Technika rozszerzania starterów oparta na fluorescencji w celu określenia punktów wyjściowych transkrypcji i miejsc cięcia RNaz in vivo

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja transkrypcyjnych punktów początkowych i miejsc rozszczepienia RNA in vivo od bakterii za pomocą reakcji wydłużania starterów fluorescencyjnych. Osiąga się to poprzez wczesną hodowlę bakterii, takich jak E. coli lub S. aria, i wyizolowanie cząsteczek RNA. Następnie RNA jest poddawane odwrotnej transkrypcji przy użyciu specyficznych starterów fluorescencyjnych i odwrotnej transkryptazy, w wyniku czego powstają fragmenty CD NA.

Następnie DNA lub plazmidy są izolowane z komórek bakteryjnych, a z matrycy DNA za pomocą zestawu do sekwencjonowania tworzona jest fluorescencyjna drabinka sekwencjonowania Sangera. Na koniec fragmenty CDNA i drabinki sekwencjonowania są rozdzielane i jednocześnie wykrywane w żelu poliakrylowym za pomocą zautomatyzowanego sekwencera żelowego i porównywane ze sobą. Ostatecznie rozszerzenie startera fluorescencyjnego służy do mapowania pięciu pierwszych końców cząsteczek RNA do rozdzielczości jednej zasady.

Główną przewagą tej techniki nad innymi metodami, takimi jak rozszerzenie pierwotne oparte na rasie lub radioaktywności, jest szybka identyfikacja pięciu od końca cząsteczek RNA, ponieważ detekcja odbywa się jednocześnie podczas elektroforezy. Czułość jest podobna do rozszerzeń pierwotnych opartych na aktywności czerwonej, ale umożliwia personelowi laboratoryjnemu stosowanie tej metody bez konieczności odbywania szkolenia w zakresie bezpieczeństwa promieniowania. Z powodzeniem wykorzystaliśmy tę technikę fluorescencyjnego pierwotnego wydłużenia do zbadania składników RNA w systemach antytoksyn toksynowych.

Staphylococki zademonstrują procedurę Christopher Schuster, doktorant z mojego laboratorium. Po przygotowaniu wysokiej wydajności RNA i zaprojektowaniu starterów zgodnie z protokołem tekstowym, należy przeprowadzić reakcję przedłużania startera, najpierw podgrzewając termocykler do 95 stopni Celsjusza. Dla każdej próbki RNA wymieszać następujące związki w probówce do PCR, denaturować próbki przez jedną minutę w temperaturze 95 stopni Celsjusza.

Następnie umieść probówki na lodzie na pięć minut, aby zhybrydyzować startery i RNA. Następnie ustaw maszynę do PCR na 47 stopni Celsjusza. Następnie przygotuj główny miks do odwrotnej transkrypcji, jak opisano tutaj.

Dodaj cztery mikrolitry, główną mieszankę odwrotnej transkrypcji do każdej zhybrydyzowanej próbki RNA i inkubuj probówki przez godzinę w temperaturze 47 stopni Celsjusza. Aby zatrzymać reakcję, podgrzej próbki do 95 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Następnie dodaj sześć mikrolitrów barwnika amidowego i przechowuj przez noc lub do dwóch tygodni w ciemności w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Po przygotowaniu genomowego DNA lub plazmidów, zgodnie z protokołem tekstowym, należy zmontować reakcję sekwencjonowania Sangera, mieszając 12 mikrolitrów około 10 do 15 mikrogramów genomowego DNA lub 100 do 500 nanogramów plazmidowego DNA z jednym mikrolitrem znakowanego fluorescencyjnie startera i jednym mikrolitrem pipety DMSO. Jeden mikrolitr każdego sekwencjonowania wymieszać do oddzielnych wstępnie znakowanych probówek do PCR. Następnie dodaj trzy mikrolitry mieszanki starterów D-N-A-D-M-S-O do każdej tubki.

Ustaw maszynę do PCR na następujący program i uruchom ją po umieszczeniu próbek w maszynie. Po przebiegu dodaj sześć mikrolitrów barwnika ładującego do próbek, a następnie na lód. W przypadku używania od razu lub długotrwałego w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przy użyciu czystych, bezpyłowych płyt o średnicy 25 centymetrów, umieść przekładki o grubości 0,25 milimetra na tylnej płycie szklanej i opuść karbowaną szklaną płytkę na górze z karbowanym końcem szklanych płyt i pilotami wejść szynowych skierowanymi do góry.

Przymocuj szyny żelowe po obu stronach szklanych płytek i lekko dokręć pokrętła, aby odlać żel. Połącz wymienione tutaj związki w zlewce z mieszadłem i umieść na magnetycznej płytce mieszającej. Natychmiast po dodaniu PS i zespoleniu użyj strzykawki o pojemności 50 mililitrów, aby pobrać roztwór akrylamidu i umieść filtr 0,45 nanometra na końcówce.

