Name: Automatyzacja eksperymentów ChIP-seq w celu wygenerowania profili epigenetycznych na 10 000 komórek HeLa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę ChIP-seq dla badań epigenetycznych przy użyciu komórek HeLa. Technologia ta umożliwia generowanie profili modyfikacji histonowych z próbek zawierających zaledwie 10 000 komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant BLUERPINT EU (BLUEPRINT – A BLUEPRINT of Haematopoietic Epigenomes). Dziękujemy również Regionowi Walonii (DG06) za wsparcie finansowe.

1. Standardowe eksperymenty ChIP
<ol>
	<li>Zbiór komórek i sieciowanie białko-DNA.
	<ol>
		<li>Hodować komórki HeLa-S3 do osiągnięcia konfluencji 80%-90%. Usunąć pożywkę hodowlaną, dwukrotnie przemyć naczynie 10 ml 1x soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) i dodać Trypsynę-EDTA (1x) do płytki z hodowlą. Inkubować przez maksymalnie 2 min, aby odlepić komórki od naczynia. Zebrać komórki i dwukrotnie przemyć 10 ml PBS. 
		UWAGA: Dłuższy czas inkubacji doprowadzi do uszkodzenia komórek.</li>
		<li>Wirować komórki przez 5 min przy 500 x g i resuspender w 20 ml PBS. Następnie przystąpić do liczenia komórek.</li>
		<li>Wirować komórki przez 5 min przy 500 x g, odrzucić nadsącz i dodać 500 μl PBS. Optymalna liczba komórek dla etapu fiksacji to 10 milionów komórek na 500 μl PBS.</li>
		<li>Do każdej porcji 500 μl zawiesiny komórkowej dodać 13,5 μl świeżego 37% formaldehydu. Fiksować komórki przez 8 min w RT.</li>
		<li>Dodać 57 μl 1,25 M roztworu glicyny, aby zatrzymać fiksację. Inkubować przez 5 min w RT, stale mieszając za pomocą delikatnego wortexowania. Od tego momentu pracować na lodzie.</li>
		<li>Wirować komórki przy 500 x g przez 5 min w 4 °C i usunąć nadsącz, nie naruszając granulatu komórkowego.</li>
		<li>Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml PBS. Delikatnie usunąć nadsącz i przechowywać granulat komórkowy na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liza komórek i fragmentacja chromatyny
	<ol>
		<li>Do granulatu komórkowego dodać 10 ml schłodzonego na lodzie buforu do lizy iL1 (optymalny stosunek to 1 ml buforu do lizy na 1 milion komórek). Kilkukrotnie pipetować w górę i w dół, a następnie inkubować przez 10 min w 4 °C przy delikatnym mieszaniu.</li>
		<li>Wirować lizat przez 5 min przy 500 x g i 4 °C. Odrzucić nadsącz.</li>
		<li>Do lizatów dodać 10 ml schłodzonego na lodzie buforu do lizy iL2 i delikatnie wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół. Inkubować lizaty przez 10 min w 4 °C.</li>
		<li>Wirować przez 5 min przy 500 x g i 4 °C i odrzucić nadsącz.</li>
		<li>Przygotować kompletny bufor do fragmentacji, dodając 200x koktajl inhibitorów proteaz (PIC) do buforu do fragmentacji iS1. Przechowywać bufor na lodzie przez 5 min, a następnie kontynuować pracę na lodzie. Do każdego granulatu 10 milionów komórek dodać 1 ml kompletnego buforu do fragmentacji iS1 i delikatnie wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół. Przed sonikacją inkubować próbki na lodzie przez 10 min w celu zmniejszenia lepkości próbki.</li>
		<li>Fragmentować 300 µl porcje chromatyny za pomocą sonikacji w sonikatorze kąpielowym przez 2 do 3 serii po 10 cykli każda. Cykl składa się z 30 s włączenia („ON”) i 30 s wyłączenia („OFF”) przy wysokim ustawieniu mocy. Alternatywnie można użyć urządzenia do piko-sonikacji z krótszym czasem sonikacji: 5 do 10 cykli po 30 s „ON” i 30 s „OFF”. Krótko wortexować i wirować probówki pomiędzy seriami. W przypadku korzystania z innych typów sonikatorów należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi fragmentacji chromatyny.</li>
		<li>Wirować sfragmentowaną chromatynę przy 16 000 x g przez 10 min i zebrać nadsącz do natychmiastowego użycia w etapie IP. Alternatywnie chromatynę można przechowywać w -80 °C do 2 miesięcy do późniejszego wykorzystania.</li>
		<li>Przed etapem immunoprecypitacji przeanalizować wydajność fragmentacji chromatyny, używając żeli agarozowych 1-1,5% TAE lub bioanalizatora. Optymalna wielkość fragmentów chromatyny mieści się w zakresie 100-600 bp.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Eksperymenty ChIP z niską liczbą komórek
<ol>
	<li>Zbiór komórek i sieciowanie DNA-białko
	<ol>
		<li>Hodować komórki HeLa-S3 do konfluencji 80%-90%. Usunąć pożywkę hodowlaną, przemyć naczynie dwukrotnie 10 ml 1x soli fizjologicznej w PBS, a następnie dodać do płytki z hodowlą 1x Trypsynę-EDTA. Inkubować przez maksymalnie 2 min, aby odlepić komórki od naczynia. 
		UWAGA: Dłuższy czas inkubacji doprowadzi do uszkodzenia komórek.</li>
		<li>Zebrać komórki, dodając 1 ml pożywki hodowlanej z surowicą do probówki do wirowania o pojemności 1 ml. Policzyć komórki.</li>
		<li>Wirować komórki przez 5 min przy 500 x g. Dostosować liczbę komórek do poziomu 10 000 komórek na 1 ml pożywki hodowlanej do utrwalania.</li>
		<li>Do każdej probówki dodać 27 μl świeżo przygotowanej 36,5% formaldehydu w celu utrwalenia. Odwrócić probówkę dwa lub trzy razy i inkubować przez 10 min w RT.</li>
		<li>Do próbki dodać 115 μl 1,25 M roztworu glicyny, odwrócić probówkę dwa lub trzy razy i inkubować przez 5 min w RT. Od tego momentu pracować w lodzie.</li>
		<li>Wirować komórki przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Powoli usunąć nadsącz.</li>
		<li>Przemyć komórki 1 ml schłodzonego do temperatury lodowej roztworu HBSS z PIC (200x, stężenie końcowe 1x). Odwrócić probówkę dwa lub trzy razy, aby resuspendować komórki, i wirować przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć nadsącz i przechowywać granulat komórkowy w lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lizy komórkowa i fragmentacja chromatyny
	<ol>
		<li>Dodać 25 μl kompletnego buforu do lizy tL1 (Lysis Buffer tL1 + PIC) na 10 000 komórek i ręcznie wymieszać dno probówki, aby resuspendować komórki. Inkubować w lodzie przez 5 min.</li>
		<li>Do każdej alikwoty zawierającej 10 000 komórek dodać 75 μl kompletnego buforu HBSS (HBSS + PIC).</li>
		<li>Fragmentować 100 μl alikwoty 10 000 komórek poprzez sonikację w 5 seriach po 5 cykli każda. Cykl składa się z 30 s „ON” i 30 s „OFF” przy ustawieniu wysokiej mocy. Alternatywnie można użyć urządzenia do piko-sonikacji z krótszym czasem sonikacji: 5 cykli po 30 s „ON” i 30 s „OFF”. Optymalna wielkość fragmentów chromatyny mieści się w zakresie 100-600 bp. Należy pamiętać, że preparaty chromatyny, typy komórek i różne sonikatory wymagają oddzielnych eksperymentów optymalizujących fragmentację.</li>
		<li>Wirować sfragmentowaną chromatynę przy 14 000 x g przez 10 min, aby usunąć materiał nierozpuszczalny i zebrać nadsącz do natychmiastowego użycia w etapie IP. Alternatywnie można przechowywać chromatynę w temperaturze -80 °C do 2 miesięcy do późniejszego wykorzystania.</li>
		<li>Przed etapem immunoprecypitacji przeanalizować wydajność fragmentacji chromatyny, używając żeli agarozowych 1-1,5% TAE lub bioanalizatora. Przed analizą na żelu agarozowym potraktować próbki RNazą, aby poprawić wizualną ocenę fragmentacji. Optymalna wielkość fragmentów chromatyny mieści się w zakresie 100-600 bp.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Immunoprecypitacja chromatyny i przygotowanie biblioteki
<ol>
	<li>W przypadku standardowych zautomatyzowanych eksperymentów ChIP
	<ol>
		<li>Dodaj 120 μl Buforu ChIP H (Bufor ChIP H + PIC) do 100 μl rozdrobnionej chromatyny. Wykorzystaj 200 μl do IP i zachowaj od 2 μl do 20 μl jako próbkę wejściową (input).</li>
		<li>Wybierz zautomatyzowany protokół ChIP 200 μl w urządzeniu automatyzacyjnym. Przepustowość protokołu wynosi od 1 do 16 próbek na jeden cykl.</li>
		<li>Przeprowadź zautomatyzowany eksperyment ChIP, wykorzystując chromatynę odpowiadającą 1-2 milionom komórek oraz 1-2 μg króliczych przeciwciał poliklonalnych klasy ChIP-seq przeciwko H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9/14ac, -H3K36me3 i H3K9me3. Optymalne ilości przeciwciał różnią się w zależności od modyfikacji histonów oraz powinowactwa i specyficzności odpowiedniego przeciwciała.
		<ol>
