocą zautomatyzowanego sekwencera żelowego i porównywane ze sobą. Ostatecznie rozszerzenie startera fluorescencyjnego służy do mapowania pięciu pierwszych końców cząsteczek RNA do rozdzielczości jednej zasady.Główną przewagą tej techniki nad innymi metodami, takimi jak rozszerzenie pierwotne oparte na rasie lub radioaktywności, jest szybka identyfikacja pięciu od końca cząsteczek RNA, ponieważ detekcja odbywa się jednocześnie podczas elektroforezy. Czułość jest podobna do rozszerzeń pierwotnych opartych na aktywności czerwonej, ale umożliwia personelowi laboratoryjnemu stosowanie tej metody bez konieczności odbywania szkolenia w zakresie bezpieczeństwa promieniowania. Z powodzeniem wykorzystaliśmy tę technikę fluorescencyjnego pierwotnego wydłużenia do zbadania składników RNA w systemach antytoksyn toksynowych.Staphylococki zademonstrują procedurę Christopher Schuster, doktorant z mojego laboratorium. Po przygotowaniu wysokiej wydajności RNA i zaprojektowaniu starterów zgodnie z protokołem tekstowym, należy przeprowadzić reakcję przedłużania startera, najpierw podgrzewając termocykler do 95 stopni Celsjusza. Dla każdej próbki RNA wymieszać następujące związki w probówce do PCR, denaturować próbki przez jedną minutę w temperaturze 95 stopni Celsjusza.Następnie umieść probówki na lodzie na pięć minut, aby zhybrydyzować startery i RNA. Następnie ustaw maszynę do PCR na 47 stopni Celsjusza. Następnie przygotuj główny miks do odwrotnej transkrypcji, jak opisano tutaj.Dodaj cztery mikrolitry, główną mieszankę odwrotnej transkrypcji do każdej zhybrydyzowanej próbki RNA i inkubuj probówki przez godzinę w temperaturze 47 stopni Celsjusza. Aby zatrzymać reakcję, podgrzej próbki do 95 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Następnie dodaj sześć mikrolitrów barwnika amidowego i przechowuj przez noc lub do dwóch tygodni w ciemności w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Po przygotowaniu genomowego DNA lub plazmidów, zgodnie z protokołem tekstowym, należy zmontować reakcję sekwencjonowania Sangera, mieszając 12 mikrolitrów około 10 do 15 mikrogramów genomowego DNA lub 100 do 500 nanogramów plazmidowego DNA z jednym mikrolitrem znakowanego fluorescencyjnie startera i jednym mikrolitrem pipety DMSO. Jeden mikrolitr każdego sekwencjonowania wymieszać do oddzielnych wstępnie znakowanych probówek do PCR. Następnie dodaj trzy mikrolitry mieszanki starterów D-N-A-D-M-S-O do każdej tubki.Ustaw maszynę do PCR na następujący program i uruchom ją po umieszczeniu próbek w maszynie. Po przebiegu dodaj sześć mikrolitrów barwnika ładującego do próbek, a następnie na lód. W przypadku używania od razu lub długotrwałego w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przy użyciu czystych, bezpyłowych płyt o średnicy 25 centymetrów, umieść przekładki o grubości 0,25 milimetra na tylnej płycie szklanej i opuść karbowaną szklaną płytkę na górze z karbowanym końcem szklanych płyt i pilotami wejść szynowych skierowanymi do góry.Przymocuj szyny żelowe po obu stronach szklanych płytek i lekko dokręć pokrętła, aby odlać żel. Połącz wymienione tutaj związki w zlewce z mieszadłem i umieść na magnetycznej płytce mieszającej. Natychmiast po dodaniu PS i zespoleniu użyj strzykawki o pojemności 50 mililitrów, aby pobrać roztwór akrylamidu i umieść filtr 0,45 nanometra na końcówce.Umieść ułożone warstwowo płytki pod kątem 10 do 20 stopni i powoli dozuj roztwór żelu między szklane płytki, ciągle przesuwając końcówkę strzykawki z jednej strony na drugą. Przestań dozować roztwór żelu, gdy zetknie się z dolnym końcem szklanych płytek. Za pomocą haczyka bąbelkowego usuń wszelkie bąbelki, które mogły się utworzyć.Następnie wsuń