Name: Zastosowanie fluorescencji o zatrzymanym przepływie i znakowanych nukleotydów do analizy cyklu obrotu ATP kinezyn (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Poznaj metodę pomiaru kinetyki wiązania i dysocjacji nukleotydów w cyklu ATP kinezyny przy użyciu fluorescencji o zatrzymanym przepływie i znakowanych nukleotydów. Technika ta pozwala określić stałe szybkościowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Radę Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi (BBSRC), Towarzystwo Królewskie oraz Uniwersytet w Nottingham.

1. Określenie zmiany intensywności fluorescencji po związaniu nukleotydu znakowanego mantem.
<ol>
	<li>Dodać 1 μM nukleotyd znakowany mantem do 1 μM kinezyny (stężenia końcowe) w odpowiednim buforze reakcyjnym. Zazwyczaj stosuje się bufor, który korzystnie wpływa na wzrost i stabilność mikrotubul (patrz dyskusja). Powszechnie stosowany bufor zawiera 80mM kwas piperazyno-bis-2-etanosulfonowy (PIPES) pH 6,9, 1mM MgCl2 i 1mM glikol etylenowy-bis-2-aminoeter-kwas tetraoctowy (EGTA). 
	Uwaga: Stężenie kinezyny podane we wszystkich protokołach odnosi się do stężenia miejsc wiązania nukleotydów (tj. domen motorycznych). Różne kinezyny występują jako monomery, dimery lub tetramery, a więc mogą zawierać więcej niż jedno miejsce wiązania nukleotydów na cząsteczkę.</li>
	<li>Po okresie inkubacji (1-3 min) i przy użyciu standardowego fluorymetru zmierzyć widmo emisyjne dla znakowanego mantem kompleksu nukleotyd-kinezyna. Użyj długości fali wzbudzenia 365 nm i zmierz emitowane światło w zakresie 400-500 nm w krokach co 1 nm.</li>
	<li>Sporządzić roztwór nukleotydu znakowanego 1 mM mant w tym samym buforze reakcyjnym, który został użyty w kroku 1.1.</li>
	<li>Zmierzyć widmo emisyjne dla próbki zawierającej tylko nukleotyd mant, jak opisano wcześniej (patrz krok 1.2).</li>
	<li>Znormalizuj widma do sygnału na długości fali szczytowej intensywności fluorescencji widma nukleotydu mant w roztworze (tj. bez kinezyny), dzieląc przez tę wartość.</li>
	<li>Wykreślić znormalizowane widma (np. Rysunek 2B), aby zaobserwować różnice w intensywności fluorescencji między kinezyną związaną z mantATP i/lub mantADP a nukleotydem mant w roztworze.</li>
</ol>
2. Pomiar stałych współczynnika asocjacji i dysocjacji dla mantATP
<ol>
	<li>Do roztworu do 20 μM kinezyny (patrz dyskusja) w dowolnym odpowiednim buforze wolnym od Mg2+ (np. 80mM PIPES pH6,9, 1mM EGTA, 0,1% Tween20), dodać 1 mM (stężenie końcowe) kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 1 mM (stężenie końcowe) ditiotreitolu (DTT). Uwaga: Dodanie Tween20 do buforu jest zalecane, ponieważ zmniejsza/zapobiega utracie białka kinezyny w kolumnie używanej do wymiany buforu (kroki 2.3 i 3.3)</li>
	<li>Inkubować roztwór w temperaturze 25 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Oddzielić wolny nukleotyd i EDTA od kinezyny za pomocą kolumny filtracyjnej z żelu grawitacyjnego G-25 sephadex zgodnie z instrukcjami producenta (patrz lista materiałów).
	<ol>
		<li>Zrównoważyć kolumnę z co najmniej 3 objętościami kolumny odpowiedniego buforu wolnego od Mg2+ (patrz krok 2.1). Załadować roztwór zawierający kinezynę do kolumny. Przygotować probówkę zbiorczą, dodając odpowiednią objętość 100 mM roztworu chlorku magnezu do pustej probówki, tak aby końcowe stężenie chlorku magnezu wynosiło 1 mM po zebraniu roztworu kinezyny. Natychmiastowe dodanie chlorku magnezu pomaga ustabilizować kinezynę wolną od nukleotydów.</li>
		<li>Eluuj kinezynę za pomocą odpowiedniego buforu wolnego od Mg2+. Kinezyny są niestabilne, gdy nie zawierają nukleotydów, dlatego ważne jest, aby działać szybko. Przechowuj kinezynę wolną od nukleotydów na lodzie i zużyj w ciągu 1-2 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W trakcie lub przed przygotowaniem kinezyny wolnej od nukleotydów należy przygotować szereg stężeń mantATP w tym samym buforze reakcyjnym, co końcowy roztwór kinezyny wolnej od nukleotydów. Określić zakres stężeń mantATP wymagany zgodnie z dostępnym stężeniem kinezyny przy typowym szeregu w zakresie od 0,1 do 50 μM (patrz krok 2.5 i omówienie).</li>
	<li>Przygotuj serię stężeń kinezyny wolnej od nukleotydów. Dla każdego stężenia mantATP (krok 2.4) należy przygotować stężenie kinezyny wolnej od nukleotydów w taki sposób, aby nukleotyd znakowany mantem miał od 5 do 10 razy więcej molowców w stosunku do miejsc wiązania nukleotydów kinezyny.</li>
	<li>Ustaw długość fali wzbudzenia na fluorymetrze z zatrzymanym przepływem na 365 nm i zbieraj emitowane światło o długości fali >400 nm za pomocą filtra długoprzepustowego.</li>
	<li>Zaczynając od najniższego stężenia mantATP, wymieszaj mantATP z odpowiednim stężeniem kinezyny wolnej od nukleotydów w stosunku 1:1 v/v za pomocą fluorymetru z zatrzymanym przepływem (Rysunek 3A i 3B Wstawka). Uwaga: Po zmieszaniu reagenty rozcieńcza się o 50%. Zanotuj stężenie nukleotydów zarówno przed, jak i po zmieszaniu (tj. 3,0/1,5 μM), aby uniknąć nieporozumień.</li>
	<li>Dopasuj zmianę intensywności fluorescencji mierzoną przy każdym stężeniu mantATP do funkcji wykładniczej plus linię stałego ujemnego nachylenia, aby uwzględnić fotobielenie grupy mant (tj. Fluorescencja = A0.exp(kobs.t)+(m.t+c), gdzie A0 jest amplitudą, kobs jest stałą szybkości, a t jest czasem, zob. rysunek 3B i dyskusja). Na podstawie tych dopasowań należy wyznaczyć stałą szybkości (kobs) dla każdego stężenia mantATP. Każdy kobs jest splotem stałej szybkości asocjacji i dysocjacji (rysunek 1, k1 i k-1).</li>
	<li>Zdekonwolucjonizuj stałe szybkości asocjacji i dysocjacji, wykreślając kobs w stosunku do stężenia mantATP (np. Rysunek 3C). Dopasuj te dane do funkcji liniowej (tj. kobs = k1[mantATP] + k-1), aby uzyskać przecięcie gradientu i osi y. Gradient reprezentuje stałą szybkości dla asocjacji mantATP (rysunek 1, k1) z jednostkami M-1 s-1. Punkt przecięcia reprezentuje stałą szybkości dysocjacji (rysunek 1, k-1) z jednostkami s-1 (patrz dyskusja). Uwaga: Podejście to można również zastosować do wyznaczenia stałych asocjacji ADP i szybkości dysocjacji (rysunek 1, k-4 i k4) przy użyciu mantADP jako nukleotydu.</li>
</ol>
3. Pomiar stałej szybkości dysocjacji dla mantADP
<ol>
	<li>Do roztworu 2 μM kinezyny w odpowiednim buforze reakcyjnym (np. 80 mM RURY pH 6,9, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0,1% Tween20) dodać 50 μM mantADP (stężenie końcowe).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 25 oC przez 30 minut.</li>
	<li>Usunąć nadmiar mantADP i innych wolnych nukleotydów za pomocą buforu, wymieniając kinezynę do wybranego buforu reakcyjnego za pomocą kolumny sephadexu G-25 (patrz lista materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Domena motoryczna kinezyny powinna być teraz załadowana za pomocą mantADP.</li>
	<li>Ustaw długość fali wzbudzenia na fluorymetrze z zatrzymanym przepływem na 365 nm i zbieraj emitowane światło o długości fali >400 nm za pomocą filtra długoprzepustowego.</li>
	<li>Wymieszaj kompleks mantADP.kinesin (~ 1 μM) z 50-krotnym lub większym nadmiarem molowym nieznakowanego ATP w stosunku 1: 1 v/v za pomocą fluorymetru z zatrzymanym przepływem (figura 4A i 4B Wkładka).</li>
	<li>Dopasuj spadek intensywności fluorescencji obserwowany w czasie do pojedynczej funkcji wykładniczej plus linia stałego ujemnego nachylenia, aby uwzględnić fotobielenie grupy mant (tj. Fluorescencja = A0.exp(kobs.t)+(m.t+c), gdzie A0 to amplituda, kobs to stała szybkość, a t to czas, patrz rysunek 4B i dyskusja). Kobs wyznaczone na podstawie tego dopasowania jest stałą szybkości dysocjacji ADP (Rysunek 1, k4) z jednostkami s-1 (patrz dyskusja).</li>
</ol>