			<li>Jako przeciwciało kontrolne izotypowe zastosuj równoważne ilości nieimmunologicznego królika IgG. Alternatywnie, jako kontrole ChIP wykorzystaj niepowlekane kuleczki lub specyficznie blokowane przeciwciało. Do każdej reakcji dodaj 20 μl magnetycznych kuleczek powlekanych Proteiną A.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Użyj odczynników z zautomatyzowanego zestawu do histone ChIP-seq, aby przeprowadzić zautomatyzowane eksperymenty ChIP z poliklonalnymi przeciwciałami przeciwko H3K79me3 i -H3K4me2. Użyj idealnych odczynników z zestawu ChIP-seq do przeprowadzenia eksperymentów ChIP z przeciwciałami przeciwko H3K27me3, -H3K4me3, -H3K9ac, -H3K9/14ac, -H3K36me3 i -H3K9me3.</li>
		<li>Wybierz zautomatyzowany protokół ChIP zgodnie z instrukcjami oprogramowania zaimplementowanego w urządzeniu automatyzacyjnym. Ustaw parametry eksperymentu ChIP na 4 h dla etapu powlekania przeciwciałem i 15 h dla etapu immunoprecypitacji. Etap odwrócenia sieciowania odbywa się w urządzeniu automatycznym w temperaturze 65 °C przez 4 h.</li>
		<li>Oczyść DNA po odwróceniu sieciowania w systemie zautomatyzowanym. Wybierz zautomatyzowane protokoły oczyszczania DNA z wykorzystaniem protokołu lub zestawu opartego na magnetycznych kuleczkach. Eluuj DNA w 25 μl wody.</li>
		<li>Oznacz ilościowo immunoprecypitowane DNA, ekstrahując 10% immunoprecypitowanego DNA. Wydajność immunoprecypitowanego DNA zależy od jakości chromatyny i przeciwciała, typu komórek oraz docelowej modyfikacji histonów. Oznacz ilość DNA za pomocą zestawu analitycznego zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Przeanalizuj jakość immunoprecypitowanego DNA za pomocą ilościowego PCR, stosując primery dla co najmniej jednego pozytywnego i jednego negatywnego regionu kontrolnego genomu. Do oceny wzbogaceń ChIP nie wykorzystuj więcej niż 10% całkowitego immunoprecypitowanego DNA.
		<ol>
			<li>Przygotuj reakcje qPCR. Dodaj 10 μl 2x SyberGreen qPCR master mix, 1 μl mieszanki primerów, 1-5 μl immunoprecypitowanego DNA lub DNA wejściowego oraz sterylną wodę do końcowej objętości reakcji 20 µl. Program qPCR obejmuje wstępny etap denaturacji w 95 °C przez 5-10 min, w zależności od dostawcy polimerazy Taq, a temperatury przyłączania powinny być ustawione zgodnie z wybranymi primerami.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Użyj zautomatyzowanych protokołów przygotowania bibliotek kompatybilnych z dostępnymi komercyjnie odczynnikami Illumina do przygotowania bibliotek ChIP-seq, wykorzystując zarówno DNA z ChIP, jak i zachowane DNA wejściowe z tej samej preparacji chromatyny. Do przygotowania biblioteki użyj 10-20 ng immunoprecypitowanego DNA z każdego przeciwciała. Przygotuj do 16 zautomatyzowanych bibliotek na jeden cykl.</li>
		<li>Przeprowadź sekwencjonowanie bibliotek i wygeneruj klastry zgodnie z instrukcjami producenta Illumina. Wykonaj podstawową analizę bioinformatyczną (filtrowanie klastrów, odczyt zasad, itp.) zgodnie ze standardowym schematem Illumina, przefiltruj i dopasuj odczyty do najnowszej wersji genomu ludzkiego (aktualna wersja to GRCh38) za pomocą alignera ELAND. Do wyznaczania piku (peak calling) użyj SICER7 lub MACS8 i przeprowadź dalsze analizy piku za pomocą programu Homer9, BEDTools10 lub innego preferowanego oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku zautomatyzowanych eksperymentów ChIP z małą liczbą komórek
	<ol>
		<li>Dodaj 120 μl kompletnego buforu ChIP tC1 (Bufor ChIP tC1 + PIC) do 100 μl rozdrobnionej chromatyny. Wykorzystaj 200 μl do IP i zachowaj 20 μl jako input.</li>
		<li>Wybierz zautomatyzowany protokół ChIP 200 μl w systemie automatyzacyjnym. Przepustowość protokołu wynosi od 1 do 16 próbek na jeden cykl.</li>
		<li>Przeprowadź zautomatyzowany eksperyment ChIP-seq, wykorzystując zautomatyzowane odczynniki ChIP i przeciwciała klasy ChIP zoptymalizowane do pracy z niskimi ilościami chromatyny. Wykorzystaj chromatynę odpowiadającą 10 000 komórek i 100 000 komórek oraz 0,5 μg przeciwciała przeciwko H3K27me3, 0,25 μg przeciwko -H3K4me3, 0,1 μg przeciwko -H3K27ac, 0,25 μg przeciwko -H3K9me3 (królicze poliklonalne przeciwciała klasy Premium ChIP-seq). Optymalne ilości przeciwciał różnią się w zależności od modyfikacji histonów oraz powinowactwa i specyficzności odpowiedniego przeciwciała.
		<ol>
			<li>Jako przeciwciało kontrolne izotypowe zastosuj równoważną ilość nieimmunologicznego królika IgG. Alternatywnie, jako kontrole ChIP wykorzystaj niepowlekane kuleczki lub specyficznie blokowane przeciwciało. Do każdej reakcji dodaj 10 μl magnetycznych kuleczek powlekanych Proteiną A.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wybierz zautomatyzowany protokół ChIP zgodnie z instrukcjami oprogramowania zaimplementowanego w urządzeniu automatyzacyjnym. Ustaw parametry eksperymentu ChIP na 4 h dla etapu powlekania przeciwciałem i 15 h dla etapu immunoprecypitacji. Etap odwrócenia siecikowania odbywa się w urządzeniu automatycznym w temperaturze 65 °C przez 4 h.</li>
		<li>Oczyść DNA po odwróceniu sieciowania za pomocą kolumienek wirówkowych zgodnie z instrukcjami producenta i eluuj w objętościach od 6 μl do 25 μl wody.</li>
		<li>Oznacz ilość DNA za pomocą komercyjnego zestawu analitycznego. Przeanalizuj wyniki za pomocą qPCR, stosując primery dla pozytywnych i negatywnych regionów kontrolnych, aby ocenić jakość ChIP.</li>
		<li>Użyj zestawu do przygotowania bibliotek z zoptymalizowanymi odczynnikami, aby przygotować biblioteki z niskimi ilościami DNA. Do przygotowania bibliotek użyj 30 pg i 300 pg DNA z ChIP (odpowiednio dla eksperymentów z 10 000 i 100 000 komórek). Przygotuj biblioteki zgodnie z zautomatyzowanym protokołem kompatybilnym z odczynnikami do przygotowania bibliotek. Zautomatyzowana przepustowość przygotowania bibliotek wynosi od 1 do 48 bibliotek na jeden cykl.</li>
		<li>Po naprawie końców dwuniciowych matryc DNA, liguj rozszczepialne adaptory pętli stem-loop zawierające miejsca primerów sekwencjonujących. Po etapie wydłużania DNA, namnóż próbkę za pomocą metody wysokowiernej amplifikacji opisanej w protokole zestawu do przygotowania bibliotek.</li>
		<li>Po amplifikacji biblioteki, oznacz ilościowo i oczyść biblioteki zgodnie z wytycznymi zestawu do przygotowania bibliotek. Uwaga: selekcja rozmiaru po oczyszczaniu nie jest konieczna.</li>
		<li>Przeprowadź sekwencjonowanie bibliotek i wygeneruj klastry zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj podstawową analizę bioinformatyczną (filtrowanie klastrów, odczyt zasad, itp.) zgodnie ze standardowym schematem producenta, przefiltruj i dopasuj odczyty do najnowszej wersji genomu ludzkiego (aktualna wersja to GRCh38) za pomocą alignera ELAND7. Do wyznaczania piku użyj SICER8 lub MACS9 i przeprowadź dalsze analizy piku za pomocą programu Homer, BEDTools10 lub dowolnego preferowanego oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP); konfiguracja mikropłytek; analiza wiązania DNA-białko." src="/files/ftp_upload/52150/52150fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Zrzuty ekranu z oprogramowania pokazujące, jak konfigurować zautomatyzowane eksperymenty ChIP w urządzeniu IP-Star Compact. Oprogramowanie zapewnia elastyczność w wyborze liczby próbek na jeden cykl, a także możliwość zmiany kluczowych parametrów eksperymentalnych (nakładanie przeciwciał, immunoprecypitację i przemywanie) zgodnie z potrzebami badacza. Zautomatyzowana procedura umożliwia równoległe testowanie różnych warunków (i.e., różnych rodzajów i ilości przeciwciał, różnych typów i ilości komórek, a nawet różnych rodzajów i ilości kulek magnetycznych w jednym cyklu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52150/52150fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Protokoły, przygotowanie próbek i układ dla PCR w interfejsie oprogramowania laboratoryjnego. Sprzęt Diagenode." src="/files/ftp_upload/52150/52150fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Zrzuty ekranu z oprogramowania pokazujące, jak skonfigurować zautomatyzowane przygotowanie bibliotek do sekwencjonowania nowej generacji przy użyciu zestawu do bibliotek w systemie automatyzacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52150/52150fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

