Name: Przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych w eksperymentalnym modelu kontuzyjnym uszkodzenia rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Poznaj metodę przeszczepu komórek macierzystych w modelu kontuzyjnym uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy. Technika obejmuje znakowanie komórek PKH 26 i wstrzyknięcie do żyły ogonowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie ekonomiczne ze strony FAIP (Federazione Associazioni Italiane Paraplegici), Fundacji "Neurogel-en-Marche" (Francja), Fondazione "La Colonna".

UWAGA: Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Rewizyjną Uniwersytetu w Mediolanie i spełniały włoskie wytyczne dotyczące zwierząt laboratoryjnych zgodnie z Dyrektywą Wspólnot Europejskich z listopada 1986 roku (86/609/EWG).
1. Przygotowanie komórek do przeszczepu
UWAGA : Użyj nerwowych komórek macierzystych między 5. a 9. pasażem w hodowli do tych eksperymentów; przetestuj kultury pod kątem zdolności do proliferacji i różnicowania przed wskazaniem do przeszczepu. Określ stopień różnicowania za pomocą immunocytochemii 12.
<ol>
	<li>Zawiesić komórki do stężenia 1 x 106 komórek/150 μl (przeszczep 1 x 106 komórek na mysz). Przygotuj co najmniej 1,2 x 106 komórek na mysz, ponieważ nadmiar komórek jest wymagany do ładowania strzykawki.</li>
	<li>Umyj komórki 3 razy za pomocą pożywki z nerwowymi komórkami macierzystymi 13 w stożkowej fiolce o pojemności 10 ml. Na każdym etapie płukania wytrącić komórki przez odwirowanie (500 x g przez 5 min, RT).</li>
	<li>Policz komórki przed ostatnim obrotem.</li>
	<li>Odwirować komórki (500 x g przez 5 minut), a następnie odessać supernatant, uważając, aby nie usunąć żadnych komórek, ale pozostawiając nie więcej niż 25 μl supernatantu.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę 2-komórkową, dodając 1 ml rozcieńczalnika C do osadu komórkowego i zawiesić z delikatnym pipetowaniem.</li>
	<li>Bezpośrednio przed barwieniem przygotować 2x roztwór barwnika (4 x 10–6 M) w rozcieńczalniku C, dodając 4 μl roztworu barwnika etanolowego PKH26 do 1 ml rozcieńczalnika C w probówce i dobrze wymieszać do dyspersji.</li>
	<li>Szybko dodać 1 ml zawiesiny 2x komórek do 1 ml 2x roztworu barwnika i natychmiast wymieszać próbkę przez pipetowanie (końcowa gęstość komórek wyniesie 1,2 x 10 7 komórek/ml i 2 x 10-6 M PKH26).</li>
	<li>Inkubować zawiesinę komórkowo-barwnikową przez 1-5 minut.</li>
	<li>Zatrzymaj barwienie, dodając równą objętość (2 ml) 1% roztworu BSA do HBSS i inkubować przez 1 minutę.</li>
	<li>Odwirować komórki (500 x g przez 10 min) i ostrożnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 10 ml HBSS i odwirować (500 x g przez 5 minut).</li>
	<li>Przemyj osad komórkowy jeszcze 2 razy 10 ml kompletnego podłoża, aby zapewnić usunięcie niezwiązanego barwnika.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 10 ml kompletnej pożywki w celu oceny odzysku komórek, żywotności komórek i intensywności fluorescencji. Jeśli komórki są potrzebne do przeszczepienia, umyj je i ponownie zawieś w sterylnym roztworze fizjologicznym o stężeniu 3,3 x 105 komórek/50 μl.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do operacji
<ol>
	<li>Wyczyść i wysterylizuj sprzęt chirurgiczny.</li>
	<li>Przygotować obszar operacji, przecierając je środkiem aseptycznym . Skonfiguruj urządzenie IH Impactor.</li>
	<li>Przygotuj sprzęt anestezjologiczny: pochłaniacz gazów aktywnych z urządzeniem do ważenia filtrów VetScav, komorę indukcyjną o ciągłym przepływie, generator tlenu, miernik niskiego przepływu O2 dla myszy. Wyczyść komorę indukcyjną i maskę używaną podczas zabiegu.</li>
	<li>Znieczulić zwierzęta 2,5% (v/v) izofluranem w tlenie (1 l/min) i odczekać 5 minut po indukcji przepływu, aby lek zaczął działać. Sprawdź, czy wąsy drgają lub czy kończyny tylne powoli się wycofują w odpowiedzi na uszczypnięcie podnóżka. Podczas zabiegu należy zmniejszyć stężenie izofluranu do 2,0% (v/v) izofluranu w tlenie (1 l/min).</li>
</ol>
3. Przygotowanie myszy do operacji i transplantacji
<ol>
	<li>Dorosłe samce myszy CD1 (25–30 g) należy przechowywać przez co najmniej 3 dni przed eksperymentami w standardowych warunkach (22 ± 2 °C, 65% wilgotności i sztucznym świetle między 08:00 a 20:00). 
	UWAGA: Cała procedura od przygotowania chirurgicznego do szycia zajmie około 40 min.
	<ol>
		<li>Aby zidentyfikować zwierzę, oznacz ogon za pomocą wodoodpornego kolorowego tuszu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj elektrycznej maszynki do strzyżenia, aby przyciąć włosy grzbietowe myszy od szyi, mniej więcej na poziomie T2, do okolicy lędźwiowej.</li>
	<li>Wysterylizuj przygotowany obszar roztworem jodku i etanolem (70% w sterylnej wodzie).</li>
	<li>Leczyć zwierzę podskórnym (podskórnie) wstrzyknięciem 200 μl gentamycyny (1 mg/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej).</li>
