Name: Szybka i solidna analiza polaryzacji komórkowej i molekularnej indukowanej przez sygnalizację chemokinową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Poznaj metodę szybkiej analizy polaryzacji komórkowej limfocytów T po stymulacji chemokinowej przy użyciu cytometrii przepływowej z obrazowaniem. Technika ta umożliwia automatyczną kwantyfikację zmian morfologicznych i lokalizacji białek w dużych populacjach komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy bardzo dziękują Pierre'owi Bourdoncle'owi, Thomasowi Guilbertowi i Louise Rimbault z Cochin Imaging Facility. Prace te były wspierane przez Inserm, CNRS i Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe labellisée).

1. Przygotowanie limfocytów T
<ol>
	<li>Przygotować pierwotne mysie lub ludzkie limfocyty T zgodnie z opisem10,11.</li>
	<li>Hodować ludzkie limfocyty T w kompletnym pożywce RPMI z 10% ludzką surowicą AB o gęstości 2 - 3 x 106 komórek/ml. 
	UWAGA: Użycie płodowej surowicy cielęcej (FCS) zamiast ludzkiej surowicy może wywołać spontaniczną polaryzację dużej części ludzkich limfocytów T w hodowli. Trzymaj te komórki w hodowli przez 4-5 dni i kontynuuj je w dowolnym momencie w tym okresie.</li>
	<li>Utrzymuj mysie limfocyty T w kompletnym pożywce RPMI uzupełnionej 10% FCS o podobnej gęstości komórek. Stosować natychmiast lub następnego dnia, po posiewie O/N w temperaturze 37 °C w obecności 10 ng/ml IL7.</li>
	<li>Hoduj ludzką linię komórek T CEM w kompletnym RPMI uzupełnionym 10% FCS.</li>
</ol>
2. Stymulacja chemokiny
<ol>
	<li>Przemyć 5 x 105 komórek na warunki eksperymentalne w ciepłym pożywce HBSS uzupełnionej 10 mM Hepes. W przypadku niektórych eksperymentów kotransfekcja pierwotnych ludzkich limfocytów T dzień wcześniej z 2 μg pmaxGFP i 8 μg pcDNA3.1 + (pusty wektor, kontrola), martwa kinaza PKCζ lub N-końcowe plazmidy Par6.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w ciepłym podłożu HBSS-Hepes (użyć 0,3 ml x liczba warunków doświadczalnych).</li>
	<li>Rozprowadzić komórki w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Dlatego jedna probówka odpowiadająca pojedynczemu warunkowi eksperymentalnemu będzie zawierała 5 x 105 komórek w 0,3 ml pożywki HBSS-Hepes. W przypadku niektórych eksperymentów dodaj 500 nM latrunkuliny A lub nośnika (DMSO) i inkubuj komórki przez 30 minut przed stymulacją chemokiną.</li>
	<li>Dodać od 10 do 500 ng/ml chemokiny CCL19 lub CXCL12 do każdej probówki. 
	UWAGA: Zwykle używamy 10 - 200 ng / ml chemokiny dla ludzkich limfocytów T. Komórki CEM nie wykazują ekspresji receptora CCR7, który wiąże CCL19. Dlatego komórki CEM będą w stanie zareagować tylko na stymulację CXCL12. Ponadto należy stosować wyższe stężenia chemokiny (300 - 500 ng / ml) do polaryzacji mysich limfocytów T.</li>
	<li>Odwróć probówki kilka razy i inkubuj je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 8 lub 10 minut odpowiednio dla pierwotnych limfocytów T lub CEM.</li>
	<li>Zatrzymaj proces polaryzacji, dodając do każdej probówki 0,3 ml ciepłego roztworu zawierającego 2% paraformaldehydu (PFA) i 10 mM Hepes w PBS. Odwrócić probówki i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
</ol>
3. Plamy
<ol>
	<li>Przenieś komórki z probówek do mikrowirówek do probówek cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Całkowicie napełnić probówki roztworem RT zawierającym 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,5 mM EDTA i 10 mM Hepes w PBS.</li>
	<li>Odwirować probówki o masie 460 x g przez 4 minuty.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl roztworu RT zawierającego 5% FCS w PBS.</li>
	<li>Dodaj 5 μl FITC-anty-HLA-ABC do każdej probówki, wiruj je i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, z dala od światła.</li>
	<li>Umyć komórki raz PBS zawierającym 5% FCS i raz tylko PBS.</li>
	<li>W temperaturze pokojowej: dodać 500 μl 1% PFA, inkubować przez 10 minut, następnie przemyć komórki roztworem zawierającym 1% BSA, 0,5 mM EDTA i 10 mM HEPES w PBS.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, całkowicie napełnić probówki roztworem PBS zawierającym 0,2% BSA, 0,1% saponiny, 0,5 mM EDTA i 10 mM Hepes (bufor permeabilizacyjny).</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie w tym medium.</li>
	<li>Odwróć probówki, aby usunąć pożywkę i odwróć je, aby oddzielić osad komórkowy.</li>
