Name: Uzyskanie i charakterystyka wolnej od transgenów indukowanej przez człowieka pluripotencjalnej linii komórek macierzystych i konwersja do określonych stanów klinicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Poznaj metodę uzyskiwania wolnych od czynników ludzkich komórek pluripotencjalnych hiPSC z fibroblastów skórnych i ich konwersję do warunków klinicznych. Protokół obejmuje reprogramowanie lentiwirusowe, ekscyzję kasyety Cre i przygotowanie GMP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Patrickowi C. Lee, Cyrilowi Ramathalowi i Saravananowi Karumbayaramowi (SK) za pomoc w przeprowadzeniu eksperymentów z wyprowadzaniem i charakteryzacją iPSC; Aaronowi Cooperowi za przeprowadzenie eksperymentów z analizą iPSC; Vittorio Sebastiano i Renee A. Reijo Pera za kierowanie początkowymi pracami nad przeprogramowaniem; SK, Williamowi E. Lowry'emu, Jerome'owi A. Zackowi i Donaldowi B. Kohnowi za kierowanie utworzeniem obiektów GMP UCLA, pozwalających na konwersję i charakterystykę iPSC klasy klinicznej; Gustavo Mostoslavsky'emu za dostarczenie nam policistronicznego wektora przeprogramowania STEMCCA. Praca ta opiera się na współpracy badawczej z Fibrocell Science i inicjatywą Clinical Investigations for Dermal Mesenchymally Obtained Derivatives (CIDMOD) w celu wygenerowania bezpiecznych, spersonalizowanych terapii komórkowych. Praca ta była wspierana przez fundusze z Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research na UCLA, The Phelps Family Foundation, Fibrocell Science, Inc. oraz UCLA CTSI Scholar's Award dla JAB.

UWAGA: Ta metoda została użyta w badaniach opisanych w Awe et al.Rozdział 10.
1. Przeprogramowanie fibroblastów skórnych dorosłego człowieka za pomocą STEMCCA
<ol>
	<li>Rozmrażać dorosłe ludzkie fibroblasty skórne (HUF), pasaż 4 lub niższy, w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 minuty, uważając, aby nie zanurzyć górnej części fiolki w wodzie.</li>
	<li>Umieścić 1 ml zawiesiny ludzkich fibroblastów w stożkowej fiolce o pojemności 15 ml i powoli umieścić 4 ml standardowej pożywki HUF, wstępnie podgrzanej do 37 °C, w sposób kroplami, w celu rozcieńczenia dimetylosulfotlenku (DMSO) i ponownego zawieszenia komórek.</li>
	<li>Odwirować fiolkę przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości pożywki, aby utworzyć zawiesinę 100 000 komórek/ml, a następnie dodać 2 ml do jednego dołka sześciodołkowej płytki, wstępnie pokrytej przez 20 minut 0,2% żelatyną. 
	UWAGA: Siostrzana studzienka z równą liczbą komórek na linię i warunkiem musi zostać zasiana w celu obliczenia zliczania komórek/wielokrotności infekcji (MOI).</li>
	<li>Kołysz płytką na boki oraz w przód iw tył, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.</li>
	<li>W dniu transdukcji należy pobrać liczbę komórek z siostrzanej studzienki (studzienek) siostrzanej po około 24 godzinach od wstępnego posiewu HUF.</li>
	<li>Rozmrozić 2 x 108 TU lub równoważny koncentrat lentiwirusowy (STEMCCA) i rozcieńczyć do 1 x 108 TU/ml w pożywce HUF.</li>
	<li>Transdukuj komórki w stosunku 10-MOI w pożywkach HUF uzupełnionych środkiem transfekcyjnym o stężeniu 8 μg/ml. Równomiernie wymieszać przebadane studzienki i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.</li>
	<li>Około 24 godziny po transdukcji lentiwirusa należy zmienić pożywkę HUF na standardową pożywkę z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC).</li>
	<li>W dniach od 2 do 6 należy codziennie zmieniać pożywkę na pożywkę ludzką z PSC.</li>
	<li>W dniu 6 umieść dwie 0,2% pokryte żelatyną 10-centymetrowe płytki o wymiarach od 1,5 do 1,75 x 106 MEF pochodzących od myszy CF1 w pożywce HUF 12.</li>
	<li>W dniu 7, uważając, aby nie odwirować więcej niż 100 x g, użyj trypsyny w temperaturze pokojowej, aby usunąć przeprogramowane fibroblasty dnia 7 z jednego dołka płytki sześciodołkowej i przejść w stosunku 1:16, poprzez posiew wszystkich komórek równomiernie między dwiema 10-centymetrowymi płytkami, ze świeżymi ludzkimi pożywkami PSC, które zostały posiane MEF dzień wcześniej. Rozprowadzić agregaty komórek ruchem spiralnym zgodnie z ruchem wskazówek zegara i umieścić na noc w inkubatorze z wilgotnością 37 °C i 5% CO2</li> .