	<li>Nałóż lubrykant okulistyczny na oba oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu i wstrzyknij buprenorfinę (podskórnie, 0,03 mg/kg) w celu złagodzenia bólu.</li>
</ol>
4. Laminektomia
<ol>
	<li>Umieść mysz na podgrzewaczu do szkiełka, aby uniknąć problemu hipotermii podczas operacji. Ułóż zwierzę grzbietową stroną do góry.</li>
	<li>Wykonaj pionowe nacięcie skalpelem nad obszarem zainteresowania, od T7 do T12.</li>
	<li>Przytrzymaj skórę i powierzchowną poduszeczkę tłuszczową za pomocą standardowych kleszczy (zwykle znajdujących się w przestrzeni między 5. a 6. wyrostkiem grzbietowym klatki piersiowej).</li>
	<li>Policz proces pod naczyniem jako T6, a następnie przejdź do T7.</li>
	<li>Umieść małe łożysko pod brzuszną stroną myszy, aby zwiększyć krzywiznę kręgosłupa. Unieruchomij rdzeń kręgowy, blokując go kleszczami Graefe.</li>
	<li>Przetnij mięśnie przykręgosłupowe obustronnie od poziomu kręgów T7 i T10 za pomocą skalpela, aż grzbietowa powierzchnia blaszki zetknie się z końcówką skalpela.</li>
	<li>Użyj skalpela, aby zaznaczyć skrzyżowanie od T7 do T10. Zatrzymaj się w przestrzeni między kolczastymi występami T8 i T9. Przetnij tkanki między T8-T9 i T9-T10 za pomocą mikronożyczek.
	<ol>
		<li>Użyj Rongeur, aby usunąć proces T9. Odsłoń połączenie, ostrożnie zeskrobując warstwę mięśniową mikronożyczkami. Kontynuuj, aż kość zostanie odsłonięta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby usunąć mięśnie z blaszki i otworzyć niewielką przestrzeń między kręgami. Delikatnie włóż mikronożyczki pod kość, odetnij blaszkę po obu stronach i usuń tę część kleszczami.</li>
	<li>Usuń blaszkę za pomocą kleszczy, aby odsłonić pępowinę. Pamiętaj, aby nie pozostawić żadnych wolnych lub postrzępionych fragmentów kości; usuń je za pomocą Rongeur.</li>
	<li>Użyj kleszczyków z małą końcówką, aby usunąć okostną, a także wszelkie fragmenty kości lub mięśnie, które mogą znajdować się w pobliżu nacięcia.</li>
	<li>Usuń górną połowę wyrostka grzbietowego T9 i przejdź do protokołu urządzenia IH Impactor.</li>
</ol>
5. Protokół urządzenia udarowego IH (kontuzja)
<ol>
	<li>Umieść mysz na środku platformy stabilizacyjnej urządzenia IH Impactor.</li>
	<li>Zablokuj zwierzę za pomocą kleszczy dwuzębowych połączonych z platformą stabilizacyjną za pomocą dwóch ramion ustalających stawy (lewe ramię dla kręgu piersiowego, prawe ramię dla kręgu szyjnego).</li>
	<li>Użyj ramienia rostralnego, aby chwycić boczną krawędź trzonu kręgu rostralnego (T8).</li>
	<li>Manipuluj ramieniem ogonowym w ten sam sposób, aby uchwycić trzon kręgu T10.</li>
	<li>Umieść platformę stabilizującą w urządzeniu i opuść końcówkę (średnica 0,75 mm) jak najbliżej przewodu, nie dotykając jej.</li>
	<li>Podnieś końcówkę o trzy pełne obroty przed zainicjowaniem uderzenia.</li>
	<li>Wykonać sttużenie z udarem ustawionym na siłę 60 kdyn z prędkością 100 mm/s.</li>
</ol>
6. Szwy i pielęgnacja końcowa
<ol>
	<li>Zszyj nacięcie wchłanialną nicią do szwów 4/0. Przykryj odsłonięty rdzeń kręgowy w miejscu usuniętej blaszki; Zszyj tkankę na końcach cięcia za pomocą małej igły. Umieść dwa szwy bezpośrednio nad i pod miejscem odsłonięcia rdzenia kręgowego.</li>
	<li>Zamknij skórę za pomocą dwóch lub trzech klipsów Reflex, nie ściskając mięśni znajdujących się pod spodem.</li>
	<li>Nawodnij mysz po operacji 2 ml roztworu soli fizjologicznej wstrzykniętego podskórnie w dolną część pleców.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem w ogrzanej klatce, aby uniknąć hipotermii podczas rekonwalescencji chirurgicznej. Umieść klatki na poduszkach grzewczych.</li>
	<li>Monitoruj myszy w ostrej fazie po urazie, sprawdzając rozmiar pęcherza, szew i wagę zwierzęcia dwa razy dziennie. Delikatnie ściskaj pęcherz (dwa razy dziennie przez 7 dni), aby uniknąć infekcji dróg moczowych (mocz może być mętny, krwawy lub zawierać jakiekolwiek osady).</li>
	<li>Myszy należy leczyć raz dziennie wstrzyknięciem roztworu soli fizjologicznej (2 ml przez dwa dni po wstrzyknięciu dochirurgicznym) i antybiotykiem (gentamycyna 0,2 ml; wstrzyknięcie dożylne) przez pięć dni po urazie.</li>
	<li>Myszy należy leczyć z powodu analgezji pooperacyjnej buprenorfiną (0,1 mg/kg; dwa razy dziennie) przez 3 dni po urazie.</li>
</ol>
7. Iniekcja komórek do żyły ogonowej
UWAGA: W następnym kroku pokazano procedurę wstrzykiwania komórek do żyły ogonowej. Komórki mogą być również podawane z przeszczepem śródrdzeniowym za pomocą ramy stereotaktycznej 15-16 lub do cisterna magna 17. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że za pomocą tej metody można przeszczepić inne typy komórek, takie jak mezenchymalne komórki zrębu (np. mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego, komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej, komórki płynu owodniowego). Ponadto inne opcje leczenia, takie jak nanocząsteczki, mogą być wstrzykiwane przez żyłę ogonową po urazie rdzenia kręgowego.
<ol>
