Name: Wykrywanie kompleksów białkowo-białkowych in situ w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Poznaj metodę PLA do wykrywania interakcji białkowych in situ w połączeniach nerwowo-mięśniowych larw Drosophila. Technika ta umożliwia wizualizację kompleksów białkowych z lokalizacją przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Bloomington Drosophila Stock Center za dostarczenie zapasów much. Dziękujemy również Developmental Studies Hybridoma Bank i dr Lynn Cooley (Uniwersytet Yale) za dostarczenie przeciwciał. Specjalne podziękowania kierujemy do AhHyun Yoo za pomoc w pracy nad manuskryptem. Praca ta była wspierana przez granty z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Krieger), William and Ada Isabelle Steel Fund (Krieger) oraz Canadian Institutes of Health Research (Harden).

1. Przygotowanie ściany ciała
UWAGA: Przygotowanie ścian ciała larw w trzecim stadium rozwojowym (do badania złączy nerwowo-mięśniowych (NMJs), które unerwiają mięśnie ściany ciała) przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem w pracy Brent et al. 10 lub Ramachandran i Budnik 11,12, lecz z pewnymi modyfikacjami.
<ol>
	<li>Sekcja
	<ol>
		<li>Hodować linie muszek i prowadzić krzyżówki w temperaturze 25 °C przez pięć do sześciu dni zgodnie ze standardowymi procedurami 13.</li>
		<li>Za pomocą precyzyjnej pęsety należy wyłowić pełzające larwy trzeciego stadium z fiolek lub butelek.</li>
		<li>Przemyj larwy w małej szalce Petri z solą fosforanowo-buforowaną (PBS), aby usunąć cząsteczki pokarmu.</li>
		<li>Umieść jedną larwę na krążku z Sylgardu i zanurz ją w kilku kroplach lodowatego PBS. Zastosowanie lodowatego PBS pomoże ogłuszyć larwę, co ułatwi manipulację. Przez cały czas trwania sekcji należy dbać o to, aby preparat był stale zanurzony w PBS, aby zapobiec jego wysychaniu.</li>
		<li>Ułóż larwę grzbietem do góry w taki sposób, aby dwa pęczki tchawiczne były widoczne pod mikroskopem stereoskopowym (Rysunek 2A). Za pomocą pęsety chwyć szpilkę entomologiczną i przyszpil larwę za tylny koniec w pobliżu przetchanic (Rycina 2B). Za pomocą innego szpilki przebij kutykulę na przednim końcu, w pobliżu haczyków gębowych. Delikatnie rozciągnij larwę wzdłuż jej osi, a następnie przymocuj ją szpilką (Rycina 2B).</li>
		<li>Za pomocą nożyczek do mikrosekcji uciśnij tylny koniec w pobliżu szpilki, aby utworzyć niewielki otwór. Nacięcie powinno być na tyle powierzchowne, aby przebić jedynie kutykulę.</li>
		<li>Wprowadź końcówkę dolnego ostrza nożyczek do nacięcia, a następnie przetnij wzdłuż całej długości linii środkowej grzbietowej pomiędzy dwoma traktami tchawiczymi (Rycina 2C). Podczas cięcia kieruj ostrza nożyczek lekko ku górze, aby uniknąć uszkodzenia mięśni brzusznej ściany ciała.</li>
		<li>Wykonaj niewielkie poziome nacięcie nieco przednio w stosunku do umieszczonego z tyłu pinu (Rycina 2C). Wykonać kolejne, podobne nacięcie nieco bardziej posterioralnie względem umieszczonego wcześniej anterioralnie pinu (Rysunek 2C). Nacięcia powinny przejść jedynie przez kutykulę. 
		UWAGA: Trzy nacięcia wykonane w krokach 1.1.7 i 1.1.8 powinny łącznie przypominać literę „<img fo:content-width="0.09in" src="/files/ftp_upload/52139/52139_letter_I.jpg" width="15px" alt="Inductor symbol diagram; circuit design; electronic schematic representation; educational use." data-altupdatedat="1787630408000">po zakończeniu, t. j.należy wykonać lewą i prawą klapkę na stronie grzbietowej ciała larwy.</li>
		<li>Ostrożnie usuń organy wewnętrzne za pomocą pęsety. Dodanie kilku silnych kropel PBS pomoże wypłukać organy z ciała larwy, co ułatwi ich usunięcie. Należy unikać nakłuwania ciała larwy, ponieważ spowoduje to uszkodzenie mięśni ściany ciała.</li>