	<li>Około 48 godzin po wysianiu przeprogramowanych komórek na MEF, a następnie każdego dnia, należy wymienić zużyte ludzkie pożywki PSC na świeże pożywki.</li>
	<li>Po 3 do 4 tygodniach wybierz pojedyncze kolonie o typowej morfologii podobnej do ESC za pomocą igły o rozmiarze 21 i subklonuj do 24-dołkowej płytki, umieszczając około 8 do 10 pojedynczych kawałków określonych kolonii w indywidualnych dołkach na 24-dołkowej płytce pokrytej żelatyną o grubości 0,2%, wstępnie wysianej MEF pochodzącymi od myszy CF1 w ludzkim pożywce PSC. 
	UWAGA: Po ekspansji wybranych kolonii, kolonie muszą zostać scharakteryzowane jako pluripotencjalne poprzez tworzenie ciała zarodkowego i analizę ekspresji markerów pluripotencji na poziomie białka.</li>
</ol>
2. Analiza miejsca integracji wektorów i wycinanie STEMCCA
<ol>
	<li>Przeanalizuj miejsce integracji STEMCCA za pomocą nierestrykcyjnej amplifikacji liniowej PCR, jak opisano10.</li>
	<li>Po wykonaniu testu w celu zapewnienia jednej integracji z pożądanym obszarem genomu, należy wyciąć STEMCCA poprzez odsysanie starej ludzkiej pożywki ESC. Następnie połączyć 45 μl skoncentrowanego wirusa Adeno-Cre-PuroR z 8 μg/ml środka do transfekcji w 3 ml standardowej pożywki PSC przez 24 godziny.</li>
	<li>Po 24-godzinnym okresie inkubacji należy odessać mieszany supernatant wirusowy i dwukrotnie przemyć komórki ludzką pożywką PSC. Umieść świeżą ludzką pożywkę PSC wraz z 2 μg/ml puromycyny na okres 5 dni, codziennie zmieniając pożywkę na świeżą pożywkę i antybiotyk.</li>
	<li>Po 5 dniach sklonuj pozostałe kolonie za pomocą igły o rozmiarze 21 do studzienek pokrytych żelatyną o grubości 0,2%, na 12-dołkowej płytce wstępnie pokrytej MEF pochodzącymi z myszy CF1 i rozpręż się, jak opisano powyżej. 