<ol><li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+%28microChIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).</li>
<li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6, 1656-1668 (2011).</li>
<li>Blecher-Gonen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nature Protocols. 8, 539-554 (2013).</li>
<li>Aldridge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHT-ChIP-seq%3A+a+completely+automated+robotic+protocol+for+high-throughput+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation.</a> Genome Biology. 14, 124(2013).</li>
<li>Farias-Hesson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+library+preparation+for+high-throughput+DNA+sequencing+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicin.%2C+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Semi-automated library preparation for high-throughput DNA sequencing platforms.</a> Journal of Biomedicin., & Biotechnology. 2010, (2010).</li>
<li>Callejas, S., Alvarez, R., Benguria, A., Dopazo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AG-NGS%3A+a+powerful+and+user-friendly+computing+application+for+the+semi-automated+preparation+of+next-generation+sequencing+libraries+using+open+liquid+handling+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">AG-NGS: a powerful and user-friendly computing application for the semi-automated preparation of next-generation sequencing libraries using open liquid handling platforms.</a> BioTechniques. 56, 28-35 (2014).</li>
<li>Zang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clustering+approach+for+identification+of+enriched+domains+from+histone+modification+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data.</a> Bioinformatics. 25, Oxford, England. 1952-1958 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, 137(2008).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Molecular Cell. 38, 576-589 (2010).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics+%28Oxford%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 26, 841-842 (2010).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).</li>
</ol>

Autorzy tego artykułu, w chwili jego pisania, są zatrudnieni przez Diagenode S.A. oraz Diagenode, Inc., producenta opisywanego systemu automatycznego.

Immunoprecypitacja chromatyny, po której następuje sekwencjonowanie, jest obecnie standardową procedurą. W tym miejscu przedstawiono zautomatyzowany protokół ChIP-seq, który może generować profile epigenetyczne chromatyny przy użyciu zaledwie 10 000 komórek materiału wyjściowego.
Automatyzacja testów ChIP i przygotowania bibliotek pozwala na standaryzację procedury optymalizacji ChIP i zmniejszenie zmienności eksperymentalnej. Przedstawiony tutaj system obsługi cieczy eliminuje wiele ręcznych procedur związanych z ChIP, skracając czas pracy wskazówek do zaledwie 30 minut, minimalizuje straty próbki i umożliwia dokładny sekwencjonat ChIP przy zaledwie kilku pikogramach danych wejściowych z biblioteki. Aby osiągnąć udane zautomatyzowane eksperymenty ChIP-seq, kluczowe jest również stosowanie wysokiej jakości preparatów chromatyny ścinanej i przeciwciał klasy ChIP-seq w każdym eksperymencie System wykorzystuje technologię opartą na kulkach magnetycznych i oferuje elastyczność w zakresie zmiany głównych parametrów eksperymentalnych, takich jak czas inkubacji dla etapów powlekania przeciwciałem i immunoprecypitacji lub modyfikacja warunków mycia, umożliwiając badaczowi przeprowadzenie wszystkich niezbędnych eksperymentów w celu optymalizacji ChIP-seq. Zautomatyzowany system jest "otwartą" platformą, która umożliwia również równoległe porównywanie wielu odczynników w celu optymalizacji warunków eksperymentalnych dla każdej pojedynczej linii komórkowej i przeciwciała oraz umożliwia bezpośrednie porównanie różnych typów i stężeń chromatyny, różnych przeciwciał, a nawet różnych typów kulek magnetycznych.
Jednym z ograniczeń zautomatyzowanego systemu jest konieczność automatyzacji wszystkich protokołów w objętościach od 5 μl do 200 μl. Jednak miniaturyzacja eksperymentów w tej zautomatyzowanej platformie umożliwia również oszczędność kosztów odczynników.
Oprócz protokołów opisanych w tym badaniu, system jest elastyczny, a także automatyzuje wiele innych zastosowań opartych na kulkach magnetycznych, takich jak immunoprecypitacja i wychwytywanie metylowanego DNA (technologie MeDIP i MethylCap), immunoprecypitacja hydroksylometylowanego DNA (hMEDIP), sekwencyjna immunoprecypitacja chromatyny (ReChIP), immunoprecypitacja RNA (RNA-IP), konwersja wodorosiarczynów i testy oczyszczania DNA.