	<li>Użyj 70% etanolu i PBS do oczyszczenia igły przed użyciem. Z igłą i strzykawką należy obchodzić się wyłącznie w sterylnych rękawiczkach.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w probówce i załadować 75 μl komórek do strzykawki o pojemności 0,3 ml (igła 29 G i strzykawka 0,33 ml ).</li>
	<li>Upewnij się, że w zawiesinie komórek nie ma pęcherzyków powietrza. Trzymać strzykawkę w pozycji poziomej, aby uniknąć sedymentacji komórek.</li>
	<li>Umieść mysz pod lampą grzewczą, aby rozszerzyć żyły ogonowe.</li>
	<li>Chwyć mysz i delikatnie pociągnij ją do ogranicznika myszy, aby wyświetlić boczną żyłę ogonową jako wąską niebieską linię.</li>
	<li>Oczyść ogon wacikiem nasączonym alkoholem. Po wizualizacji żyły chwyć żyłę ogonową między środkowym palcem a kciukiem lewej ręki.</li>
	<li>Przyłóż igłę do powierzchni pod kątem 15° od horyzontu i upewnij się, że skos jest podniesiony.</li>
	<li>Wstrzyknąć 50 μl komórek z szybkością 0,33 μl/sek. Po wstrzyknięciu należy opóźnić wycofanie igły o 10 sekund. Powoli wycofać igłę i zwrócić uwagę na możliwy wypływ zawiesiny komórek.</li>
	<li>Czyścić strzykawkę jak w kroku 7.1 między ładowaniami.</li>
</ol>
8. Testy behawioralne i funkcja kończyn tylnych
<ol>
	<li>Umieść mysz na otwartym polu.</li>
	<li>Oceń funkcję lokomotoryczną i regenerację kończyn tylnych po stłuczeniu za pomocą testu w otwartym polu zgodnie ze skalą myszy Basso (BMS) 18 . 
	UWAGA: Funkcja neurologiczna musi być oceniana okresowo, od 3 dnia po urazie przez 4 tygodnie 18.</li>
</ol>
9. Perfuzja
<ol>
	<li>Pod koniec okresu doświadczalnego znieczulić zwierzęta poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (65 mg/kg). Użyj szczypania palców u stóp, aby ocenić poziom znieczulenia i kontynuuj dopiero wtedy, gdy mysz przestanie reagować na szkodliwe bodźce.</li>
	<li>Unieruchomić zwierzę w pozycji leżącej na plecach na płaszczyźnie operacyjnej.</li>
	<li>Przeciąć powłokę i ścianę brzucha tuż pod klatką piersiową. Oddziel przeponę od wątroby.</li>
	<li>Użyj nożyczek, aby przeciąć przeponę, aby odsłonić jamę opłucnej.</li>
	<li>Przetnij boki klatki piersiowej aż do obojczyków</li>.
	<li>Użyj hemostatów, aby zacisnąć chrząstkę mieczykowatą i umieść hemostat nad głową.</li>
	<li>Przytrzymaj dolną trzecią część serca w płaszczyźnie poprzecznej za pomocą kleszczy. Wbić igłę do lewej komory.</li>
	<li>Użyj hemostatu, aby zacisnąć serce. Zabezpiecza to igłę i zapobiega wyciekaniu.</li>
	<li>Użyj nożyczek, aby wyciąć prawe przedsionek.</li>
	<li>Pozwolić, aby PBS przepompował (18 ml/min) przez zwierzę. Ciśnienie to należy utrzymywać przez cały okres infuzji buforu (3-4 min; co odpowiada około 70 ml PBS). Kontynuuj, aż serce będzie czyste.</li>
	<li>Przełączyć zawór odcinający, aby umożliwić przepuszczenie utrwalacza (4% paraformaldehydu w wodzie destylowanej, 4% PFA) przez pompę. Pozwól 4% PFA pompować przez zwierzę przez około 8-10 minut (300 ml). Stopniowo zwiększaj ciśnienie, aż osiągniesz maksimum 30 ml/min. Stwardniała wątroba jest najlepszym wskaźnikiem udanej perfuzji.</li>
</ol>
10. Pobieranie i przetwarzanie tkanek, histologia i immunohistochemia
<ol>
	<li>Wypreparuj rdzeń kręgowy od T5 do L1. Następnie utrwalić tkankę w 6 ml w 4% PFA (O/N w temperaturze 4 °C).</li>
	<li>Umieścić tę samą tkankę w roztworze z 30% sacharozą na 72 godziny w temperaturze 4 °C w celu jej krioochrony i zapobieżenia tworzeniu się kryształów podczas zamrażania.</li>
	<li>Szybko zamroź przewód za pomocą suchego lodu i przechowuj go w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Wyciąć za pomocą kriostatu o grubości 15 μm i zebrać skrawki na szkiełkach szkiełkowych i kontynuować do immunocytochemii.</li>
	<li>Przepłukać sekcje 200 μl PBS na każde szkiełko (3 razy po 5 minut, RT).</li>
	<li>Przepuszczalność każdego szkiełka za pomocą 200 μl 10% NGS i 0,2% Triton X-100 w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przepłukać sekcje 200 μl PBS na każde szkiełko (3 razy po 5 minut, RT).</li>
	<li>Zablokuj niespecyficzne miejsca za pomocą 200 μl roztworu blokującego do szkiełka (5% NGS; 0,1% Triton X-100 w PBS) przez 30 minut (RT).</li>
	<li>Inkubować każde szkiełko z 200 μl pierwszorzędowych przeciwciał O/N w temperaturze 4 °C (rozcieńczyć przeciwciało w 5% NGS; 0,1% Triton X-100 w PBS).</li>
	<li>Przemyć sekcje 200 μl PBS na każde szkiełko (3 razy; po 5 minut; RT).</li>
	<li>Inkubować z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć sekcje 200 μl PBS na każde szkiełko (3 razy; po 5 minut; RT).</li>
	<li>Zabarwić jądra 200 μl 4',6-diamidyno-2-fenilindolu (DAPI) (1 μg/ml stężenie końcowe, 10 min w temperaturze pokojowej).</li>
	<li>Zamontuj za pomocą odczynnika FluorSave i przeanalizuj za pomocą mikroskopii konfokalnej. 
	UWAGA: W oznaczeniach kontrolnych pierwszorzędowe przeciwciała muszą być pominięte i zastąpione równoważnymi stężeniami niepowiązanych IgG z tej samej podklasy. Zastosowano przeciwciało pierwszorzędowe związane z białkiem 2 związanym z mikrotubulami.</li>
</ol>