Umieść ułożone warstwowo płytki pod kątem 10 do 20 stopni i powoli dozuj roztwór żelu między szklane płytki, ciągle przesuwając końcówkę strzykawki z jednej strony na drugą. Przestań dozować roztwór żelu, gdy zetknie się z dolnym końcem szklanych płytek. Za pomocą haczyka bąbelkowego usuń wszelkie bąbelki, które mogły się utworzyć.

Następnie wsuń przekładkę kieszeni żelowej między szklane płytki na karbowanym końcu, zanurzając ją w roztworze żelu i mocując ją poprzez przymocowanie płyty odlewniczej, lekko dokręć górne szyny i pozwól żelowi zastygnąć przez jedną do dwóch godzin. Przed wyjęciem płytki odlewniczej i przekładki kieszeniowej użyj destylowanej wody dejonizowanej, aby oczyścić kieszeń z soli i resztek żelu, aby uruchomić żel. Wsuń uchwyt zbiornika buforowego w szyny żelowe na przednich szklanych płytkach i dokręć pokrętła.

Umieść żel w dolnym zbiorniku żelu automatycznego urządzenia do obrazowania żelu przy płycie grzewczej i zamocuj, wsuwając pilota wejścia szynowego do wsporników aparatu. Użyj jednego bufora XTBE do napełnienia górnej i dolnej komory buforowej żelu. Następnie zamknij dolną komorę buforową i za pomocą przewodu zasilającego podłącz górną komorę buforową do zasilania.

Jeśli w kieszeni żelowej znajduje się sól, użyj buforu, aby kilkakrotnie pipetować do kieszeni, aby ją wyczyścić. Następnie użyj górnej pokrywy bufora, aby zamknąć górną komorę zbiornika buforowego. Po włączeniu imagera i komputera oraz uruchomieniu oprogramowania do zbierania danych w podczerwieni obrazu bazowego zgodnie z protokołem tekstowym, użyj ustawień wymienionych tutaj, aby skonfigurować sterowanie skanerem.

Następnie uruchom pusty żel przez 20 minut, wybierając voltage on i naciskając enter. W międzyczasie, za pomocą maszyny do PCR, podgrzej drabinkę sekwencyjną i produkty przedłużające starter do 90 stopni Celsjusza przez dwie minuty Przed schłodzeniem na lodzie przerwij elektroforezę, otwórz automatyczny sekwencer żelowy i zdejmij górną pokrywę zbiornika buforowego. Następnie włóż grzebień z zębami rekina między szklane płytki i zęby rekina.

Lekko przebić pipetę żelową jednym do dwóch mikrolitrów produktów przedłużających starter lub reakcji drabinki sekwencjonowania do każdej kieszeni żelowej. Na wszelkie puste kieszenie. Użyj barwnika ładującego, aby je napełnić, aby zapobiec niespójnemu zachowaniu podczas pracy, zamknij zbiornik buforowy i drzwi sekwencera żelowego.

Następnie rozpocznij elektroforezę, wybierając voltage on dla lasera, wybierz stan skanowania włączony i naciśnij enter. Gdy obszar zainteresowania przejdzie przez laser, przerwij elektroforezę, jak pokazano tutaj. Reakcja wydłużenia startera może być wykorzystana do określenia transkrypcji punktów początkowych lub TSP interesujących transkryptów i może pomóc w wydedukowaniu regionów promotorowych.

W tym przykładzie TSP mRNA MPE zostało zidentyfikowane jako G zgodnie z wcześniej opublikowanymi danymi. Pierwiastki promotora minus 35 i minus 10 wydedukowano jako T-T-G-T-A-A i T-A-G-A-C-T, a motywy te różnią się tylko zasadami z każdej z ich uzgodnionych sekwencji przy użyciu rozszerzenia startera w celu identyfikacji produktów cięcia mRNA. Mapowanie RNA rozszczepienia w pobliżu START co on przez RNA Ybi SEC dwa jest pokazane tutaj, gdy RNA nie jest obecne lub nieaktywne, w pobliżu co start nie powstają żadne produkty wydłużania startera w wyniku aktywności RNA.

Jednak dwie silne prążki pojawiają się tuż za powłoką początkową na tym rysunku, co pokazuje nieudany eksperyment z wydłużaniem startera z powodu nadmiaru RNA w reakcji odwrotnej transkrypcji, która uniemożliwia identyfikację poszczególnych prążków. Pokazuje to, że całkowita ilość matrycowego RNA musi być dostosowana do obfitości interesującego nas RNA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyjaśnić punkty początkowe transkrypcji i miejsca cięcia RNA in vivo za pomocą starterów fluorescencyjnych i automatycznego sekwencera żelowego przy odrobinie praktyki.

Ta metoda jest szybka i łatwa do wykonania. Powodzenia w eksperymentach.