	UWAGA: Po wystarczającym rozprężeniu w celu uzyskania zamrożonego materiału wymagane jest przełączenie na warunki wolne od karmienia. Spodziewaj się co najmniej 95% śmierci kolonii komórek macierzystych, ponieważ większość komórek nie zostanie pomyślnie przetransdukowana i ulegnie antybiotykowi w ciągu 5-dniowego okresu inkubacji. Chociaż Adeno-Cre-PuroR integruje się z wydajnością 0,001-1% z chromosomami gospodarza zakażonych komórek, ponowne wystawienie próbki kolonii wolnych od czynników na działanie puromycyny w celu zapewnienia 100% śmierci komórki potwierdzi, że nie nastąpiła integracja13.</li>
	<li>Rozmrozić jedną fiolkę wstępnie podzielonego na lód podłoża komórkowego przez okres około 2 godzin (zalecenia producenta) do momentu, aż matryca stanie się cieczą i rozcieńczyć do końcowego stężenia 1:30 w zimnej pożywce podstawowej. Pokryj żądaną liczbę dołków na płytce sześciodołkowej po 1 ml na studzienkę. Odstawić w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.</li>
	<li>Zakreskuj krzyżowo (za pomocą igły o rozmiarze 18 lub szklanej lub plastikowej "końcówki") co najmniej 20 do 30 kolonii ze studni uprzednio pokrytej MEF. Uważaj, aby zmniejszyć uniesienie MEF i przeniesienie z talerza.
	<ol>
		<li>Urządzenie do kreskowania krzyżowego można wygenerować na wiele różnych sposobów, od bardziej skomplikowanego podgrzewania, wyciągania i wykańczania szklanej pipety Pasteura na otwartym ogniu, po proste użycie sterylnej plastikowej końcówki do pipety lub, jak w naszym przypadku, igieł o rozmiarze 21 i/lub 18.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po inkubacji odessać matrycę z powleczonej studni.</li>
	<li>Usunąć kawałki kolonii przez delikatne zeskrobanie ze starej płytki za pomocą pipetora o pojemności 200 μl i ostrożnie umieścić w 3 ml świeżej pożywki połączonej 1 na płytce pokrytej matrycą. Inkubować przez noc w inkubatorze z wilgotnością 37 °C i 5% CO2 . Zmień nośnik 48 godzin po pasażu.</li>
	<li>Ekstrakcja genomowego DNA z przetworzonych hiPSC po wycięciu i bez podawania, przy ponad 80% konfluencji, przy użyciu komercyjnych zestawów do ekstrakcji DNA.</li>
	<li>Analizuj pod kątem prawidłowego wycięcia za pomocą starterów specyficznych dla egzogennych integracji lentiwirusa STEMCCA: gDNA-hendo-MycS-naprzód, 5′-acgagcacaagctcacctct-3′; gDNA-hWPRE-reverse, 5′-tcagcaaacagtgcacacc-3′. Rozpuść liofilizowane startery w wodzie klasy PCR do roztworu podstawowego 10 μM.</li>
	<li>Przeprowadzić PCR z następującym pięcioetapowym protokołem: początkowa denaturacja w temperaturze 95 °C przez 3 minuty; 35 cykli każdego z poniższych: denaturacja w temperaturze 98 °C przez 20 sekund, wyżarzanie startera w temperaturze 62 °C przez 15 sekund i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 15 sekund, a następnie końcowe przedłużenie w jednym cyklu w temperaturze 72 °C przez 3 minuty.</li>
	<li>Przygotuj 3% żel agarozowy, ważąc 1,5 grama agarozy i umieszczając go w 50 ml 1x buforu Tris-acetate-EDTA. Kuchenkę mikrofalową, aż agaroza się rozpuści i umieść w barwieniu żelu DNA w odpowiednim rozcieńczeniu, wymieszaj i dozuj odpowiednią objętość do kasety żelowej, aby zestalić się na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Załaduj 12 μl produktu PCR zmieszanego z 3 μl barwnika ładującego do 3% żelu agarozowego. Uruchom żel na 30 minut przy napięciu 80 V.</li>
	<li>Wizualizuj za pomocą światła ultrafioletowego brak pasma wskazującego na prawidłowe wycięcie.</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja różnic w ekspresji genów za pomocą ilościowego PCR z hiPSC przed i po wycięciu
<ol>
	<li>Ekstrakcja całkowitego RNA z przetworzonych hiPSC po wycięciu i bez podawania za pomocą komercyjnych zestawów do ekstrakcji RNA.</li>
	<li>Odwrotna transkrypcja do 1 μg całkowitego RNA przy użyciu komercyjnych zestawów zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj zakotwiczonych oligo(dT)18 i losowych starterów heksamerowych. 
