Szybka i solidna analiza polaryzacji komórkowej i molekularnej indukowanej przez sygnalizację chemokinową
12 grudnia 2014
Sygnalizacja chemokiny wywołuje wyraźne zmiany w morfologii komórek i niektóre ważne redystrybucje białek wewnątrzkomórkowych. W tym przypadku dostarczany jest szybki i szczegółowy protokół do badania tych zdarzeń.
Celem poniższej procedury jest szybkie i automatyczne ilościowe określenie zmian w morfologii komórek i subkomórkowej lokalizacji określonych białek będących przedmiotem zainteresowania w dużej liczbie komórek w odpowiedzi na określony bodziec. Osiąga się to poprzez uprzednią stymulację limfocytów T za pomocą interesujących ich rodzajów chemii. W drugim etapie komórki są znakowane fluorescencyjnie, a następnie analizowane za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej.
W ostatnim kroku liczbę morfologicznie spolaryzowanych limfocytów i stopień segregacji markerów fluorescencyjnych można ocenić na podstawie lokalizacji i intensywności pikseli dla każdego barwienia, w zależności od wybranej maski. Ostatecznie ta technologia obrazowania cytometrii przepływowej może być wykorzystana do szybkiego i solidnego ilościowego określenia zmian morfologicznych limfocytów po stymulacji chemokinami, a także lokalizacji określonych białek będących przedmiotem zainteresowania w spolaryzowanych komórkach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia, jest to, że duża liczba komórek może być wielokrotnie przetwarzana i automatycznie analizowana, co zapewnia statystycznie silną analizę zmian morfologicznych i rozmieszczenia białek.
W limfocytach T stymulowanych chemokiną, stymulacja limfocytów T w rodzaju Boche rozpoczyna się od pięciokrotnego wyśrodkowania pięciu komórek w warunkach eksperymentalnych w ciepłym HBSS uzupełnionym 10 milimolowymi HEPs, wirowaniu przez pięć minut w temperaturze 340 razy G.At temperaturze pokojowej, usunięciu supinatu i ponownym zawieszeniu granulek w 0,3 mililitra ciepłego HBSS na kawałek na probówkę. Następnie przenieś zawiesiny komórek do pojedynczych mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj od 10 do 500 nanogramów na mililitr chemokiny do każdej probówki, a następnie odwróć probówki kilka razy, aby wymieszać.
Inkubuj komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po ośmiu do 10 minutach zatrzymaj polaryzację za pomocą 0,3 mililitra ciepłego, 2% paraldehydu uzupełnionego 10 milimolami. On groszku.
Następnie wymieszaj probówki z większą ilością odwracania i inkubuj je przez kolejne pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wybarwić komórki do analizy immunofluorescencyjnej. Następnie przenieś stymulowane limfocyty T do odpowiednich probówek do cytometrii przepływowej. Całkowicie napełnij probówki buforem barwiącym.
Następnie odwiruj komórki i ponownie zawieś granulki w 100 mikrolitrach 5% płodowej surowicy cielęcej w PBS. Teraz dodaj pięć mikrolitrów ZI N-T-H-L-A-A-B-C do każdej probówki. Wiruj je i inkubuj komórki przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności pod koniec inkubacji.
Umyj komórki dwukrotnie, a następnie inkubuj je w 500 mikrolitrach 1% para formaldehydu. Po 10 minutach umyj komórki w większej ilości buforu barwiącego, a następnie całkowicie napełnij probówki buforem przenikającym. Po dwukrotnym umyciu komórek w buforze przenikania pozostaw probówki, aby usunąć supinat, a następnie odwirować je, aby zdysocjować osady komórkowe.
Teraz wybarwić próbki punktem zerowym 25 mikrogramów na mililitr, trixi na schab, wirować je i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie, pod koniec okresu inkubacji, umyć komórki w buforze do przenikania. Znowu resus.
Zawieś granulki w 200 mikrolitrach PBS, a następnie przenieś komórki do pojedynczych mikroprobówek wirówek, aby określić procent spolaryzowanych limfocytów T po stymulacji chemokinami. Najpierw włącz obrazowy cytometr przepływowy i pozwól mu się skalibrować zgodnie z instrukcjami producenta. Narysuj histogramy, które określają ilościowo wartości gradientu RMS na podstawie populacji wybranej w punkcie ostrości gradientu RMS.
Histogram wyznacza populację pojedynczych komórek na histogramie obszaru po włożeniu probówki mikrowirówki do maszyny, dostosowuje chód mocy lasera na poszczególnych komórkach i uzyskuje 5 000 limfocytów T. W oprogramowaniu do analizy pomysłów. Otwórz pobrane pliki, a następnie utwórz histogram przedstawiający wartość RMS gradientu dla obrazów w jasnym polu uzyskanych dla każdej pojedynczej komórki, rysując bramkę na komórkach, wykazując wartość gradientu RMS powyżej 57.
