Przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych w eksperymentalnym modelu kontuzyjnym uszkodzenia rdzenia kręgowego

Ogólnym celem tej procedury jest szczegółowe opisanie modelu kontuzji uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy, a następnie przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych. Osiąga się to poprzez uprzednie oznakowanie post mortem, neuronalnych komórek prekursorowych lub NPC PM za pomocą niezbędnego znacznika PKH 26. Następnie na myszy wykonuje się nacięcie grzbietowe i odsłania rdzeń kręgowy.

Następnie stosuje się urządzenie do nieskończonego horyzontu lub impaktora IH w celu stworzenia uszkodzenia rdzenia kręgowego. Na koniec PM i PC oznaczone PKH 26 są wstrzykiwane do żyły ogonowej myszy. Ostatecznie losy wszczepionego PKH 20 o godz. 18:00 i PC w miejscu zmiany chorobowej są śledzone.

Model urazu odwzorowuje uraz rdzenia kręgowego u mężczyzny. Po pierwotnym urazie mechanicznym następuje postępujące zwyrodnienie wtórne, w którym bada się leczenie komórkowe i farmakologiczne. Opisane zastosowania mogą stanowić podstawę metodologiczną do uzyskania dalszych spostrzeżeń na temat wiary.

Indukcja komórek macierzystych przeszczepionych do rdzenia kręgowego w czasie, gdy zachodzą zwyrodnienia i zdarzenia zapalne. Zmianę zademonstruje dr Tony Laja Longo, doktorant w laboratorium. Podczas gdy wstrzyknięcie ogona zostanie wykonane przez Dr.Ache, który jest doktorem habilitowanym w laboratorium, zaczynając od nerwowych komórek macierzystych, które spełniają kryteria opisane w protokole tekstowym.

Resus zawiesić komórki do stężenia jeden razy 10 do sześciu komórek na 150 mikrolitrów. Przygotuj co najmniej 1,2 razy 10 do sześciu komórek na mysz, aby mieć wystarczającą ilość komórek do załadowania pipety. Za pomocą pożywki z nerwowymi komórkami macierzystymi umyj komórki trzy razy w 10-mililitrowej stożkowej fiolce, wirując z prędkością 500 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby osadzać komórki.

Po każdym praniu, przed ostatecznym odliczeniem wirowania, komórki, a następnie po wirowaniu, odsysają supernatant, pozostawiając około 25 mikrolitrów płynu, aby zapobiec zasysaniu jakichkolwiek komórek. Następnie przygotuj zawiesinę dwa X, dodając jeden mililitr rozcieńczalnika C do podniebienia komórkowego i użyj delikatnego pipetowania, aby natychmiast ją zawiesić. Przed barwieniem należy przygotować dwa x roztwór barwnika w rozcieńczalniku C, dodając cztery mikrolitry roztworu etanolu D PKH 26 do jednego mililitra rozcieńczalnika C w probówce i dobrze wymieszać.

Aby szybko się rozproszyć, dodaj jeden mililitr zawiesiny dwóch komórek X do jednego mililitra dwóch roztworów XD i natychmiast wymieszaj próbkę przez pipetowanie. Po inkubacji zawiesiny matrycy komórkowej przez jedną do pięciu minut, należy zatrzymać barwienie, dodając równą objętość 1% roztworu BSA do HBSS i inkubować przez jedną minutę. Następnie odwirować komórki w temperaturze 500 razy G przez 10 minut i ostrożnie usunąć supernatant.

Użyj 10 mililitrów kompletnej pożywki do ponownego zawieszenia osadu komórkowego w celu oceny regeneracji komórek, żywotności komórek i intensywności fluorescencji. Odwirować komórki, wyrzucić supernatant i dodać 10 mililitrów HBSS do osadu komórkowego. Przemyć dwukrotnie HBSS i ponownie zawiesić komórki w sterylnym roztworze fizjologicznym.

Po przygotowaniu pola operacyjnego i myszy zgodnie z protokołem tekstowym, umieść zwierzę grzbietową stroną do góry na podgrzewaczu do szkiełka, aby uniknąć hipotermii podczas operacji za pomocą skalpela, wykonaj pionowe nacięcie nad obszarem zainteresowania od T seven do T 12 za pomocą kleszczy. Trzymaj skórę i powierzchowną poduszeczkę tłuszczową znajdującą się między przestrzenią między piątym a szóstym wyrostkiem piersiowym pod mikroskopem stereoskopowym. Policz proces pod naczyniem krwionośnym jako T sześć, a następnie przejdź do T siedem.