<ol><li>Cord Injury Statistical Center: spinal cord injury facts and figures at glance. , 
 
 <a target="_blank" href="https://www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202013.pdf">https://www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202013.pdf</a> (2013).</li>
<li>Yip, P. K., Malaspina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+trauma+and+the+molecular+point+of+no+return%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Spinal cord trauma and the molecular point of no return.</a> Molecular Neurodegeneration. 7, 6(2012).</li>
<li>Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+systematic+reviews+on+the+treatment+of+acute+spinal+cord+injury%3A+a+foundation+for+best+medical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice.</a> J Neurotrauma. 28 (8), 1329-1333 (2011).</li>
<li>Furlan, J. C., Noonan, V., Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+decompressive+surgery+of+spinal+cord+after+traumatic+spinal+cord+injury%3A+an+evidence-based+examination+of+pre-clinical+and+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Timing of decompressive surgery of spinal cord after traumatic spinal cord injury: an evidence-based examination of pre-clinical and clinical studies.</a> J Neurotrauma. 28 (8), 1371-1399 (2011).</li>
<li>Sekhon, L. H., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology%2C+demographics%2C+and+pathophysiology+of+acute+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury.</a> Spine. 26 (24), 2-12 (2001).</li>
<li>Gorio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+human+erythropoietin+counteracts+secondary+injury+and+markedly+enhances+neurological+recovery+from+experimental+spinal+cord+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (14), 9450-9455 (2002).</li>
<li>Windle, W. F., Clemente, C. D., Chambers, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+formation+of+a+glial+barrier+as+a+means+of+permitting+a+peripheral+nerve+to+grow+into+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of formation of a glial barrier as a means of permitting a peripheral nerve to grow into the brain.</a> J Comp Neurol. 96 (2), 359-369 (1952).</li>
<li>Young, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+contusion+models%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Spinal cord contusion models.</a> Prog Brain Res. 137, 231-255 (2002).</li>
<li>Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electromechanical+spinal+injury+device+with+dynamic+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">An electromechanical spinal injury device with dynamic sensitivity.</a> J Neurotrauma. 9 (3), 187-195 (1992).</li>
<li>Jakeman, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+spinal+cord+injury+produced+controlled+contusion+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Traumatic spinal cord injury produced controlled contusion in mouse.</a> J Neurotrauma. 17 (4), 299-319 (2000).</li>
<li>Sahni, V., Kessler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapies+for+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapies for spinal cord injury.</a> Nat Rev Neurol. 6, 363-372 (2010).</li>
<li>Marfia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neural+precursors+isolated+from+post+mortem+brain+yield+mostly+neurons%3A+an+erythropoietin-dependent+process%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Adult neural precursors isolated from post mortem brain yield mostly neurons: an erythropoietin-dependent process.</a> Neurobiol Dis. 43 (1), 86-98 (2011).</li>
<li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+neural+stem+cells+reside+into+the+rostral+extension+and+olfactory+bulb+of+adult+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multipotent neural stem cells reside into the rostral extension and olfactory bulb of adult rodents.</a> J Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).</li>
<li>Whetstone, W. D., Hsu, J. Y., Eisenberg, M., Werb, Z., Noble-Haeusslein, L. J. J Neurosci Res. 74 (2), 227-239 (2003).</li>
<li>Gonzalez-Lara, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+cellular+magnetic+resonance+imaging+to+track+the+fate+of+iron-labeled+multipotent+stromal+cells+after+direct+transplantation+in+a+mouse+model+of+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of cellular magnetic resonance imaging to track the fate of iron-labeled multipotent stromal cells after direct transplantation in a mouse model of spinal cord injury.</a> Mol Imaging Biol. 13 (4), 702-711 (2010).</li>
<li>Ottobrini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+of+stem+cell+transplantation+in+injured+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+R4%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging of stem cell transplantation in injured mouse spinal cord.</a> Cell R4. 2 (3), e963(2014).</li>
<li>Janowwski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransplantation+in+mice%3A+The+concorde-like+position+ensures+minimal+cell+leakage+and+widespread+distribution+of+cells+transplanted+into+the+cistern+magna%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letter%22%5BJournal%5D)">Neurotransplantation in mice: The concorde-like position ensures minimal cell leakage and widespread distribution of cells transplanted into the cistern magna.</a> Neuroscience Letter. 430 (2), 169-174 (2008).</li>
<li>Basso, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basso+Mouse+Scale+for+locomotion+detects+differences+in+recovery+after+spinal+cord+injury+in+five+common+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains.</a> J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).</li>
<li>Hofstetter, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allodynia+limits+the+usefulness+of+intraspinal+neural+stem+cell+grafts%3B+directed+differentiation+improves+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Allodynia limits the usefulness of intraspinal neural stem cell grafts; directed differentiation improves outcome.</a> Nat Neurosci. 8 (3), 346-353 (2005).</li>
<li>Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability-dependent+promoting+action+of+adult+neural+precursors+in+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury.</a> Mol. Med. 14 (9-10), 634-644 (2008).</li>
<li>Bottai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+promote+motor+recovery+and+affect+inflammatorycell+infiltration+in+spinal+cord+injured+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells promote motor recovery and affect inflammatorycell infiltration in spinal cord injured mice.</a> Exp Neurol. 223 (2), 452-463 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

W niniejszej pracy opisano metodę uzyskania powtarzalnego modelu urazowego uszkodzenia rdzenia kręgowego przy użyciu Infinite Horizon Impactor o sile 70 kdyne (ciężkiej). Używając paradygmatu większej siły (80 kdyne), możemy spowodować poważniejsze obrażenia, które niestety wiążą się z wyższą śmiertelnością myszy. Aby uniknąć tego problemu, często wybieramy paradygmat umiarkowanej siły (70 kdyne), który wiąże się z powtarzalną zmianą ze stopniowym odzyskiwaniem funkcji i niższą śmiertelnością. Aby doprowadzić do tak stab...

