Zastosowanie fluorescencji o zatrzymanym przepływie i znakowanych nukleotydów do analizy cyklu obrotu ATP kinezyn

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar kinetyki wiązania i dysocjacji nukleotydów podczas cyklu obrotu A TP kinezyny. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie białka kinezyny, wolnego od nukleotydów lub obciążonego fluorescencyjnie znakowanym nukleotydem. Następnie przygotowaną kinezynę miesza się z nukleotydem za pomocą fluorymetru o zatrzymanym przepływie i obserwuje się zmianę fluorescencji związaną z wiązaniem lub dysocjacją znakowanego fluorescencyjnie nukleotydu.

Następnie zmiana fluorescencji jest dopasowywana do funkcji wykładniczej, aby uzyskać stałą szybkości. Na koniec zmierzone stałe szybkości są decentralizowane, a stałe szybkości są przypisywane do poszczególnych przejść cyklu rotacji A TP. Ostatecznie połączenie znakowanego fluorescencyjnie nukleotydu i fluorescencji zatrzymanego przepływu służy do pomiaru kinetyki wiązania i dysocjacji nukleotydów.

CIN Procedurę zademonstrują Jennifer Patel i Hannah Belch, doktorantka z mojego laboratorium. Po określeniu intensywności fluorescencji kinezyny po związaniu nukleotydu znakowanego przez człowieka, jak opisano w protokole tekstowym, z roztworem do 20 mikromolowych kinezyn w buforze wolnym od magnezu w jednym milimolowym buforze EDTA i jednym milimolowym DTT, inkubować roztwór przez 15 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza, ustawić żelową kolumnę filtracyjną G 25 SX z przepływem grawitacyjnym i zrównoważyć z co najmniej trzema objętościami kolumny bez magnezu bufor. Następnie załaduj roztwór essyny do kolumny, aby oddzielić wolne nukleotydy i EDTA od kinezyny.

Naprawić probówkę zbiorczą, dodając do pustej probówki objętość 100 milimolowego roztworu chlorku magnezu tak, aby końcowe stężenie chlorku magnezu wynosiło jeden milimol. Po zebraniu roztworu kinezyny, przy użyciu odpowiedniego buforu wolnego od magnezu, szybko wymyj kinezynę. Obecność chlorku magnezu w probówce zbiorczej pomaga ustabilizować kinezynę natychmiast po tym, jak Ian z kolumny przechowuje kinezynę na lodzie i zużywa w ciągu jednej do dwóch godzin.

W międzyczasie przygotuj człowiekowi serię stężeń TP. Wybierz zakres stężeń w zależności od dostępnego stężenia kinezyny. Dla każdego stężenia mant a TP należy przygotować odpowiednie stężenie kinezyny tak, aby nukleotyd znakowany przez człowieka miał od pięciu do dziesięciu razy więcej mola niż miejsca wiązania nukleotydów kinezyny.

Ustaw długość fali wzbudzenia na fluorymetrze z zatrzymanym przepływem na 365 nanometrów i długość fali emisji powyżej 400 nanometrów za pomocą filtra długoprzepustowego. Następnie, zaczynając od najniższego stężenia Manta TP, użyj fluorymetru z zatrzymanym przepływem, aby wymieszać mantę TP i kinezynę wolną od nukleotydów w stosunku objętościowym jeden do jednego. Korzystając z poniższego wzoru, dopasuj miarę zmiany intensywności fluorescencji, aby nauczyć stężenie mant A TP do funkcji wykładniczej, plus linię stałego ujemnego nachylenia, aby uwzględnić fotobielenie grupy mant.

Na podstawie tych pasowań wyznacz stałą szybkości przy każdym stężeniu mantu. TP następnie przekazuje wskaźniki asocjacji i dysocjacji poprzez nitkowanie kopów w stosunku do stężenia mantu. A TP Następnie dopasuj te dane do funkcji liniowej, aby uzyskać przecięcie gradientu i osi y.

Gradient reprezentuje stałą szybkości dla człowieka asocjację TP z jednostkami na mol na sekundę. Punkt przecięcia reprezentuje stałą szybkość dysocjacji z jednostkami na sekundę. Aby zmierzyć szybkość dysocjacji, należy sfermentować DP do roztworu dwóch mikromolowych kinezyn w odpowiednim buforze w temperaturze 50.

Mikromolowy oznaczał inkubator DP o temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po użyciu kolumny G 25 Sedex do usunięcia fre mant, A DP z kinezyny, załadowanej mant A DP i ustawieniu flutera przepływu zatrzymującego zgodnie z opisem wcześniej w tym filmie, użyj zatrzymanego przepływu do wymieszania kompleksu mant A DP Kinine z 50-krotnym lub większym nadmiarem molowym nieznakowanego A TP w dopasowaniu stosunku objętości jeden do jednego. Spadek intensywności fluorescencji obserwowany w czasie do pojedynczej funkcji wykładniczej plus linia stałego ujemnego nachylenia, aby umożliwić fotobielenie grupy.

Kops wyznaczone na podstawie tego dopasowania jest stałą szybkości dysocjacji mant A DP w jednostkach na sekundę. Wielkość zmiany sygnału po związaniu lub dysocjacji nukleotydu drewna płaszczowego zależy od konkretnej kinezyny. Dlatego warto najpierw wykonać pomiary równowagi, aby potwierdzić zarówno obecność, jak i wielkość zmiany intensywności fluorescencji.

Widma fluorescencyjne fermentują TP i oznaczają DP zarówno w roztworze, jak iw kompleksie kinezyny M CAC są pokazane tutaj. Rysunek ten przedstawia reakcję, która zachodzi po zmieszaniu człowieka TP z kinezyną wolną od nukleotydów. Pokazano tutaj wzrost intensywności fluorescencji, który występuje po związaniu człowieka A TP z M CAC, dopasowując stałą szybkości w stosunku do człowieka.

Stężenie TP do funkcji liniowej, jak widać tutaj, umożliwia dekonwolucję stałej szybkości, która przyczynia się do kops i zapewnia fermentację postawy asocjacji i dysocjacji w pozycji A TP. Ten rysunek pokazuje spadek intensywności fluorescencji obserwowany przy fermentacji A DP po dysocjacji od M CEC, jak pokazano tutaj. Stała szybkości dysocjacji mant A DP od kinezyny jest określana przez dopasowanie tych danych do funkcji wykładniczej. Po opanowaniu, każdy z tych protokołów można ukończyć w mniej niż trzy godziny.

Chociaż ta metoda może dostarczyć informacji na temat kinezyny, można ją również zastosować do innych białek wiążących nukleotydy, takich jak miozyna i białka G. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać znakowanych fluorescencyjnie nukleotydów i przepływomierza zatrzymającego do pomiaru kinetyki wiązania i dysocjacji nukleotydów dla kinezyny.