<ol><li>Marx, A., Hoenger, A., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+kinesin+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Structures of kinesin motor proteins.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66, 958-966 (2009).</li>
<li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).</li>
<li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+kinesin+ATP+turnover+to+translocation+and+microtubule+regulation%3A+one+engine%2C+many+machines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Muscle+Res.+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Coupling of kinesin ATP turnover to translocation and microtubule regulation: one engine, many machines.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 377-383 (2012).</li>
<li>Yun, M., Zhang, X., Park, C. G., Park, H. W., Endow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+pathway+for+activation+of+the+kinesin+motor+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A structural pathway for activation of the kinesin motor ATPase.</a> EMBO J. 20, 2611-2618 (2001).</li>
<li>Hirose, K., Akimaru, E., Akiba, T., Endow, S. A., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+conformational+changes+in+a+kinesin+motor+catalyzed+by+interaction+with+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Large conformational changes in a kinesin motor catalyzed by interaction with microtubules.</a> Mol. Cell. 23, 913-923 (2006).</li>
<li>Kikkawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch-based+mechanism+of+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Switch-based mechanism of kinesin motors.</a> Nature. 411, 439-445 (2001).</li>
<li>Friel, C. T., Bagshaw, C. R., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+the+ATP+turnover+cycle+of+microtubule+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysing the ATP turnover cycle of microtubule motors.</a> Methods Mol. Biol. 777, 177-192 (2011).</li>
<li>Bagshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+analogues+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">ATP analogues at a glance.</a> J. Cell Sci. 114, 459-460 (2001).</li>
<li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinesin-13+MCAK+has+an+unconventional+ATPase+cycle+adapted+for+microtubule+depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The kinesin-13 MCAK has an unconventional ATPase cycle adapted for microtubule depolymerization.</a> EMBO J. 30, 3928-3939 (2011).</li>
<li>Gilbert, S. P., Webb, M. R., Brune, M., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+of+processive+ATP+hydrolysis+by+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pathway of processive ATP hydrolysis by kinesin.</a> Nature. 373, 671-676 (1995).</li>
<li>Sadhu, A., Taylor, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+study+of+the+kinesin+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A kinetic study of the kinesin ATPase.</a> J. Biol. Chem. 267, 11352-11359 (1992).</li>
<li>Woodward, S. K., Eccleston, J. F., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+the+interaction+of+2%27%283%27%29-O-%28N-methylanthraniloyl%29-ATP+with+myosin+subfragment+1+and+actomyosin+subfragment+1%3A+characterization+of+two+acto-S1-ADP+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics of the interaction of 2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP with myosin subfragment 1 and actomyosin subfragment 1: characterization of two acto-S1-ADP complexes.</a> Biochemistry. 30, 422-430 (1991).</li>
<li>Hackney, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+of+ADP-stimulated+ADP+release+and+dissociation+of+tethered+kinesin+from+microtubules.+Implications+for+the+extent+of+processivity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Pathway of ADP-stimulated ADP release and dissociation of tethered kinesin from microtubules. Implications for the extent of processivity.</a> Biochemistry. 41, 4437-4446 (2002).</li>
<li>Lockhart, A., Cross, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+motility+of+the+Eg5+microtubule+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics and motility of the Eg5 microtubule motor.</a> Biochemistry. 35, 2365-2373 (1996).</li>
<li>Chen, C. J., Porche, K., Rayment, I., Gilbert, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ATPase+pathway+that+drives+the+kinesin-14+Kar3Vik1+powerstroke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The ATPase pathway that drives the kinesin-14 Kar3Vik1 powerstroke.</a> J. Biol. Chem. 287, 36673-36682 (2012).</li>
<li>Moyer, M. L., Gilbert, S. P., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+of+ATP+hydrolysis+by+monomeric+and+dimeric+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Pathway of ATP hydrolysis by monomeric and dimeric kinesin.</a> Biochemistry. 37, 800-813 (1998).</li>
<li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Direct Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33, 8262-8271 (1994).</li>
<li>Goodrich, J. A., Kugel, J. F. Chapter 4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodrich%2C+JA+%22Binding+and+Kinetics+for+Molecular+Biologists%22">Binding and Kinetics for Molecular Biologists</a>. 4, Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring, NY. 69-97 (2006).</li>
<li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+reconstituted+in+vitro+and+imaged+by+single-molecule+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy.</a> Methods Cell Biol. 95, 221-245 (2010).</li>
<li>Olmsted, J. B., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+and+nucleotide+requirements+for+microtubule+polymerization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ionic and nucleotide requirements for microtubule polymerization in vitro.</a> Biochemistry. 14, 2996-3005 (1975).</li>
<li>Brinkley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules%3A+a+brief+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubules: a brief historical perspective.</a> J. Struct Biol. 118, 84-86 (1997).</li>
<li>Ostap, E. M., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+kinetic+characterization+of+the+Acanthamoeba+myosin-I+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical kinetic characterization of the Acanthamoeba myosin-I ATPase.</a> J. Cell Biol. 132, 1053-1060 (1996).</li>
<li>Eccleston, J. F., Moore, K. J., Brownbridge, G. G., Webb, M. R., Lowe, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+approaches+to+the+study+of+the+p21ras+GTPase+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Fluorescence approaches to the study of the p21ras GTPase mechanism.</a> Biochem. Soc. Trans. 19, 432-437 (1991).</li>