przekładkę kieszeni żelowej między szklane płytki na karbowanym końcu, zanurzając ją w roztworze żelu i mocując ją poprzez przymocowanie płyty odlewniczej, lekko dokręć górne szyny i pozwól żelowi zastygnąć przez jedną do dwóch godzin. Przed wyjęciem płytki odlewniczej i przekładki kieszeniowej użyj destylowanej wody dejonizowanej, aby oczyścić kieszeń z soli i resztek żelu, aby uruchomić żel. Wsuń uchwyt zbiornika buforowego w szyny żelowe na przednich szklanych płytkach i dokręć pokrętła.Umieść żel w dolnym zbiorniku żelu automatycznego urządzenia do obrazowania żelu przy płycie grzewczej i zamocuj, wsuwając pilota wejścia szynowego do wsporników aparatu. Użyj jednego bufora XTBE do napełnienia górnej i dolnej komory buforowej żelu. Następnie zamknij dolną komorę buforową i za pomocą przewodu zasilającego podłącz górną komorę buforową do zasilania.Jeśli w kieszeni żelowej znajduje się sól, użyj buforu, aby kilkakrotnie pipetować do kieszeni, aby ją wyczyścić. Następnie użyj górnej pokrywy bufora, aby zamknąć górną komorę zbiornika buforowego. Po włączeniu imagera i komputera oraz uruchomieniu oprogramowania do zbierania danych w podczerwieni obrazu bazowego zgodnie z protokołem tekstowym, użyj ustawień wymienionych tutaj, aby skonfigurować sterowanie skanerem.Następnie uruchom pusty żel przez 20 minut, wybierając voltage on i naciskając enter. W międzyczasie, za pomocą maszyny do PCR, podgrzej drabinkę sekwencyjną i produkty przedłużające starter do 90 stopni Celsjusza przez dwie minuty Przed schłodzeniem na lodzie przerwij elektroforezę, otwórz automatyczny sekwencer żelowy i zdejmij górną pokrywę zbiornika buforowego. Następnie włóż grzebień z zębami rekina między szklane płytki i zęby rekina.Lekko przebić pipetę żelową jednym do dwóch mikrolitrów produktów przedłużających starter lub reakcji drabinki sekwencjonowania do każdej kieszeni żelowej. Na wszelkie puste kieszenie. Użyj barwnika ładującego, aby je napełnić, aby zapobiec niespójnemu zachowaniu podczas pracy, zamknij zbiornik buforowy i drzwi sekwencera żelowego.Następnie rozpocznij elektroforezę, wybierając voltage on dla lasera, wybierz stan skanowania włączony i naciśnij enter. Gdy obszar zainteresowania przejdzie przez laser, przerwij elektroforezę, jak pokazano tutaj. Reakcja wydłużenia startera może być wykorzystana do określenia transkrypcji punktów początkowych lub TSP interesujących transkryptów i może pomóc w wydedukowaniu regionów promotorowych.W tym przykładzie TSP mRNA MPE zostało zidentyfikowane jako G zgodnie z wcześniej opublikowanymi danymi. Pierwiastki promotora minus 35 i minus 10 wydedukowano jako T-T-G-T-A-A i T-A-G-A-C-T, a motywy te różnią się tylko zasadami z każdej z ich uzgodnionych sekwencji przy użyciu rozszerzenia startera w celu identyfikacji produktów cięcia mRNA. Mapowanie RNA rozszczepienia w pobliżu START co on przez RNA Ybi SEC dwa jest pokazane tutaj, gdy RNA nie jest obecne lub nieaktywne, w pobliżu co start nie powstają żadne produkty wydłużania startera w wyniku aktywności RNA.Jednak dwie silne prążki pojawiają się tuż za powłoką początkową na tym rysunku, co pokazuje nieudany eksperyment z wydłużaniem startera z powodu nadmiaru RNA w reakcji odwrotnej transkrypcji, która uniemożliwia identyfikację poszczególnych prążków. Pokazuje to, że całkowita ilość matrycowego RNA musi być dostosowana do obfitości interesującego nas RNA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyjaśnić punkty początkowe transkrypcji i miejsca cięcia RNA in vivo za pomocą starterów fluorescencyjnych i automatycznego sekwencera żelowego przy odrobinie praktyki.Ta metoda jest szybka i łatwa do wykonania. Powodzenia w eksperymentach.