		<li>Rozprostować ciało larwy i przytwierdzić jego narożniki szpilkami (Rysunek 2D). Podczas przypinania rozciągnąć ścianę ciała zarówno w poziomie, jak i w pionie, aby utworzyć równomiernie napięty prostokąt (patrz Rycina 2G (dla zachowania kształtu), uważając, aby w tym procesie nie przerwać mięśni ściany ciała.</li>
		<li>Dokończ usuwanie wszelkich pozostałych narządów wewnętrznych (Rysunek 2E).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fiksacja i permeabilizacja
	<ol>
		<li>Zanurzyć przypięte ścianie ciała w kilku kroplach roztworu Bouina. Inkubować przez 15 min w lodzie. Alternatywnie można zastosować 4% paraformaldehyd (PFA) jako zamienny utrwalacz; inkubować przez 30 min.</li>
		<li>Przepłukać trzykrotnie roztworem buforu fosforanowo-solnego z dodatkiem Tritonu (PBT).</li>
		<li>Za pomocą precyzyjnej pęsety ostrożnie usuń piny i przenieś ścianki ciała, chwytając je za narożniki, do zylikonizowanej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0,65 ml.</li>
		<li>Przechowywać ściany ciała w PBT w temperaturze 4 °C do momentu rozpoczęcia procedury PLA. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy rozpocząć immunostaining ścian ciała w ciągu jednego lub dwóch dni od sekcji. 
		UWAGA: Aby zaoszczędzić odczynniki i zapewnić równą traktację wszystkich ścianek ciała podczas analizy, różne genotypy można umieścić w jednej probówce. Genotypy można rozróżnić, przycinając narożniki ścianek ciała w różny sposób (patrz Rycina 2F (np. dla przykładów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Immunohistochemia
UWAGA: Immunobarwienie ścian ciała larw trzeciego stadium przeprowadzono zgodnie z opisem w pracach Brent et al. 14 oraz Ramachandran i Budnik 11, z pewnymi modyfikacjami 11,14. 
UWAGA: Wszystkie etapy należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej i przy łagodnym mieszaniu, chyba że wskazano inaczej.
<ol>
	<li>Blokowanie
	<ol>
		<li>Przemyć ściany ciała roztworem PBT trzy razy po 10 min.</li>
		<li>Blokować 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) przez 1 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunobarwienie
	<ol>
		<li>Inkubować ściany ciała z mysimi i króliczymi przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko dwóm białkom docelowym (rozcieńczonymi w 1% BSA) przez 2 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C. W tym przypadku należy zastosować przeciwciało mysie anty-Dlg w rozcieńczeniu 1:10 oraz królicze anty-HtsM w rozcieńczeniu 1:250 15,16. Można również dołączyć przeciwciała przeciwko markerom, które nie są produkowane u myszy ani królika — np. zastosować kozie anty-Hrp w rozcieńczeniu 1:200 w celu wyznaczenia błon neuronowych.</li>
		<li>Przemyć roztworem PBT trzy razy po 10 min.</li>
		<li>Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem w celu wykrycia markerów (rozcieńczonymi w 1% BSA) przez 2 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C. Ponieważ sygnał PLA jest później wizualizowany za pomocą czerwonego fluoroforu, do wykrycia markera należy użyć innego fluoroforu — np. zastosować przeciwciało anty-kozie sprzężone z FITC w rozcieńczeniu 1:200 do wykrycia przeciwciała koziego anty-Hrp. Ze względu na zastosowanie reagentów światłoczułych, od tego momentu przechowywać probówki w ciemności. 
		UWAGA: Stosowany zestaw umożliwia przeprowadzenie PLA pomiędzy przeciwciałami pierwszorzędowymi wytworzonymi u myszy i królika, przy czym sygnał jest wizualizowany w kanale czerwonym w mikroskopii konfokalnej. W razie potrzeby dostępne są inne zestawy, które pozwalają na wykonanie testu z przeciwciałami pierwszorzędowymi wytworzonymi u innych gatunków i wizualizację sygnału w innych kanałach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test ligacji bliskości (Proximity Ligation Assay)
UWAGA: Wszystkie etapy należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej i przy delikatnym mieszaniu, chyba że wskazano inaczej.