	<li>Dodać 0,25 μg/ml TRITC-falloidyny i/lub rozcieńczyć przeciwciało anty-P-ERM w stosunku 1:100 do każdej probówki, zawirować je i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć komórki buforem permeabilizacyjnym. W razie potrzeby inkubować z fluorescencyjnym przeciwciałem drugorzędowym.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 200 μl PBS i przenieść je do probówek do mikrowirówek. 
	UWAGA: Komórki są gotowe do akwizycji. Alternatywnie, zachowując maksymalną całkowitą objętość 200 μl na probówkę, dodać skoncentrowany PFA do końcowego stężenia 1% w celu zachowania barwień, jeśli komórki nie mają być użyte tego samego dnia do dalszego przetwarzania.</li>
</ol>
4. Akwizycja i analiza obrazów
<ol>
	<li>Włącz aparaturę (patrz Tabela Specyficznych Odczynników/Sprzętu) i pozwól mu się skalibrować zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Oprogramowanie INSPIRE było używane z obiektywem 40X (0,75 NA). Do wszystkich raportowanych kwantyfikacji wykorzystano oprogramowanie IDEAS 3.0.</li>
	<li>Przygotuj serię okien akwizycji, które można zapisać w szablonie do przyszłych eksperymentów. Narysuj histogramy, które określają ilościowo wartości gradientu RMS. Z populacji "W centrum uwagi", wybranej na histogramie gradientu RMS, wyznacz populację "Pojedyncza komórka" na histogramie obszaru. Po włożeniu probówki mikrowirówki do maszyny, wyreguluj moc lasera, włącz poszczególne komórki i uzyskaj 5,000 limfocytów T.</li>
	<li>W oprogramowaniu Ideas otwórz plik akwizycji i utwórz histogram, który pokaże wartość RMS gradientu dla obrazów w jasnym polu (Kanał 1) uzyskanych dla każdej pojedynczej komórki. Narysuj bramkę na histogramie gradientu RMS, która uwzględnia komórki wykazujące wartość gradientu RMS powyżej 57, 
	UWAGA: Gradient RMS pozwala na uwzględnienie w analizie tylko tych limfocytów T, które znajdują się w płaszczyźnie ogniskowej. Ustaliliśmy empirycznie, że pojedyncze komórki wykazujące wartość gradientu RMS większą niż 57 znajdują się w płaszczyźnie ogniskowej i można je dokładnie uwzględnić.</li>
	<li>W menu Analiza/Maski utwórz nową maskę o nazwie Erode(M01,2) z maski morfologicznej na obrazach w jasnym polu M01, zerodowanej o 2 piksele. Następnie w menu Analiza/Obiekty utwórz nową cechę Obszaru, obliczoną na masce Ero(M01,2). Z komórek wybranych w poprzedniej bramie otwórz histogram pokazujący obszar komórek przy użyciu tej nowo utworzonej maski. 
	UWAGA: Maski morfologii, które są dostępne domyślnie, są znacznie większe niż rzeczywisty rozmiar komórki. W ten sposób bardziej precyzyjne jest erodowanie go do 2 pikseli.</li>
	<li>Narysuj bramkę na poszczególnych limfocytach T, z wyłączeniem koralików kalibracyjnych i zanieczyszczeń (mały obszar) oraz dubletów (duży obszar). Dostosuj tę bramkę przy każdym przejęciu. 
	UWAGA: Różnice w rozmiarze komórki będą miały wpływ na położenie bramy. Ponieważ mysie limfocyty T są mniejsze niż ludzkie limfocyty T, które same w sobie są mniejsze niż komórki CEM, powierzchnia każdego typu komórki będzie proporcjonalna do jej wielkości.</li>
	<li>Biorąc pod uwagę pojedyncze, ostre komórki, które zostały bramkowane w poprzednich krokach, otwórz wykres punktowy składający się z Raw Max Pixel na barwieniu HLA-ABC (kanał 2, oś x) jako funkcja Raw Max Pixel na barwieniu falloidyny (Kanał 4, oś y). Utwórz bramkę, aby wykluczyć niezabarwione lub nasycone zdarzenia fluorescencyjne. Otwórz dwa histogramy przedstawiające Raw Max Pixel dla barwień HLA-ABC (kanał 2) i falloidyny (kanał 4).</li>
	<li>W menu Analiza/Maski utwórz nową maskę o nazwie Erode(M02,2) z maski morfologicznej komórek barwionych HLA-ABC (Kanał 2), zerodowanej o 2 piksele. Następnie w menu Analiza/Obiekty utwórz nowy element składający się z parametru Kołowość, obliczonego na podstawie parametru Erode(M02,2). 
	UWAGA: Ten parametr mierzy odchylenie kształtu komórki od okręgu. Dlatego idealnie okrągła komórka T będzie miała wysoką wartość kołowości, podczas gdy wydłużone spolaryzowane komórki będą wykazywać niski wskaźnik kołowości.</li>
	<li>Następnie utwórz kolejny histogram, który będzie zawierał wartości funkcji Kolistość z wcześniej bramkowanych komórek. Użyj tego histogramu, aby bezpośrednio wykreślić rozkład pojedynczej, wyostrzonej populacji komórek zgodnie z wartością kołowości dla każdej pojedynczej komórki.</li>