Następnie umieść małe łożysko pod brzuszną stroną myszy, aby zwiększyć krzywiznę kręgosłupa i użyj kleszczy Grofa, aby zablokować kręgosłup, aby go unieruchomić. Następnie za pomocą skalpela przeciąć parę mięśni kręgowych obustronnie od T seven do T 10 na poziomie kręgów, aż grzbietowa powierzchnia blaszki zetknie się z końcówką skalpela. Następnie za pomocą skalpela odhaczyć skrzyżowanie od T seven do T 10 na poziomie kręgów, aż grzbietowa powierzchnia blaszki zetknie się z końcówką skalpela, zatrzymaj się w przestrzeni między małymi występami T ósemki i T dziewiątej.

Następnie użyj mikronożyczek, aby przeciąć tkankę między T osiem a T dziewięć oraz T dziewięć i T 10. Teraz użyj rongeur, aby usunąć proces T nine. Odsłoń połączenie za pomocą mikronożyczek, aby ostrożnie zeskrobać warstwę mięśniową.

Kontynuuj, aż kość zostanie odsłonięta. Użyj kleszczy, aby usunąć mięśnie z blaszki i otworzyć niewielką przestrzeń między kręgami. Następnie delikatnie włóż mikronożyczki pod kość.

Przetnij blaszkę po obu stronach i użyj kleszczy, aby ją usunąć, odsłaniając pępowinę. Użyj ron jour, aby usunąć wszelkie pozostawione wolne lub postrzępione fragmenty kości. Następnie usuń górną połowę wyrostka grzbietowego T nine.

Po wykonaniu protokołu urządzenia udarowego IH, zgodnie z wytycznymi zawartymi w tekście, użyj czterech wchłanialnych szwów, aby zamknąć nacięcie, najpierw zakrywając odsłonięty rdzeń kręgowy w miejscu usuniętej blaszki. Uważając, aby nie uszczypnąć leżących pod spodem mięśni. Użyj dwóch lub trzech klipsów refleksyjnych, aby zamknąć skórę.

Wstrzyknij podskórnie dwa mililitry soli fizjologicznej w dolną część pleców i umieść mysz w ciepłej klatce na poduszce grzewczej, aby wyzdrowieć. Aby przeprowadzić wstrzyknięcie komórek do żyły ogonowej. Ponownie zawiesić komórki w probówce i załadować 75 mikrolitrów do strzykawki o pojemności 0,3 mililitra, upewniając się, że w zawiesinie komórek nie ma pęcherzyków.

Aby uniknąć sedymentacji komórek, należy trzymać strzykawkę w pozycji poziomej. Umieść mysz pod lampą grzewczą, aby rozszerzyć żyły ogonowe. Następnie delikatnie wciągnij mysz w ogranicznik, aby uwidocznić boczną żyłę ogonową, która wygląda jak wąska niebieska linia.

Użyj wacika nasączonego alkoholem, aby oczyścić ogon, a po uwidocznieniu żyły ogonowej chwyć żyłę ogonową między środkowym palcem a kciukiem lewej ręki. Stłuczenie T nine pokazane w tym filmie spowodowało przejściową utratę funkcji kończyn tylnych trzy razy 10 do piątych komórek lub PBS wstrzyknięto do żyły ogonowej w trzech iniekcjach przeprowadzonych 30 minut, sześć godzin i 18 godzin po urazie. Jak pokazano tutaj, w ciągu dwóch do trzech tygodni PBS leczył rannych, myszy poprawiły się, a funkcja kończyn tylnych osiągnęła trzy punkty podstawowej skali myszy lub myszy BMS leczone PM.NPC wykazały jednak szybszy powrót do zdrowia i osiągnęły 4,5 punktu BMS, jak widać tutaj, większość wszczepionych pm NPC oznaczonych PKH 26, nagromadziła się na krawędziach zmiany tworzącej skupiska.

Wkrótce po podaniu przeszczepione komórki migrowały wzdłuż krawędzi zmiany i w bardziej rozproszony sposób, gdzie różnicowały się w neurony. Po 30 dniach od zmiany chorobowej i przeszczepu ciało komórkowe NPC pm zwiększyło swoją wielkość, aw większości komórek procesy podobne do dendrytycznych były oczywiste i w pełni wybarwione immunologicznie przez specyficzne przeciwciała, do których należało zmapować Podczas uzyskiwania tej profesjonalnej procedury ważne jest, aby pamiętać, że większe siły mogą zwiększyć śmiertelność zwierzęcia z powodu poważniejszych obrażeń. Dlatego sugerujemy skorzystanie z naszego paradygmatu paradygmatu zmiany chorobowej, po którym następuje bardziej powtarzalny proces zdrowienia.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać powtarzalny eksperymentalny model urazowego uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy za pomocą impaktora nieskończonego horyzontu.