<ol>
	<li>Sondy PLA
	<ol>
		<li>Przemyć ścianki ciała w roztworze PBT trzykrotnie, po 10 min za każdym razem.</li>
		<li>Inkubować z sondami PLA (każda w rozcieńczeniu 1:5 w 1% BSA) przez 2 hr w 37 °C. W tym przypadku użyć 40 µl sondy PLA anti-mouse MINUS, 40 µl sondy PLA anti-rabbit PLUS oraz 120 µl 1% BSA, aby zapewnić właściwe zanurzenie i wymieszanie 5-10 ścianek ciała. Rozcieńczenie sond PLA nawet do 1:25 może nadal zapewniać odpowiedni stosunek sygnału do szumu (tzn. w przypadku tego eksperymentu).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ligacja
	<ol>
		<li>Przemyć ścianki ciała w Buforze do Płukania A dwukrotnie, po 5 min za każdym razem.</li>
		<li>Inkubować z roztworem do ligacji (rozcieńczenie Ligazy 1:40 w buforze do ligacji) przez 1 hr w 37 °C. W tym przypadku użyć 5 µl Ligazy, 40 µl buforu do ligacji oraz 155 µl wody wysokiej czystości, aby zapewnić właściwe zanurzenie i wymieszanie 5-10 ścianek ciała.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Amplifikacja
	<ol>
		<li>Przemyć ścianki ciała w Buforze do Płukania A dwukrotnie, po 2 min za każdym razem.</li>
		<li>Inkubować z roztworem do amplifikacji (rozcieńczenie Polimerazy 1:80 w buforze do amplifikacji) przez 2 hr w 37 °C. W tym przypadku użyć 2,5 µl Polimerazy, 40 µl buforu do amplifikacji oraz 157,5 µl wody wysokiej czystości, aby zapewnić właściwe zanurzenie i wymieszanie 5-10 ścianek ciała.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie do obrazowania
	<ol>
		<li>Przemyć ścianki ciała w Buforze do Płukania B dwukrotnie, po 10 min za każdym razem.</li>
		<li>Przemyć raz w roztworze 0,01x Buforu do Płukania B przez 1 min.</li>
		<li>Równoważyć w kilku kroplach medium montażowego przez co najmniej 30 min przed montażem lub przechowywać przez noc w 4 °C.</li>
		<li>Za pomocą precyzyjnej pęsety ostrożnie przenieść ścianki ciała na szkiełko obiektowe, kładąc je kutykulą do dołu. Ułożyć ścianki ciała w rzędach i w tej samej orientacji w jednej lub dwóch kroplach medium montażowego. Przykryć preparat szkiełkiem nakrywkowe 22 mm x 40 mm, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza, a następnie uszczelnić szkiełko bezbarwnym lakierem do paznokci.</li>
		<li>Przechowywać szkiełka w ciemności w -20 °C do czasu obrazowania konfokalnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Woods, D. F., Bryant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discs-large+tumor+suppressor+gene+of+Drosophila+encodes+a+guanylate+kinase+homolog+localized+at+septate+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions.</a> Cell. 66, 451-464 (1991).</li>
<li>Yamanaka, T., Ohno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Lgl%2FDlg%2FScribble+in+the+regulation+of+epithelial+junction%2C+polarity+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth.</a> Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).</li>
<li>Humbert, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+tumourigenesis+by+the+Scribble%2FDlg%2FLgl+polarity+module%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module.</a> Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).</li>
<li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13, 823-835 (1994).</li>
<li>Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolding+proteins+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).</li>
<li>Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+as+a+model+for+scaffold+complexes+at+glutamatergic+synapses%3A+benefits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations.</a> J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).</li>
<li>Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adducin%3A+structure%2C+function+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Adducin: structure, function and regulation.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+adducin+regulates+Dlg+phosphorylation+and+targeting+of+Dlg+to+the+synapse+and+epithelial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane.</a> Dev Biol. 357, 392-403 (2011).</li>
<li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+staining+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).</li>
<li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+Laboratory+Manual%22">Drosophila: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (1989).</li>
<li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+postsynaptic+structure+and+protein+localization+by+the+Rho-type+guanine+nucleotide+exchange+factor+dPix%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix.</a> Neuron. 32, 415-424 (2001).</li>
<li>Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ovhts+polyprotein+is+cleaved+to+produce+fusome+and+ring+canal+proteins+required+for+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis.</a> Development. 134, 703-712 (2007).</li>
<li>Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hts%2FAdducin+controls+synaptic+elaboration+and+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination.</a> Neuron. 69, 1114-1131 (2011).</li>
<li>Spradling, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Berkeley+Drosophila+Genome+Project+gene+disruption+project%3A+Single+P-element+insertions+mutating+25%25+of+vital+Drosophila+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes.</a> Genetics. 153, 135-177 (1999).</li>
<li>Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+p21-Activated+Kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biology of the p21-Activated Kinases.</a> Annu Rev Biochem. 72, 743-781 (2003).</li>
<li>Bahri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+leading+edge+during+dorsal+closure+as+a+model+for+epithelial+plasticity%3A+Pak+is+required+for+recruitment+of+the+Scribble+complex+and+septate+junction+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation.</a> Development. 137, 2023-2032 (2010).</li>
<li>Albin, S. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+structural+and+functional+synapse+development%3A+postsynaptic+p21-activated+kinase+independently+specifies+glutamate+receptor+abundance+and+postsynaptic+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology.</a> J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).</li>
<li>Koles, K., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+neuromuscular+junction+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in neuromuscular junction development.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li>
<li>Packard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Wnt%2C+wingless%2C+provides+an+essential+signal+for+pre-+and+postsynaptic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation.</a> Cell. 111, 319-330 (2002).</li>
<li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assays%3A+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).</li>
<li>Thymiakou, E., Episkopou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+signaling+effector-complexes+downstream+of+bmp4+using+PLA%2C+a+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Maglione, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+forest+tree+by+tree%3A+super-resolution+light+microscopy+meets+the+neurosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences.</a> Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-regulated+Drosophila+adducin+is+a+determinant+of+synaptic+plasticity+in+a+complex+with+Dlg+and+PIP2+at+the+larval+neuromuscular+junction%0A++%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Open%22%5BJournal%5D)">Phospho-regulated Drosophila adducin is a determinant of synaptic plasticity in a complex with Dlg and PIP2 at the larval neuromuscular junction
 .</a> Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Raport ten pokazuje, w jaki sposób PLA można zastosować do larwy Drosophila NMJ. Test przeprowadza się na preparatach mięśni ściany ciała larw w celu wykrycia endogennych oddziaływań białko-białko obecnych w NMJ. Dzięki tej technice wykazano, że Dlg i Hts znajdują się blisko siebie, a zatem istnieją w kompleksie, szczególnie w regionie postsynaptycznym 27. Na poparcie tego wyniku, poprzednie badanie dostarczyło dowodów na ich związek z następującymi danymi: 1) immunoreaktywne dystrybucje Dlg i Hts nak...

