Uzyskanie i charakterystyka wolnej od transgenów indukowanej przez człowieka pluripotencjalnej linii komórek macierzystych i konwersja do określonych stanów klinicznych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wyprowadzenie pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka na bazie lentiwirusów, przeprogramowanych, wolnych od czynników ludzkich i przekształcenie tych komórek w przypuszczalne stany kliniczne. Osiąga się to poprzez uprzednie przeprogramowanie dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych za pomocą pojedynczej, dużej kasety z lentiwirusowymi komórkami macierzystymi lub samochodu macierzystego w PSC HI. Następnie przeprogramowane PSC HI są wystawiane na działanie wirusa mruczenia adeno Cree w celu pełnego wycięcia i usunięcia macierzystego samochodu z genomu gospodarza.

Następnie ekstrakcja genomowego DNA z wolnych od feedera HI PSC, a następnie analiza agel potwierdza prawidłowe wycięcie wagonu macierzystego. Wreszcie, czynnik trzeci H IPC są przekształcane w przypuszczalne warunki klasy GMP za pomocą metodologii powolnej konwersji do w pełni zdefiniowanych warunków wolnych od ksenomorfozy. Ostatecznie, wirusowe przeprogramowanie dorosłych fibroblastów skóry i pełna konwersja H IPC do warunków klinicznych podkreśla szerokie zastosowanie tej metodologii do przeprogramowania dorosłych komórek ludzkich i przekształcania ich w stany klinicznie istotne.

Implikacje tej techniki rozciągają się na zastosowania kliniczne ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, ponieważ są one całkowicie wolne od czynników i przekształcane do warunków klinicznych, dzięki czemu są kompatybilne z ludzkimi terapiami. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ przeprogramowanie, wycięcie i etapy konwersji klasy klinicznej są trudne do nauczenia się ze względu na główne skomplikowane i specyficzne procedury, których należy przestrzegać, aby uzyskać czynnik trzeci i klinicznie indukowane ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste Aby rozpocząć rozmrażanie. Dorosłe ludzkie fibroblasty skórne lub HAF w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty.

Należy uważać, aby nie zanurzyć górnej części fiolki w wodzie. Umieść jednomililitrową zawiesinę komórek w 15-mililitrowej fiolce kroniki, aby ponownie zawiesić komórki i rozcieńczyć DMSO w sposób kroplowy. Powoli dodaj cztery mililitry wstępnie podgrzanego podłoża huff, odwiruj fiolet 200 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie zasysaj sup, nacent i reus. Zawieś komórki w pożywce do 100 000 komórek na mililitr w jednym dołku sześciodołkowej płytki preco do 0,2% żelatyny. Dodaj dwa mililitry zawiesiny komórek, a następnie dodaj dwa mililitry zawiesiny na sekundę.

Cóż, aby można je było wykorzystać do pomiaru wielokrotności infekcji lub MOI, kołysz płytką na boki i tam iz powrotem, aby równomiernie rozprowadzić komórki przed inkubacją przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w wilgotnej komorze. 24 godziny później, po zliczeniu komórek, rozmrozić dwukrotnie osiem jednostek transdukcji lub S równoważnego koncentratu lentiwirusowego i użyć pożywki do rozcieńczenia do 10 razy do ośmiu t na mililitr przy użyciu połowy pożywki uzupełnionej ośmioma mikrogramami na mililitr odczynnika do transfekcji. Transdukuj komórki przy współczynniku 10 wielokrotności infekcji.

Równomiernie wymieszać dołki transdukcyjne i inkubować przez noc około 24 godziny po transdukcji lentiwirusa. Usuń pożywkę i zastąp ją standardową pożywką z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych lub pożywką PSC. Zmieniaj pożywkę codziennie w dniach od drugiego do szóstego dnia na dwie 0,2% pokryte żelatyną 10-centymetrowe talerze 1,5 do 1,75 razy 10 do sześciu mysich fibroblastów embrionalnych pochodzących z pierwszego czynnika składnika dopełniacza lub mukowiscydozy jednej myszy w połowie pożywki w siódmym dniu.

Dodaj wycieczki w temperaturze pokojowej do jednej studzienki z sześciodołkowej płytki przeprogramowanych fibroblastów. Delikatnie zdejmuje komórki i obraca 100 razy G ze świeżą ludzką pożywką PSC wszystkie komórki w stosunku od 1 do 16 na dwóch 10-centymetrowych płytkach metamfetaminy CFI. Rozprowadzić agregaty ruchem spiralnym zgodnie z ruchem wskazówek zegara i inkubować przez około 48 godzin przed wymianą pożywki.

Po trzech do czterech tygodniach użyj igły o rozmiarze 21, aby wybrać od ośmiu do 10 pojedynczych kawałków określonych kolonii o typowej morfologii podobnej do ESC i po ekspansji sklonować je do indywidualnych studzienek CFI MFS. Potwierdzić, że komórki są pluripotencjalne poprzez tworzenie ciała zarodka i analizę ekspresji markerów po zweryfikowaniu miejsca integracji samochodu macierzystego, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym. Samochód z trzpieniem akcyzowym, najpierw odsysając starą pożywkę PSC dla ludzi do trzech mililitrów standardowego podłoża PSC łącznie.