<li>Ahmadian, M. R., Wittinghofer, A., Herrmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+methods+in+the+study+of+small+GTP-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence methods in the study of small GTP-binding proteins.</a> Methods Mol. Biol. 189, 45-63 (2002).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym miejscu przedstawiono protokoły obserwacji i analizy kinetyki przejść między stanami nukleotydowymi dla kinezyny. Protokoły te wykorzystują metodę szybkiego mieszania zatrzymanego przepływu w połączeniu z fluorescencyjnie znakowanymi nukleotydami. Metody tego typu były szeroko stosowane do badania wiązania i dysocjacji nukleotydów dla różnych kinezyn9-11,13-16. Opisane metody nie pozwalają na obserwację uwalniania fosforanów (Rysunek 1, Krok 3). Jednak fluorescencja zatrzymanego przepływu może być wykorzystana do obserwacji tego przejścia za pomocą białka wykrywającego fosforany do sprzężenia produkcji fosforanu ze zmianą intensywności fluorescencji17. W przedstawionych metodach wykorzystuje się nukleotydy znakowane małym fluoroforem methylanthraniloyl (mant), które na ogół wykazują wzrost intensywności fluorescencji po związaniu z białkiem. Co więcej, fluorofor mant, sprzężony z pozycją 2' lub 3' na rybozie, często ma niewielki lub żaden wpływ na wiązanie, dysocjację lub hydrolizę nukleotydu9-12. Nukleotydy znakowane mantem są łatwo dostępne ze źródeł komercyjnych (patrz lista materiałów) i są dostarczane jako mieszaniny koniugatu 2' i 3', ponieważ szybko przywracają równowagę po oczyszczeniu do pojedynczego izomeru8. Nukleotydy znakowane mantem są doskonałymi cząsteczkami reporterowymi, za pomocą których można zaobserwować kinetykę wiązania i dysocjacji nukleotydów.
Zastosowanie znakowanych fluorescencyjnie nukleotydów oznacza, że odczyt z opisanych testów jest zmianą intensywności fluorescencji w czasie rzeczywistym. To sprawia, że testy te idealnie nadają się do fluorescencji z zatrzymanym przepływem, która umożliwia szybkie mieszanie odczynników i obserwację w czasie rzeczywistym zmian fluorescencji związanych z następczą reakcją. Połączenie zatrzymanego przepływu jako techniki mieszania i fluorescencji jako metody wykrywania tworzy system, który jest stosunkowo wydajny dla próbki. Na przykład, aby uzyskać dane pokazane na rysunku 3C , potrzeba 0,8 - 1,0 mg oczyszczonej kinezyny-13, MCAK, a aby uzyskać dane pokazane na rysunku 4B , potrzeba ~0,3 mg oczyszczonej kinezyny-13, MCAK. Jedną z wad stosowania mantu jako fluoroforu jest to, że jest on podatny na fotowybielanie. Można to zaobserwować w oderwaniu od kinetyki reakcji kinezyny poprzez zmieszanie roztworu nukleotydu znakowanego mantem z buforem reakcyjnym, przy braku kinezyny, w zatrzymanym przepływie. Obserwuje się powolny spadek intensywności fluorescencji, gdy grupa mant ulega bieleniu. W zakresie skal czasowych stosowanych w opisanych protokołach fotowybielanie grupy mant jest dobrze opisane przez funkcję liniową. Dlatego prostym sposobem skorygowania danych do fotowybielania jest dopasowanie do funkcji wykładniczej z linią bazową opisaną przez funkcję liniową (tj. m.t + c), a nie do bardziej powszechnej płaskiej linii bazowej, opisanej pojedynczym parametrem.
wiązanie mantATP
Podczas pomiaru stałych szybkości asocjacji i dysocjacji mantATP (sekcja 2) ADP, który pozostaje związany z miejscem wiązania nukleotydów kinezyny pod nieobecność mikrotubul, musi zostać usunięty. Pozwala to na zaobserwowanie asocjacji i dysocjacji mantATP (Rysunek 1, krok 1) w izolacji od dysocjacji ADP. Aby to osiągnąć, kinezyna jest inkubowana z co najmniej 50-krotnym nadmiarem EDTA nad miejscami wiązania nukleotydów (krok 2.1). EDTA sekwestruje jony Mg2+ , powodując dysocjację Mg2+ z kieszeni wiążącej nukleotydy, co powoduje uwolnienie nukleotydu11. Dlatego podczas wykonywania kroków 2.1 - 2.3 ważne jest, aby użyć buforu wolnego od Mg2+. Wolne od nukleotydów białko kinezyny jest wymieniane w buforze w celu oddzielenia go zarówno od wolnego nukleotydu, jak i od EDTA. Aby osiągnąć tę separację, wystarczy jednorazowa kolumna filtracyjna z żelem grawitacyjnym, która jest prosta i szybka w użyciu (patrz lista materiałów). Interakcja mantATP z kinezyną wolną od nukleotydów odbywa się w zakresie stężeń mantATP (krok 2.4), aby umożliwić dekonwolucję stałych szybkości asocjacji i dysocjacji (krok 2.8). Teoria stojąca za tego typu eksperymentami jest dobrze opisana w odnośniku 18. Wykonując te eksperymenty, zaczyna się od najniższego stężenia mantATP. Eliminuje to konieczność stosowania etapów mycia między różnymi stężeniami. Prawdopodobnie konieczne będzie dostosowanie czułości fluorymetru z zatrzymanym przepływem wraz ze wzrostem stężenia mantATP. Stężenie mantATP musi być zawsze co najmniej 5-krotnie wyższe od stężenia miejsc wiązania nukleotydów kinezyny, aby utrzymać warunki pseudo pierwszego rzędu. Jednak wraz ze wzrostem stężenia mantATP zmiana sygnału może zostać zalana, ponieważ frakcja nukleotydu, która wiąże się z kinezyną, maleje. W związku z tym stężenie kinezyny jest również zwiększane dla każdego nowego stężenia mantATP tak, że stężenie mantATP nigdy nie jest większe niż 10-krotny molowy nadmiar nad miejscami wiązania nukleotydów (krok 2.6).
mantDysocjacja ADP 
Chociaż stałe szybkości asocjacji i dysocjacji dla mantADP można wyznaczyć tą samą metodą, co dla mantATP (sekcja 2). Dysocjację ADP od kinezyny można bezpośrednio zaobserwować poprzez wstępne obciążenie miejsca wiązania nukleotydów mantADP (kroki 3.1-3.3) Kompleks mantADP.kinesin jest następnie mieszany z nadmiarem nieznakowanego ATP (krok 3.5). Nadmiar nieznakowanego ATP zapobiega ponownemu wiązaniu mantADP z kinezyną, a tym samym umożliwia obserwację reakcji dysocjacji (ryc. 1, k4) w izolacji od asocjacji mantADP. W tym teście stężenie nieznakowanego ATP musi wynosić co najmniej 50-krotny molowy nadmiar miejsc wiązania nukleotydów. Teoria stojąca za tym testem jest dobrze opisana w odnośniku 18. Ta metoda bezpośrednia daje dokładniejszą wartość stałej szybkości dysocjacji niż ekstrapolacja na oś y opisaną w kroku 2.8.
Włączenie mikrotubul
Opisane metody można również wykorzystać do określenia kinetyki wiązania i dysocjacji nukleotydów w obecności mikrotubul. Mikrotubule są wprowadzane do strzykawki zawierającej nukleotydy przed zmieszaniem w zatrzymanym przepływie: dolnej strzykawce na rysunku 3B i 4B (wstawki). W tej konfiguracji kinezyna spotka się z nukleotydem w tym samym czasie, w którym spotka się z mikrotubulami. Stosuje się stabilizowane mikrotubule, w których wydłuża się żywotność polimeru tubuliny poprzez zastosowanie stabilizującego związku chemicznego, takiego jak taksol, lub niehydrolizującego analogu GTP, takiego jak trifosforan guanozyno-5'-[(α,β)-metyleno]trifosforan (GMPCPP, patrz wykaz materiałów). Możliwe jest zastosowanie dwóch cykli polimeryzacji tubuliny z GMPCPP do wytworzenia mikrotubul, które mogą być przechowywane przez wiele miesięcy w ciekłym azocie9,19. Zastosowanie wcześniej przygotowanych mikrotubul znacznie zmniejsza praktyczne trudności w wykonywaniu tych testów. Aby uwzględnić mikrotubule w testach, ważne jest użycie buforu reakcyjnego odpowiedniego dla stabilności mikrotubul. Wybrany bufor jest oparty na PIPES, przy czym najczęściej stosowany bufor zawiera 80 mM PIPES pH 6,9, 1 mM MgCl2 i 1 mM EGTA (znany jako BRB80)20,21.
Opisane metody nie są ograniczone do stosowania z kinezynami, ale mogą być dostosowane i zastosowane do dowolnego białka wiążącego nukleotydy. Na przykład, podobne metody zastosowano do cyklu obrotu ATP członków rodziny silników molekularnych miozyny12,22 , a zastosowanie nukleotydów guanozynowych znakowanych mant dodatkowo rozszerza metody tego typu na białka hydrolizujące GTP23,24.