Uraz rdzenia kręgowego (SCI) jest najczęstszym urazem spowodowanym przez wysokoenergetyczne urazy, takie jak wypadki samochodowe, upadki, sport i przemoc 1. W ciężkim SCI siła urazu niszczy lub uszkadza tkankę nerwową, powodując nagłą utratę funkcji neurologicznych. Urazowe SCI występuje często u młodych dorosłych w wieku od 10 do 40 lat. Ma ogromny wpływ na kondycję psychiczną i fizyczną pacjenta oraz powoduje ogromne skutki ekonomiczne dla społeczeństwa 2. Podejście do leczenia w ostrej fazie jest często ograniczone do dużej dawki kortykosteroidów, stabilizacji chirurgicznej i dekompresji w celu ewentualnego złagodzenia dalszych uszkodzeń 3-4, ale rola tych metod w powrocie do zdrowia lokomotorycznego po SCI jest nadal kontrowersyjna. Oprócz ostrej utraty tkanki, uraz i aktywacja wtórnych mechanizmów zwyrodnienia powodują demielinizację i śmierć wielu typów komórek 5-6. Stopień odzyskania funkcji może być często skorelowany z zakresem oszczędzonej istoty białej w miejscu urazu 7.
Modele zwierzęce SCI mogą być używane zarówno do badania biologicznych reakcji tkanki na uraz, jak i do testowania potencjalnych terapii. Co więcej, użyteczny zwierzęcy model ludzkiej patologii musi nie tylko odtwarzać niektóre aspekty tego stanu, ale także oferować przewagę nad bezpośrednią obserwacją kliniczną i eksperymentem. Najczęściej stosowane modele uszkodzenia rdzenia kręgowego obejmują stłuczenie lub uraz kompresyjny dostarczony do chirurgicznie odsłoniętego rdzenia kręgowego 8. Opracowanie kontrolowanego urazu, który spowodował spadek masy ciała, stanowi ważny kamień milowy w historii badań nad SCI. Centrum badań nad rdzeniem kręgowym Uniwersytetu Stanowego Ohio podjęło próbę stworzenia urządzenia, które można wykorzystać do wywołania określonego ucisku rdzenia kręgowego o parametrach uderzenia kontrolowanych przez komputer 9. Został on pierwotnie zaprojektowany do użytku ze szczurami; Później został zmodyfikowany, aby zastosować go do myszy 10. Zaletą tego rodzaju podejścia jest to, że biomechanika urazu może być badana bardziej dogłębnie, a parametry urazu mogą być zdefiniowane w bardziej kompletny sposób w celu uzyskania powtarzalnego modelu eksperymentalnego, co pozwala na bardziej precyzyjną ocenę wpływu badanych terapii na proces funkcjonalnej rekonwalescencji.
Wiele badań oceniało efekty przeszczepu różnych komórek macierzystych w modelach SCI 11. Niedawno wyizolowaliśmy dorosłe nerwowe komórki macierzyste ze strefy podkomorowej (SVZ) kilka godzin po śmierci mysiego dawcy 12-13. Procedura ta zapewnia populację nerwowych komórek macierzystych, zwanych post mortem neuronalnymi prekursorami (PM-NPC), które wydają się być korzystne w podejściu medycyny regeneracyjnej do leczenia SCI. W tym artykule pokażemy: i) protokół znakowania komórek za pomocą znacznika życiowego PKH26, ii) zabieg chirurgiczny do wykonania w przypadku urazowego SCI oraz iii) dożylne (iv) podawanie znakowanych komórek. Ponadto w tej pracy wykazaliśmy, że przeszczepione komórki migrują do miejsc uszkodzenia rdzenia kręgowego i różnicują się głównie w komórki dodatnie z białkiem związanym z mikrotubulami (MAP) 2. Ponadto różnicowaniu towarzyszy promowanie stabilnego odzyskiwania funkcji kończyn tylnych.

<table><tbody><tr><td>PKH26GL-1KT&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>091M0973</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie impaktorowe o nieskończonym horyzoncie (IH)&nbsp;</td><td>Precision Systems and Instrumentation, LLC</td><td>Model 0400 Serial 0171</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna 10 mg/ml</td><td>Euroclone</td><td>ECM0011B</td><td>1 mg/ml w sterylnym roztworze soli</td></tr><tr><td>fizjologicznej Isoflurane-Vet 250 ml</td><td>Merial</td><td>B142J12A</td><td></td></tr><tr><td>Blefarolin POM OFT 10 g</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz do slajdów</td><td>2Biological Instruments</td><td>HB101-sm-402</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel, rozmiar 10</td><td>Lance Paragon</td><td>26920</td><td></td></tr><tr><td>Małe kleszcze Graefe</td><td>2Instrumenty biologiczne</td><td>11023-14</td><td></td></tr><tr><td>Instrumenty medyczne Rongeur</td><td>07</td><td>60 07</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>2Instrumenty biologiczne</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Szwy wchłanialne (4/0)</td><td>Safil Quick</td><td>C0046203</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>2Instrumenty biologiczne</td><td>13014-14</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator do spinek do ran Reflex 7</td><td>2Biological Instruments</td><td>12031-07</td><td></td></tr><tr><td>Klipsy do ran Reflex 7 mm</td><td>2Biological Instruments</td><td>12032-07</td><td></td></tr><tr><td>NGS</td><td>Euroclone</td><td>ECS0200D</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Merck Millipore</td><td>1086431000</td><td></td></tr><tr><td>Białko powlekane antymikrotubulami&nbsp; (MAP) 2</td><td>Millipore</td><td>AB5622</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik FluorSave&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka dla nerwowych komórek macierzystych Pożywka</td><td></td><td></td><td>DMEM-F12 (Euroclone) zawierająca 2 mm l-glutaminy (Euroklon), 0,6% glukozy (Sigma-Aldrich), 9,6 g/ml putrescyny (Sigma-Aldrich), 6,3 ng/ml progesteronu (Sigma-Aldrich), 5,2 ng/ml seleninu sodu (Sigma-Aldrich), 0,025 mg/ml insuliny (Sigma-Aldrich), 0,1 mg/ml transferyny (Sigma-Aldrich) oraz 2 &mu; g/ml heparyny (sól sodowa, stopień II; Sigma-Aldrich), bFGF (rekombinant ludzki, 10 ng/ml; Life Technologies) i EGF (rekombinant ludzki, 20 ng/ml; Technologie życiowe)&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Euroclone</td><td>ASM5002</td><td></td></tr><tr><td>l-glutamina</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>putrescyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780-25G</td><td></td></tr><tr><td>progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6149-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Selenit sodowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9133-1MG</td><td></td></tr><tr><td>transferyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T 5391</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sól sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0200000</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Life Technology</td><td>PHG0024</td><td></td></tr><tr><td>h-EGF</td><td>Life Technology</td><td>PHG6045</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 0,33 cc 29 G</td><td>Terumo</td><td>MYJECTOR&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>buprenorfina</td><td>Schering Plough SpA</td><td>TEMGESIC</td><td></td></tr><tr><td>żel pod oczy</td><td>Bausch & Lomb</td><td>LIPOSOWY</td><td></td></tr></tbody></table>

przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych w eksperymentalnym modelu kontuzyjnym uszkodzenia rdzenia kręgowego