Drosophila Discs large (Dlg) jest konserwatywnym członkiem rodziny białek rusztowania kinazy guanylanowej związanych z błoną, które pomagają organizować składanie dużych kompleksów białkowych w określonych miejscach błony plazmatycznej. Pierwotnie zidentyfikowane jako białko supresorowe nowotworu, Dlg służy jako ważny wyznacznik nabłonkowej polaryzacji apikopodstawnej 1,2,3. Dlg służy również jako główny moduł rusztowania w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) glutaminergicznym neuronów ruchowych podczas rozwoju larwalnego 4. Dlg odgrywa różne role w larwalach NMJ, a jego plejotropizm opiera się na zdolności do łączenia się z wieloma białkami 5,6. Jednym z takich białek jest Hu-li tai shao (Hts), homolog ssaków adducyny, które zostały opisane głównie w odniesieniu do ich roli w regulacji cytoszkieletu spektryny aktyny 7. Wcześniej wykazano, że Dlg i Hts mogą tworzyć ze sobą kompleks na podstawie eksperymentów in vitro z udziałem całych dorosłych lizatów much 8. Jedną z wad tych wyników jest jednak to, że nie wskazują one, gdzie ten kompleks się formuje. Za pomocą immunohistochemii obserwuje się, że rozkłady Dlg i Hts nakładają się na siebie w błonie postsynaptycznej larw NMJ, ale czy są one w kompleksie w tym regionie 8? Jak ostatnio wykazano i szczegółowo opisano tutaj, test ligacji zbliżeniowej (PLA) służy do poszukiwania związku in situ między Dlg i Hts, w szczególności w larwie NMJ 27.
PLA to stosunkowo nowa technika stosowana głównie w hodowlach komórkowych i tkankowych, która może wykrywać interakcje białko-białko in situ 9. W tym teście pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko dwóm białkom będącym przedmiotem zainteresowania są wykrywane za pomocą pary specyficznych dla gatunku przeciwciał drugorzędowych, zwanych sondami PLA, które są sprzężone z oligonukleotydami (Figura 1A, B). Jeśli dwa białka znajdują się w bliskiej odległości od siebie (tj. w odległości kilkudziesięciu nanometrów), odległość między dołączonymi sondami PLA można zniwelować poprzez hybrydyzację dwóch dodatkowych oligonukleotydów łącznikowych (ryc. 1C). W tej konformacji wolne końce oligonukleotydów łącznikowych są wystarczająco blisko, aby się ze sobą stykać, a po ligacji in situ można utworzyć zamkniętą kolistą cząsteczkę DNA (ryc. 1D). Okrągła cząsteczka DNA służy jako matryca do amplifikacji in situ w toczeniu koła, która jest zapoczątkowana przez jeden z oligonukleotydów sprzężonych z sondami PLA (ryc. 1E). Sekwencje w powstałym amplifikowanym, konkatenerycznym produkcie DNA można następnie wizualizować za pomocą znakowanych fluorescencyjnie, komplementarnych sond oligonukleotydowych (ryc. 1F). Ponieważ amplifikowane DNA pozostaje przyłączone do jednej z sond PLA, można łatwo ustalić subkomórkową lokalizację interakcji białko-białko w tkance.
Kilka metod jest powszechnie używanych do wykrywania interakcji białko-białko, w tym techniki in vitro, takie jak koimmunoprecypitacja, testy pull-down i badania przesiewowe drożdży dwuhybrydowych, oraz techniki in vivo, takie jak Förster Resonance Energy Transfer (FRET) i Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC). Pułapką technik in vitro jest to, że nie identyfikują one, gdzie interakcja zachodzi endogennie, podczas gdy wyżej wymienione techniki in vivo obejmują sztuczną ekspresję białek fuzyjnych, które mogą nie odzwierciedlać natywnego zachowania ich endogennych odpowiedników. Jedną z głównych zalet PLA jest to, że jest w stanie określić w tkance subkomórkową lokalizację endogennych interaktorów białkowych, które znajdują się blisko siebie i prawdopodobnie tworzą kompleks, przy czym stopień bliskości wymagany do wygenerowania sygnału jest porównywalny z FRET i BiFC. PLA może wykrywać interakcje o wysokiej swoistości i czułości dzięki sprzężeniu rozpoznawania przeciwciał i amplifikacji DNA. W ten sposób test może generować dyskretne, jasne sygnały w postaci puncta, które ujawniają dokładne położenie oddziaływania. Ponadto można wykryć ledwo widoczne antygeny. Wreszcie, PLA jest stosunkowo prostą techniką do wykonania i nie zajmuje więcej czasu niż standardowa procedura immunohistochemiczna. W związku z tym PLA zapewnia techniczną przewagę nad innymi testami interakcji białko-białko, które często są nękane długim czasem przygotowania i obszernym rozwiązywaniem problemów.
Ten protokół pokazuje, jak PLA może być zastosowany do larwy Drosophila NMJ w celu wykrywania endogennych interakcji białko-białko in situ. W tym przypadku PLA wykonuje się na preparatach mięśni ściany ciała larw, w których wykazano, że Dlg i Hts rzeczywiście występują w kompleksie w regionie postsynaptycznym NMJ. PLA nie był wcześniej używany do badania larw NMJ, a obecnie istnieje tylko kilka opublikowanych prac, w których zastosowano ten test w tkance Drosophila. Oczekuje się, że dalsza ekspozycja PLA na społeczność Drosophila spowoduje jego zwiększone wykorzystanie jako dodatkowego narzędzia uzupełniającego inne, częściej stosowane testy interakcji białko-białko.