Kinezyny stanowią superrodzinę białek charakteryzujących się silnie konserwowaną domeną motorową1. Domena motorowa kinezyny oddziałuje z mikrotubulami w sposób zależny od nukleotydów. Przedstawiciele rodziny kinezyn wykazują szereg funkcji – od kinezyn translokacyjnych, które transportują ładunek w sposób ukierunkowany wzdłuż mikrotubul, po nietranslokacyjne kinezyny wiążące końce mikrotubul, które regulują dynamikę mikrotubul2,3.
Kinezyny wykorzystują obrót adenozyno-5’-trifosforanu (ATP) do regulacji swojej interakcji z cytoszkieletem mikrotubularnym4-6. Konformacja domeny motorowej kinezyny, a w konsekwencji jej powinowactwo do mikrotubuli, zależy od stanu nukleotydowego: związany może być ATP, ADP, ADP.Pi lub brak nukleotydu (Rysunek 1). Aby zrozumieć molekularny mechanizm działania kinezyny, niezbędne jest poznanie zależności między obrotem ATP a interakcją z mikrotubulami. Dlatego głównym celem w badaniach nad kinezynami jest charakterystyka właściwości funkcjonalnych różnych stanów nukleotydowych oraz kinetyki przejść między nimi, zarówno w obecności, jak i w przypadku braku mikrotubul.
<img alt="Schemat cyklu reakcji syntezy ATP; przedstawia ścieżki przepływu ADP, ATP oraz stałych szybkości k1 do k4." fo:content-width="2in" width="200" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Najprostszy cykl obrotu ATP dla kinezyny składa się z czterech możliwych stanów: bez nukleotydu (Φ), związanego z ATP, związanego z ADP.Pi oraz związanego z ADP.Każde z czterech przejść charakteryzuje się stałą szybkości reakcji w kierunku przodowym i wstecznym (odpowiednio kx oraz k-x).
Aby zrozumieć, w jaki sposób chemiczny cykl obrotu ATP jest sprzężony z mechanicznym cyklem interakcji z mikrotubulami, należy określić, który etap w cyklu obrotu ATP jest etapem limitującym w przypadku braku mikrotubul, a następnie ustalić, jak cykl ten zmienia się w obecności mikrotubul. Najprostszy cykl obrotu ATP składa się z czterech poszczególnych etapów chemicznych: (1) wiązania ATP z pustym miejscem (Φ oznacza puste miejsce, t.j. kinezynę pozbawioną nukleotydu); (2) rozszczepienia ATP; (3) dysocjacji fosforanu oraz (4) dysocjacji ADP (Rysunek 1). Etap limitujący wyznacza stałą szybkości dla pełnego cyklu obrotu ATP. Dlatego, aby określić, który etap jest limitujący, należy zmierzyć każde z poszczególnych przejść i porównać je ze stałą szybkości pełnego cyklu. Metody pomiaru ogólnej stałej szybkości cyklu obrotu ATP nie zostały tutaj opisane, ale można je znaleźć w odniesieniu 7. W niniejszej pracy opisujemy metody, za pomocą których można wyznaczyć stałe szybkości poszczególnych etapów chemicznych. Dostępnych jest szereg metod pozwalających na badanie poszczególnych przejść w cyklu obrotu białka hydrolizującego nukleotydy. Przedstawione tutaj metody wykorzystują właściwości nukleotydów znakowanych fluoroforem metyloantraniloilo, zazwyczaj określanym jako mant, który wykazuje zmianę intensywności fluorescencji po związaniu z białkiem8. Grupa mant jest stosowana, ponieważ jej niewielki rozmiar sprawia, że w połączeniu z rybozą (Rysunek 2A) zazwyczaj ma ona niewielki lub żaden wpływ na kinetykę wiązania lub hydrolizy nukleotydów9-12. Przedstawiamy tutaj protokoły opisujące zastosowanie nukleotydów znakowanych mant w połączeniu z fluorescencją w technice stopped-flow, co pozwala na obserwację wiązania i dysocjacji nukleotydów w cyklu obrotu ATP kinezyny.