	<li>Patrząc na kształt histogramu dla komórek niestymulowanych, narysuj bramkę dla komórek spolaryzowanych, zaczynając od najniższej wartości kołowości aż do wartości granicznej kolistości, w której wykreślona jest większość komórek niestymulowanych. Spójrz na wyświetlane statystyki dotyczące procentu spolaryzowanych komórek w populacji bramkowanej (%bramkowanej). 
	UWAGA: Ustawiliśmy tę bramkę dla wartości indeksu cyrkularności poniżej 13.</li>
	<li>Aby przyjrzeć się polaryzacji barwienia aktyną w komórkach, należy wykreślić histogram dla wartości podobieństwa jasnych szczegółów R3, porównując barwienie HLA-ABC (kanał 2) i barwienie falloidyną (kanał 4). 
	UWAGA: Im większa wartość tej cechy, tym bardziej nałożone na siebie są te dwie plamy.</li>
	<li>Używając tej samej strategii bramkowania, co poprzednio, narysuj bramkę na niestymulowanych komórkach dla segregowanego barwienia, która pokazuje procent komórek ze spolaryzowanym barwieniem aktyny.</li>
	<li>Po zakończeniu, odsetek komórek wykazujących segregację w rozkładzie MHC klasy I i barwienia falloidyną, procent spolaryzowanych komórek wraz ze średnimi wartościami wskaźników cyrkularności i podobieństwa wszystkich komórek ± SD są pokazane w odpowiednich panelach statystycznych.</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, D., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+chemokines+and+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biology of chemokines and their receptors.</a> Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).</li>
<li>Thelen, M., Stein, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+chemokines+invite+leukocytes+to+dance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">How chemokines invite leukocytes to dance.</a> Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).</li>
<li>Rougerie, P., Rho Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases%3A+masters+of+T+lymphocyte+migration+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation.</a> Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).</li>
<li>Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+polarization+in+cell+migration+and+immune+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions.</a> Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).</li>
<li>Adams, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+growth+factor+and+macrophage+inflammatory+protein+1+beta%3A+structurally+distinct+cytokines+that+induce+rapid+cytoskeletal+changes+and+subset-preferential+migration+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).</li>
<li>Rougerie, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fam65b+is+a+new+transcriptional+target+of+FOXO1+that+regulates+RhoA+signaling+for+T+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration.</a> J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).</li>
<li>Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Atypical+PKCs+regulate+T+lymphocyte+polarity+and+scanning+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior.</a> J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).</li>
<li>Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+T+cell+shape%2C+motility%2C+and+sensitivity+to+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen.</a> Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).</li>
<li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageStream+System%3A+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), 409(2007).</li>
<li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen+specific+CD4%2B+T+cells+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+phosphorylation%3A+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li>
<li>Freeley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+regulates+polarization+and+migration+in+chemokine-stimulated+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes.</a> J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wykorzystując najnowszą technologię obrazowania cytometrii przepływowej, przedstawiono szybką i pouczającą strategię bramkowania do analizy zdarzeń komórkowych i molekularnych wywołanych stymulacją chemokin. Z pojedynczego eksperymentu można uzyskać dwa główne rodzaje informacji: zmiany w morfologii komórek wywołane stymulacją chemokiny oraz subkomórkową dystrybucję różnych białek podczas procesu polaryzacji. Co ciekawe, przedstawiono również dowody na możliwość analizy dużej liczby komórek, co pozwala na statystyczną so...