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Uraz rdzenia kręgowego jest wyniszczającym stanem klinicznym, charakteryzującym się kompleksem dysfunkcji neurologicznych. Zwierzęce modele uszkodzenia rdzenia kręgowego mogą być wykorzystywane zarówno do badania biologicznych reakcji na uraz, jak i do testowania potencjalnych terapii. Stłuczenie lub uraz kompresyjny dostarczony do chirurgicznie odsłoniętego rdzenia kręgowego są najczęściej stosowanymi modelami patologii. W niniejszym raporcie eksperymentalne stłuczenie jest wykonywane przy użyciu urządzenia Infinite Horizon (IH) Impactor, które umożliwia stworzenie powtarzalnego modelu zwierzęcego urazu poprzez zdefiniowanie określonych parametrów urazu. Przeszczep komórek macierzystych jest powszechnie uważany za potencjalnie użyteczną strategię leczenia tego wyniszczającego stanu. W licznych badaniach oceniano efekty przeszczepiania różnych komórek macierzystych. Tutaj demonstrujemy dostosowaną metodę uszkodzenia rdzenia kręgowego, a następnie wstrzyknięcie komórek do żyły ogonowej u myszy CD1. Krótko mówiąc, zapewniamy procedury dotyczące: i) znakowania komórek za pomocą niezbędnego znacznika, ii) opieki przedoperacyjnej nad myszami, iii) wykonania stłuczonego uszkodzenia rdzenia kręgowego oraz iv) dożylnego podawania pośmiertnych prekursorów nerwowych. Ten model kontuzji może być wykorzystany do oceny skuteczności i bezpieczeństwa przeszczepu komórek macierzystych w podejściu medycyny regeneracyjnej.

Całkowita liczba przeszczepionych komórek wyniosła 1 x 106 komórek i została podzielona na trzy kolejne zastrzyki do żyły ogonowej. Podano 3,3 x 105 komórek w 50 µl roztworu buforu fosforanowego (PBS). Pierwszy zastrzyk wykonano w ciągu 30 min po urazie, drugi 6 hr później, a ostatni 18 hr po uszkodzeniu. Wybór limitu czasu wynoszącego 18 hr po SCI dla podania PM-NPCs był podyktowany optymalną przepuszczalnością bariery krew-mózg w tym czasie 14. Aby ocenić efekt wstrzyknięcia komórek mac...

Uraz rdzenia kręgowego to traumatyczny stan, który powoduje ciężką zachorowalność i wysoką śmiertelność. W niniejszej pracy szczegółowo opisano model kontuzji rdzenia kręgowego u myszy, po którym następuje przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych.

Przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych w eksperymentalnym modelu kontuzyjnym uszkodzenia rdzenia kręgowego