Ponieważ technologie sekwencjonowania nowej generacji (NGS) stały się powszechne i bardziej dostępne, podstawową metodą mapowania całego genomu interakcji białko-DNA jest teraz immunoprecypitacja chromatyny, a następnie detekcja NGS (ChIP-seq), która umożliwia odkrycie miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego lub wzorców modyfikacji histonów. ChIP-seq jest korzystny w dostarczaniu danych o wysokiej przepustowości całego genomu, które można wykorzystać do ilościowej i jakościowej analizy interakcji białko-DNA poprzez pomiar wzbogaconych fragmentów DNA. Istnieją jednak pewne wady standardowych eksperymentów ChIP-seq, takie jak trudność w uzyskaniu wystarczającej ilości materiału do stworzenia biblioteki sekwencjonowania.
Eksperymenty ChIP dzielą się na sześć podstawowych etapów, w tym: 1) sieciowanie regionów wiążących białko-DNA, 2) przygotowanie próbki, które obejmuje lizę komórek i ścinanie chromatyny przez sonikację, 3) tworzenie immunokompleksów, 4) wytrącanie immunokompleksów, 5) mycie immunokompleksów, oraz 6) elucję wzbogaconego materiału i analizę za pomocą qPCR i NGS.
Sukces testu ChIP zależy od trzech głównych czynników: dobrego przygotowania chromatyny, ilości antygenu w oryginalnej próbce oraz specyficzności i powinowactwa przeciwciała do pokrewnego antygenu. Głównym ograniczeniem jest wymóg dużej ilości początkowej liczby komórek w celu uzyskania wystarczającej ilości wzbogaconego DNA do stworzenia biblioteki sekwencjonowania. Dla naukowców, którzy pracują z ograniczonymi ilościami próbek, takimi jak próbki z biopsji lub subpopulacje komórek, eksperymenty ChIP-seq są bardzo trudne. Ostatnie badania wykazały, że testy ChIP-seq można wykonywać podczas pracy z małą liczbą komórek1, 2. Firma Diagenode opracowała zrobotyzowany system obsługi cieczy, który może w pełni zautomatyzować eksperymenty z sekwencją ChIP, gdy zaczyna się od ograniczonej liczby komórek.
Automatyzacja zapewnia wiele zalet w porównaniu z ręcznym przygotowywaniem próbek ChIP-seq, ponieważ zmniejsza błędy ludzkie, zmniejsza zmienność i zmniejsza koszty eksperymentów. Opisano półautomatyczne protokoły immunoprecypitacji chromatyny i przygotowania biblioteki, ale żadne z tych badań nie wykazało danych przy użyciu niskiej liczby komórek3, 4, 5, 6.
W tym artykule opisano kompletny zautomatyzowany przepływ pracy zarówno dla testów immunoprecypitacji chromatyny, jak i przygotowania biblioteki w zrobotyzowanym systemie obsługi cieczy, który wykorzystuje technologię opartą na kulkach magnetycznych i który może adresować wiele parametrów w optymalizacji protokołu. W tym przypadku z powodzeniem przeprowadzono zautomatyzowane eksperymenty ChIP-seq na ograniczonej liczbie komórek w celu uproszczenia, standaryzacji i zapewnienia niezawodnego rozwiązania do badania profili epigenetycznych w populacjach małych komórek. Zautomatyzowany protokół ChIP opisany w tym artykule został zoptymalizowany na komórkach HeLa przy użyciu specyficznych przeciwciał histonowych i odczynników, ale przepływ pracy można dostosować do innych linii komórkowych i przeciwciał z odpowiednią optymalizacją eksperymentalną.

<table><tbody><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Technologie życiowe</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd 37%</td><td>Sigma</td><td>F8775-25</td><td></td></tr><tr><td>1,25 M Roztwór glicyny</td><td>Diagenoda</td><td>C01020010</td><td>Składnik idealnego zestawu ChIP-seq</td></tr><tr><td>Bufor do lizy iL1</td><td>Diagenoda</td><td>C01020010</td><td>Składnik idealnego zestawu ChIP-seq</td></tr><tr><td>Bufor do lizy iL2</td><td>Diagenode</td><td>C01020010</td><td>Składnik idealnego zestawu ChIP-seq</td></tr><tr><td>Bufor ścinający iS1</td><td>Diagenode</td><td>C01020010</td><td>Składnik idealnego zestawu ChIP-seq</td></tr><tr><td>Mieszanka inhibitorów proteazy (200x)</td><td>Diagenode</td><td>C01010130</td><td>Składnik zestawu Auto True Micro ChIP</td></tr><tr><td>HBSS (bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej)</td><td>Life technologies</td><td>14175-053</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy tL1</td><td>Diagenode</td><td>C01010130</td><td>Komponent zestawu Auto True Micro ChIP</td></tr><tr><td>Bufor ChIP tC1</td><td>Diagenode</td><td>C01010130</td><td>Składnik zestawu Auto True Micro ChIP</td></tr><tr><td>idealny zestaw ChIP-seq</td><td>Diagneode</td><td>C01010051</td><td></td></tr><tr><td>ChIP-Buffer H</td><td>Diagenode</td><td>C01010020</td><td>Składnik zestawu Auto Histone ChIP-seq</td></tr><tr><td>Auto Histone Zestaw sekwencyjny</td><td>Diagenode</td><td>C01010020</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Auto True Micro ChIP Przeciwciało</td> poliklonalne <td>C01010130</td><td></td><td>Diagenode</td></tr><tr><td>H3K79me3-Klasyczne Przeciwciało</td><td>poliklonalne Diagenode</td><td>C15310068</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3-Klasyczne Przeciwciało poliklonalne</td><td>Diagenode</td><td>C15410069</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3-Klasyczne</td><td></td><td>Przeciwciało</td> poliklonalne C15410030 <td></td></tr><tr><td>H3K4me2-Klasyczne</td><td>Przeciwciało poliklonalne Diagenode</td><td>C15410035</td><td></td></tr><tr><td>H3K9ac-Premium</td><td>Diagenode</td><td>C15410004</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne H3K9/14ac-Premium</td><td>Diagenode</td><td>C15410200</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne H3K36me3-Premium</td><td>Diagenode</td><td>C15410058</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne H3K9me3-Premium</td><td>Diagenode</td><td>C15410193</td><td></td></tr><tr><td>IgG królika</td><td>Kulki paramagnetyczne powlekane C15410206</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Diagenode Białko A Diagenode</td><td>C01010020</td><td></td></tr><tr><td>Auto IPure</td><td>Diagenode</td><td>C03010010</td><td></td></tr><tr><td>MicroChIP Kolumny DiaPure</td><td>Diagenode</td><td>C03040001</td><td></td></tr><tr><td>Universal SyberGreenMaster Mix 1,25 ml</td><td>Diagenode</td><td>DMMLD2D100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Quant-IT dsDNA</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania próbki Illumina do Genomic DNA</td><td>Illumina</td><td>FC-121-3001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Illumina True-seq Zestaw do przygotowania biblioteki ChIP</td><td>Illumina</td><td>IP-202-1012</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania biblioteki MicroPlex</td><td>Diagenode</td><td>C05010010</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do analizy ilościowej Illumina Library</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4844</td><td></td></tr><tr><td>IP-Star Compact&nbsp; Zautomatyzowany system</td><td>Diagenode</td><td>B03000002</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Plus</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Pico</td><td>Diagenode</td><td>B01060001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit system</td><td>Invitrogen</td><td>Q32857</td><td></td></tr><tr><td>Illumina Systemy Hiseq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

automatyzacja eksperymentów chip-seq w celu wygenerowania profili epigenetycznych na 10 000 komórek hela

Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Immunoprecypitacja chromatyny, a następnie sekwencjonowanie nowej generacji (ChIP-seq) jest techniką z wyboru do badania interakcji białko-DNA. ChIP-seq został wykorzystany do mapowania interakcji białko-DNA i przypisywania modyfikacji histonów. Procedura jest żmudna i czasochłonna, a jednym z głównych ograniczeń jest zapotrzebowanie na duże ilości materiału wyjściowego, zwykle miliony komórek. Automatyzacja testów immunoprecypitacji chromatyny jest możliwa, gdy procedura opiera się na wykorzystaniu kulek magnetycznych. Skuteczne zautomatyzowane protokoły immunoprecypitacji chromatyny i przygotowania biblioteki zostały specjalnie zaprojektowane w dostępnym na rynku zrobotyzowanym systemie obsługi cieczy, przeznaczonym głównie do automatyzacji testów epigenetycznych. W pierwszej kolejności przedstawiono walidację zautomatyzowanych testów ChIP-seq przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko różnym modyfikacjom histonów, a następnie optymalizację zautomatyzowanych protokołów przeprowadzania immunoprecypitacji chromatyny i przygotowania biblioteki, zaczynając od niskiej liczby komórek. Celem tych eksperymentów jest dostarczenie cennego narzędzia do przyszłej analizy epigenetycznej określonych typów komórek, subpopulacji i próbek biopsyjnych.

