Układ węchowy jako model do badania wzorców wzrostu i morfologii aksonów in vivo
30 października 2014
Opisujemy protokół znakowania in vivo węchowych neuronów czuciowych za pomocą elektroporacji, a następnie konfokalnego skanowania laserowego lub mikroskopii wielofotonowej w celu wizualizacji morfologii neuronów i ich rozwoju w czasie.
Ogólnym celem tej procedury jest oznakowanie węchowych neuronów czuciowych in vivo w celu wizualizacji morfologii i rozwoju aksonów. Osiąga się to poprzez pierwsze wstrzyknięcie dekstranu sprzężonego z czterema fluorami do pojedynczych węchowych neuronów czuciowych. Drugim krokiem jest odczekanie 24 godzin, aby barwnik mógł rozprzestrzenić się w procesach aksonalnych neuronów czuciowych.
Następnie kijanka jest znieczulana i uzyskuje się trójwymiarowy obraz stosu opuszki węchowej za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Ostatnim krokiem jest wielokrotne badanie znakowanego neuronu u tego samego zwierzęcia w określonych odstępach czasu. Ostatecznie rekonstrukcja morfologii komórkowej pozwala na wizualizację zmian w morfologii aksonów.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak to, w jaki sposób aksony rosną w kierunku docelowych obszarów w przodomózgowiu i jak powstają synapsy. Przed eksperymentem. Upewnij się, że zestaw do elektroporacji składa się z mikroskopu stereoskopowego o dużej odległości roboczej i jest wyposażony w oświetlenie fluorescencyjne i zestawy filtrów do barwnika.
Używany do elektroporacji użyj dedykowanej elektroporacji pojedynczej komórki lub ogólnego generatora impulsów kwadratowych podłączonego do oscyloskopu. Podłącz wyjścia elektroporacyjne do uchwytu na pipety i elektrody do kąpieli. Upewnij się, że zarówno uchwyt pipety, jak i elektroda kąpieli zawierają srebrne druty pokryte cienką warstwą chlorku srebra.
Następnie zamontuj uchwyt na pipety na mikromanipulatorze, aby umożliwić precyzyjne pozycjonowanie. Następnie należy wyprodukować mikropipety do elektroporacji z kapilarnami ze szkła krzemianowego z wewnętrznym żarnikiem. Ustaw parametry mikropipety polarnej, aby uzyskać dłuższą końcówkę i mniejszy otwór końcówki mikropipeta o wysokiej rezystancji pipety do elektroporacji pojedynczej komórki.
Następnie zmierz rezystancję pipety bezpośrednio za pomocą dedykowanej pojedynczej kuwety elektroporowanej. W tej procedurze rozpuść dekstran sprzężony z fluorem czteroma w dzwonie żaby w stężeniu trzech milimolowych. Podzielić ten roztwór podstawowy na małe porcje i przechowywać ten do wykorzystania w przyszłości w zamrażarce.
Następnie napełnij mikropipetę od jednego do pięciu mikrolitrów roztworu dekstranu. Ostrożnie potrząśnij mikropipetą, aby usunąć resztki pęcherzyków powietrza z końcówki pipety. Następnie zamontuj mikropipetę w uchwycie na pipety.
Upewnij się, że srebrny drut wewnątrz pipety styka się z roztworem barwnika. Teraz umieść mały kawałek tkanki na szalce Petriego i zalej go niewielką ilością wody zawierającej 0,02% trików. Następnie znieczulij kijankę przed metamorfią w wodzie zawierającej 0,02% trica.
Potwierdź prawidłowe znieczulenie, dotykając go i upewniając się, że nie reaguje. Następnie ostrożnie przenieś kijankę na pokrytą tkanką szalkę Petriego. Upewnij się, że elektroda styka się z mokrą tkanką i umieść końcówkę mikropipety blisko narządu węchowego kijanki za pomocą mikromanipulatora.