<table><tbody><tr><td>2'/3'-(N-metyloantraniloilolo)adenozyno-5' trifosforan&nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-202</td><td>mantATP</td></tr><tr><td>2'/3'-(N-metyloantraniloilolo)adenozyno-5'-difosforan&nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-201</td><td>mantADP</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Roche</td><td># 10519979001</td><td>Sól disodową ATP wytwarza się do stężenia 100&nbsp; mM w 100&nbsp; mM MgCl2. Stężenie należy sprawdzić przez absorpcję w temperaturze 260&nbsp; nm (e = 15,400&nbsp; M-1cm-1). Roztwór przechowywany w podwielokrotnościach na poziomie -20&nbsp; oC.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td>0,5&nbsp; M roztwór podstawowy w wodzie, pH 8,0. ZAGROŻENIE: proszek szkodliwy w przypadku wdychania.</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td>1&nbsp; M roztwór podstawowy w świeżej wodzie do spożycia tego samego dnia. ZAGROŻENIE: proszek szkodliwy w przypadku wdychania lub kontaktu ze skórą.</td></tr><tr><td>Kolumna NAP-5</td><td>GE Healthcare</td><td># 17-0853</td><td>G-25 kolumna filtracyjna żelowa z żywicy grawitacyjno-przepływowej sephadex</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-405</td><td>niehydrolizowalny analog fluorymetru</td></tr><tr><td>z zatrzymanym przepływem GTP&nbsp;</td><td>Fotofizyka stosowana</td><td>SX20</td><td>Fluorymetr z dołączoną instalacją hydrauliczną, która umożliwia szybkie mieszanie odczynników w kuwecie obserwacyjnej. Pozwalając tym samym na kinetykę reakcji w skalach czasowych ~0,1&nbsp;-&nbsp; 100&nbsp; s, które mają być monitorowane.</td></tr></tbody></table>