Chemokiny to małe rozpuszczalne białka, które przyciągają komórki do wyspecjalizowanych miejsc1. Dlatego uczestniczą w prawidłowym pozycjonowaniu komórek w tkankach, co jest kluczową funkcją w rozwoju i fizjologii. Układ odpornościowy nie jest wyjątkiem od tej reguły, ponieważ opiera się na działaniu wielu różnych typów komórek, które działają wspólnie, aby wytworzyć skuteczną odpowiedź immunologiczną. Kontrolując specyficzną lokalizację jednego typu komórek odpornościowych w danym stanie, chemokiny są wstępnie wymagane, zanim obce antygeny będą mogły zostać wykryte i zneutralizowane.
W szczególności w limfocytach T, chemokiny wiążą się ze specyficznymi receptorami powierzchniowymi, które po zaangażowaniu wywołują wiele sygnałów wewnątrzkomórkowych (wzrost wapnia, fosforylacja ERK, aktywacja GTPaz Rho, wzrost powinowactwa integryn i zmiany cytoszkieletu), które sprzyjają ruchliwości komórek T2,3. Na poziomie komórkowym można zaobserwować zmiany morfologiczne wywołane stymulacją chemokiną. Te zmiany w kształtach komórek są szczególnie dramatyczne w limfocytach T: odpoczywające limfocyty T mają okrągłą morfologię przypominającą koraliki, gdy podróżują w krwiobiegu. Jednak wykrycie obecności chemokin w miejscach zapalnych lub w pobliżu narządów limfatycznych zmieni kształt limfocytów T, które teraz przyjmują typową morfologię "lustrzanego odbicia dłoni" składającą się z formy dwubiegunowej: krawędź natarcia z przodu i krawędź spływu, czyli uropod,z tyłu. Ponadto składniki wewnątrzkomórkowe mogą segregować się w te dwa przeciwległe regiony spolaryzowanej komórki T, aby podtrzymać migrację. Na przykład polimeryzacja włókien aktynowych wzrasta po stymulacji chemokiną5, a spolimeryzowana aktyna gromadzi się z przodu spolaryzowanej limfocytu T2. Z drugiej strony, kilka białek, takich jak fosforylowane białka z rodziny Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), które łączą błonę plazmatyczną z korowym cytoszkieletem F-aktyny, ponownie lokalizują się w uropodach spolaryzowanych limfocytów T6. Co ciekawe, my i inni wykazaliśmy, że ten proces polaryzacji jest wymagany do migracji limfocytów T. Rzeczywiście, każde leczenie, które zakłóca polaryzację, hamuje ruchliwość komórek. Na przykład hamowanie aktywności członków rodziny atypowych kinaz białkowych C (PKC), PKCζ i PKCι blokuje polaryzację limfocytów T i ich migracyjny proces skanowania komórek dendrytycznych7. Polaryzacja limfocytów T jest również regulowana przez GTPazy Rho. Wykazaliśmy, że modulacja aktywności RhoA przez niedawno opisane białko Fam65b zakłóca zmiany morfologii limfocytów T i ich zdolność do migracji w teście Transwell6. Ponieważ polaryzacja jest niezbędnym etapem dla ruchliwości komórek, ważne jest, aby móc określić ją ilościowo jako główny odczyt odpowiedzi chemokin. Zmiany kształtu komórki były wcześniej mierzone ręcznie8. Tego rodzaju kwantyfikacja jest jednak bardzo czasochłonna, przez co zwykle bierze się pod uwagę tylko kilkadziesiąt komórek.
Tutaj prezentowana jest nowa metoda szybkiego ilościowego określania stopnia zmian kształtu limfocytów T narażonych na stymulację chemokinami. Stosowana jest technologia obrazowania cytometrii przepływowej (patrz Tabela specyficznych odczynników/sprzętu), która łączy zalety cytometru przepływowego i mikroskopu9 w celu skutecznego ilościowego określenia ilości spolaryzowanych komórek w różnych warunkach stymulacji chemokinami. Oprócz kwantyfikacji zmian morfologicznych, które można solidnie zmierzyć za pomocą tej technologii, możliwa jest również ocena zmian w subkomórkowej lokalizacji niektórych białek po sygnalizacji chemokinowej.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Surowica ludzka AB</td><td>PAA</td><td>C11-021</td><td>Podgrzej wstępnie, aby dezaktywować dopełniacz.</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3300</td><td>Podgrzej wstępnie, aby dezaktywować dopełniacz.</td></tr><tr><td>Zestaw nukleofactor ludzkich limfocytów T</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Murine CCL19</td><td>Peprotech</td><td>250-27B</td><td>Podwielokrotności rozmraża się na lodzie przed dodaniem chemokiny do komórek.</td></tr><tr>Ludzkie podwielokrotności <td>CCL19</td><td>Peprotech</td><td>300-29B</td><td>rozmraża się na lodzie przed dodaniem chemokiny do komórek.</td></tr><tr><td>Ludzkie CXCL12</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td>Aliquots są rozmrażane na lodzie przed dodaniem chemokiny do komórek. Ta chemokina może być również stosowana na mysich limfocytach T.</td></tr><tr><td>Mikroskopia elektronowa</td> <td>PFA</td> Nauki <td>157-8-100</td><td>Jest to 8% roztwór PFA w wodzie. Wymieszaj objętość do objętości z 2x PBS, aby uzyskać 4% roztwór PFA w PBS.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Fluka</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 falloidyna</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>FITC-przeciwciało anty-HLA-ABC</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1838</td><td>klon B9.12.1</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-P-ERM</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>3149P</td><td></td></tr><tr><td>ImageStreamx Mark II</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