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Ogólnym celem tej procedury jest szczegółowe opisanie modelu kontuzji uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy, a następnie przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych. Osiąga się to poprzez uprzednie oznakowanie post mortem, neuronalnych komórek prekursorowych lub NPC PM za pomocą niezbędnego znacznika PKH 26. Następnie na myszy wykonuje się nacięcie grzbietowe i odsłania rdzeń kręgowy.Następnie stosuje się urządzenie do nieskończonego horyzontu lub impaktora IH w celu stworzenia uszkodzenia rdzenia kręgowego. Na koniec PM i PC oznaczone PKH 26 są wstrzykiwane do żyły ogonowej myszy. Ostatecznie losy wszczepionego PKH 20 o godz. 18:00 i PC w miejscu zmiany chorobowej są śledzone.Model urazu odwzorowuje uraz rdzenia kręgowego u mężczyzny. Po pierwotnym urazie mechanicznym następuje postępujące zwyrodnienie wtórne, w którym bada się leczenie komórkowe i farmakologiczne. Opisane zastosowania mogą stanowić podstawę metodologiczną do uzyskania dalszych spostrzeżeń na temat wiary.Indukcja komórek macierzystych przeszczepionych do rdzenia kręgowego w czasie, gdy zachodzą zwyrodnienia i zdarzenia zapalne. Zmianę zademonstruje dr Tony Laja Longo, doktorant w laboratorium. Podczas gdy wstrzyknięcie ogona zostanie wykonane przez Dr.Ache, który jest doktorem habilitowanym w laboratorium, zaczynając od nerwowych komórek macierzystych, które spełniają kryteria opisane w protokole tekstowym.Resus zawiesić komórki do stężenia jeden razy 10 do sześciu komórek na 150 mikrolitrów. Przygotuj co najmniej 1,2 razy 10 do sześciu komórek na mysz, aby mieć wystarczającą ilość komórek do załadowania pipety. Za pomocą pożywki z nerwowymi komórkami macierzystymi umyj komórki trzy razy w 10-mililitrowej stożkowej fiolce, wirując z prędkością 500 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby osadzać komórki.Po każdym praniu, przed ostatecznym odliczeniem wirowania, komórki, a następnie po wirowaniu, odsysają supernatant, pozostawiając około 25 mikrolitrów płynu, aby zapobiec zasysaniu jakichkolwiek komórek. Następnie przygotuj zawiesinę dwa X, dodając jeden mililitr rozcieńczalnika C do podniebienia komórkowego i użyj delikatnego pipetowania, aby natychmiast ją zawiesić. Przed barwieniem należy przygotować dwa x roztwór barwnika w rozcieńczalniku C, dodając cztery mikrolitry roztworu etanolu D PKH 26 do jednego mililitra rozcieńczalnika C w probówce i dobrze wymieszać.Aby szybko się rozproszyć, dodaj jeden mililitr zawiesiny dwóch komórek X do jednego mililitra dwóch roztworów XD i natychmiast wymieszaj próbkę przez pipetowanie. Po inkubacji zawiesiny matrycy komórkowej przez jedną do pięciu minut, należy zatrzymać barwienie, dodając równą objętość 1% roztworu BSA do HBSS i inkubować przez jedną minutę. Następnie odwirować komórki w temperaturze 500 razy G przez 10 minut i ostrożnie usunąć supernatant.Użyj 10 mililitrów kompletnej pożywki do ponownego zawieszenia osadu komórkowego w celu oceny regeneracji komórek, żywotności komórek i intensywności fluorescencji. Odwirować komórki, wyrzucić supernatant i dodać 10 mililitrów HBSS do osadu komórkowego. Przemyć dwukrotnie HBSS i ponownie zawiesić komórki w sterylnym roztworze fizjologicznym.Po przygotowaniu pola operacyjnego i myszy zgodnie z protokołem tekstowym, umieść zwierzę grzbietową stroną do góry na podgrzewaczu do szkiełka, aby uniknąć hipotermii podczas operacji za pomocą skalpela, wykonaj pionowe nacięcie nad obszarem zainteresowania od T seven do T 12 za pomocą kleszczy. Trzymaj skórę i powierzchowną poduszeczkę tłuszczową znajdującą się między przestrzenią między piątym a szóstym wyrostkiem piersiowym pod mikroskopem stereoskopowym. Policz proces pod naczyniem krwionośnym jako T sześć, a następnie przejdź do T siedem.Następnie umieść małe łożysko pod brzuszną stroną myszy, aby zwiększyć krzywiznę kręgosłupa i użyj kleszczy Grofa, aby zablokować kręgosłup, aby go unieruchomić. Następnie za pomocą skalpela przeciąć parę mięśni kręgowych obustronnie od T seven do T 10 na poziomie kręgów, aż grzbietowa powierzchnia blaszki zetknie się z końcówką skalpela. Następnie za pomocą skalpela odhaczyć skrzyżowanie od T seven do T 10 na poziomie kręgów, aż grzbietowa powierzchnia blaszki zetknie się z końcówką skalpela, zatrzymaj się w przestrzeni między małymi występami T ósemki i T dziewiątej.Następnie użyj mikronożyczek, aby przeciąć tkankę między T osiem a T dziewięć oraz T dziewięć i T 10. Teraz użyj rongeur, aby usunąć proces T nine. Odsłoń połączenie za pomocą mikronożyczek, aby ostrożnie zeskrobać warstwę mięśniową.Kontynuuj, aż kość zostanie odsłonięta. Użyj kleszczy, aby usunąć mięśnie z blaszki i otworzyć niewielką przestrzeń między kręgami. Następnie delikatnie włóż mikronożyczki pod kość.Przetnij blaszkę po obu stronach i użyj kleszczy, aby ją usunąć, odsłaniając pępowinę. Użyj ron jour, aby usunąć wszelkie pozostawione wolne lub postrzępione fragmenty kości. Następnie usuń górną połowę wyrostka grzbietowego T nine.Po wykonaniu protokołu urządzenia udarowego IH, zgodnie z wytycznymi zawartymi w tekście, użyj czterech wchłanialnych szwów, aby zamknąć nacięcie, najpierw zakrywając odsłonięty rdzeń kręgowy w miejscu usuniętej blaszki. Uważając, aby nie uszczypnąć leżących pod spodem mięśni. Użyj dwóch lub trzech klipsów refleksyjnych, aby zamknąć skórę.Wstrzyknij podskórnie dwa mililitry soli fizjologicznej w dolną część pleców i umieść mysz w ciepłej klatce na poduszce grzewczej, aby wyzdrowieć. Aby przeprowadzić wstrzyknięcie komórek do żyły ogonowej. Ponownie zawiesić komórki w probówce i załadować 75 mikrolitrów do strzykawki o pojemności 0,3 mililitra, upewniając się, że w zawiesinie komórek nie ma pęcherzyków.Aby uniknąć sedymentacji komórek, należy trzymać strzykawkę w pozycji poziomej. Umieść mysz pod lampą grzewczą, aby rozszerzyć żyły ogonowe. Następnie delikatnie wciągnij mysz w ogranicznik, aby uwidocznić boczną żyłę ogonową, która wygląda jak wąska niebieska linia.Użyj wacika nasączonego alkoholem, aby oczyścić ogon, a po uwidocznieniu żyły ogonowej chwyć żyłę ogonową między środkowym palcem a kciukiem lewej ręki. Stłuczenie T nine pokazane w tym filmie spowodowało przejściową utratę funkcji kończyn tylnych trzy razy 10 do piątych komórek lub PBS wstrzyknięto do żyły ogonowej w trzech iniekcjach przeprowadzonych 30 minut, sześć godzin i 18 godzin po urazie. Jak pokazano tutaj, w ciągu dwóch do trzech tygodni PBS leczył rannych, myszy poprawiły się, a funkcja kończyn tylnych osiągnęła trzy punkty podstawowej skali myszy lub myszy BMS leczone PM.NPC wykazały jednak szybszy powrót do zdrowia i osiągnęły 4,5 punktu BMS, jak widać tutaj, większość wszczepionych pm NPC oznaczonych PKH 26, nagromadziła się na krawędziach zmiany tworzącej skupiska.Wkrótce po podaniu przeszczepione komórki migrowały wzdłuż krawędzi zmiany i w bardziej rozproszony sposób, gdzie różnicowały się w neurony. Po 30 dniach od zmiany chorobowej i przeszczepu ciało komórkowe NPC pm zwiększyło swoją wielkość, aw większości komórek procesy podobne do dendrytycznych były oczywiste i w pełni wybarwione immunologicznie przez specyficzne przeciwciała, do których należało zmapować Podczas uzyskiwania tej profesjonalnej procedury ważne jest, aby pamiętać, że większe siły mogą zwiększyć śmiertelność zwierzęcia z powodu poważniejszych obrażeń. Dlatego sugerujemy skorzystanie z naszego paradygmatu paradygmatu zmiany chorobowej, po którym następuje bardziej powtarzalny proces zdrowienia.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać powtarzalny eksperymentalny model urazowego uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy za pomocą impaktora nieskończonego horyzontu.

neural-stem-cell-transplantation-experimental-contusive-model-spinal

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Transplantacja prekursorów neuronalnych jest obiecującą strategią ochrony i/lub zastępowania utraconych lub dysfunkcyjnych szyjnych neuronów ruchowych nerwu przeponowego w przypadku urazów rdzenia kręgowego (SCI) oraz w przebiegu stwardnienia bocznego zanikowego (ALS), będącego chorobą neuronów ruchowych. Przedstawiamy protokół dostarczania komórek do przedniego rogu szyjnego rdzenia kręgowego w gryzoniach w modelach ALS i SCI.