Optymalizacja zautomatyzowanych eksperymentów ChIP-seq dla ośmiu różnych markerów histonowych
W celu pomyślnego opracowania i walidacji zautomatyzowanych protokołów ChIP wybrano przeciwciała klasy ChIP-seq, które zostały wcześniej zwalidowane w manualnych eksperymentach ChIP-Seq (dane nie zostały przedstawione). Do niniejszego badania wybrano następujące przeciwciała klasy ChIP-seq: anty-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9/14ac, -H3K36me3 oraz -H3K9me3. Specyficzność wszystkich przeciwciał klasy ChIP-seq została wcześniej potwierdzona za pomocą techniki dot blot, macierzy peptydowych oraz eksperymentów Western Blot (dane nie zostały przedstawione). Przeprowadzono pilotażowe eksperymenty ChIP-qPCR z zastosowaniem zwiększających się ilości przeciwciał w celu określenia ich czułości (Rysunek 3). Przeanalizowano qPCR z co najmniej dwoma pozytywnymi i dwoma negatywnymi celami kontrolnymi; profile, w których wzbogacenie celu pozytywnego względem negatywnego było ponad pięciokrotne, zakwalifikowano do eksperymentów sekwencjonowania. Ważne jest przeprowadzanie eksperymentów ChIP i ChIP-seq z użyciem wysokiej jakości fragmentowanej chromatyny. Wszystkie eksperymenty ChIP przedstawione w niniejszej publikacji wykonano przy użyciu świeżej chromatyny. Możliwe jest również zamrożenie utrwalonych komórek w temperaturze -80 °C i przystąpienie do przygotowania oraz fragmentacji chromatyny w innym dniu. Jednakże chromatyna przygotowana z zamrożonych utrwalonych komórek może zachowywać się inaczej niż chromatyna przygotowana na świeżo, w związku z czym warunki sonikacji mogą wymagać optymalizacji dla każdej partii chromatyny. Podczas pracy z różnymi typami komórek można stosować bufory do fragmentacji o różnym składzie detergentów (SDS). Typy komórek, takie jak pierwotne linie komórkowe lub komórki hodowane w zawiesinie, są trudne do fragmentacji i wymagają wysokich stężeń SDS (1%), natomiast linie komórkowe łatwe do fragmentacji, takie jak HeLa, wymagają niskich stężeń SDS (0,1%) w buforach do fragmentacji.
<img alt="Wykres analizy modyfikacji histonów; wykres słupkowy porównujący poziomy H3K27me3, H3K9ac, H3K36me3." src="/files/ftp_upload/52150/52150fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Walidacja przeciwciał klasy ChIP przy użyciu systemu automatycznego. ChIP przeprowadzono z zastosowaniem króliczych przeciwciał poliklonalnych przeciwko H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, H3K9/14ac, -H3K36me3 oraz -H3K9me3 na fragmentowanej chromatynie z 1 miliona komórek HeLa-S3, w zależności od modyfikacji histonów. W urządzeniu automatycznym do eksperymentów z mianowania przeciwciał wykorzystano zautomatyzowane protokoły ChIP z objętościami roboczymi 200 µl. W każdym eksperymencie ChIP przetestowano ilości przeciwciał wynoszące 1, 2, 5 i 10 μg, a jako kontrolę negatywną zastosowano 2 μg IgG. Wzbogacenia oceniono za pomocą qPCR. Wyniki przedstawiono jako % inputu (względna ilość immunoprecypitowanego DNA w porównaniu do DNA wejściowego po analizie qPCR). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52150/52150fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Po walidacji i wyznaczeniu optymalnych ilości przeciwciał klasy ChIP do wykorzystania w systemie automatycznym, przeprowadzono zautomatyzowane eksperymenty ChIP-seq w celu wygenerowania profili sekwencjonowania dla każdej modyfikacji histonów (Rysunek 4).
<img alt="Profilemodyfikacji chromatyny; znaki epigenetyczne; metylacja histonów; loci genowe; wizualizacja na wykresie słupkowym." src="/files/ftp_upload/52150/52150fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Profile ChIP-seq histonów wygenerowane przez zautomatyzowane eksperymenty ChIP-seq. Rysunek przedstawia profile ChIP-seq w różnych regionach genomicznych dla H3K4me3, H3K9ac i H3K9/14acH3K4me2 H3K79me3 oraz H3K36me3. 4A pokazuje rozkład piku wzdłuż całego chromosomu X, a 4B rozkład w regionie 75 kb otaczającym gen GAPDH. 4C przedstawia profile H3K27me3, H3K36me3 i H3K4me3 w regionie 500 kb otaczającym gen MYT1, a 4D pokazuje rozkład H3K9me3 w regionie 200 kb otaczającym ZNF12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52150/52150fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wygenerowano profile epigenetyczne dla sześciu różnych modyfikacji histonów związanych z ekspresją genów (H3K4me3, H3K9ac, H3K9/14ac, H3K4me2, H3K79me3 oraz H3K36me3). Rycina 4A przedstawia profile ChIP-seq wzdłuż chromosomu X dla różnych markerów histonowych. Wysoka korelacja pików zaobserwowana pomiędzy 6 różnymi profilami histonowymi wskazuje na zdolność systemu zautomatyzowanego do generowania dokładnych i wiarygodnych danych. Rycina 4B, 4C i 4D przedstawiają rozkład pików dla różnych modyfikacji histonowych w określonych regionach genomicznych.
Zautomatyzowane eksperymenty immunoprecypitacji chromatyny dla próbek obejmujących nawet 200 komórek
Minimalna liczba komórek, którą można wykorzystać w eksperymentach ChIP, zależy od jakości chromatyny, specyficzności i czułości przeciwciała oraz poziomu badanego białka lub modyfikacji histonów. Wybór wysokiej jakości przeciwciał klasy ChIP-seq jest kluczowy przy pracy z ograniczoną ilością próbki, a dobór optymalnych odczynników i różnych nośników zwiększa wydajność odzysku DNA i przyczynia się do sukcesu eksperymentu ChIP. Aby określić minimalną liczbę komórek, którą może przetworzyć zautomatyzowany protokół ChIP, w systemie zautomatyzowanym IP-Star przetestowano różne ilości chromatyny, przeciwciał oraz kulek magnetycznych, stosując odczynniki do ChIP specjalnie zoptymalizowane pod kątem pracy z niskimi ilościami chromatyny.
W pierwszej kolejności chromatynę z 10 000 komórek poddano sonikacji zgodnie z opisem w protokole. Wyniki ChIP potwierdzono za pomocą qPCR (Rysunek 5A), który wykazuje znaczące wzbogacenie z użyciem przeciwciał H3K4me3 w regionach kontroli pozytywnej oraz pomijalny sygnał w regionach kontroli negatywnej. Dla porównania i w celu potwierdzenia spójności przedstawiono dodatkowe dane uzyskane z zastosowaniem przeciwciał H3K27ac, H3K9me3 oraz H3K27me3 przy użyciu 10 000 komórek.
Następnie przeprowadzono zautomatyzowane eksperymenty ChIP, aby zademonstrować zdolność zautomatyzowanego systemu do pracy z niewielkimi ilościami komórek przy użyciu tego samego przeciwciała przeciwko H3K4me3. Zautomatyzowany ChIP działał sprawnie, co wykazała seria dziesięciu reakcji IP, które były powtarzalne i wysoce porównywalne z wynikami ręcznego ChIP (Rycina 5B). Przeprowadzono eksperymenty ręczne i zautomatyzowane, a korzyści z zastosowania protokołów zautomatyzowanych przejawiły się w zmniejszeniu zmienności między poszczególnymi eksperymentami (Rycina 5C).
<img alt="Wykresy słupkowe ChIP-seq przedstawiające modyfikację histonów (H3K4me3) przy zastosowaniu zautomatyzowanych i manualnych metod ChIP." src="/files/ftp_upload/52150/52150fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Optymalizacja eksperymentów ChIP i Auto ChIP na 10 000 komórek Manualne eksperymenty ChIP przeprowadzono na 10 000 komórek, stosując 0,25 μg przeciwciał H3K4me3, 0,1 μg H3K27ac, 0,5 μg H3K9me3 oraz 0,25 μg H3K27me3. Jako kontrolę zastosowano identyczne ilości IgG króliczego. qPCR przeprowadzono z użyciem starterów dla dwóch loci pozytywnych i dwóch loci negatywnych dla każdego analizowanego ChIP. Rycina 5A przedstawia odzysk, wyrażony jako procent DNA wejściowego (relatywna ilość DNA immunoprecypitowanego w porównaniu do DNA wejściowego po analizie qPCR). Rycina 5B przedstawia 10 reakcji ChIP przeprowadzonych na systemie IP-Star Compact z użyciem 0,25 μg poliklonalnego przeciwciała H3K4me3 oraz 0,25 μg IgG króliczego jako negatywnego przeciwciała kontrolnego. Następnie wykonano analizę qPCR z użyciem starterów dla loci pozytywnych (promotor EIF4A2 i TSS GAPDH) oraz loci negatywnych (ekson 2 Myoglobiny i Sat2). Rycina przedstawia odzysk, wyrażony jako procent DNA wejściowego (relatywna ilość DNA immunoprecypitowanego w porównaniu do DNA wejściowego po analizie qPCR). Rycina 5C przedstawia dane ChIP dla H3K4me3 z 10 manualnych eksperymentów ChIP w porównaniu do 10 zautomatyzowanych eksperymentów ChIP. Słupki błędów reprezentują odchylenia standardowe dla każdego z dziesięciu powtórzeń. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52150/52150fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
W celu oceny czułości zautomatyzowanych protokołów ChIP przeprowadzono eksperymenty z wykorzystaniem liczby komórek w zakresie od 100 000 do 200 komórek na jedną reakcję IP. Zastosowano przeciwciało anty-H3K27me3, ponieważ jest to bardzo powszechna modyfikacja histonowa. Użycie innych przeciwciał antyhistonowych lub nieantyhistonowych może wymagać większej lub mniejszej liczby komórek, w zależności od obfitości epitopu oraz jakości przeciwciała. Eksperymenty zwalidowano za pomocą ilościowego PCR, w wyniku czego zaobserwowano, że zmniejszenie ilości kulek oraz przeciwciał redukuje tło w badaniach, co pozwala na uzyskanie pomyślnych wyników ChIP-qPCR przy użyciu nawet 200 komórek z przeciwciałem (Rysunek 6).
<img alt="Wykres słupkowy immunoprecypitacji chromatyny; analiza wzbogacenia H3K27me3 w porównaniu GAPDH i TSH2B." src="/files/ftp_upload/52150/52150fig6highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Zautomatyzowane analizy ChIP na 200 komórkach. Komórki HeLa-S3 i przeciwciało skierowane przeciwko H3K27me3. Chromatynę poddano fragmentacji z 1 miliona komórek, a następnie do każdej reakcji ChIP wykorzystano rozcieńczenia szeregowe tej chromatyny (od równowartości 100 000 do 200 komórek). W doświadczeniu na 100 000 komórek zastosowano 1 µg H3K27me3 oraz 10 μl magnetycznych kulek pokrytych białkiem A; w przypadku 10 000 i 1 000 komórek zastosowano 0,5 µg H3K27me3 oraz 10 µl kulek; natomiast dla 500 i 200 komórek użyto 0,25 µg H3K27me3 oraz 5 µl kulek. Jako przeciwciało kontrolne negatywne zastosowano odpowiednio 1 µg i 0,5 µg króliczego IgG podczas przeprowadzania doświadczeń z 100 000 i 1 000 komórek. 6A przedstawia stopień zajętości genów TSH2B i GAPDH w % względem inputu. 6B przedstawia względną zajętość TSH2B w stosunku do negatywnego kontrolnego regionu genomicznego GAPDH.
Analiza końcowa wyników ChIP-seq dla 10 000 komórek
W celu oceny ogólnej jakości zautomatyzowanych eksperymentów ChIP-seq przy niskiej początkowej liczbie komórek, przeprowadzono zautomatyzowane analizy ChIP-seq z zastosowaniem 0,25 µg przeciwciała H3K4me3 na 10 000 komórek HeLa, natomiast eksperymenty ChIP na 100 000 komórek HeLa-S3 posłużyły jako kontrola pozytywna eksperymentu. Zautomatyzowane biblioteki przygotowano przy użyciu odczynników z zestawu do przygotowania bibliotek MicroPlex, dostosowanych do bibliotek o niskiej zawartości DNA. Należy zauważyć, że mimo możliwości przeprowadzenia pomyślnych zautomatyzowanych eksperymentów ChIP z liczbą komórek mniejszą niż 10 000, ilość wyizolowanego DNA nie będzie wystarczająca do przygotowania bibliotek przy użyciu odczynników z zestawu. Generowanie klastrów oraz sekwencjonowanie przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta. Analizy bioinformatyczne po sekwencjonowaniu wykazały wyjątkowe wyniki dla próbek ChIP o niskiej liczbie komórek. Zbiór danych 30 pg (odpowiadający 10 000 komórek materiału wyjściowego) charakteryzuje się niskim szumem tła i wysoce wiarygodnymi pikami wzbogacenia, które zostały potwierdzone zarówno przez zbiór danych 300 pg (odpowiadający 100 000 komórek materiału wyjściowego), jak i zbiorem danych H3K4me3 wygenerowanym przez Broad Institute dla projektu ENCODE, który posłużył jako referencja zewnętrzna. Istotne jest zwrócenie uwagi na dane dotyczące współczynnika nakładania się Top 40, który odnosi się do standardowej metody stosowanej w projekcie ENCODE11; w tej metodzie ChIP-seq uznaje się za powtarzalny, jeśli przy porównaniu dwóch zbiorów danych występuje co najmniej 80% nakładania się najlepszych 40% pików uszeregowanych według wyniku istotności. Zbiór danych 30 pg spełnia te kryteria w porównaniu zarówno ze zbiorem danych 300 pg (uwzględniając wszystkie jego piki, a nie tylko najlepsze 40%), jak i z danymi Broad Institute (Tabela 1). Zbiór danych 300 pg wykazuje niemal identyczne piki jak dane Broad Institute, przy współczynniku nakładania się Top 40 wynoszącym 98% (Rysunek 7).
<img alt="Wykres dostępności chromatyny; wyniki sekwencjonowania DNA; piki odczytów; porównanie próbek komórkowych." src="/files/ftp_upload/52150/52150fig7highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Analizy ChIP i generowanie bibliotek z 10 000 komórek Eksperymenty ChIP-seq przeprowadzono na 10 000 i 100 000 komórkach HeLa-S3 z wykorzystaniem przeciwciała H3K4me3 (0,25 µg/µl). Tagi o długości 35 bp zmapowano do genomu ludzkiego za pomocą alignera ELAND. Podczas następczego wyznaczania pików (peak calling) program SICER mógł wiarygodnie zidentyfikować wzbogacenia zarówno z małej liczby komórek, jak i z milionów komórek. Zestawy danych zostały przeanalizowane i porównane ze sobą oraz z danymi referencyjnymi wygenerowanymi przez Broad Institute. Próbki z niską liczbą komórek są spójne i wykazują bardzo wysokie podobieństwo. Próbka 30 pg spełnia kryteria ENCODE11 (min. 80% z górnych 40% pików powinno nakładać się na siebie). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52150/52150fig7large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Tabela z wynikami analizy dostępności chromatyny, porównująca parametry piku dla 10 tys. i 100 tys. komórek." src="/files/ftp_upload/52150/52150table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1.