Następnie wniknij w skórę pokrywającą narząd węchu. Za pomocą końcówki pipety ostrożnie wsuń końcówkę do centralnie położonej warstwy neuronu czuciowego głównego nabłonka węchowego lub nabłonka nosa MRO. Teraz wyzwól dodatnie impulsy napięcia kwadratowego, aby przenieść barwnik do neuronów czuciowych, stosując pojedynczy biegun napięcia lub ciągi wielu impulsów.
Następnie zwizualizuj udane wytłaczanie barwnika i elektroporację za pomocą stereoskopowego mikroskopu fluorescencyjnego. Barwnik szybko rozprzestrzenia się w ciele komórki i dendrytuje po udanej elektroporacji. Po powtórzeniu procedur dla drugiego narządu węchowego kijanki, przenieś kijankę do zlewki wypełnionej świeżą wodą w celu odzyskania i pozwól, aby elektroporowany barwnik rozprzestrzenił się do neuronów czuciowych i opuszki węchowej.
Co najmniej 24 godziny po elektroporacji znieczulić kijankę w wodzie zawierającej 0,02% trica. Następnie ostrożnie przenieś kijankę do komory obrazowania. Wytnij mały prostokąt z paska paramu.
Następnie przykryj kijankę paramem, pozostawiając przednią głowę ogonową przez wycięte okienko. Przymocuj param za pomocą igieł do naczynia, nie uszkadzając kijanki i upewnij się, że kijanka jest zanurzona w wystarczającej ilości wody zawierającej 0,02% Trica. Następnie zamontuj komorę obrazowania na stoliku pionowego mikroskopu wielofotonowego lub mikroskopu konfokalnego.
Uzyskaj trójwymiarowy stos obrazów opuszki węchowej i upewnij się, że procedura obrazowania nie przekracza 10 do 15 minut. Następnie włóż kijankę z powrotem do normalnej wody w osobnym zbiorniku i zapobiegaj jej ekspozycji na światło. Na tym zdjęciu cztery pasma pokładowe sprzężone z różnymi czwórkami fluorowymi zostały wyelektroporowane w czterech odległych miejscach narządu węchowego, bocznej oznaczonej kolorem zielonym, pośredniej oznaczonej żółtym przyśrodkowym oznaczonym na czerwono i narządzie nosowym lemieszowym oznaczonym kolorem pomarańczowym.
Pozwala to na wizualizację dodatkowej opuszki węchowej i trzech głównych pól projekcyjnych głównej opuszki węchowej. Obraz ten przedstawia trójwymiarowe rekonstrukcje różnych aksonalnych wzorców wzrostu pojedynczych węchowych neuronów czuciowych nałożonych na strukturę opuszki węchowej, a oto przykład pojedynczego aksonu węchowego neuronu czuciowego wystającego do opuszki węchowej i tworzącego arboryzację kępkową w kulistym kłębuszkowym. Jak widać tutaj w Opus Levu, aksony te rozwidlają się regularnie przed połączeniem z jednym, dwoma lub wieloma gmerami.
Jest to reprezentatywny przykład pojedynczego węchowego neuronu czuciowego wielokrotnie badanego za pomocą obrazowania poklatkowego in vivo, wykazującego ciągłe zmiany w morfologii aksonów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oznaczać węchowe neurony czuciowe za pomocą elektroporacji i jak monitorować ich rozwój za pomocą obrazowania poklatkowego in vivo.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół dotyczący in vivo znaczenia neuronów czuciowych wzrokowych z wykorzystaniem elektroporacji, poprzedzony technikami obrazowania takimi jak konfokalne skanowanie laserowe i mikroskopia multifotonowa. Metoda ta pozwala na wizualizację morfologii neuronów i ich rozwoju w czasie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Techniki obrazowania
Tło
- Rozumienie neuronów czuciowych wzrokowych jest kluczowe dla poznania rozwoju neuronów.
- Elektroporacja jest techniką stosowaną do wprowadzania substancji do komórek.