45 mikrolitrów skoncentrowanego adeno Cree pur lub wirusa z ośmioma mikrogramami na mililitr środków do transfekcji. Następnie dodać do komórek i inkubować przez 24 godziny po inkubacji, zassać supinat wirusa, skłonić ludzką pożywkę PSC do dwukrotnego przemycia komórek. Następnie dodaj pożywkę HPSC z dwoma mikrogramami na mililitr czystej mycyny i wymieniaj codziennie po pięciu dniach, subklonuj pozostałe kolonie i rozwijaj je zgodnie z opisem wcześniej w filmie.

Następnie rozmrozić jedną fiolkę z matrycą błony podstawnej pre Eloqua na lodzie i rozcieńczyć zimną pożywkę podstawową do końcowego stężenia od jednego do 30. Użyj jednego mililitra na studzienkę, aby pokryć żądaną liczbę dołków sześciodołkowej płytki i pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej na jedną godzinę. Następnie za pomocą igły o rozmiarze 18 kreskuj co najmniej 20 do 30 kolonii ze studni wcześniej pokrytej mes.

Zadbaj o to, aby ograniczyć podnoszenie na duchu i przenoszenie komórek z płytki. Po godzinnej inkubacji odessać matrycę z pokrytej studzienki pipetą o pojemności 200 mikrolitrów. Usuń kawałki kolonii, delikatnie zeskrobując je ze starej płytki i ostrożnie umieść je w trzech mililitrach świeżo połączonego podłoża, po jednym na płytce pokrytej matrycą.

Po inkubacji przez 48 godzin zmieniaj podłoże codziennie, gdy wycięte po wycięciu i bez karmienia przekształcone HI PSC osiągną płynność 80% CO. Użyj komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA, aby wyekstrahować genomowe DNA za pomocą pokazanych tutaj starterów, które są specyficzne dla egzogennych integracji lentiwirusa macierzystego. Przeanalizuj DNA metodą PCR pod kątem prawidłowego wycięcia w celu przejścia po wycięciu HI PSC do warunków klasy GMP.

Wymieszaj pożywkę kombinowaną HPSC jeden i pożywkę zgodną z GMP klasy klinicznej lub pożywkę kombinowaną dwa w stosunku 80 do 20 podgrzanych do 37 stopni Celsjusza. Odessać starą pożywkę pożywkę pożywkę ze komórek i zastąpić trzema mililitrami nowego roztworu ciepłej pożywki. Wymieniaj pożywkę codziennie przez trzy dni, pasażując zgodnie z protokołem tekstowym, aby utrzymać odpowiednią wielkość i gęstość kolonii w czwartym dniu, zastąp pożywkę mieszanką 50-50 ciepłych połączonych pożywek jeden i dwa inkubować przez trzy dni.

Wymieniając pożywkę codziennie w siódmym dniu, zmień stosunek 20 do 80 podgrzanych połączonych pożywek odpowiednio jeden i dwa i wymieniaj codziennie przez trzy dni. W dniu 10 zmień na ciepłe, w 100% połączone podłoże dwa i zmieniaj codziennie. Komórki znajdują się teraz na całkowicie zdefiniowanym podłożu wolnym od kseno.

Następnie, po użyciu zdefiniowanego substratu wolnego od ksenotypów do pokrycia jednej studzienki z sześciodołkowej płytki, zastąp wolne od ksenoizolacji podłoże w studzience komórek konfluencji świeżym podłożem zawierającym jedną x skałę. Po inkubacji przez godzinę użyj igły o rozmiarze 18, aby mechanicznie umieścić komórki w świeżo przygotowanym roztworze. Cóż, pozwól komórkom inkubować się bez zakłóceń przez dwa dni, aby umożliwić maksymalne przywiązanie przed scharakteryzowaniem komórek zgodnie z protokołem tekstowym.

Ten rysunek przedstawia reprezentatywny obraz trzech różnych wstępnie wyciętych linii H-I-P-S-C po przeprogramowaniu z podejściem do samochodu macierzystego na warstwie mes pokazany tutaj jest żel PCR z odwrotną transkrypcją po wycięciu, pokazujący jeden konkretny subklon całkowicie wolny od lentiwirusa macierzystego, o czym świadczy brak prążka amplikonu specyficznego dla określonej sekwencji endogennej dla samochodu macierzystego. Na tym rysunku przedstawiono wstępnie przekształcone IPC na matrycy zawierającej kseno i IPC wolne od ksenozy GMP klasy H po akcyzie na matrycy syntetycznej przedstawiono ilościowo standardowe czynniki związane z pluripotencją, w tym SOX dwa, OCT cztery i nanog. Korzystanie z QPCR jest zilustrowane tutaj.

Wreszcie, jak widać tutaj, PSC HI przekształcone przed konwersją i po konwersji do warunków klasy GMP przetestowano za pomocą cytometrii przepływowej pod kątem kwasu sjalowego i glikolu kwasu neuronowego wskazujących na antygeny inne niż ludzkie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprogramować ludzkie dorosłe fibroblasty skóry za pomocą wirusa przeprogramowania stemco, wyciąć wirusa z genomu, a następnie w pełni przekształcić te HI PSC w warunki kliniczne w pełni kompatybilne z terapiami dla ludzi. Nie zapominaj, że praca ze staca, wektorem przeciwwirusowym trzeciej generacji, może być niezwykle niebezpieczna i wymaga środków ostrożności.

Podczas wykonywania tej procedury należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej i pomieszczenia do hodowli tkankowych VSL two plus.