Metody mapowania interakcji białko-DNA in vivo stają się kluczowe dla każdego aspektu badań genomicznych, ale są pracochłonne, kosztowne i czasochłonne. W artykule przedstawiono dostępny na rynku zrobotyzowany system obsługi cieczy, który automatyzuje immunoprecypitację chromatyny w celu mapowania in vivo interakcji białko-DNA z ograniczoną liczbą komórek.

Automatyzacja eksperymentów ChIP-seq w celu wygenerowania profili epigenetycznych na 10 000 komórek HeLa

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq ...

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie naukowcom zautomatyzowanej platformy zdolnej do przeprowadzania eksperymentów immunoprecypitacji chromatyny na zaledwie 10 000 komórek. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie wysokiej jakości chromatyny ściętej do immunoprecypitacji chromatyny. W drugim kroku tworzony jest eksperyment z automatycznym immunoprecypitacją chromatyny i uruchamiane są zautomatyzowane biblioteki z DNA wytrąconym immunologicznie.DNA wytrącone immunologicznie jest analizowane za pomocą ilościowego PCR i sekwencjonowania nowej generacji. Ostatecznie, sukces zautomatyzowanej technologii można potwierdzić poprzez porównanie profili sekwencji immunoprecypitacji chromatyny wygenerowanych na oryginalnej próbce 10 000 komórek z eksperymentami przeprowadzonymi na 100 000 komórek i istniejącymi zestawami danych w celach informacyjnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki, aby pogłębić nasze zrozumienie funkcji określonych biomarkerów w różnych tkankach.Etapy rozwoju i stany chorobowe. Technika ta ma implikacje w diagnozowaniu wielu chorób, ponieważ pomoże zidentyfikować biomarkery epigenetyczne w zdrowiu i chorobie, dokładne i wiarygodne. Technologie automatyczne są ważnymi narzędziami dla naukowców zajmujących się analizą epigenetyczną określonych typów komórek, subpopulacji i biopsji.W przypadku standardowego eksperymentu z automatyczną immunoprecypitacją chromatyny zacznij od dodania 120 mikrolitrów buforu immunoprecypitacyjnego chromatyny H do 100 mikrolitrów ściętej chromatyny z jednego do 2 milionów komórek, rezerwując od dwóch do 20 mikrolitrów chromatyny na próbkę wejściową. Następnie, aby skonfigurować automatyczny eksperyment na protokołach IP star compact, wybierz i kliknij ikonę immunoprecypitacji chromatyny. Wybierz metodę bezpośrednią immunoprecypitacji chromatyny, a następnie na następnym ekranie wybierz protokół immunoprecypitacji chromatyny 200 mikrolitrów i określ liczbę próbki.Ustaw parametry eksperymentalne immunoprecypitacji chromatyny na cztery godziny dla powłoki przeciwciała. Krok 15 godzin na etap immunoprecypitacji i pięć minut na każdy etap mycia. Następnie skonfiguruj odczynniki zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie informacyjnym układu i dodaj odpowiednie odczynniki oraz wysoce zwalidowane przeciwciała klasy ChIP-seq.Następnie dodaj 20 mikrolitrów białka, kulki magnetyczne pokryte A dla każdej reakcji, a próbki chromatyny po nocnym protokole chipowym i odwrotnym sieciowaniu są zakończone. Oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania DNA na bazie kulek magnetycznych. Użyj wysoce czułego komercyjnego testu metrycznego fluoro, aby określić ilościowo DNA wytrącone immunologicznie.Następnie przy użyciu starterów dla co najmniej jednego pozytywnego i jednego negatywnego regionu genomowego kontroli. Analizować jakość immunologicznie wytrąconego DNA metodą ilościowego PCR zgodnie z odpowiednimi parametrami materiałów do analizy. Wyniki są wyrażone jako procent odzysku danych wejściowych dla sekwencjonowania nowej generacji w ramach protokołów.Teraz kliknij ikonę przygotowania biblioteki, a następnie wybierz preferowaną technologię przygotowania biblioteki i ustaw odczynniki zgodnie z instrukcjami na ekranie informacyjnym układu. Na przykład w tym eksperymencie wygenerowano profile sekwencjonowania dla sześciu różnych modyfikacji histonów związanych z ekspresją genów. Wysoka korelacja pików zaobserwowana między tymi markerami histonowymi wskazuje na zdolność zautomatyzowanego systemu do generowania dokładnych i wiarygodnych danych.Co więcej, wykresy te pokazują rozkład pików dla różnych modyfikacji histonów w określonych regionach genomu. Wreszcie, w przypadku eksperymentu z automatyczną immunoprecypitacją chromatyny dla próbek o niskiej liczbie komórek, ustaw protokół automatycznego immunoprecypitacji chromatyny 200 mikrolitrów w systemie automatyzacji, jak właśnie pokazano. Następnie załaduj system ChIP-seq, zoptymalizuj przeciwciała i odczynniki do pracy na ilościach chromatyny od 10 000 do 100 000 komórek przy użyciu tylko 10 mikrolitrów białka, kulek magnetycznych pokrytych A dla każdej reakcji.Po chipie uruchom przygotowanie biblioteki, wybierz protokół przygotowania biblioteki micro plex i ustaw odczynniki zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie informacji o układzie. W tym reprezentatywnym ilościowym PCR immunoprecypitacji chromatyny z próbki wyjściowej 10 000 komórek zaobserwowano znaczące wzbogacenie w przeciwciała antyhisttonowe w regionach kontroli pozytywnej i znikome sygnały w regionach kontroli ujemnej. W tym miejscu przedstawiono serię 10 reakcji immunoprecypitacji, które były powtarzalne i wysoce porównywalne z eksperymentem z manualną immunoprecypitacją chromatyny, wykazując zdolność zautomatyzowanego systemu do pracy z małymi ilościami komórek bez widocznego wzrostu zmienności między eksperymentami w porównaniu z ręczną immunoprecypitacją.Dane te ilustrują analizy bioinformatyczne bibliotek sekwencji 10 000 i 100 000. On a S3 komórki po immunoprecypitacji chromatyny, wykazując znakomite wyniki z próbek immunoprecypitacji chromatyny o niskiej liczbie komórek. Ten zestaw danych, który odpowiada eksperymentowi z 10 000 komórek materiału wyjściowego, zawiera niski poziom szumu tła z wysoce wiarygodnymi pikami wzbogacenia, które są potwierdzone zarówno przez zestaw danych 100 000 komórek, jak i zestaw danych referencyjnych Broad Institute.W przypadku projektu kodowania ważne jest, aby zauważyć, że dane z 10 000 komórek wykazują prawie identyczne piki z danymi Broad Institute z 98% współczynnikiem nakładania się najlepszych 40% pików uszeregowanych według znaczącego wyniku, jak użyto w projekcie kodu końcowego. Zautomatyzowany system IP star wymaga minimalnej interwencji operatora, skracając czas HandsOn immunoprecypitacji chromatyny do zaledwie jednej do dwóch godzin. Ponadto zautomatyzowany proces zastępuje liczne podatne na błędy etapy ręcznego immunoprecypitacji chromatyny i zapewnia bardzo spójne wyniki.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że dobra immunoprecypitacja chromatyny oraz dobry dobór wysoce specyficznych i wrażliwych przeciwciał jest kluczem do sukcesu eksperymentu. Technologia ta utorowała drogę naukowcom z każdej dziedziny biologii do poprawy dokładności, odtwarzalności i spójności terapii. Badania epigenetyczne.