W menu analizy utwórz nową maskę o nazwie erode M1 two z maski morfologicznej na obrazach w jasnym polu M zero jeden zerodowany z dwóch pikseli. Następnie w menu cech analizy utwórz nową cechę obszaru obliczonego na masce erozji M1 dwie z komórek utworzonych w poprzedniej bramce. Otwórz histogram pokazujący obszar komórek Korzystając z tej nowo utworzonej maski, narysuj bramkę na poszczególnych komórkach T, wyłączając koraliki kalibracyjne i zanieczyszczenia na małym obszarze, a także dublety na dużym obszarze.
Następnie otwórz a. bot składający się z surowego maksimum na barwieniu H-L-A-A-B-C jako funkcji surowego maksimum piksela na barwieniu Phin w menu masek analizy z tyłu do nowej maski o nazwie erozja M dwa dwa z maski morfologii komórek barwiących H-L-A-A-B-C zerodowanych o dwa piksele. Następnie w menu obiektów analizy utwórz nowy obiekt składający się z parametru kołowości obliczonego na erodze M dwa dwa.
Następnie utwórz kolejny histogram, aby przedstawić wartości funkcji kołowości z wcześniej bramkowanych komórek. Następnie, patrząc na kształt histogramu dla komórek niestymulowanych, RO agatuje się dla komórek spolaryzowanych, zaczynając od najniższej wartości kołowości aż do wartości granicznej okrągłości, w której większość komórek niestymulowanych jest wykreślana w celu oceny polaryzacji barwienia aktyny w komórkach. Plus histogram dla podobieństwa jasnych szczegółów, wartość R trzy do porównania H-L-A-A-B-C i foid w barwieniu.
Następnie przy użyciu tej samej strategii bramkowania, jak właśnie pokazano, plus GA na niestymulowanych komórkach dla niekolokalizowanego posegregowanego barwienia. Panel statystyk pokazuje tutaj procent limfocytów T ze spolaryzowanym barwieniem aktyną. Pokazano przykłady limfocytów T stymulowanych CCL 19, które wpadają w bramę komórek niespolaryzowanych lub spolaryzowanych.
Wyraźnie można zaobserwować różnice w morfologii między obiema subpopulacjami. Właśnie zademonstrowana strategia bramkowania może być również wykorzystana do wykreślenia procentu komórek, które wpadają w spolaryzowaną bramkę przy braku obecności CCL 19. Zgodnie z oczekiwaniami jasne jest, że stymulacja chemokiną zwiększa odsetek spolaryzowanych limfocytów T.
Można również wykreślić średni wskaźnik kołowości całej populacji komórek uzyskany w obu warunkach. Rzeczywiście, stymulacja CCL 19 wywołuje spadek tego wskaźnika. Jednakże, ponieważ tylko połowa komórek jest spolaryzowana, zmiana średniego wskaźnika kolistości obserwowana po stymulacji CCL 19 jest niewielka.
W tym eksperymencie limfocyty T zostały przecięte przez GFP wraz z plazmidami kodującymi dominujące ujemne mutanty kompleksu polarności par sześć. PKC zeta. Histogram dla komórek transfekowanych nont pozwolił na specyficzne bramkowanie dla odpowiednich komórek T GFP dodatnich, co wskazuje, że transfekowana została zbyt niewielka część całej populacji komórek.
Stopień polaryzacji morfologicznej tych transfekowanych komórek został następnie określony ilościowo, mierząc tylko wskaźnik kolistości komórek GFP dodatnich i dodatkowy chód dla limfocytów T. Wykazując niskie wartości cyrkularności, stworzono w celu oszacowania procentu spolaryzowanych komórek w każdym pobranym warunku. Łącznie dane te pokazują, że zakłócenie funkcji par sześć PK CZ do szlaku sygnałowego hamuje polaryzację komórek T indukowaną zarówno przez chemokiny CCL 19, jak i c Xcl 12.
Zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami. Podczas próby tej procedury bardzo ważne jest, aby zawsze pracować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cały etap stymulacji krewniaków roztworu i następującego po nim utrwalenia, aby zapewnić silną i niezawodną polaryzację morfologiczną limfocytów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę ilościowego określania zmian w morfologii komórek i lokalizacji białek w komórkach T po stymulacji chemokinami. Wykorzystuje cytometrię przepływową z obrazem do szybkiego przeanalizowania dużych populacji komórek.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia komórki
- Immunologia
- Ilościowe obrazy
Tło
- Sygnalizowanie chemokinami wpływa na morfologię komórki.
- Redystrybucja białek wewnątrzkomórkowych jest kluczowa dla funkcji komórki.