<table><tbody><tr><td>Kleszcze (drobne #5)</td><td>Almedic</td><td>A10-704</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Disc</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Wymieszaj bazę elastomerową i utwardzacz w proporcji 10:1. Ustawiany na 30 min. Wlać do formy (np. użyć 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej). Pozostaw na utwardzenie przez co najmniej 24 godziny. Podczas preparowania należy przykleić się do pokrywki z płytki Petriego o wymiarach 60 x 15 mm.</td></tr><tr><td>Szpilki minutien (0,0125&nbsp; mm średnica końcówki)</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikrodysekcji (bardzo cienkie)</td><td>Narzędzia do nauki</td> precyzyjnej <td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice</td><td></td><td></td> platformowe <td>Przyklej dwa szkiełka nakrywkowe 22 x 22 mm2 na szkiełku mikroskopowym za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci, pozostawiając < Odstęp 20 mm pomiędzy nimi do montażu próbki.</td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>3605</td><td></td></tr><tr><td>hts01103</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>10989</td><td>Stado zostało ponownie zbalansowane za pomocą równoważnika GFP, dzięki czemu homozygotyczne mutanty mogą być wybierane na podstawie braku sygnału GFP.</td></tr><tr><td>1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami): 3&nbsp; mM NaH2PO4, 7&nbsp; mM Na2HPO4, 130&nbsp; mM NaCl, pH 7,0</td><td></td><td></td><td>NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>Roztwór Bouina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT10132</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA (Paraformaldehyd): 4% PFA w 1x PBS</td><td></td><td></td><td>PFA (nauka o anachemii - 66194-300). Zobacz doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 w celu uzyskania instrukcji, jak przygotować rozwiązanie.</td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>1x PBT (sól fizjologiczna buforowana fosforanami z trytonem): 1x PBS z 0,01% Triton</td><td></td><td></td><td>Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)</td></tr><tr><td>1% BSA (albumina surowicy bydlęcej): 1% BSA w 1x PBT</td><td></td><td></td><td>BSA (Bioshop Canada - ALB001). Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>mysz anty-Dlg (duże dyski)</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>4F3</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:10 w 1% BSA.</td></tr><tr><td>królik anty-HtsM (Hu-li tai shao)</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez dr Lynn Cooley (Uniwersytet Yale). Stosować w rozcieńczeniu 1:250 w 1% BSA.</td></tr><tr><td>królik anty-Pak (kinaza aktywowana p21)</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez dr Nicholasa Hardena (Simon Fraser University). Stosować w rozcieńczeniu 1:500 w 1% BSA.</td></tr><tr><td>mysz anty-Wg (bezskrzydły)</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>4D4</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:5 w 1% BSA.</td></tr><tr><td>kozia anty-Hrp (peroksydaza chrzanowa)</td><td>Jackson&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ImmunoResearch</td><td>123-065-021</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:200 w 1% BSA.</td></tr><tr><td>Anty-kozioł z koniugacją FITC</td><td>Jackson&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ImmunoResearch</td><td>705-095-003</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:200 w 1% masy ciała.</td></tr><tr><td>Duolink In Situ PLA Sonda anty-mysia MINUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ PLA Sonda anty-królicza PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ Odczynniki do wykrywania Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92008</td><td></td></tr><tr><td>1x Bufor do płukania A: 0,01&nbsp; M Tris, 0,15&nbsp; M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)</td></tr><tr><td>1x Bufor do płukania B: 0,2&nbsp; M Tris, 0,1&nbsp; M NaCl, pH 7,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>0,01x Bufor do płukania B: 2&nbsp; mM Tris, 1&nbsp; mM NaCl, pH 7,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>Duolink In Situ Medium montażowe z DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie kompleksów białkowo-białkowych in situ w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) jest konserwatywnym członkiem rodziny kinaz guanylanowych związanych z błoną i służy jako główne białko rusztowania w larwalnym złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) u Drosophila. Wcześniejsze badania wykazały, że postsynaptyczny rozkład Dlg w larwalnym NMJ pokrywa się z rozkładem Hu-li tai shao (Hts), homologiem do addudyn ssaków. Ponadto zaobserwowano, że Dlg i Hts tworzą ze sobą kompleks na podstawie eksperymentów z koimmunoprecypitacją z udziałem całych dorosłych lizatów much. Ze względu na charakter tych eksperymentów nie wiadomo było jednak, czy kompleks ten występuje konkretnie w NMJ podczas rozwoju larw.
Test ligacji zbliżeniowej (PLA) to niedawno opracowana technika stosowana głównie w hodowlach komórkowych i tkankowych, która może wykrywać interakcje białko-białko in situ. W tym teście próbki są inkubowane z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko dwóm białkom będącym przedmiotem zainteresowania przy użyciu standardowych procedur immunohistochemicznych. Przeciwciała pierwszorzędowe są następnie wykrywane za pomocą specjalnie zaprojektowanej pary przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z oligonukleotydami, zwanych sondami PLA, które mogą być używane do generowania sygnału tylko wtedy, gdy dwie sondy zwiążą się w bliskiej odległości od siebie. W ten sposób można uwidocznić białka znajdujące się w kompleksie. W tym miejscu pokazano, w jaki sposób można wykorzystać PLA do wykrywania interakcji białko-białko in situ w larwalach Drosophila NMJ. Technikę tę przeprowadza się na preparatach mięśni ściany ciała larw, aby pokazać, że kompleks między Dlg i Hts rzeczywiście istnieje w regionie postsynaptycznym NMJ.

