Wykrywanie kompleksów białkowo-białkowych in situ w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Ten protokół pokazuje, jak można użyć testu ligacji zbliżeniowej do wykrywania interakcji in situ białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila. Dzięki tej technice wykazano, że duże dyski i Hu-li tai shao tworzą kompleks w regionie postsynaptycznym, związek wcześniej zidentyfikowany poprzez koimmunoprecypitację.

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykrycie subkomórkowej lokalizacji endogennych interakcji białkowych białek w larwie drosophila larva NMJ. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie immunofluorescencji przy użyciu pary sprzężonych oligonukleotydów przeciwciał drugorzędowych zwanych sondami PLA, które wiążą się z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko dwóm białkom będącym przedmiotem zainteresowania. Następnie luka między sondami PLA jest wypełniana poprzez hybrydyzację dwóch oligonukleotydów łącznikowych.

Tylko wtedy, gdy dwa białka znajdują się blisko siebie, a zamknięta kolista cząsteczka DNA powstaje w wyniku ligacji in situ, wówczas przeprowadza się amplifikację in situ w toczonym okręgu w celu amplifikacji sekwencji w zamkniętej kolistej cząsteczce DNA, które są następnie wykrywane za pomocą komplementarnych fluorescencyjnie znakowanych oligonukleotydów. Uzyskany w ten sposób sygnał fluorescencyjny generowany przez każdy produkt wzmacniający jest łatwo widoczny jako wyraźny jasny punkt, gdy jest oglądany za pomocą mikroskopii konfokalnej. Tak więc główną przewagą tej techniki nad innymi istniejącymi metodami, takimi jak hybrydowe wytrącanie i zagrożenie E, jest to, że PLA jest w stanie wykryć w tkance subkomórkową lokalizację endogennych białek, które są zlokalizowane w bliskiej odległości od siebie i prawdopodobnie tworzą kompleks.

Chociaż ta metoda zapewnia wgląd w sieci interakcji białko-białko, które zachodzą szczególnie w de larva i mj. Może być również stosowany w innych systemach jolo. Zasugeruj tkanki nabłonkowe w zarodkach i dyskach wyobrażeniowych.

Procedurę zademonstrują hel yu i Ha king, dwaj technicy z naszego laboratorium. Po inkubacji kultur Drosophila w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć do sześciu dni, użyj cienkich kleszczy, aby wybrać pełzające larwy trzeciego stadium z fiolek lub butelek, aby umyć larwy. Przenieś je na małą szalkę Petriego zawierającą PBS.

Następnie umieść jedną z umytych larw w krążku cygara S i zanurz ją w kilku kroplach lodowatego PBS, aby ją zahamować, ułatwiając w ten sposób manipulację. Ustaw larwy grzbietową stroną skierowaną do góry, tak aby dwie ścieżki tchawicy były widoczne pod mikroskopem preparacyjnym. Następnie za pomocą kleszczy chwycić szpilkę mnuchin, przygwoźdź larwy na tylnym końcu w pobliżu spiral za pomocą kolejnej szpilki, przebij naskórek na przednim końcu w pobliżu haczyków ustnych i delikatnie rozciągnij larwy wzdłuż przed przygwożdżeniem go.

Następnie, za pomocą mikropreparacji, nożyczki ściskają tylny koniec w pobliżu szpilki, aby utworzyć mały otwór, nacięcie powinno być na tyle powierzchowne, aby przejść tylko przez naskórek. Następnie umieść końcówkę dolnego ostrza nożyczek w nacięciu i kierując ostrza nożyczek lekko do góry, aby uniknąć uszkodzenia leżących pod spodem mięśni, przeciąć na całej długości grzbietowej linii środkowej między dwoma drogami tchawicy. Teraz wykonaj małe poziome nacięcie tuż przez naskórek, nieco przed umieszczoną z tyłu szpilką.

Następnie wykonaj kolejne podobne nacięcie nieco z tyłu od umieszczonej z przodu szpilki. Po dodaniu kilku mocnych kropli PBS do ciała larwy, użyj kleszczy, aby ostrożnie oczyścić narządy wewnętrzne. Unikaj szturchania ciała larwy, ponieważ spowoduje to uszkodzenie ciała.

Mięśnie ścianowe rozwijają ciało larwy i aby przygwoździć rogi w dół, rozciągają ścianę ciała zarówno w poziomie, jak i w pionie, aby utworzyć równomiernie napięty prostokąt. Uważając, aby nie rozerwać mięśni ściany ciała w procesie mocowania tkanki. Zanurz przypięte ścianki ciała w kilku kroplach roztworu boana i inkubuj na lodzie przez 15 minut po utrwaleniu.