zastosowanie fluorescencji o zatrzymanym przepływie i znakowanych nukleotydów do analizy cyklu obrotu atp kinezyn

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

Nadrodzina kinezyny białek motorycznych związanych z mikrotubulami ma charakterystyczną domenę motoryczną, która zarówno hydrolizuje ATP, jak i wiąże mikrotubule. Kinezyny wykazują różnice w całej nadrodzinie zarówno w obrocie ATP, jak i w interakcji mikrotubul. Różnice te dostosowują określone kinezyny do różnych funkcji, takich jak transport ładunków, przesuwanie mikrotubul, depolimeryzacja mikrotubul i stabilizacja mikrotubul. Aby zrozumieć mechanizm działania kinezyny, ważne jest zrozumienie, w jaki sposób cykl chemiczny obrotu ATP jest sprzężony z mechanicznym cyklem oddziaływania mikrotubul. Aby przeanalizować cykl obrotu ATP, jednym ze sposobów jest wykorzystanie znakowanych fluorescencyjnie nukleotydów do wizualizacji poszczególnych etapów cyklu. Określenie kinetyki każdej przemiany nukleotydowej w cyklu obrotu ATP pozwala na zidentyfikowanie kroku lub kroków ograniczających szybkość dla całego cyklu. W przypadku kinezyny ważne jest, aby znać krok ograniczający szybkość w przypadku braku mikrotubul, ponieważ krok ten jest na ogół przyspieszany kilka tysięcy razy, gdy kinezyna wchodzi w interakcję z mikrotubulami. Cykl przy braku mikrotubul jest następnie porównywany z cyklem w obecności mikrotubul, aby w pełni zrozumieć cykl obrotu ATP kinezyny. Kinetyka poszczególnych przejść nukleotydowych jest na ogół zbyt szybka, aby można ją było zaobserwować przez ręczne mieszanie reagentów, szczególnie w obecności mikrotubul. Do monitorowania takich przejść można użyć urządzenia do szybkiego mieszania, takiego jak fluorymetr z zatrzymanym przepływem, który pozwala obserwować kinetykę w skalach czasowych wynoszących zaledwie kilka milisekund. W tym miejscu opisujemy protokoły, w których szybkie mieszanie odczynników przez zatrzymany przepływ jest stosowane w połączeniu z fluorescencyjnie znakowanymi nukleotydami w celu przeanalizowania cyklu obrotu ATP kinezyny.

Wzrost intensywności fluorescencji grupy mant jest zazwyczaj obserwowany podczas wiązania nukleotydu znakowanego mantem z kinezyną. Jednakże wielkość takiej zmiany sygnału zależy od konkretnej analizowanej kinezyny. Dlatego też przed przejściem do testów kinetycznych warto przeprowadzić pomiary równowagowe, aby potwierdzić zarówno obecność, jak i wielkość zmiany intensywności fluorescencji. Reprezentatywne widma fluorescencji dla mantATP i mantADP, zarówno w roztworze, jak i w kompleksie z kinezyną-13, MCAK, przedstawiono na Rysunku 2B. Dane te podkreślają wzrost intensywności fluorescencji wykazany zarówno przez mantATP, jak i mantADP po związaniu z MCAK. Zmiana intensywności fluorescencji po związaniu nukleotydu mant z kinezyną jest wykorzystywana do monitorowania asocjacji i dysocjacji zarówno ATP, jak i ADP (Sekcje 2 i 3). W przypadku MCAK obserwuje się różnicę w intensywności fluorescencji pomiędzy mantATP.kinesin a mantADP.kinesin9.
Rysunek 3A przedstawia reakcję zachodzącą po zmieszaniu mantATP z kinezyną pozbawioną nukleotydów. Reprezentatywne dane ilustrujące wzrost intensywności fluorescencji występujący podczas wiązania mantATP do kinezyny-13, MCAK, pokazano na Rysunku 3B. Dane typu przedstawionego na Rysunku 3B są zbierane dla różnych stężeń mantATP. Wykres stałych szybkości (kobs) wyznaczonych w funkcji stężenia mantATP pokazano na Rysunku 3C. Dopasowanie tych danych do funkcji liniowej (t.j. kobs = k1[mantATP] + k-1) pozwala na dekonwolucję stałych szybkości, które składają się na kobs (Krok 2.8). Umożliwia to zatem wyznaczenie zarówno stałej szybkości asocjacji, jak i dysocjacji dla mantATP (Rysunek 1, odpowiednio k1 i k-1).
Rysunek 4A przedstawia reakcję zachodzącą po zmieszaniu mantADP.kinesyny z nadmiarem nieznakowanego ATP. Dane na Rysunku 4B pokazują spadek intensywności fluorescencji zaobserwowany dla mantADP po dysocjacji z kinesyny-13, MCAK. Poprzez dopasowanie tych danych do funkcji wykładniczej (Krok 3.6) bezpośrednio wyznaczono stałą szybkości dysocjacji mantADP.
<img alt="Struktura chemiczna ATP i wykres widm fluorescencji pokazujący oddziaływanie ATP z MCAK." src="/files/ftp_upload/52142/52142fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Nukleotydy znakowane fluoroforem metyloantraniloilowym (mant) są wykorzystywane do wyizolowania poszczególnych etapów cyklu obrotu ATP. (A) Struktura mantATP pokazująca położenie fluoroforu mant sprzężonego z pozycją 2’ lub 3’ rybozy. (B) Znormalizowane widma fluorescencji dla mantATP i mantADP w roztworze (mAXP) oraz mantATP i mantADP w kompleksie z kinezyną MCAK (mATP+MCAK i mADP+MCAK). Widma mantATP zostały znormalizowane do fluorescencji maksymalnej dla mantATP w roztworze, a widma mantADP do fluorescencji max dla mantADP w roztworze. Widma nukleotydów mant zmieszanych z MCAK zarejestrowano 1 min po zmieszaniu. Stężenia odczynników oraz ustawienia fluorymetru są opisane w krokach protokołu 1.1 i 1.2.
<img alt="Schemat testu fluorescencyjnego; natężenie fluorescencji w funkcji czasu, analiza kinetyczna, badanie wiązania mantATP." src="/files/ftp_upload/52142/52142fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Pomiar stałej szybkości asocjacji mantATP. (A) Schemat przedstawiający reakcję zachodzącą po zmieszaniu metodą stopped-flow: mantATP (mATP) wiąże się z kinezyną pozbawioną nukleotydów. Natężenie fluorescencji grupy mant wzrasta po związaniu z białkiem. (B) Zmiana sygnału fluorescencji (czarny), obserwowana po zmieszaniu mantATP (25 M) z MCAK (5 M pozbawionym nukleotydów, ). Dane te dopasowano (czerwona przerywana linia) do funkcji pojedynczej wykładniczej oraz linii o stałym ujemnym nachyleniu, co uwzględnia fotowyblakanie fluoroforu mant (patrz dyskusja). Wstawka: Zawartość strzykawek przed zmieszaniem we fluorymetrze stopped-flow. (C) Stałe szybkości (kobs) wyznaczone dla reakcji mantATP z MCAK pozbawionym nukleotydów, przedstawione w funkcji stężenia mantATP. Wykres ten posiada obszar liniowy, w którym nachylenie stanowi stałą szybkości asocjacji (Rysunek 1, k1) wyrażoną w M-1 s-1, a punkt przecięcia z osią y stanowi stała szybkości dysocjacji (Rysunek 1, k-1) wyrażona w s-1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Konwersja ATP do mADP; zanik fluorescencji, aktywność enzymu MCAK, wykres czasu względem intensywności." src="/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Pomiar stałej szybkości dysocjacji dla mantADP. (A) Schemat przedstawiający reakcję zachodzącą po zmieszaniu metodą stopped-flow: kinezyna uprzednio obciążona mantADP zostaje rozcieńczona w nadmiarze nieznakowanego ATP. Dysocjujący mantADP jest zastępowany przez nieznakowane ATP, co zapobiega reakcji odwrotnej asocjacji mantADP (patrz sekcja dyskusja). Intensywność fluorescencji grupy mant maleje podczas dysocjacji z białka. (B) Spadek fluorescencji obserwowany podczas dysocjacji mantADP z kinezyny MCAK. Sygnał fluorescencji (czarny) został dopasowany (czerwona przerywana linia) do pojedynczej funkcji wykładniczej oraz linii o stałym ujemnym nachyleniu w celu uwzględnienia fotobielenia grupy mant (patrz sekcja dyskusja). Wyznaczona stała szybkości jest stałą szybkości dysocjacji mantADP (Rysunek 1, k4). Wstawka: Zawartość strzykawek przed zmieszaniem w fluorymetrze stopped-flow. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Kinezyny charakteryzują się zależnym od nukleotydów oddziaływaniem z mikrotubulami: cyklem obrotu ATP sprzężonym z cyklem interakcji mikrotubul. W tym miejscu opisujemy protokoły analizy kinetyki poszczególnych przejść nukleotydowych w cyklu obrotu ATP kinezyny przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie nukleotydów i fluorescencji zatrzymanego przepływu.

