1.11: Pierwotne kultury neuronalne

Mózg jest jednym z najbardziej złożonych narządów w ciele, więc neuronaukowcy często potrzebują prostszego systemu do eksperymentalnych manipulacji i obserwacji. Hodowla komórkowa jest jednym z takich systemów, który umożliwia łatwy dostęp do żywych neuronów. Ogólnie rzecz biorąc, hodowla komórek polega na hodowaniu ich w specjalnych roztworach zwanych pożywkami hodowlanymi w sterylnym, kontrolowanym środowisku ? zwykle ciepły inkubator. Kultura pierwotna to taka, która jest wytwarzana z tkanki wypreparowanej z organizmu. Różne typy pierwotnych kultur neuronalnych mogą być wytwarzane z różnych zwierząt, etapów rozwojowych i tkanek układu nerwowego.

Ten film będzie stanowił wprowadzenie do metody wytwarzania pierwotnych kultur neuronalnych i niektórych eksperymentów, w których powszechnie wykorzystuje się te komórki.

Wiele modeli zwierzęcych ważnych dla badań neurobiologicznych można wykorzystać do przygotowania pierwotnych kultur neuronalnych. Z myszami i szczurami ? Dwa z najczęściej wykorzystywanych ssaków w badaniach biomedycznych ? Tkanka neuronalna z zarodków, nowonarodzonych szczeniąt i dorosłych osobników może być preparowana w celu hodowli. Zarodki i młode okołoporodowe są zazwyczaj preferowane, ponieważ komórki mózgowe są niedojrzałe i mniej podatne na uszkodzenia.

Różne tkanki układu nerwowego mogą być izolowane i wykorzystywane do produkcji różnych typów pierwotnych kultur neuronalnych. Na przykład można wypreparować określone części mózgu, takie jak móżdżek, kora mózgowa i hipokamp. Rdzeń kręgowy lub elementy obwodowego układu nerwowego, takie jak zwoje korzenia grzbietowego, można również wypreparować i wyhodować w celu wyhodowania określonych typów neuronów.

Niezależnie od źródła tkanki, ogólną metodę wytwarzania pierwotnych kultur neuronalnych można podsumować w kilku głównych krokach: rozwarstwienie, dysocjacja, posiew i utrzymanie.

Zacznijmy dogłębny przegląd tych kroków od pierwszego: Sekcji. Przygotowując się do etapów sekcji i hodowli, sterylność ma kluczowe znaczenie, aby zapobiec zanieczyszczeniu kultur. Narzędzia należy sterylizować alkoholem, a do usuwania zanieczyszczeń unoszących się w powietrzu często używa się okapu z przepływem laminarnym.

W celu hodowli neuronów gryzoni tkanki świeżo uśpionych zwierząt powinny zostać usunięte do zimnego, buforowanego roztworu soli. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego mniejsze części tkanki ? takich jak hipokampy ? można starannie odizolować w celu dalszej obróbki.

Następnie konieczne jest rozbicie próbki na składniki komórkowe w procesie znanym jako dysocjacja. Wypreparowaną tkankę najpierw miele się za pomocą skalpela lub nożyczek. Powstałe w ten sposób fragmenty tkanek są następnie przenoszone do nowego pojemnika. Następnie dodaje się enzym proteolityczny, taki jak trypsyna lub papaina, w celu strawienia białek macierzy zewnątrzkomórkowej, które wiążą ze sobą komórki. Po krótkiej inkubacji w ciepłym inkubatorze lub łaźni wodnej kawałki tkanek delikatnie przemywa się buforem w celu usunięcia enzymów.

Zmiękczone fragmenty tkanki można teraz zdysocjować przez rozcieranie, które polega na wielokrotnym przepuszczeniu tkanki przez pipetę, tak aby komórki zostały uwolnione do pojedynczej zawiesiny komórkowej. W tym momencie komórki można policzyć pod kątem koncentracji i sprawdzić pod kątem żywotności za pomocą barwników, takich jak błękit trypanowy, który pomaga określić, ile zawiesiny należy rozcieńczyć, aby pomyślnie wzrosła.

