Metody transfekcji neuronów

Transfekcja – przenoszenie materiału genetycznego do komórek ssaków – jest cennym narzędziem, które pozwala naukowcom na genetyczną manipulację neuronami i tkanką neuronalną. Wyjątkowe właściwości tych delikatnych komórek sprawiają, że transfekcja jest zadaniem trudnym i wymaga zastosowania specjalistycznych technik.

W niniejszym filmie omówione zostaną zasady transfekcji neuronów oraz przedstawione zostaną strategie powszechnie stosowane w przypadku tych komórek, w tym nukleofekcja, transfekcja biolistyczna oraz transdukcja wirusowa. Na koniec omówimy zastosowania technik transfekcji w badaniach z zakresu neuronauki komórkowej i molekularnej.

Zacznijmy od omówienia mechanizmu transfekcji. Chociaż materiał genetyczny można dostarczyć w bezpośrednie sąsiedztwo hodowanej komórki, dodając go do otaczającego medium, nukleotydy nie mogą efektywnie przenikać przez błony komórkowe.

Wszystkie protokoły transfekcji są zaprojektowane tak, aby umożliwić materiałowi genetycznemu pokonanie tej bariery. Nukleotydy blokujące produkcję białek, takie jak siRNA, mogą natychmiast pełnić swoją funkcję po dostaniu się do cytoplazmy. Jednak konstrukty oparte na DNA muszą zostać przetransportowane do jądra komórkowego w celu translacji, zanim rozpocznie się synteza białek.

W komórkach dzielących się rozpad otoczki jądrowej podczas mitozy może prowadzić do wbudowania przetransfekowanego DNA do reformujących się jąder komórek potomnych. Ponieważ większość hodowanych neuronów to komórki postmitotyczne – czyli niedzielące się – do skutecznego indukowania ekspresji genów wymagane są specjalistyczne protokoły transfekcji.

Przegląd tych protokołów rozpoczniemy od nukleofekcji. Technika ta wykorzystuje połączenie indukowanego pola elektrycznego i odczynników chemicznych, które wspólnie tworzą przejściowe struktury przypominające pory w błonach komórkowych oraz jądrowych. Ponieważ nukleotydy są naładowane, pole elektryczne wymusza również ruch DNA przez pory.

Aby przeprowadzić tę procedurę, neurony w zawiesinie są zbierane w formie osadu poprzez wirowanie przed ponownym zawieszeniem w komercyjnym odczynniku do nukleofekcji. Następnie mieszaninę komórek łączy się z oczyszczonym DNA i przenosi do kuwety do elektroporacji, która posiada dwie aluminiowe płyty zapewniające kontakt elektryczny z aparatem do nukleofekcji. Urządzenie to generuje serię szybkich impulsów elektrycznych, których liczba i czas trwania są dostosowane do rodzaju komórek. Po nukleofekcji komórki można rozcieńczyć w pożywce hodowlanej i wysiać w celu dalszego wzrostu.

Alternatywnie, technika biolistyki (gene gun) pozwala przełamać bariery transfekcyjne poprzez wystrzeliwanie mikropocisków przenoszących materiał genetyczny przez błony komórkowe i jądrowe.

Aby przygotować pociski do biolistyki, DNA kodujące interesujący gen poddaje się wytrącaniu na koralikach w skali mikronowej, zazwyczaj wykonanych ze złota. Po 10 minutowej inkubacji koraliki są płukane i przenoszone do probówek. Następnie probówki są obracane podczas wysychania roztworu, co prowadzi do uzyskania jednolitej powłoki koralików. W dalszej kolejności probówki są cięte na wkłady i ładowane do urządzenia. Dostarczenie ładunku genetycznego za pomocą napędu gazowego może być przeprowadzone na komórkach hodowanych na standardowych płytkach hodowlanych poprzez proste naciśnięcie spustu.

Na koniec, transdukcja wirusowa wykorzystuje cykl życiowy wirusa do dostarczenia obcego materiału genetycznego do jądra komórkowego. RNA kodujące interesujący nas gen jest pakowane do zmodyfikowanych retrowirusów, znanych jako wektory lentiwirusowe, które wnikają do komórek docelowych poprzez wiązanie się ze specyficznymi białkami błonowymi, co wywołuje fuzję błon. Wirusowe RNA jest następnie odwrotnie transkrybowane do komplementarnej nici DNA, która jest transportowana do jądra.

Przed rozpoczęciem tej procedury należy pamiętać, że wirusy mogą infekować zarówno komórki organizmu, jak i komórki w naczyniu hodowlanym, dlatego niezwykle ważne jest przestrzeganie zasad bezpieczeństwa.

Pierwszym krokiem jest wytworzenie cząstek lentiwirusowych przenoszących interesujący nas gen. Osiąga się to poprzez ekspresję elementów budulcowych wirusa w ludzkiej linii komórkowej zoptymalizowanej pod kątem produkcji wirusów, takiej jak komórki 293T. Aby uniknąć niekontrolowanego rozprzestrzeniania się zmodyfikowanych wirusów, geny niezbędne do ich montażu są utrzymywane oddzielnie od wektora transferowego, którego sekwencja zostanie włączona do zakaźnej cząstki.

W pełni zmontowane wirusy są uwalniane do pożywki hodowlanej w ciągu około 2 dni, skąd mogą zostać zebrane i skoncentrowane za pomocą ultrawirowania. Następnie, poprzez ocenę skuteczności transdukcji w testowej linii komórkowej, określa się odpowiednie stężenie, czyli miano wirusa. Wektor lentiwirusowy jest następnie dodawany do docelowej hodowli neuronalnej i zazwyczaj inkubowany przez 24 do 48 godzin, aby zapewnić zajście infekcji.

Po zapoznaniu się z powszechnymi technikami transfekcji, wybór konkretnej metody będzie zależał od specyficznych celów przeprowadzanych eksperymentów. Przyjrzyjmy się kilku przykładom.

Na początek, obserwacja dojrzewania neuronów w hodowli pozwala na szczegółową analizę zmian morfologicznych istotnych dla łączności neuronalnej, takich jak tworzenie się kolców dendrytycznych. Aby zwizualizować morfologię komórek w czasie, badacze wykorzystali nukleofekcję do wprowadzenia białka fluorescencyjnego do hodowlanych neuronów. W tym przypadku do podgrupy komórek transfekowano białko tubuliny znakowane fluorescencyjnie, co umożliwiło szczegółową analizę wypustek komórkowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ponieważ poziomy ekspresji były utrzymywane przez cały czas życia neuronu, analizę morfologiczną można było prowadzić przez co najmniej miesiąc w hodowli.

Transfekcję można również wykorzystać do badania wpływu specyficznych mutacji genetycznych na funkcje neuronów. Do wprowadzenia DNA kodującego wersje białka typu dzikiego lub zmutowane można użyć pistoletu genowego, a następnie ocenić krótkoterminowy wpływ na biologię komórki, na przykład poprzez rejestrację wyładowań neuronów metodą patch-clamp.

Ostatnią powszechną strategią testowania funkcji genu jest obserwacja zmian zachodzących w komórkach po zablokowaniu jego ekspresji. W takich eksperymentach można wykorzystać wektory lentiwirusowe do dostarczenia konstruktów wyciszającego RNA, które zapobiegają syntezie białka. W tym doświadczeniu wyciszenie genów związanych z chorobą Parkinsona prowadzi do znacznego spadku żywotności komórek.

Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do transfekcji neuronów. W tym filmie przedstawiliśmy zasady transfekcji neuronów, a także procedury i zastosowania trzech powszechnych strategii transfekcji.

Dziękujemy za oglądanie!