Użyj PBT, aby trzykrotnie przepłukać chusteczkę. Następnie, aby zaoszczędzić na odczynnikach i upewnić się, że wszystkie ściany ciała są traktowane jednakowo podczas testu. Odetnij rogi każdego genotypu inaczej, aby je odróżnić.

A po usunięciu szpilek drobnymi kleszkami umieść je wszystkie w tej samej silikonowanej, mikroprobówce wirówkowej o pojemności 0,65 mililitra. Aby przeniknąć do tkanki, użyj PBT, aby umyć ściany ciała trzy razy po 10 minut każda. Po usunięciu końcowego płukania dodaj 1% BSA, aby zablokować próbki i inkubować przez godzinę.

Oprócz barwienia immunologicznego, ściany ciała dodają pierwszorzędowe przeciwciała myszy i królika przeciwko dwóm białkom będącym przedmiotem zainteresowania i inkubują przez dwie godziny. W tym przypadku stosuje się od jednego do 10 myszy anty DLG i jednego do 250 królików anty HTS w 1% BSA. Przeciwciała przeciwko markerom można również dodać po inkubacji.

Użyj PBT, aby umyć ściany ciała trzy razy po 10 minut każda. Następnie dodać cztery znakowane fluorem przeciwciała drugorzędowe przeciwko dowolnym markerom w 1% BSA i inkubować w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc następnego ranka. Użyj PBT, aby umyć ściany ciała trzy razy po 10 minut każda.

Aby rozpocząć test od jednego do pięciu rozcieńczeń w co najmniej 200 mikrolitrach. Całkowita objętość zarówno sondy PLA, sondy anty mysi minus, jak i sondy PLA anty królika plus w 1% BSA do ścian ciała inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza po użyciu buforu płuczącego A do mycia ścian ciała dwa razy przez pięć minut każdy w rozcieńczeniu ligazy w roztworze ligazy od jednego do 40, inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza po inkubacji. Użyj buforu A do mycia ścianek ciała dwa razy przez dwie minuty przed dodaniem rozcieńczenia polimerazy w ilości od 1 do 80 w roztworze do amplifikacji.

Inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby przygotować próbki do obrazowania. Użyj buforu myjącego B, aby umyć ściany karoserii dwa razy po 10 minut każda. Następnie użyj 100-krotnego rozcieńczenia buforu do płukania B, aby wykonać końcowe płukanie przez jedną minutę.

Równoważ ściany ciała w kilku kroplach roztworu montażowego przez co najmniej 30 minut za pomocą drobnych kleszczy. Ostrożnie przenieś ścianki korpusu na zjeżdżalnię platformową z odstępami między naskórkami w dół. Ustaw je w rzędach w tej samej orientacji w odległości jednej lub dwóch kropli od roztworu montażowego.

Na preparacie należy nałożyć szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 milimetry na 40 milimetrów, uważając, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza. Następnie użyj przezroczystego lakieru do paznokci, aby uszczelnić szkiełko. Przechowuj szkiełka w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do obrazowania konfokalnego.

Jak pokazano tutaj u larw njs typu dzikiego, DLG znajduje się głównie na błonie postsynaptycznej bhutonu glutaminergicznego typu pierwszego, przy czym poziomy są bardziej wyraźne w typie pierwszym B niż w typie pierwszym S bs HTS znajduje się w całym mięśniu, ale koncentruje się na błonie postsynaptycznej z poziomami równymi w obu Bhutonach typu pierwszego, DLG i HTS w dużej mierze nakładają się na siebie w regionie postsynaptycznym, aby określić, czy DLG i HTS występują w kompleksie. W N-M-J-P-L-A przeprowadzono z przeciwciałami anty DLG i anty HTS, jak pokazano tutaj. Sygnał PLA między tymi dwoma białkami obserwuje się szczególnie w dzikim typie NMJ, sygnał głównie lokalizuje się obwodowo do błony presynaptycznej oznaczonej przez HRP.

Tak więc DLG i HTS znajdują się w bliskiej odległości i prawdopodobnie tworzą kompleks w regionie postsynaptycznym. Wynik jest specyficzny jako kontrola negatywna obejmująca mutanty HTS, których brakuje. Immunoreaktywność HTS nie wykazuje obserwowalnego sygnału PLA, duże powiększenie Widoki bns pokazują, że immunoreaktywność DLG i HTS rażąco nakładają się na błonę postsynaptyczną.

W przeciwieństwie do tego, PLA między tymi dwoma białkami powoduje dyskretne PUNCTA, co wskazuje, że tylko podzbiór całkowitych białek DLG i HTS jest w kompleksie po opanowaniu. Wykonanie tej techniki nie trwa dłużej niż standardowa procedura immunohistochemiczna. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób PLA jest używany do wykrywania subkomórkowej lokalizacji endogennej interakcji białkowej, która zachodzi w larwie NMJ.