W złączach nerwowo-mięśniowych (NMJ) larw trzeciego stadium rozwoju typu dzikiego, Dlg znajduje się głównie w błonie postsynaptycznej glutaminergicznych pęcherzy typu I, przy czym poziom immunoreaktywności Dlg jest bardziej wyraźny w pęcherzach typu Ib niż w pęcherzach typu Is (Ryc. 3A) 4. Hts występuje w całym mięśniu, ale koncentruje się w regionie postsynaptycznym, gdzie poziom immunoreaktywności Hts wydaje się być taki sam w obu typach pęcherzy typu I; białko to występuje również presynapt...

Ten protokół pokazuje, jak można użyć testu ligacji zbliżeniowej do wykrywania interakcji in situ białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila. Dzięki tej technice wykazano, że duże dyski i Hu-li tai shao tworzą kompleks w regionie postsynaptycznym, związek wcześniej zidentyfikowany poprzez koimmunoprecypitację.

Wykrywanie kompleksów białkowo-białkowych in situ w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykrycie subkomórkowej lokalizacji endogennych interakcji białkowych białek w larwie drosophila larva NMJ. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie immunofluorescencji przy użyciu pary sprzężonych oligonukleotydów przeciwciał drugorzędowych zwanych sondami PLA, które wiążą się z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko dwóm białkom będącym przedmiotem zainteresowania. Następnie luka między sondami PLA jest wypełniana poprzez hybrydyzację dwóch oligonukleotydów łącznikowych.Tylko wtedy, gdy dwa białka znajdują się blisko siebie, a zamknięta kolista cząsteczka DNA powstaje w wyniku ligacji in situ, wówczas przeprowadza się amplifikację in situ w toczonym okręgu w celu amplifikacji sekwencji w zamkniętej kolistej cząsteczce DNA, które są następnie wykrywane za pomocą komplementarnych fluorescencyjnie znakowanych oligonukleotydów. Uzyskany w ten sposób sygnał fluorescencyjny generowany przez każdy produkt wzmacniający jest łatwo widoczny jako wyraźny jasny punkt, gdy jest oglądany za pomocą mikroskopii konfokalnej. Tak więc główną przewagą tej techniki nad innymi istniejącymi metodami, takimi jak hybrydowe wytrącanie i zagrożenie E, jest to, że PLA jest w stanie wykryć w tkance subkomórkową lokalizację endogennych białek, które są zlokalizowane w bliskiej odległości od siebie i prawdopodobnie tworzą kompleks.Chociaż ta metoda zapewnia wgląd w sieci interakcji białko-białko, które zachodzą szczególnie w de larva i mj. Może być również stosowany w innych systemach jolo. Zasugeruj tkanki nabłonkowe w zarodkach i dyskach wyobrażeniowych.Procedurę zademonstrują hel yu i Ha king, dwaj technicy z naszego laboratorium. Po inkubacji kultur Drosophila w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć do sześciu dni, użyj cienkich kleszczy, aby wybrać pełzające larwy trzeciego stadium z fiolek lub butelek, aby umyć larwy. Przenieś je na małą szalkę Petriego zawierającą PBS.Następnie umieść jedną z umytych larw w krążku cygara S i zanurz ją w kilku kroplach lodowatego PBS, aby ją zahamować, ułatwiając w ten sposób manipulację. Ustaw larwy grzbietową stroną skierowaną do góry, tak aby dwie ścieżki tchawicy były widoczne pod mikroskopem preparacyjnym. Następnie za pomocą kleszczy chwycić szpilkę mnuchin, przygwoźdź larwy na tylnym końcu w pobliżu spiral za pomocą kolejnej szpilki, przebij naskórek na przednim końcu w pobliżu haczyków ustnych i delikatnie rozciągnij larwy wzdłuż przed przygwożdżeniem go.Następnie, za pomocą mikropreparacji, nożyczki ściskają tylny koniec w pobliżu szpilki, aby utworzyć mały otwór, nacięcie powinno być na tyle powierzchowne, aby przejść tylko przez naskórek. Następnie umieść końcówkę dolnego ostrza nożyczek w nacięciu i kierując ostrza nożyczek lekko do góry, aby uniknąć uszkodzenia leżących pod spodem mięśni, przeciąć na całej długości grzbietowej linii środkowej między dwoma drogami tchawicy. Teraz wykonaj małe poziome nacięcie tuż przez naskórek, nieco przed umieszczoną z tyłu szpilką.Następnie wykonaj kolejne podobne nacięcie nieco z tyłu od umieszczonej z przodu szpilki. Po dodaniu kilku mocnych kropli PBS do ciała larwy, użyj kleszczy, aby ostrożnie oczyścić narządy wewnętrzne. Unikaj szturchania ciała larwy, ponieważ spowoduje to uszkodzenie ciała.Mięśnie ścianowe rozwijają ciało larwy i aby przygwoździć rogi w dół, rozciągają ścianę ciała zarówno w poziomie, jak i w pionie, aby utworzyć równomiernie napięty prostokąt. Uważając, aby nie rozerwać mięśni ściany ciała w procesie mocowania tkanki. Zanurz przypięte