- Tradycyjne metody mikroskopowe mają ograniczoną przepustowość.
- Cytometria przepływowa z obrazem umożliwia zautomatyzowaną analizę wielu komórek.
Cel badania
- Ilościowe określenie zmian morfologicznych w limfocytach po stymulacji chemokinami.
- Ocenienie lokalizacji określonych białek w spolaryzowanych komórkach.
- Ulepszenie analizy statystycznej poprzez przetwarzanie o dużej przepustowości.
Stosowane metody
- Stymulowanie komórek T chemokinami.
- Fluorescencyjne oznaczanie komórek.
- Analiza za pomocą cytometrii przepływowej z obrazem.
- Ocena morfologii komórek i segregacji białek.
Główne wyniki
- Szybkie ilościowe określenie spolaryzowanych limfocytów.
- Ocenienie dystrybucji fluorescencyjnego markera.
- Statystycznie solidna analiza zmian morfologicznych.
- Porównanie z tradycyjnymi metodami mikroskopowymi.
Wnioski
- Cytometria przepływowa z obrazem jest skuteczna do analizy morfologii komórek.
- Ta metoda zwiększa zrozumienie efektów sygnalizowania chemokinami.
- Umożliwia efektywne badanie dużych populacji komórek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables high-throughput quantification of chemokine-induced cellular polarization and protein redistribution, addressing a key bottleneck in target validation for immunomodulatory drug discovery. By automating morphological and co-localization analysis across thousands of cells, it enhances predictive confidence in early-stage mechanistic de-risking of chemokine receptor pathways. The approach supports scalable, reproducible assessment of compound effects on cell polarity, directly informing go/no-go decisions in preclinical portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chemokine receptor signaling hypotheses through quantitative measurement of actin polarization and phospho-ERM segregation as functional readouts of pathway activation.
- Operational Value: Provides statistically robust data from large cell populations, reducing variability and increasing confidence in target engagement assessments.
- Translational Value: Supports mechanistic de-risking by linking receptor stimulation to defined cytoskeletal rearrangements, clarifying biological function before downstream investment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes a quantitative, imaging-based assay for polarization that captures both shape change and protein redistribution, enabling multiparametric profiling of compound effects.
- Operational Value: Uses imaging flow cytometry to process 5,000+ cells per condition with automated gating, ensuring assay standardization and reproducibility across runs.
- Translational Value: Generates scalable, multiplexable readouts suitable for hit validation and lead optimization in chemokine-targeted screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates utility in evaluating inhibitory compounds (e.g., actin polymerization blockers) and genetic perturbations (e.g., Par6/aPKC mutants), providing a disease-relevant system for pathway-specific de-risking.
- Operational Value: Enables side-by-side comparison of polarized vs. non-polarized subpopulations within the same sample, improving internal control and data interpretability.
- Translational Value: Supports translational biomarker alignment by correlating morphological polarization with subcellular protein segregation, a hallmark of functional chemokine response.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, offering a quantitative bridge between biochemical receptor engagement and functional cellular phenotype. It enables early assessment of whether a compound modulates not just receptor binding but also downstream effector mechanisms critical for immune cell function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying morphological polarization and protein co-localization as direct outputs of chemokine receptor signaling, clarifying pathway activity in primary lymphocytes.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized staining, stimulation, and imaging flow cytometry protocols that produce quantitative circularity and co-localization metrics for compound screening.
- Analytics: Provides RMS gradient, area, circularity, and co-localization readouts that enable statistical comparison of conditions and compound effects on cell polarity.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical continuity by establishing a disease-relevant readout (actin/phospho-ERM segregation) that mirrors in vivo polarization events.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular, plug-and-play capability for immunology and oncology teams studying chemokine-driven cell migration, adaptable to multiple stimuli and readouts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in chemokine receptor signaling through direct, multiparametric visualization of polarization events.
- Operational Value: Delivers standardization and scalability via automated imaging flow cytometry analysis, minimizing user bias and enabling consistent execution across sites.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative insight into functional pathway modulation, reducing late-stage failure due to unanticipated biological complexity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of chemokine-targeted candidates based on their ability to induce or inhibit bona fide cellular polarization phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in imaging flow cytometry operation, compensation, and mask-based analysis for morphological and fluorescence parameters.
- Dependent on access to imaging flow cytometry instrumentation and associated software for feature extraction (e.g., RMS gradient, circularity, co-localization).
- Necessitates standardization of cell stimulation, fixation, and staining protocols across users to ensure reproducibility of polarization readouts.
- Requires optimization of chemokine concentration and incubation time for each cell type and stimulus to avoid over- or under-stimulation artifacts.
- Limited to adherent or suspension cells compatible with imaging flow cytometry shear stress; not applicable to fragile or non-viable primary samples without optimization.