szybka i solidna analiza polaryzacji komórkowej i molekularnej indukowanej przez sygnalizację chemokinową

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Komórki reagują na stymulację chemokiną utratą swojego okrągłego kształtu w procesie zwanym polaryzacją oraz zmianą lokalizacji subkomórkowej wielu białek. Do badania tych zjawisk wykorzystano klasyczne techniki obrazowania. Wymagały one jednak ręcznego pozyskania wielu komórek, a następnie czasochłonnej kwantyfikacji morfologii i kolokalizacji barwienia dziesiątek komórek. W tym miejscu opisano szybką i potężną metodę badania tych zjawisk na próbkach składających się z kilku tysięcy komórek przy użyciu technologii obrazowania cytometrii przepływowej, która łączy zalety mikroskopu z zaletami cytometru. Wykorzystując limfocyty T stymulowane CCL19 i barwienie cząsteczek MHC klasy I i nitkowatej aktyny, przedstawiono strategię bramkowania w celu jednoczesnego pomiaru stopnia zmian kształtu i zakresu kolokalizacji markerów, na które wpływa sygnalizacja CCL19. Co więcej, ta strategia bramkowania pozwoliła nam zaobserwować segregację nitkowatych białek aktyny (z przodu) i fosforylowanych białek Ezrin-Radixin-Moesin (fosfo-ERM) (z tyłu) w spolaryzowanych limfocytach T po stymulacji CXCL12. Technika ta była również przydatna do obserwacji wpływu blokowania na polaryzację dwóch różnych elementów: hamowania polimeryzacji aktyny przez inhibitor farmakologiczny i ekspresji mutantów szlaku sygnałowego Par6/atypowy PKC. W ten sposób wykazano, że technika ta jest przydatna do analizy zarówno zmian morfologicznych, jak i redystrybucji białek.

Pierwszy wybrany tutaj przykład dotyczy zastosowania ludzkich pierwotnych limfocytów T stymulowanych CCL19. Tę samą strategię można jednak zastosować w przypadku pierwotnych limfocytów T myszy, linii komórkowych limfocytów T lub każdego innego typu komórek reagujących na stymulację chemokinami. Przedstawiona tutaj strategia bramkowania obejmuje serię okien, które wybierają zdarzenia skupione, a następnie pojedyncze komórki. Na koniec, jako przykład, śledzony jest zakres intensywności fluorescencji dla dwóch markerów: MHC...

Sygnalizacja chemokiny wywołuje wyraźne zmiany w morfologii komórek i niektóre ważne redystrybucje białek wewnątrzkomórkowych. W tym przypadku dostarczany jest szybki i szczegółowy protokół do badania tych zdarzeń.

