Metody transfekcji neuronalnej

Transfekcja - transfer materiału genetycznego do komórek ssaków - jest cennym narzędziem, które pozwala naukowcom na genetyczne manipulowanie neuronami i tkanką neuronalną. Unikalne właściwości delikatnych komórek sprawiają, że transfekcja jest wyzwaniem i wymaga specjalistycznych technik.

W tym filmie omówiono zasady transfekcji neuronów i przedstawiono strategie powszechnie stosowane w tych komórkach, w tym nukleofekcję, transfekcję biolistyczną i transdukcję wirusa. Na koniec omówimy zastosowania technik transfekcji w badaniach nad neurobiologią komórkową i molekularną.

Zacznijmy od przyjrzenia się, jak działa transfekcja. Podczas gdy materiał genetyczny może być dostarczany w bliskiej odległości od hodowanej komórki poprzez dodanie go do otaczającej pożywki, nukleotydy nie mogą skutecznie przenikać przez błony komórkowe.

Wszystkie protokoły transfekcji są zaprojektowane tak, aby umożliwić materiałowi genetycznemu ominięcie tej bariery. Nukleotydy, które blokują produkcję białek, takie jak wyciszanie RNA, mogą natychmiast pełnić swoją funkcję po wejściu do cytoplazmy. Jednak konstrukty oparte na DNA muszą zostać przetransportowane do jądra w celu translacji, zanim rozpocznie się synteza białek.

W dzielących się komórkach rozpad otoczki jądrowej podczas mitozy może spowodować włączenie transfekowanego DNA do reformujących się jąder komórek potomnych. Ponieważ większość hodowanych neuronów to komórki postmitotyczne lub niedzielące się, w celu skutecznego wywołania ekspresji genów wymagane są wyspecjalizowane protokoły transfekcji.

Zacznijmy nasz przegląd tych protokołów od nukleofekcji. Technika ta wykorzystuje połączenie indukowanego pola elektrycznego i odczynników chemicznych, które działają razem, tworząc przejściowe, przypominające pory struktury zarówno w błonach komórkowych, jak i jądrowych. Ponieważ nukleotydy są naładowane, pole elektryczne również napędza ruch DNA przez pory.

Aby przeprowadzić tę procedurę, neurony w zawiesinie zbiera się w postaci osadu przez odwirowanie przed ponownym zawieszeniem w komercyjnym odczynniku do nukleofekcji. Mieszanina komórek jest następnie łączona z oczyszczonym DNA i przenoszona do kuwety elektroporacyjnej, która zawiera dwie aluminiowe płytki, które nawiązują kontakt elektryczny z aparatem Nucleofector. To urządzenie dostarcza serię szybkich impulsów elektrycznych, których liczba i czas trwania są dostosowywane w zależności od typu ogniwa. Po nukleofekcji komórki można rozcieńczyć w pożywce hodowlanej i posiać w celu dalszego wzrostu.

Alternatywnie, technika pistoletu genowego przebija się przez bariery transfekcyjne, wystrzeliwując pociski przenoszące materiał genetyczny zarówno przez błony komórkowe, jak i jądrowe.

Aby wytworzyć pociski do pistoletów genowych, DNA kodujące interesujący cię gen jest wytrącane na koralikach w skali mikronów, zwykle składających się ze złota. Po 10 minutach inkubacji kulki są myte i przenoszone do rurki. Rurka jest następnie obracana w miarę wysychania roztworu, co powoduje równomierną powłokę kulek. Następnie rurka jest cięta na naboje i ładowana do pistoletu. Zasilane gazem dostarczanie ładunku genetycznego może być przeprowadzone na komórkach rosnących na standardowych płytkach hodowlanych za pomocą prostego pociągnięcia za spust.

Wreszcie, transdukcja wirusa wykorzystuje cykl życiowy wirusa do dostarczania obcego materiału genetycznego do jądra. RNA kodujące gen będący przedmiotem zainteresowania jest pakowane w zmodyfikowane retrowirusy znane jako wektory lentiwirusowe, które dostają się do komórek docelowych poprzez wiązanie się ze specyficznymi białkami błonowymi, wywołując zdarzenie fuzji błonowej. Wirusowe RNA jest następnie odwrotnie transkrybowane do komplementarnej nici DNA, która jest transportowana do jądra.

Przed rozpoczęciem tej procedury należy pamiętać, że wirusy mogą infekować komórki w twoim ciele, a także te w twoim naczyniu, dlatego przestrzeganie wytycznych dotyczących bezpieczeństwa jest niezwykle ważne.

Pierwszym krokiem jest wygenerowanie cząsteczek lentiwirusa przenoszących interesujący Cię gen. Osiąga się to poprzez ekspresję elementów budulcowych wirusa w ludzkiej linii komórkowej zoptymalizowanej do produkcji wirusa, takiej jak komórki 293T. Aby uniknąć niepotrzebnego rozprzestrzeniania się zmodyfikowanych wirusów, geny potrzebne do ich złożenia są przechowywane oddzielnie od wektora przenoszenia, którego sekwencja zostanie zawarta w cząsteczce zakaźnej.

Potrzeba około 2 dni, aby w pełni złożone wirusy zostały uwolnione do pożywki hodowlanej, gdzie można je zebrać i zagęścić przez ultrawirowanie. Następnie określa się odpowiednie stężenie lub miano wirusa, oceniając powodzenie transdukcji w testowej linii komórkowej. Wektor lentiwirusowy jest następnie dodawany do docelowej hodowli neuronalnej i zwykle inkubowany przez 24 do 48 godzin, aby upewnić się, że doszło do infekcji.

Teraz, gdy jesteś już zaznajomiony z popularnymi technikami transfekcji, ta, której użyjesz, będzie zależeć od konkretnych celów twoich eksperymentów. Spójrzmy na kilka przykładów.

Po pierwsze, obserwacja dojrzewania neuronów w kulturze pozwala na szczegółową analizę zmian morfologicznych, które są ważne dla połączeń neuronalnych, takich jak tworzenie się kolców dendrytycznych. Aby zobrazować morfologię komórek w czasie, naukowcy wykorzystali nukleofekcję do dostarczenia białka fluorescencyjnego do hodowanych neuronów. W tym przypadku znakowane fluorescencyjnie białko tubuliny zostało transfekowane do podzbioru komórek, co pozwoliło na szczegółową analizę procesów komórkowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ponieważ poziom ekspresji utrzymywał się przez całe życie neuronu, analizę morfologiczną można było przeprowadzać przez co najmniej miesiąc w hodowli.

Transfekcja może być również wykorzystana do zbadania wpływu określonych mutacji genetycznych na funkcję neuronów. Pistolet genowy może być używany do dostarczania DNA kodującego dzikie lub zmutowane wersje białka, a krótkoterminowy wpływ na biologię komórkową można ocenić, na przykład poprzez rejestrację wypalania neuronów za pomocą klamry.

Wreszcie, powszechną strategią testowania funkcji genu jest obserwacja, co dzieje się z komórkami, gdy jego ekspresja jest zablokowana. W tych eksperymentach wektory lentiwirusowe mogą być wykorzystane do dostarczania wyciszających konstruktów RNA, które zapobiegają syntezie białek. W tym eksperymencie knockdown genów związanych z chorobą Parkinsona prowadzi do znacznego spadku żywotności komórek.

Właśnie obejrzeliście wprowadzenie JoVE do transfekcji neuronów. W tym filmie przedstawiliśmy zasady transfekcji neuronów, a także procedury i zastosowania dla trzech popularnych strategii transfekcji.

Dzięki za oglądanie!