Automatyzacja eksperymentów ChIP-seq w celu wygenerowania profili epigenetycznych na 10 000 komórek HeLa
10 grudnia 2014
Metody mapowania interakcji białko-DNA in vivo stają się kluczowe dla każdego aspektu badań genomicznych, ale są pracochłonne, kosztowne i czasochłonne. W artykule przedstawiono dostępny na rynku zrobotyzowany system obsługi cieczy, który automatyzuje immunoprecypitację chromatyny w celu mapowania in vivo interakcji białko-DNA z ograniczoną liczbą komórek.
Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie naukowcom zautomatyzowanej platformy zdolnej do przeprowadzania eksperymentów immunoprecypitacji chromatyny na zaledwie 10 000 komórek. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie wysokiej jakości chromatyny ściętej do immunoprecypitacji chromatyny. W drugim kroku tworzony jest eksperyment z automatycznym immunoprecypitacją chromatyny i uruchamiane są zautomatyzowane biblioteki z DNA wytrąconym immunologicznie.
DNA wytrącone immunologicznie jest analizowane za pomocą ilościowego PCR i sekwencjonowania nowej generacji. Ostatecznie, sukces zautomatyzowanej technologii można potwierdzić poprzez porównanie profili sekwencji immunoprecypitacji chromatyny wygenerowanych na oryginalnej próbce 10 000 komórek z eksperymentami przeprowadzonymi na 100 000 komórek i istniejącymi zestawami danych w celach informacyjnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki, aby pogłębić nasze zrozumienie funkcji określonych biomarkerów w różnych tkankach.
Etapy rozwoju i stany chorobowe. Technika ta ma implikacje w diagnozowaniu wielu chorób, ponieważ pomoże zidentyfikować biomarkery epigenetyczne w zdrowiu i chorobie, dokładne i wiarygodne. Technologie automatyczne są ważnymi narzędziami dla naukowców zajmujących się analizą epigenetyczną określonych typów komórek, subpopulacji i biopsji.
W przypadku standardowego eksperymentu z automatyczną immunoprecypitacją chromatyny zacznij od dodania 120 mikrolitrów buforu immunoprecypitacyjnego chromatyny H do 100 mikrolitrów ściętej chromatyny z jednego do 2 milionów komórek, rezerwując od dwóch do 20 mikrolitrów chromatyny na próbkę wejściową. Następnie, aby skonfigurować automatyczny eksperyment na protokołach IP star compact, wybierz i kliknij ikonę immunoprecypitacji chromatyny. Wybierz metodę bezpośrednią immunoprecypitacji chromatyny, a następnie na następnym ekranie wybierz protokół immunoprecypitacji chromatyny 200 mikrolitrów i określ liczbę próbki.
Ustaw parametry eksperymentalne immunoprecypitacji chromatyny na cztery godziny dla powłoki przeciwciała. Krok 15 godzin na etap immunoprecypitacji i pięć minut na każdy etap mycia. Następnie skonfiguruj odczynniki zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie informacyjnym układu i dodaj odpowiednie odczynniki oraz wysoce zwalidowane przeciwciała klasy ChIP-seq.
Następnie dodaj 20 mikrolitrów białka, kulki magnetyczne pokryte A dla każdej reakcji, a próbki chromatyny po nocnym protokole chipowym i odwrotnym sieciowaniu są zakończone. Oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania DNA na bazie kulek magnetycznych. Użyj wysoce czułego komercyjnego testu metrycznego fluoro, aby określić ilościowo DNA wytrącone immunologicznie.
Następnie przy użyciu starterów dla co najmniej jednego pozytywnego i jednego negatywnego regionu genomowego kontroli. Analizować jakość immunologicznie wytrąconego DNA metodą ilościowego PCR zgodnie z odpowiednimi parametrami materiałów do analizy. Wyniki są wyrażone jako procent odzysku danych wejściowych dla sekwencjonowania nowej generacji w ramach protokołów.
Teraz kliknij ikonę przygotowania biblioteki, a następnie wybierz preferowaną technologię przygotowania biblioteki i ustaw odczynniki zgodnie z instrukcjami na ekranie informacyjnym układu. Na przykład w tym eksperymencie wygenerowano profile sekwencjonowania dla sześciu różnych modyfikacji histonów związanych z ekspresją genów. Wysoka korelacja pików zaobserwowana między tymi markerami histonowymi wskazuje na zdolność zautomatyzowanego systemu do generowania dokładnych i wiarygodnych danych.