Szybka i solidna analiza polaryzacji komórkowej i molekularnej indukowanej przez sygnalizację chemokinową

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

Celem poniższej procedury jest szybkie i automatyczne ilościowe określenie zmian w morfologii komórek i subkomórkowej lokalizacji określonych białek będących przedmiotem zainteresowania w dużej liczbie komórek w odpowiedzi na określony bodziec. Osiąga się to poprzez uprzednią stymulację limfocytów T za pomocą interesujących ich rodzajów chemii. W drugim etapie komórki są znakowane fluorescencyjnie, a następnie analizowane za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej.W ostatnim kroku liczbę morfologicznie spolaryzowanych limfocytów i stopień segregacji markerów fluorescencyjnych można ocenić na podstawie lokalizacji i intensywności pikseli dla każdego barwienia, w zależności od wybranej maski. Ostatecznie ta technologia obrazowania cytometrii przepływowej może być wykorzystana do szybkiego i solidnego ilościowego określenia zmian morfologicznych limfocytów po stymulacji chemokinami, a także lokalizacji określonych białek będących przedmiotem zainteresowania w spolaryzowanych komórkach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia, jest to, że duża liczba komórek może być wielokrotnie przetwarzana i automatycznie analizowana, co zapewnia statystycznie silną analizę zmian morfologicznych i rozmieszczenia białek.W limfocytach T stymulowanych chemokiną, stymulacja limfocytów T w rodzaju Boche rozpoczyna się od pięciokrotnego wyśrodkowania pięciu komórek w warunkach eksperymentalnych w ciepłym HBSS uzupełnionym 10 milimolowymi HEPs, wirowaniu przez pięć minut w temperaturze 340 razy G.At temperaturze pokojowej, usunięciu supinatu i ponownym zawieszeniu granulek w 0,3 mililitra ciepłego HBSS na kawałek na probówkę. Następnie przenieś zawiesiny komórek do pojedynczych mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj od 10 do 500 nanogramów na mililitr chemokiny do każdej probówki, a następnie odwróć probówki kilka razy, aby wymieszać.Inkubuj komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po ośmiu do 10 minutach zatrzymaj polaryzację za pomocą 0,3 mililitra ciepłego, 2% paraldehydu uzupełnionego 10 milimolami. On groszku.Następnie wymieszaj probówki z większą ilością odwracania i inkubuj je przez kolejne pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wybarwić komórki do analizy immunofluorescencyjnej. Następnie przenieś stymulowane limfocyty T do odpowiednich probówek do cytometrii przepływowej. Całkowicie napełnij probówki buforem barwiącym.Następnie odwiruj komórki i ponownie zawieś granulki w 100 mikrolitrach 5% płodowej surowicy cielęcej w PBS. Teraz dodaj pięć mikrolitrów ZI N-T-H-L-A-A-B-C do każdej probówki. Wiruj je i inkubuj komórki przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności pod koniec inkubacji.Umyj komórki dwukrotnie, a następnie inkubuj je w 500 mikrolitrach 1% para formaldehydu. Po 10 minutach umyj komórki w większej ilości buforu barwiącego, a następnie całkowicie napełnij probówki buforem przenikającym. Po dwukrotnym umyciu komórek w buforze przenikania pozostaw probówki, aby usunąć supinat, a następnie odwirować je, aby zdysocjować osady komórkowe.Teraz wybarwić próbki punktem zerowym 25 mikrogramów na mililitr, trixi na schab, wirować je i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie, pod koniec okresu inkubacji, umyć komórki w buforze do przenikania. Znowu resus.Zawieś granulki w 200 mikrolitrach PBS, a następnie przenieś komórki do pojedynczych mikroprobówek wirówek, aby określić procent spolaryzowanych limfocytów T po stymulacji chemokinami. Najpierw włącz obrazowy cytometr przepływowy i pozwól mu się skalibrować zgodnie z instrukcjami producenta. Narysuj histogramy, które określają ilościowo wartości gradientu RMS na podstawie populacji wybranej w punkcie ostrości gradientu RMS.Histogram wyznacza populację pojedynczych komórek na histogramie obszaru po włożeniu probówki mikrowirówki do maszyny, dostosowuje chód