Wewnątrzrdzeniowa transplantacja komórek w celu ukierunkowania na przednie rogi rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym w stwardnieniu bocznym zanikowym i urazowym uszkodzeniu rdzenia kręgowego

Źródło: Lakshman, N., et al. Test neurosfery do oceny endogennej aktywacji nerwowych komórek macierzystych w mysim modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego. J. Vis. Exp. (2018). Ten film pokazuje aktywację i migrację nerwowych komórek macierzystych (NSC) w mysim modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego. Aby odsłonić rdzeń kręgowy, z znieczulonej myszy usuwa się kręg z klatki piersiowej kręgosłupa. Następnie za pomocą wygiętej igły tworzy się powierzchowny uraz w istocie białej rdzenia...

 Model minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego do badania aktywacji i migracji nerwowych komórek macierzystych

Opisano model kontuzji ciężkiego uszkodzenia rdzenia kręgowego. Opisano szczegółowe etapy przedoperacyjne, operacyjne i pooperacyjne w celu uzyskania spójnego modelu.

Model stłuczenia ciężkiego uszkodzenia rdzenia kręgowego u szczurów

Matryce fibrynowe zawierające czynniki wzrostu zostały użyte do zatrzymania przeszczepionych nerwowych komórek macierzystych w miejscach całkowitego przecięcia rdzenia kręgowego. Przeszczepione komórki całkowicie wypełniły jamę chorobową i zróżnicowały się w wiele typów komórek nerwowych, w tym neurony, które rozciągały aksony do rdzenia kręgowego gospodarza na duże odległości.

Promowanie przeżycia i różnicowania nerwowych komórek macierzystych z koktajlami fibryny i czynnika wzrostu po ciężkim urazie rdzenia kręgowego

Leczenie uszkodzeń rdzenia kręgowego odcinka szyjnego zarówno za pomocą peptydów samoorganizujących się (SAP), jak i nerwowych komórek prekursorowych (NPC), wraz z czynnikami wzrostu, jest obiecującym podejściem do promowania regeneracji i regeneracji. Ustalono szczurzy model klisa do stłuczenia/ucisku tętniaka szyjki macicy i leczenia skojarzonego obejmującego wstrzyknięcie SAP i przeszczep NPC.

Synergiczne zastosowanie neuronalnych komórek prekursorowych i samoorganizujących się peptydów w eksperymentalnym uszkodzeniu rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym

Poważne urazy rdzenia kręgowego często skutkują wadami tkanek. Opisano dwie możliwości skutecznego wypełnienia takich luk w celu promowania adaptacji tkanek, reakcji regeneracyjnych i poprawy funkcjonalnej u szczurów poprzez wszczepienie mechanicznego systemu mikrołączników po ostrym urazie i pięć tygodni po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego.

Eksperymentalne strategie wypełniania dużych luk tkankowych w uszkodzonym rdzeniu kręgowym po ostrym i przewlekłym uszkodzeniu

Ten artykuł opisuje technikę wprowadzania pustego przewodu między kikuty rdzenia kręgowego po całkowitym przecięciu i wypełnieniu komórkami Schwanna (SC) oraz wstrzykiwalną macierzą błony podstawnej w celu wypełnienia i wspomagania regeneracji aksonów w poprzek szczeliny.

Przeszczep komórek Schwanna wewnątrz przewodów PVDF-TrFE w celu zmostkowania przeciętych kikutów rdzenia kręgowego szczura w celu promowania regeneracji aksonów w poprzek luki

Tutaj demonstrujemy działanie modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego u dorosłej myszy, która oszczędza centralną niszę kanałową, w której znajdują się endogenne nerwowe komórki macierzyste (NSC). Pokazujemy, w jaki sposób test neurosfery można wykorzystać do ilościowego określenia aktywacji i migracji ostatecznych i pierwotnych NSC po urazie.

Test neurosfery do oceny endogennej aktywacji nerwowych komórek macierzystych w mysim modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego

Ten protokół demonstruje metodologie dla mysiego modelu urazowego mózgu z otwartą czaszką i przeszczepu hodowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do miejsca urazu. W skrócie opisano również testy behawioralne i histologiczne wyników tych procedur.

Kontrolowany model wpływu kory mózgowej uszkodzenia mózgu myszy z terapeutycznym przeszczepem ludzkich pluripotencjalnych komórek nerwowych pochodzących z komórek macierzystych

W tym artykule przedstawiamy powtarzalną metodę generowania i utrzymywania długoterminowych wycinków organotypowych rdzenia kręgowego przeszczepionych z nerwowymi komórkami macierzystymi jako model ex vivo do testowania komórkowych terapii zastępczych.

Długoterminowa organotypowa hodowla warstw rdzenia kręgowego myszy jako platforma do walidacji przeszczepu komórek w urazie rdzenia kręgowego

W tym badaniu opracowano i scharakteryzowano kompozytowe hydrożele mimetyczne nerwowe, które mogą być wykorzystywane do badania i wykorzystania proregeneracyjnego zachowania komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu do naprawy urazu rdzenia kręgowego.

Rozwój kombinatorycznych terapii w leczeniu urazów rdzenia kręgowego z wykorzystaniem dostarczania komórek macierzystych

Poznaj metodę przeszczepu komórek macierzystych w modelu kontuzyjnym uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy. Technika obejmuje znakowanie komórek PKH 26 i wstrzyknięcie do żyły ogonowej.

Przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych w eksperymentalnym modelu kontuzyjnym uszkodzenia rdzenia kręgowego

Przeglądaj więcej filmów