ścianki ciała w kilku kroplach roztworu boana i inkubuj na lodzie przez 15 minut po utrwaleniu.Użyj PBT, aby trzykrotnie przepłukać chusteczkę. Następnie, aby zaoszczędzić na odczynnikach i upewnić się, że wszystkie ściany ciała są traktowane jednakowo podczas testu. Odetnij rogi każdego genotypu inaczej, aby je odróżnić.A po usunięciu szpilek drobnymi kleszkami umieść je wszystkie w tej samej silikonowanej, mikroprobówce wirówkowej o pojemności 0,65 mililitra. Aby przeniknąć do tkanki, użyj PBT, aby umyć ściany ciała trzy razy po 10 minut każda. Po usunięciu końcowego płukania dodaj 1% BSA, aby zablokować próbki i inkubować przez godzinę.Oprócz barwienia immunologicznego, ściany ciała dodają pierwszorzędowe przeciwciała myszy i królika przeciwko dwóm białkom będącym przedmiotem zainteresowania i inkubują przez dwie godziny. W tym przypadku stosuje się od jednego do 10 myszy anty DLG i jednego do 250 królików anty HTS w 1% BSA. Przeciwciała przeciwko markerom można również dodać po inkubacji.Użyj PBT, aby umyć ściany ciała trzy razy po 10 minut każda. Następnie dodać cztery znakowane fluorem przeciwciała drugorzędowe przeciwko dowolnym markerom w 1% BSA i inkubować w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc następnego ranka. Użyj PBT, aby umyć ściany ciała trzy razy po 10 minut każda.Aby rozpocząć test od jednego do pięciu rozcieńczeń w co najmniej 200 mikrolitrach. Całkowita objętość zarówno sondy PLA, sondy anty mysi minus, jak i sondy PLA anty królika plus w 1% BSA do ścian ciała inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza po użyciu buforu płuczącego A do mycia ścian ciała dwa razy przez pięć minut każdy w rozcieńczeniu ligazy w roztworze ligazy od jednego do 40, inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza po inkubacji. Użyj buforu A do mycia ścianek ciała dwa razy przez dwie minuty przed dodaniem rozcieńczenia polimerazy w ilości od 1 do 80 w roztworze do amplifikacji.Inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby przygotować próbki do obrazowania. Użyj buforu myjącego B, aby umyć ściany karoserii dwa razy po 10 minut każda. Następnie użyj 100-krotnego rozcieńczenia buforu do płukania B, aby wykonać końcowe płukanie przez jedną minutę.Równoważ ściany ciała w kilku kroplach roztworu montażowego przez co najmniej 30 minut za pomocą drobnych kleszczy. Ostrożnie przenieś ścianki korpusu na zjeżdżalnię platformową z odstępami między naskórkami w dół. Ustaw je w rzędach w tej samej orientacji w odległości jednej lub dwóch kropli od roztworu montażowego.Na preparacie należy nałożyć szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 milimetry na 40 milimetrów, uważając, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza. Następnie użyj przezroczystego lakieru do paznokci, aby uszczelnić szkiełko. Przechowuj szkiełka w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do obrazowania konfokalnego.Jak pokazano tutaj u larw njs typu dzikiego, DLG znajduje się głównie na błonie postsynaptycznej bhutonu glutaminergicznego typu pierwszego, przy czym poziomy są bardziej wyraźne w typie pierwszym B niż w typie pierwszym S bs HTS znajduje się w całym mięśniu, ale koncentruje się na błonie postsynaptycznej z poziomami równymi w obu Bhutonach typu pierwszego, DLG i HTS w dużej mierze nakładają się na siebie w regionie postsynaptycznym, aby określić, czy DLG i HTS występują w kompleksie. W N-M-J-P-L-A przeprowadzono z przeciwciałami anty DLG i anty HTS, jak pokazano tutaj. Sygnał PLA między tymi dwoma białkami obserwuje się szczególnie w dzikim typie NMJ, sygnał głównie lokalizuje się obwodowo do błony presynaptycznej oznaczonej przez HRP.Tak więc DLG i HTS znajdują się w bliskiej odległości i prawdopodobnie tworzą kompleks w regionie postsynaptycznym. Wynik jest specyficzny jako kontrola negatywna obejmująca mutanty HTS, których brakuje. Immunoreaktywność HTS nie wykazuje obserwowalnego sygnału PLA, duże powiększenie Widoki bns pokazują, że immunoreaktywność DLG i HTS rażąco nakładają się na błonę postsynaptyczną.W przeciwieństwie do tego, PLA między tymi dwoma białkami powoduje dyskretne PUNCTA, co wskazuje, że tylko podzbiór całkowitych białek DLG i HTS jest w kompleksie po opanowaniu. Wykonanie tej techniki nie trwa dłużej niż standardowa procedura immunohistochemiczna. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób PLA jest używany do wykrywania subkomórkowej lokalizacji endogennej interakcji białkowej, która zachodzi w larwie NMJ.