Nareszcie neurony są gotowe do hodowli! Przyjrzyjmy się kilku ważnym środkom, które należy podjąć, aby utrzymać je przy życiu i zdrowiu. Bardzo ważny jest skład pożywki hodowlanej, która jest używana do hodowli neuronów. Do pożywek zwykle dodaje się specjalne suplementy, które wspomagają przeżycie i wzrost neuronów. Inne dodatki mogą obejmować leki, które hamują podział komórek nieneuronalnych, takich jak komórki glejowe.

Po zmieszaniu zawiesiny komórek neuronalnych z pożywką, komórki są gotowe do posiewu w żądanych pojemnikach. Mogą to być naczynia i talerze hodowlane lub szklane szkiełka nakrywkowe umieszczone wewnątrz tych pojemników. Ponieważ neurony nie mogą rosnąć bezpośrednio na szkle, szkiełka nakrywkowe są wcześniej poddawane obróbce, aby stworzyć lepsze powierzchnie do przyczepiania się i wzrostu komórek. Zabiegi te mogą obejmować powlekanie syntetycznymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej; na przykład polilizyna i laminina; lub trawienie kwasem w celu zszorstkowania powierzchni.

Po platerowaniu neurony są hodowane w ciepłym, nawilżonym inkubatorze. Wzrost procesów neuronalnych można zaobserwować w ciągu kilku godzin do kilku dni. Aby utrzymać kultury, część pożywek hodowlanych jest zastępowana świeżymi pożywkami mniej więcej raz w tygodniu. Zazwyczaj pierwotne hodowle neuronów są używane do eksperymentów w dowolnym miejscu od kilku dni do kilku tygodni po posiewaniu.

Teraz, gdy neurony rosną w kulturach, co możesz zrobić z tymi komórkami?

Jedną z podstawowych metod powszechnie stosowanych w hodowlach neuronów jest manipulacja genetyczna poprzez transfekcję lub transdukcję wirusa. Materiał genetyczny kodujący na przykład zmutowane białko może zostać wprowadzony do hodowanych neuronów w celu zmiany funkcji neuronów. Alternatywnie, transfekcja z dwuniciowym RNA jest skuteczną techniką blokowania ekspresji białek. Dostępność wielu metod i odczynników do manipulacji genetycznych sprawia, że jest to szczególnie cenne zastosowanie dla szerokiej gamy pytań badawczych.

Przykładowym pytaniem, na które można odpowiedzieć za pomocą transfekcji w kulturach neuronalnych, jest: W jaki sposób i gdzie pewne białka lub kompleksy białkowe są transportowane do różnych struktur morfologicznych neuronu? Aby uzyskać odpowiedź, neurony są transfekowane DNA kodującym interesujące nas białko, które można połączyć z białkiem fluorescencyjnym, takim jak białko zielonej fluorescencji lub GFP. Wzorce ruchu i lokalizacja białka znakowanego fluorescencyjnie mogą być następnie monitorowane za pomocą obrazowania na żywo. Metoda ta może być wykorzystana do badania np. transportu receptorów neuroprzekaźników na powierzchnię komórki.

Pierwotne hodowle neuronów są również bardzo przydatne w badaniach elektrofizjologicznych, w których aktywność elektryczną pojedynczych komórek można mierzyć za pomocą mikroelektrod. Pojedyncza warstwa neuronów w hodowli oznacza, że pojedyncze komórki są łatwe do namierzenia, a manipulacje, takie jak leczenie farmakologiczne, są szybko i równomiernie stosowane. Na przykład wpływ badanego związku na aktywność pojedynczego neuronu można zmierzyć za pomocą techniki zacisku krosowego w hodowanych neuronach.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do pierwotnych kultur neuronalnych. W tym filmie pokazaliśmy, w jaki sposób te kultury są przygotowywane i jakie są rodzaje eksperymentów, w których są powszechnie używane. Pierwotne hodowle neuronów można wytwarzać z wielu różnych źródeł tkankowych, zwykle przy użyciu metody obejmującej preparację, dysocjację do zawiesiny komórkowej i hodowlę w pożywkach hodowlanych w inkubatorach.

Dzięki za oglądanie!