fluorescence-based-primer-extension-technique-to-determine

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metody fotowybielania, w tym Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) oraz Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP), służące do monitorowania dynamiki białek chromatyny w embrionalnych komórkach macierzystych (ES). Dynamika białek chromatyny, uznawana za jeden ze sposobów badania plastyczności chromatyny, jest zwiększona w komórkach pluripotencjalnych.

Analizy fotoblaknięcia (FRAP i FLIP) do pomiaru dynamiki białek chromatyny w żywych embrionalnych komórkach macierzystych

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Egzonukleazy odgrywają kluczową rolę w zapewnieniu stabilności genomu. Utrata funkcji egzonukleazy WRN powoduje przedwczesne starzenie się. Badanie substratów i innych wymagań nukleazy in vitro może pomóc w wyjaśnieniu jej roli in vivo. Tutaj demonstrujemy szybki i powtarzalny test oparty na fluorescencji do pomiaru jego aktywności nukleazy.

Test egzonukleazy oparty na fluorescencji w celu scharakteryzowania DmWRNexo, ortologu ludzkiej egzonukleazy progeroidalnej WRN i jej zastosowania do innych nukleaz

Ratiometryczne dwumolekularne latarnie (RBMB) mogą być używane do obrazowania pojedynczych transkryptów RNA w żywych komórkach. W tym miejscu opisujemy przygotowanie i oczyszczanie RBMB, dostarczanie RBMB do komórek za pomocą mikroporacji i obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych transkryptów RNA w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych zmodyfikowanych transkryptów RNA w żywych komórkach przy użyciu ratiometrycznych latarni bimolekularnych

W tej pracy zapewniamy eksperymentalny przepływ pracy, w jaki sposób aktywne wzmacniacze mogą być identyfikowane i eksperymentalnie weryfikowane.

Przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym

Tutaj opisujemy składanie kompleksów elongacyjnych polimerazy II (Pol II) wymagających jedynie krótkich syntetycznych oligonukleotydów DNA i RNA oraz oczyszczonego Pol II. Kompleksy te są przydatne do badania mechanizmów leżących u podstaw kotranskrypcyjnego przetwarzania transkryptów związanych z kompleksem elongacyjnym Pol II.

Sztuczne kompleksy elongacyjne polimerazy II RNA do analizy zdarzeń przetwarzania kotranskrypcyjnego RNA

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (smFISH) to metoda dokładnego ilościowego określania poziomów i lokalizacji określonych RNA na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu przedstawiamy nasze zatwierdzone protokoły laboratoryjne dotyczące przetwarzania na mokrym stole, obrazowania i analizy obrazu w celu ilościowego oznaczania pojedynczych komórek określonych RNA.

Analiza pojedynczych komórek alleli aktywnych transkrypcyjnie za pomocą pojedynczej cząsteczki FISH

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

W pracy przedstawiono prosty, przyjazny dla użytkownika ratiometryczny test FRET do wykrywania i ilościowej oceny aktywności DNazy oraz wykazano jego zastosowanie w analizie słabej nukleazy.

Ocena aktywności DNazy za pomocą ratiometrycznego transferu energii rezonansu fluorescencji

Protokół ten ilościowo mierzy stabilność i okres półtrwania intergenowych i intragenowych RNA wzmacniających w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą leczenia aktinomycyną D, RT-qPCR oraz analizy regresji nieliniowej. Stosuje się strategie normalizacji specyficzne dla pozycji, aby dokładnie modelować dynamikę rozpadu eRNA w sposób zależny od kontekstu.

Zoptymalizowana ilościowa ocena stabilności RNA wzmacniającego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Poznaj metodę rozszerzania starterów opartą na fluorescencji do identyfikacji punktów startowych transkrypcji i miejsc cięcia RNA in vivo w bakteriach. Technika wykorzystuje zautomatyzowany sekwenator żelowy do szybkiej analizy.

Technika rozszerzania starterów oparta na fluorescencji w celu określenia punktów wyjściowych transkrypcji i miejsc cięcia RNaz in vivo (Wideo) | JoVE Journal

Technika rozszerzania starterów oparta na fluorescencji w celu określenia punktów wyjściowych transkrypcji i miejsc cięcia RNaz in vivo

Przeglądaj więcej filmów