Co więcej, wykresy te pokazują rozkład pików dla różnych modyfikacji histonów w określonych regionach genomu. Wreszcie, w przypadku eksperymentu z automatyczną immunoprecypitacją chromatyny dla próbek o niskiej liczbie komórek, ustaw protokół automatycznego immunoprecypitacji chromatyny 200 mikrolitrów w systemie automatyzacji, jak właśnie pokazano. Następnie załaduj system ChIP-seq, zoptymalizuj przeciwciała i odczynniki do pracy na ilościach chromatyny od 10 000 do 100 000 komórek przy użyciu tylko 10 mikrolitrów białka, kulek magnetycznych pokrytych A dla każdej reakcji.
Po chipie uruchom przygotowanie biblioteki, wybierz protokół przygotowania biblioteki micro plex i ustaw odczynniki zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie informacji o układzie. W tym reprezentatywnym ilościowym PCR immunoprecypitacji chromatyny z próbki wyjściowej 10 000 komórek zaobserwowano znaczące wzbogacenie w przeciwciała antyhisttonowe w regionach kontroli pozytywnej i znikome sygnały w regionach kontroli ujemnej. W tym miejscu przedstawiono serię 10 reakcji immunoprecypitacji, które były powtarzalne i wysoce porównywalne z eksperymentem z manualną immunoprecypitacją chromatyny, wykazując zdolność zautomatyzowanego systemu do pracy z małymi ilościami komórek bez widocznego wzrostu zmienności między eksperymentami w porównaniu z ręczną immunoprecypitacją.
Dane te ilustrują analizy bioinformatyczne bibliotek sekwencji 10 000 i 100 000. On a S3 komórki po immunoprecypitacji chromatyny, wykazując znakomite wyniki z próbek immunoprecypitacji chromatyny o niskiej liczbie komórek. Ten zestaw danych, który odpowiada eksperymentowi z 10 000 komórek materiału wyjściowego, zawiera niski poziom szumu tła z wysoce wiarygodnymi pikami wzbogacenia, które są potwierdzone zarówno przez zestaw danych 100 000 komórek, jak i zestaw danych referencyjnych Broad Institute.
W przypadku projektu kodowania ważne jest, aby zauważyć, że dane z 10 000 komórek wykazują prawie identyczne piki z danymi Broad Institute z 98% współczynnikiem nakładania się najlepszych 40% pików uszeregowanych według znaczącego wyniku, jak użyto w projekcie kodu końcowego. Zautomatyzowany system IP star wymaga minimalnej interwencji operatora, skracając czas HandsOn immunoprecypitacji chromatyny do zaledwie jednej do dwóch godzin. Ponadto zautomatyzowany proces zastępuje liczne podatne na błędy etapy ręcznego immunoprecypitacji chromatyny i zapewnia bardzo spójne wyniki.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że dobra immunoprecypitacja chromatyny oraz dobry dobór wysoce specyficznych i wrażliwych przeciwciał jest kluczem do sukcesu eksperymentu. Technologia ta utorowała drogę naukowcom z każdej dziedziny biologii do poprawy dokładności, odtwarzalności i spójności terapii. Badania epigenetyczne
.Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono zautomatyzowaną platformę do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), która pozwala na wydajne przetwarzanie niewielkiej liczby komórek, konkretnie 10 000 komórek. Metoda ta ma na celu usprawnienie mapowania oddziaływań białko-DNA, co jest kluczowe dla badań genomicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genomika
- Epigenetyka
- Zautomatyzowane techniki laboratoryjne
Wprowadzenie
- Interakcje białko-DNA mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia regulacji genów.
- Tradycyjne metody ChIP są pracochłonne i wymagają dużej liczby komórek.
- Automatyzacja może zwiększyć wydajność i powtarzalność eksperymentów genomicznych.
- Niniejsze badanie koncentruje się na systemie robotycznym, który minimalizuje interwencję manualną.
Cel badania
- Opracowanie zautomatyzowanej metody ChIP dla małej liczby komórek.
- Walidacja skuteczności systemu zautomatyzowanego w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Ułatwienie identyfikacji epigenetycznych biomarkerów w zdrowiu i chorobie.
Zastosowane metody
- Przygotowanie wysokiej jakości fragmentowanej chromatyny z 10 000 komórek.
- Automatyzacja procesu ChIP z wykorzystaniem robotycznego systemu do obsługi cieczy.
- Analiza immunoprecypitowanego DNA za pomocą ilościowej PCR oraz sekwencjonowania nowej generacji.
- Porównanie wyników z danymi uzyskanymi z większych próbek komórek oraz z istniejącymi zbiorami danych.
Główne wyniki
- Zautomatyzowany system dostarczył wiarygodnych i powtarzalnych wyników, porównywalnych z metodami manualnymi.
- W obszarach kontroli pozytywnej zaobserwowano istotne wzbogacenie modyfikacji histonów.
- Wysoka korelacja z zestawami danych referencyjnych wskazała na dokładność podejścia zautomatyzowanego.
- Minimalna interwencja operatora znacząco zredukowała czas pracy manualnej.