Zastosowanie fluorescencji o zatrzymanym przepływie i znakowanych nukleotydów do analizy cyklu obrotu ATP kinezyn

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar kinetyki wiązania i dysocjacji nukleotydów podczas cyklu obrotu A TP kinezyny. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie białka kinezyny, wolnego od nukleotydów lub obciążonego fluorescencyjnie znakowanym nukleotydem. Następnie przygotowaną kinezynę miesza się z nukleotydem za pomocą fluorymetru o zatrzymanym przepływie i obserwuje się zmianę fluorescencji związaną z wiązaniem lub dysocjacją znakowanego fluorescencyjnie nukleotydu.Następnie zmiana fluorescencji jest dopasowywana do funkcji wykładniczej, aby uzyskać stałą szybkości. Na koniec zmierzone stałe szybkości są decentralizowane, a stałe szybkości są przypisywane do poszczególnych przejść cyklu rotacji A TP. Ostatecznie połączenie znakowanego fluorescencyjnie nukleotydu i fluorescencji zatrzymanego przepływu służy do pomiaru kinetyki wiązania i dysocjacji nukleotydów.CIN Procedurę zademonstrują Jennifer Patel i Hannah Belch, doktorantka z mojego laboratorium. Po określeniu intensywności fluorescencji kinezyny po związaniu nukleotydu znakowanego przez człowieka, jak opisano w protokole tekstowym, z roztworem do 20 mikromolowych kinezyn w buforze wolnym od magnezu w jednym milimolowym buforze EDTA i jednym milimolowym DTT, inkubować roztwór przez 15 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza, ustawić żelową kolumnę filtracyjną G 25 SX z przepływem grawitacyjnym i zrównoważyć z co najmniej trzema objętościami kolumny bez magnezu bufor. Następnie załaduj roztwór essyny do kolumny, aby oddzielić wolne nukleotydy i EDTA od kinezyny.Naprawić probówkę zbiorczą, dodając do pustej probówki objętość 100 milimolowego roztworu chlorku magnezu tak, aby końcowe stężenie chlorku magnezu wynosiło jeden milimol. Po zebraniu roztworu kinezyny, przy użyciu odpowiedniego buforu wolnego od magnezu, szybko wymyj kinezynę. Obecność chlorku magnezu w probówce zbiorczej pomaga ustabilizować kinezynę natychmiast po tym, jak Ian z kolumny przechowuje kinezynę na lodzie i zużywa w ciągu jednej do dwóch godzin.W międzyczasie przygotuj człowiekowi serię stężeń TP. Wybierz zakres stężeń w zależności od dostępnego stężenia kinezyny. Dla każdego stężenia mant a TP należy przygotować odpowiednie stężenie kinezyny tak, aby nukleotyd znakowany przez człowieka miał od pięciu do dziesięciu razy więcej mola niż miejsca wiązania nukleotydów kinezyny.Ustaw długość fali wzbudzenia na fluorymetrze z zatrzymanym przepływem na 365 nanometrów i długość fali emisji powyżej 400 nanometrów za pomocą filtra długoprzepustowego. Następnie, zaczynając od najniższego stężenia Manta TP, użyj fluorymetru z zatrzymanym przepływem, aby wymieszać mantę TP i kinezynę wolną od nukleotydów w stosunku objętościowym jeden do jednego. Korzystając z poniższego wzoru, dopasuj miarę zmiany intensywności fluorescencji, aby nauczyć stężenie mant A TP do funkcji wykładniczej, plus linię stałego ujemnego nachylenia, aby uwzględnić fotobielenie grupy mant.Na podstawie tych pasowań wyznacz stałą szybkości przy każdym stężeniu mantu. TP następnie przekazuje wskaźniki asocjacji i dysocjacji poprzez nitkowanie kopów w stosunku do stężenia mantu. A TP Następnie dopasuj te dane do funkcji liniowej, aby uzyskać przecięcie gradientu i osi y.Gradient reprezentuje stałą szybkości dla człowieka asocjację TP z jednostkami na mol na sekundę. Punkt przecięcia reprezentuje stałą szybkość dysocjacji z jednostkami na sekundę. Aby zmierzyć szybkość dysocjacji, należy sfermentować DP do roztworu dwóch mikromolowych kinezyn w odpowiednim buforze w temperaturze 50.Mikromolowy oznaczał inkubator DP o temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po użyciu kolumny G 25 Sedex do usunięcia fre mant, A DP z kinezyny, załadowanej mant A DP i ustawieniu flutera przepływu zatrzymującego zgodnie z opisem wcześniej w tym filmie, użyj zatrzymanego przepływu do wymieszania kompleksu mant A DP Kinine z 50-krotnym lub większym nadmiarem molowym nieznakowanego A TP w dopasowaniu stosunku objętości jeden do jednego. Spadek intensywności fluorescencji obserwowany w czasie do pojedynczej funkcji wykładniczej plus linia stałego ujemnego nachylenia, aby umożliwić fotobielenie grupy.Kops wyznaczone na podstawie tego dopasowania jest stałą szybkości dysocjacji mant A DP w jednostkach na sekundę. Wielkość zmiany sygnału po związaniu lub dysocjacji nukleotydu drewna płaszczowego zależy od konkretnej kinezyny. Dlatego warto najpierw wykonać pomiary równowagi, aby potwierdzić zarówno obecność, jak i wielkość zmiany intensywności fluorescencji.Widma fluorescencyjne fermentują TP i oznaczają DP zarówno w roztworze, jak iw kompleksie kinezyny M CAC są pokazane tutaj. Rysunek ten przedstawia reakcję, która zachodzi po zmieszaniu człowieka TP z kinezyną wolną od nukleotydów. Pokazano tutaj wzrost intensywności fluorescencji, który występuje po związaniu człowieka A TP z M CAC, dopasowując stałą szybkości w stosunku do człowieka.Stężenie TP do funkcji liniowej, jak widać tutaj, umożliwia dekonwolucję stałej szybkości, która przyczynia się do kops i zapewnia fermentację postawy asocjacji i dysocjacji w pozycji A TP. Ten rysunek pokazuje spadek intensywności fluorescencji obserwowany przy fermentacji A DP po dysocjacji od M CEC, jak pokazano tutaj. Stała szybkości dysocjacji mant A DP od kinezyny jest określana przez dopasowanie tych danych do funkcji wykładniczej. Po opanowaniu, każdy z tych protokołów można ukończyć w mniej niż trzy godziny.Chociaż ta metoda może dostarczyć informacji na temat kinezyny, można ją również zastosować do innych białek wiążących nukleotydy, takich jak miozyna i białka G. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać znakowanych fluorescencyjnie nukleotydów i przepływomierza zatrzymającego do pomiaru kinetyki wiązania i dysocjacji nukleotydów dla kinezyny.