detection-situ-protein-protein-complexes-at-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej pracy pokazujemy, jak wykorzystać test ligacji bliskości (Proximity Ligation Assay, PLA) wraz z kombinacją przeciwciał do wizualizacji sygnalizacji białka morfogenetycznego kości (Bone Morphogenetic Protein, BMP) w utrwalonych komórkach. Technika ta pozwoliła nam śledzić nuklearną akumulację endogennych kompleksów efektorowych aktywowanych przez BMP oraz ilościowo określić ich poziomy w czasie pod wpływem stymulacji BMP4.

Wykrywanie kompleksów efektorowych szlaków sygnalizacyjnych downstream BMP4 przy użyciu in situ PLA, testu ligacji w bliskości

Złącze neuromięśniowe (NMJ) Drosophila melanogaster stanowi istotny system modelowy do badania prawidłowej funkcji synaptycznej, jak i zaburzeń tej funkcji występujących w niektórych chorobach neurologicznych. Przedstawiamy protokół sekcji układu ruchowego larw Drosophila oraz immunobarwienia białek strefy aktywnej w obrębie NMJ.

Disekcja i obrazowanie stref aktywnych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila

Ten film opisuje test ligacji zbliżeniowej do badania in situ interakcji białko-białko w komórkach nicieni. Bliskie sąsiedztwo badanych białek generuje kolistą matrycę DNA za pomocą sondy PLA dołączonej do przeciwciała wtórnego. Sonda jest dalej amplifikowana za pomocą roztworu do amplifikacji, który wytwarza długie, jednoniciowe DNA, a następnie hybrydyzuje sondę detektora, umożliwiając lokalizację interakcji białko-białko w komórkach.

Test ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ

Ten film przedstawia wizualizację interakcji białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila (NMJ) przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej (PLA). Po wyizolowaniu ścian ciała, oddziałujące białka są badane za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych i przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z PLA. Bliskość oddziałujących białek ułatwia ligację sond z oligonukleotydami konektorowymi, tworzącymi koliste DNA, które jest następnie amplifikowane przez amplifikację toczącego się koła. Sondy...

Wykrywanie interakcji białko-białko u larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Tutaj opisujemy procedurę wizualizacji i ilościowego określania z dużą czułością endogennych interakcji między retikulum endoplazmatycznym a mitochondriami w komórkach stałych. Protokół zawiera zoptymalizowany test ligacji zbliżeniowej in situ ukierunkowany na receptor 1,4,5-trifosforanu inozytolu / białko regulowane glukozą 75 / zależny od napięcia kanał anionowy / kompleks cyklofiliny D na granicy faz błony związanej z mitochondriami.

Badanie interakcji retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ w komórkach utrwalonych

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Tutaj pokazujemy, jak używać testu ligacji zbliżeniowej (PLA) do wizualizacji heterodimeryzacji MST1/MST2 w stałych komórkach z wysoką czułością.

Wykrywanie heterodimeryzacji izoform białek za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ

Ten protokół demonstruje użycie testu ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ w linii zarodkowej C. elegans.

Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

DetectSyn to bezstronny, szybki test fluorescencyjny, który mierzy zmiany we względnej liczbie synaps (zaangażowanie pre- i postsynaptyczne) w różnych terapiach lub stanach chorobowych. Technika ta wykorzystuje technikę ligacji zbliżeniowej, która może być stosowana zarówno w hodowanych neuronach, jak i w tkance stałej.

DetectSyn: szybka, bezstronna metoda fluorescencyjna do wykrywania zmian w gęstości synaps

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualizacji sieci mikrotubul w połączeniach nerwowo-mięśniowych i komórkach mięśniowych. W połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila melanogaster, protokół ten znacznie ułatwia genetyczne badania przesiewowe i analizę dynamiki mikrotubul pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym.

Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul

Poznaj metodę PLA do wykrywania interakcji białkowych in situ w połączeniach nerwowo-mięśniowych larw Drosophila. Technika ta umożliwia wizualizację kompleksów białkowych z lokalizacją przestrzenną.

Wykrywanie kompleksów białkowo-białkowych in situ w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie kompleksów białkowo-białkowych in situ w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Przeglądaj więcej filmów