mocy lasera na poszczególnych komórkach i uzyskuje 5 000 limfocytów T. W oprogramowaniu do analizy pomysłów. Otwórz pobrane pliki, a następnie utwórz histogram przedstawiający wartość RMS gradientu dla obrazów w jasnym polu uzyskanych dla każdej pojedynczej komórki, rysując bramkę na komórkach, wykazując wartość gradientu RMS powyżej 57.W menu analizy utwórz nową maskę o nazwie erode M1 two z maski morfologicznej na obrazach w jasnym polu M zero jeden zerodowany z dwóch pikseli. Następnie w menu cech analizy utwórz nową cechę obszaru obliczonego na masce erozji M1 dwie z komórek utworzonych w poprzedniej bramce. Otwórz histogram pokazujący obszar komórek Korzystając z tej nowo utworzonej maski, narysuj bramkę na poszczególnych komórkach T, wyłączając koraliki kalibracyjne i zanieczyszczenia na małym obszarze, a także dublety na dużym obszarze.Następnie otwórz a. bot składający się z surowego maksimum na barwieniu H-L-A-A-B-C jako funkcji surowego maksimum piksela na barwieniu Phin w menu masek analizy z tyłu do nowej maski o nazwie erozja M dwa dwa z maski morfologii komórek barwiących H-L-A-A-B-C zerodowanych o dwa piksele. Następnie w menu obiektów analizy utwórz nowy obiekt składający się z parametru kołowości obliczonego na erodze M dwa dwa.Następnie utwórz kolejny histogram, aby przedstawić wartości funkcji kołowości z wcześniej bramkowanych komórek. Następnie, patrząc na kształt histogramu dla komórek niestymulowanych, RO agatuje się dla komórek spolaryzowanych, zaczynając od najniższej wartości kołowości aż do wartości granicznej okrągłości, w której większość komórek niestymulowanych jest wykreślana w celu oceny polaryzacji barwienia aktyny w komórkach. Plus histogram dla podobieństwa jasnych szczegółów, wartość R trzy do porównania H-L-A-A-B-C i foid w barwieniu.Następnie przy użyciu tej samej strategii bramkowania, jak właśnie pokazano, plus GA na niestymulowanych komórkach dla niekolokalizowanego posegregowanego barwienia. Panel statystyk pokazuje tutaj procent limfocytów T ze spolaryzowanym barwieniem aktyną. Pokazano przykłady limfocytów T stymulowanych CCL 19, które wpadają w bramę komórek niespolaryzowanych lub spolaryzowanych.Wyraźnie można zaobserwować różnice w morfologii między obiema subpopulacjami. Właśnie zademonstrowana strategia bramkowania może być również wykorzystana do wykreślenia procentu komórek, które wpadają w spolaryzowaną bramkę przy braku obecności CCL 19. Zgodnie z oczekiwaniami jasne jest, że stymulacja chemokiną zwiększa odsetek spolaryzowanych limfocytów T.Można również wykreślić średni wskaźnik kołowości całej populacji komórek uzyskany w obu warunkach. Rzeczywiście, stymulacja CCL 19 wywołuje spadek tego wskaźnika. Jednakże, ponieważ tylko połowa komórek jest spolaryzowana, zmiana średniego wskaźnika kolistości obserwowana po stymulacji CCL 19 jest niewielka.W tym eksperymencie limfocyty T zostały przecięte przez GFP wraz z plazmidami kodującymi dominujące ujemne mutanty kompleksu polarności par sześć. PKC zeta. Histogram dla komórek transfekowanych nont pozwolił na specyficzne bramkowanie dla odpowiednich komórek T GFP dodatnich, co wskazuje, że transfekowana została zbyt niewielka część całej populacji komórek.Stopień polaryzacji morfologicznej tych transfekowanych komórek został następnie określony ilościowo, mierząc tylko wskaźnik kolistości komórek GFP dodatnich i dodatkowy chód dla limfocytów T. Wykazując niskie wartości cyrkularności, stworzono w celu oszacowania procentu spolaryzowanych komórek w każdym pobranym warunku. Łącznie dane te pokazują, że zakłócenie funkcji par sześć PK CZ do szlaku sygnałowego hamuje polaryzację komórek T indukowaną zarówno przez chemokiny CCL 19, jak i c Xcl 12.Zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami. Podczas próby tej procedury bardzo ważne jest, aby zawsze pracować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cały etap stymulacji krewniaków roztworu i następującego po nim utrwalenia, aby zapewnić silną i niezawodną polaryzację morfologiczną limfocytów.