- Metody obrazowania takie jak mikroskopia multifotonowa umożliwiają szczegółową wizualizacje struktur neuronowych.
- To badanie koncentruje się na zmianach morfologicznych neuronów w czasie.
Cel badania
- Aby oznaczyć neurony czuciowe wzrokowe in vivo w celu przeprowadzenia badań morfologicznych.
- Aby wizualizować wzrost aksonów i tworzenie synaps.
- Aby zrozumieć dynamikę rozwoju neuronów w żywym organizmie.
Zastosowanie metod
- Elektroporacja neuronów czuciowych wzrokowych z wykorzystaniem fluoro four coupled dextran.
- Wizualizacja ziarnistka węchowego za pomocą mikroskopi multifotonowej.
- Wizualizacja w czasie rzeczywistym w celu monitorowania zmian w morfologii aksonów.
- Zastosowanie znieczulenia w celu przygotowania kijanek do procedur obrazowania.
Główne wyniki
- Udało się osiągnąć pomyślne znaczenie neuronów czuciowych wzrokowych.
- Uzyskano trójwymiarowe rekonstrukcje wzorców wzrostu aksonów.
- Zdokumentowano ciągłe zmiany w morfologii aksonów w czasie.
- Metoda zapewnia wgląd w to, jak aksony nawigują w kierunku regionów docelowych.
Wnioski
- Protokół skutecznie umożliwia badanie morfologii neuronów in vivo.
- To podejście może pomóc odpowiedzieć na fundamentalne pytania w neuronauce.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie do badania rozwoju synaps.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables direct visualization of axonal growth and morphological dynamics in a living vertebrate model, providing a physiologically relevant system for studying neuronal wiring mechanisms. By allowing longitudinal tracking of single axons in vivo, it supports mechanistic de-risking in target validation for neurodevelopmental disorders. The approach offers predictive value in assessing compound effects on axonal guidance and synaptic integration early in discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of axonal growth pathways and guidance cue functionality in a native tissue context.
- Operational Value: Provides a reproducible method to validate targets involved in neurite outgrowth and synaptic formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative morphological readouts such as axon length, branching patterns, and arborization complexity.
- Operational Value: Supports assay standardization through standardized electroporation and imaging parameters across time points.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers a disease-relevant system to model axonal regeneration defects seen in neurodegenerative conditions.
- Operational Value: Facilitates preclinical continuity by enabling longitudinal assessment of axonal repair or degeneration.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization by providing structural and functional readouts on neuronal connectivity.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing how axons navigate toward olfactory bulb targets under experimental perturbations.
- Screening: Enables quantitative assessment of compound effects on axonal morphology through time-lapse imaging.
- Analytics: Delivers high-content morphological data including bifurcation frequency, terminal arborization, and growth cone dynamics.
- Translational Research: Connects to preclinical models by demonstrating conserved axonal growth mechanisms in amphibian and mammalian systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying neuronal development across multiple neurotherapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in axonal guidance hypotheses through direct in vivo observation.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized electroporation parameters and imaging intervals.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early structural biomarkers of neuroactive compound activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on axonal integrity and connectivity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, electroporation, and multiphoton microscopy.
- Depends on specialized equipment including fluorescence stereo microscope and upright multiphoton or confocal system.
- Necessitates cross-team standardization for consistent tadpole staging, anesthesia, and image acquisition.
- Involves adaptation considerations when translating to other model systems or neuronal subtypes.
- Limited by the need for prolonged imaging sessions and potential phototoxicity over longitudinal studies.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:20
Preparation of Instruments and Pipette Fabrication
2:43
Preparation of Electroporation Solution
3:32
Electroporation of Fluorophore-coupled Dextrans
5:27
Mounting Animals for In Vivo Visualization of Cells and Axonal Processes
6:44
Results: Visualizing Olfactory Axon Projections in the Excised Olfactory Bulb
8:05
Conclusion