use-stopped-flow-fluorescence-labeled-nucleotides-to-analyze-atp

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Molekularne wahadła składające się z funkcjonalizowanych mikrotubul przesuwających się po przytwierdzonych do powierzchni białkach motorycznych kinezynach mogą służyć jako nanoskala system transportowy. W niniejszej pracy opisano montaż typowego systemu wahadłowego.

Ładowanie ładunku na molekularne wahadła napędzane kinezyną

Tutaj prezentowany jest protokół identyfikacji ładunków Kinesin-1. Bezsilnikowy mutant ciężkiego łańcucha Kinesin-1 (KIF5B) agreguje się w cytoplazmie i indukuje agregację jej ładunków. Oba agregaty są wykrywane pod mikroskopią fluorescencyjną. Podobną strategię można zastosować do identyfikacji ładunków innych białek motorycznych.

Identyfikacja ładunków kinezyny-1 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Prezentujemy protokół budowy molekularnych wahadłowców, gdzie przylegające do powierzchni białka motoryczne kinezyny napędzają mikrotubule znakowane barwnikiem. Słabe oddziaływania kinezyn z powierzchnią umożliwiają ich odwracalne przywiązanie do niej. W ten sposób powstaje system w nanoskali, który wykazuje dynamiczny montaż i demontaż swoich elementów przy zachowaniu swojej funkcjonalności.

Montaż molekularnych wahadłowców zasilanych przez odwracalnie przyłączone kinezyny

Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Dwukierunkowa mitoza kinezyna-5 Cin8 gromadzi się w klastrach, które rozdzielają się i łączą podczas swojej ruchliwości. Akumulacja w gromadach zmienia również prędkość i kierunkowość Cin8. W tym miejscu opisano protokół oznaczania ruchliwości z oczyszczonym Cin8-GFP oraz analizy właściwości ruchliwych pojedynczych cząsteczek i klastrów Cin8.

Ruchliwość pojedynczych cząsteczek i klastrów dwukierunkowej kinezyny-5 Cin8 oczyszczonej z komórek S. cerevisiae

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

To badanie szczegółowo opisuje oczyszczanie KIF1A(1-393LZ), członka rodziny kinezyny-3, przy użyciu systemu ekspresji Sf9-bakulowirusa. Analiza in vitro pojedynczych cząsteczek i wielu silników ślizgowych tych oczyszczonych silników wykazała silne właściwości ruchliwości porównywalne z silnikami z lizatu komórkowego ssaków. W ten sposób system Sf9-bakulowirusa jest podatny na ekspresję i oczyszczanie białka motorycznego będącego przedmiotem zainteresowania.

Analiza pojedynczych cząsteczek oczyszczonych superprocesyjnych silników z rodziny Kinesin-3 Sf9

Prezentujemy protokoły prostych testów mikroprzepływowych filamentów aktynowych, w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, które pozwalają na dokładne monitorowanie poszczególnych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, podczas sekwencyjnego wystawiania ich na działanie różnych roztworów białkowych.

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

Poznaj metodę pomiaru kinetyki wiązania i dysocjacji nukleotydów w cyklu ATP kinezyny przy użyciu fluorescencji o zatrzymanym przepływie i znakowanych nukleotydów. Technika ta pozwala określić stałe szybkościowe.

Zastosowanie fluorescencji o zatrzymanym przepływie i znakowanych nukleotydów do analizy cyklu obrotu ATP kinezyn

Przeglądaj więcej filmów