rapid-robust-analysis-cellular-molecular-polarization-induced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszej pracy opisujemy szczegółowe metody obrazowania żywych komórek służące do badania chemotaksji. Przedstawiamy metody mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania dynamiki czasowo-przestrzennej zdarzeń sygnalizacyjnych w migrujących komórkach. Pomiar zdarzeń sygnalizacyjnych pozwala nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób sieć sygnalizacyjna GPCR umożliwia wyczuwanie gradientu chemoatraktantów i kontroluje kierunkową migrację komórek eukariotycznych.

Obrazowanie zdarzeń sygnalizacyjnych pośredniczonych przez receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), które kontrolują chemotaksję Dictyostelium discoideum

Ten film demonstruje test chemotaksji neutrofili przy użyciu metody all-on-chip. Metoda ta pozwala na bezpośrednią izolację neutrofili z krwi pełnej poprzez immunomagnetyczną selekcję ujemną, a następnie test chemotaksji na chipie mikroprzepływowym.

Mikroprzepływowa metoda oparta na chipie do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili przy użyciu krwi pełnej

Przedstawiono sposób na uzyskanie nowego wglądu w złożoność reakcji zapalnej mózgu. Opisujemy protokoły oparte na immunofluorescencji, po których następuje trójwymiarowa analiza konfokalna w celu zbadania wzorca koekspresji markerów fenotypu mikrogleju / makrofagów w mysim modelu ogniskowego niedokrwienia.

Trójwymiarowa analiza konfokalna markerów polaryzacji mikrogleju/makrofagów w eksperymentalnym uszkodzeniu mózgu

Na poziomie subkomórkowym, zdarzenia sygnalizacyjne są dynamicznie modulowane przez sygnały rozwojowe i środowiskowe. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje system przejściowej ekspresji tytoniu do monitorowania dynamicznej interakcji białko-białko i ujawniania przestrzennej organizacji transdukcji sygnału w komórkach roślinnych.

Obrazowanie przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego MAPK przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu

Wizualne testy chemotaksji są niezbędne do lepszego zrozumienia, w jaki sposób komórki eukariotyczne kontrolują kierunkową migrację komórek za pośrednictwem chemoatraktantu. W tym miejscu opisujemy szczegółowe metody dla: 1) monitorowania w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości wielu testów chemotaksji oraz 2) jednoczesnej wizualizacji gradientu chemoatraktantu i czasoprzestrzennej dynamiki zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilopodobnych komórkach HL60.

Obrazowanie chemotaksji sprzężonej z białkiem G i jej zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilowych komórkach HL60

Ten artykuł przedstawia szczegółową metodę przeprowadzania szybkiego testu chemotaksji neutrofili poprzez integrację wbudowanej izolacji neutrofili z krwi pełnej oraz testu chemotaksji na pojedynczym chipie mikroprzepływowym.

Kompleksowa metoda do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili bezpośrednio z kropli krwi

Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.

Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Tutaj opisujemy metody oceny odpowiedzi komórkowej na ostrą stymulację mechaniczną. W teście opartym na mikroskopii badamy lokalizację biosensorów znakowanych fluorescencyjnie po krótkiej stymulacji przepływem ścinającym. Badamy również biochemicznie aktywację różnych interesujących nas białek w odpowiedzi na ostrą stymulację mechaniczną.

Ocena odpowiedzi Dictyostelium discoideum na ostrą stymulację mechaniczną

Przedstawiamy protokół uzyskiwania sygnatur proteomicznych ludzkich makrofagów i stosowania go do określania wpływu środowiska o niskiej zawartości tlenu na polaryzację makrofagów.

Analiza proteomiczna polaryzacji ludzkich makrofagów w środowisku o niskiej zawartości tlenu

Opisujemy metodę konstruowania urządzeń do hodowli 3D i eksperymentowania z komórkami i organoidami wielokomórkowymi. Urządzenie to umożliwia analizę odpowiedzi komórkowych na sygnały rozpuszczalne w mikrośrodowiskach 3D ze zdefiniowanymi gradientami chemoatraktantu. Organoidy są lepsze niż pojedyncze komórki w wykrywaniu słabych hałaśliwych sygnałów.

Analiza 3D wielokomórkowych odpowiedzi na gradienty chemoatraktantu

Aby przetestować wpływ chemokiny na rekrutację makrofagów in vivo, do wykrycia ektopowej ekspresji chemokiny użyto całej hybrydyzacji in situ, a do oznaczania makrofagów użyto barwienia immunologicznego. Obrazowanie na żywo wykorzystano do obserwacji migracji makrofagów w czasie rzeczywistym.

Ektopowy model ekspresji chemokiny do badania rekrutacji makrofagów in vivo

Poznaj metodę szybkiej analizy polaryzacji komórkowej limfocytów T po stymulacji chemokinowej przy użyciu cytometrii przepływowej z obrazowaniem. Technika ta umożliwia automatyczną kwantyfikację zmian morfologicznych i lokalizacji białek w dużych populacjach komórek.

Szybka i solidna analiza polaryzacji komórkowej i molekularnej indukowanej przez sygnalizację chemokinową

Przeglądaj więcej filmów