Wnioski
- Zautomatyzowana metoda ChIP jest skuteczna przy niskiej liczbie komórek.
- Technologia ta może przyczynić się do rozwoju badań epigenetycznych oraz odkrywania biomarkerów.
- Automatyzacja zwiększa spójność i niezawodność analiz genomicznych.
Często zadawane pytania
Przemysłowe zastosowania praktyczne
Automatyzacja ChIP-seq dla małej liczby komórek rozwiązuje krytyczny problem wąskiego gardła w walidacji celów epigenetycznych, umożliwiając mechanistyczną weryfikację hipotez przy użyciu deficytowych populacji pierwotnych lub rzadkich komórek. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania poprzez generowanie powtarzalnych profili epigenomicznych z ograniczonych próbek, co wspiera selekcję projektów w portfelu oraz podejmowanie decyzji w oparciu o biomarkery. Technologia ta pozycjonuje testy epigenomiczne jako skalowalne i wielokrotne narzędzia badawcze, zapewniające ciągłość translacyjną od identyfikacji celu do walidacji przedklinicznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych i wyjaśnienie szlaków sygnałowych poprzez profilowanie modyfikacji histonów w próbkach o niskim wkładzie materiału.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego i funkcjonalną walidację celów poprzez generowanie powtarzalnych danych ChIP-seq z 10 000 komórek.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio dzięki wiarygodnym odczytom epigenomicznym, które korelują ze zbiorami referencyjnymi i punktami odniesienia ustalonymi ręcznie.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych analiz przesiewowych poprzez ustanowienie zestandaryzowanych, zautomatyzowanych schematów ChIP-seq.
- Wartość operacyjna: Rozwiązuje kwestie standaryzacji testów, powtarzalności oraz wyników ilościowych dzięki automatyzacji opartej na koralikach magnetycznych oraz odczytom qPCR/NGS.
- Skalowalność: Podkreśla gotowość do badań przesiewowych i możliwość ponownego wykorzystania platformy dzięki skróceniu czasu pracy manualnej i minimalizacji interwencji operatora.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Omówienie znaczenia dla choroby poprzez identyfikację epigenetycznych biomarkerów w stanach zdrowia i choroby przy użyciu ChIP-seq z małej liczby komórek.
- Zgodność przedkliniczna: Opis ciągłości od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dzięki umożliwieniu spójnego profilowania epigenomicznego w różnych rozmiarach próbek.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wsparcie decyzji za pomocą powtarzalnych danych z niskim poziomem tła, potwierdzonych w odniesieniu do zbiorów danych obejmujących 100 000 komórek oraz zbiorów referencyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Zautomatyzowana metoda ChIP-seq integruje się z procesem badawczym – od testowania hipotez po identyfikację kluczowych cząsteczek, umożliwiając profilowanie epigenomiczne na wczesnych etapach przy ograniczonej ilości materiału.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez generowanie profili modyfikacji histonów z niewielkiej ilości komórek.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość i powtarzalność testów dzięki zautomatyzowanemu przygotowaniu bibliotek oraz ilościowym pomiarom odzysku DNA.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar zmiennych zależnych za pomocą qPCR (% odzysku materiału wejściowego) oraz korelacji szczytów NGS w celu porównania warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość w fazie przedklinicznej poprzez profile epigenomiczne zgodne z biomarkerami, walidowane względem ortogonalnych zbiorów danych.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia platformę robotyczną jako wielokrotnego użytku zasób do analiz epigenetycznych w różnych projektach, co redukuje redundancję.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu oraz redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w badaniach nad mechanizmami epigenetycznymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność uzyskane dzięki zautomatyzowanemu dozowaniu cieczy i zminimalizowaniu liczby etapów manualnych.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki wiarygodnym danym epigenomicznym przy niskim wkładzie materiału.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje dotyczące rozwoju wspierane przez powtarzalne wyniki ChIP-seq skorelowane z referencjami.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie przygotowania chromatyny, walidacji przeciwciał oraz obsługi zautomatyzowanych systemów do pipetowania cieczy.
- Konieczne jest zaplecze instrumentacyjne, w tym platforma robotyczna (np. IP-Star Compact), systemy do obsługi kulek magnetycznych oraz infrastruktura analityczna qPCR/NGS.
- Wymagana jest standaryzacja wyboru przeciwciał, fragmentacji chromatyny oraz parametrów protokołu pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Należy uwzględnić kwestie adaptacyjne podczas skalowania liczby komórek z 10 000 do 100 000 lub przy zastosowaniu metody w biopsjach pierwotnych i subpopulacjach.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zależność od wysokiej jakości, specyficznych przeciwciał oraz optymalnej fragmentacji chromatyny w przypadku niskiego wkładu materiału.
