Układ węchowy jako model do badania wzorców wzrostu i morfologii aksonów in vivo

Ogólnym celem tej procedury jest oznakowanie węchowych neuronów czuciowych in vivo w celu wizualizacji morfologii i rozwoju aksonów. Osiąga się to poprzez pierwsze wstrzyknięcie dekstranu sprzężonego z czterema fluorami do pojedynczych węchowych neuronów czuciowych. Drugim krokiem jest odczekanie 24 godzin, aby barwnik mógł rozprzestrzenić się w procesach aksonalnych neuronów czuciowych.

Następnie kijanka jest znieczulana i uzyskuje się trójwymiarowy obraz stosu opuszki węchowej za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Ostatnim krokiem jest wielokrotne badanie znakowanego neuronu u tego samego zwierzęcia w określonych odstępach czasu. Ostatecznie rekonstrukcja morfologii komórkowej pozwala na wizualizację zmian w morfologii aksonów.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak to, w jaki sposób aksony rosną w kierunku docelowych obszarów w przodomózgowiu i jak powstają synapsy. Przed eksperymentem. Upewnij się, że zestaw do elektroporacji składa się z mikroskopu stereoskopowego o dużej odległości roboczej i jest wyposażony w oświetlenie fluorescencyjne i zestawy filtrów do barwnika.

Używany do elektroporacji użyj dedykowanej elektroporacji pojedynczej komórki lub ogólnego generatora impulsów kwadratowych podłączonego do oscyloskopu. Podłącz wyjścia elektroporacyjne do uchwytu na pipety i elektrody do kąpieli. Upewnij się, że zarówno uchwyt pipety, jak i elektroda kąpieli zawierają srebrne druty pokryte cienką warstwą chlorku srebra.

Następnie zamontuj uchwyt na pipety na mikromanipulatorze, aby umożliwić precyzyjne pozycjonowanie. Następnie należy wyprodukować mikropipety do elektroporacji z kapilarnami ze szkła krzemianowego z wewnętrznym żarnikiem. Ustaw parametry mikropipety polarnej, aby uzyskać dłuższą końcówkę i mniejszy otwór końcówki mikropipeta o wysokiej rezystancji pipety do elektroporacji pojedynczej komórki.

Następnie zmierz rezystancję pipety bezpośrednio za pomocą dedykowanej pojedynczej kuwety elektroporowanej. W tej procedurze rozpuść dekstran sprzężony z fluorem czteroma w dzwonie żaby w stężeniu trzech milimolowych. Podzielić ten roztwór podstawowy na małe porcje i przechowywać ten do wykorzystania w przyszłości w zamrażarce.

Następnie napełnij mikropipetę od jednego do pięciu mikrolitrów roztworu dekstranu. Ostrożnie potrząśnij mikropipetą, aby usunąć resztki pęcherzyków powietrza z końcówki pipety. Następnie zamontuj mikropipetę w uchwycie na pipety.

Upewnij się, że srebrny drut wewnątrz pipety styka się z roztworem barwnika. Teraz umieść mały kawałek tkanki na szalce Petriego i zalej go niewielką ilością wody zawierającej 0,02% trików. Następnie znieczulij kijankę przed metamorfią w wodzie zawierającej 0,02% trica.

Potwierdź prawidłowe znieczulenie, dotykając go i upewniając się, że nie reaguje. Następnie ostrożnie przenieś kijankę na pokrytą tkanką szalkę Petriego. Upewnij się, że elektroda styka się z mokrą tkanką i umieść końcówkę mikropipety blisko narządu węchowego kijanki za pomocą mikromanipulatora.

Następnie wniknij w skórę pokrywającą narząd węchu. Za pomocą końcówki pipety ostrożnie wsuń końcówkę do centralnie położonej warstwy neuronu czuciowego głównego nabłonka węchowego lub nabłonka nosa MRO. Teraz wyzwól dodatnie impulsy napięcia kwadratowego, aby przenieść barwnik do neuronów czuciowych, stosując pojedynczy biegun napięcia lub ciągi wielu impulsów.

Następnie zwizualizuj udane wytłaczanie barwnika i elektroporację za pomocą stereoskopowego mikroskopu fluorescencyjnego. Barwnik szybko rozprzestrzenia się w ciele komórki i dendrytuje po udanej elektroporacji. Po powtórzeniu procedur dla drugiego narządu węchowego kijanki, przenieś kijankę do zlewki wypełnionej świeżą wodą w celu odzyskania i pozwól, aby elektroporowany barwnik rozprzestrzenił się do neuronów czuciowych i opuszki węchowej.

Co najmniej 24 godziny po elektroporacji znieczulić kijankę w wodzie zawierającej 0,02% trica. Następnie ostrożnie przenieś kijankę do komory obrazowania. Wytnij mały prostokąt z paska paramu.

Następnie przykryj kijankę paramem, pozostawiając przednią głowę ogonową przez wycięte okienko. Przymocuj param za pomocą igieł do naczynia, nie uszkadzając kijanki i upewnij się, że kijanka jest zanurzona w wystarczającej ilości wody zawierającej 0,02% Trica. Następnie zamontuj komorę obrazowania na stoliku pionowego mikroskopu wielofotonowego lub mikroskopu konfokalnego.

Uzyskaj trójwymiarowy stos obrazów opuszki węchowej i upewnij się, że procedura obrazowania nie przekracza 10 do 15 minut. Następnie włóż kijankę z powrotem do normalnej wody w osobnym zbiorniku i zapobiegaj jej ekspozycji na światło. Na tym zdjęciu cztery pasma pokładowe sprzężone z różnymi czwórkami fluorowymi zostały wyelektroporowane w czterech odległych miejscach narządu węchowego, bocznej oznaczonej kolorem zielonym, pośredniej oznaczonej żółtym przyśrodkowym oznaczonym na czerwono i narządzie nosowym lemieszowym oznaczonym kolorem pomarańczowym.

Pozwala to na wizualizację dodatkowej opuszki węchowej i trzech głównych pól projekcyjnych głównej opuszki węchowej. Obraz ten przedstawia trójwymiarowe rekonstrukcje różnych aksonalnych wzorców wzrostu pojedynczych węchowych neuronów czuciowych nałożonych na strukturę opuszki węchowej, a oto przykład pojedynczego aksonu węchowego neuronu czuciowego wystającego do opuszki węchowej i tworzącego arboryzację kępkową w kulistym kłębuszkowym. Jak widać tutaj w Opus Levu, aksony te rozwidlają się regularnie przed połączeniem z jednym, dwoma lub wieloma gmerami.

Jest to reprezentatywny przykład pojedynczego węchowego neuronu czuciowego wielokrotnie badanego za pomocą obrazowania poklatkowego in vivo, wykazującego ciągłe zmiany w morfologii aksonów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oznaczać węchowe neurony czuciowe za pomocą elektroporacji i jak monitorować ich rozwój za pomocą obrazowania poklatkowego in vivo.