automating-chip-seq-experiments-to-generate-epigenetic-profiles-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Połączenie immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania ultra-wysokoprzepustowego (ChIP-seq) może zidentyfikować i zmapować interakcje białko-DNA w danej tkance lub linii komórkowej. Przedstawiono sposób generowania wysokiej jakości szablonu ChIP do późniejszego sekwencjonowania, na przykładzie doświadczenia z czynnikiem transkrypcyjnym TCF7L2.

Generowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny do sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i przygotowania biblioteki ChIP-seq do generowania globalnych profili epigenomicznych z próbek embrionalnych kurczaków o niskiej liczebności.

Protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dla próbek embrionalnych o niskiej liczebności

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół sekwencjonowania ChIP o wysokiej przepustowości oraz potok analiz obliczeniowych do określania wzorców stanu chromatyny w całym genomie z zamrożonych tkanek nowotworowych i linii komórkowych.

Zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP w tkankach nowotworowych

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawnia niejednorodność genotypową w systemach biologicznych, ale obecnym technologiom brakuje przepustowości niezbędnej do głębokiego profilowania składu i funkcji społeczności. W tym miejscu opisujemy mikroprzepływowy przepływ pracy do sekwencjonowania &gt;50 000 genomów jednokomórkowych z różnych populacji komórek.

Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Opisujemy krok po kroku protokół sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny tandemowej (tChIP-Seq), który umożliwia analizę specyficznej dla typu komórki modyfikacji histonów w całym genomie.

TChIP-Seq: Profilowanie epigenomu specyficzne dla typu komórki

Ten artykuł opisuje półautomatyczny, mikroskalowany protokół ChIP-Seq regionów DNA związanych z specyficzną modyfikacją histonu (H3K27ac) przy użyciu platformy ChIP do obsługi cieczy, a następnie przygotowanie biblioteki za pomocą tagmentacji. Procedura obejmuje ocenę kontrolną pod względem jakościowym i ilościowym i może być dostosowana do innych modyfikacji histonów lub czynników transkrypcyjnych.

Półautomatyczna procedura ChIP-Seq do badań epigenetycznych na dużą skalę

Obecny protokół opisuje metodę pojedynczej komórki do iteracyjnych analiz epigenomicznych przy użyciu pojedynczej komórki wielokrotnego użytku. Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku umożliwia analizę wielu znaczników epigenetycznych w tej samej pojedynczej komórce i statystyczną walidację wyników.

Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku do iteracyjnych analiz epigenomicznych

ATAC-seq to metoda sekwencjonowania DNA, która wykorzystuje nadpobudliwą zmutowaną transpozazę, Tn5, do mapowania zmian w dostępności chromatyny, w których pośredniczą czynniki transkrypcyjne. ATAC-seq umożliwia odkrycie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zmian fenotypowych w komórkach nowotworowych. Protokół ten określa procedury optymalizacyjne dla sekwencji ATAC w typach komórek nabłonkowych, w tym komórkach nowotworowych.

Optymalizacja ATAC-Seq do badań epigenetycznych nowotworów

Tutaj prezentujemy protokół selekcji in vitro zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych (ETR) o wysokiej, długoterminowej, stabilnej skuteczności wyciszania na miejscu i niskiej aktywności w całym genomie, poza celem. Taki przepływ pracy pozwala na zredukowanie początkowego, złożonego repertuaru potencjalnych ETR do krótkiej listy, nadającej się do dalszej oceny w odpowiednich terapeutycznie warunkach.

In vitro Wybór zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych do ukierunkowanego wyciszania epigenetycznego

Przedstawiamy tutaj protokół automatyzacji analizy posttranslacyjnej modyfikacji histonów pojedynczych komórek, wykorzystując strategię znakowania izotopowego dwu-plexowego oraz trawienie ArgC. Ten workflow umożliwia ilościowe, powtarzalne i wysokoczułe profilowanie heterogeniczności chromatyny oraz odpowiedzi epigenetycznych w rozdzielczości pojedynczych komórek.

Automatyczne przygotowanie próbki do multipleksowanej analizy pojedynczokomórkowych modyfikacji histonów po translacji (sc-hPTM2)

Poznaj zautomatyzowaną metodę ChIP-seq dla badań epigenetycznych przy użyciu komórek HeLa. Technologia ta umożliwia generowanie profili modyfikacji histonowych z próbek zawierających zaledwie 10 000 komórek.

Automatyzacja eksperymentów ChIP-seq w celu wygenerowania profili epigenetycznych na 10 000 komórek HeLa

Przeglądaj więcej filmów