	UWAGA: Upewnij się, że protokół PCR jest dostosowany do transkryptów genów o wielkości większej lub mniejszej niż 4 kb. Konieczne będzie wykonanie specjalnych starterów dla dowolnego genu, z którym STEMCCA jest pierwotnie zintegrowany.</li>
	<li>Rozpuść liofilizowany starter w wodzie klasy PCR do roztworu podstawowego o stężeniu 20 μM.</li>
	<li>Użyj 5 ng próbki na 20 μl reakcji, która składa się z sondy UPL 10 μM, 2x LightCycler 480 Probes Master oraz 20 μM starterów do przodu i do tyłu.</li>
</ol>
4. Konwersja do warunków klasy GMP
<ol>
	<li>W pierwszym dniu po przejściu hiPSC po wycięciu do warunków klasy GMP, należy przygotować mieszankę pożywek składającą się z pożywek złożonych z pożywek złożonych PSC dla ludzi 1 (pożywka kombinowana 1) i pożywki zgodnej z dobrą praktyką wytwarzania (GMP) klasy klinicznej (pożywka kombinowana 2) w proporcji 80:20.</li>
	<li>Odessać starą pożywkę pożywkę pożywką 1 i umieścić w niej 3 ml nowej pożywki złożonej 1 i 2, wstępnie podgrzanej, w stosunku 80:20. Zmieniaj media codziennie przez 3 dni z tym konkretnym stosunkiem. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>W dniu 4 ułóż połączone podłoża 1 i 2 w stosunku 50:50. Odessać starą pożywkę i zastąpić ją wstępnie podgrzaną pożywką, z pożywką połączoną 1 i 2 w stosunku 50:50. Zmieniaj media na 3 dni przy tym określonym stosunku. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>W dniu 7 ułóż połączone podłoża 1 i 2 w proporcji 20:80. Odessać starą pożywkę i zastąpić ją wstępnie podgrzaną pożywką, z pożywkami połączonymi 1 i 2 w proporcji 20:80. Zmieniaj media na 3 dni przy tym określonym stosunku. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>W dniu 10 przygotuj połączone pożywki 1 i 2 w stosunku 0:100. Odessać starą pożywkę i zastąpić ją wstępnie podgrzaną pożywką, z pożywką połączoną 1 i 2 w stosunku 0:100. Zmieniaj media codziennie w tym konkretnym stosunku. Komórki znajdują się teraz w całkowicie zdefiniowanym podłożu wolnym od kseno. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5%CO2. 
	UWAGA: Podczas całego procesu konwersji konieczne jest rutynowe pasażowanie za pomocą igły o rozmiarze 18, aby utrzymać odpowiednią wielkość i gęstość kolonii. Zaplanuj pasażowanie komórek co 4 do 5 dni na podstawie wielkości kolonii, konfluencji i różnicowania.</li>
	<li>Pokryj jedną studzienkę w płytce sześciodołkowej określonym substratem wolnym od kseno, zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	<li>Mechanicznie przeprowadź zlewającą się studzienkę, już przekształconą w warunki wolne od ksenoizolacji, z sześciodołkowej płytki za pomocą igły o rozmiarze 18. Co ważne, umieść nowe podłoża (pożywki kombinowane 2) na komórkach z 1x inhibitorem ROCK na 1 godzinę, przed pasażowaniem w celu wstępnego kondycjonowania pożywki.</li>
	<li>Odessać roztwór syntetycznego substratu z nowej płytki, na którą przenoszone są komórki. Usuń wszystkie podłoża zawierające grudki komórek macierzystych ze starej płytki i przenieś na nową płytkę.</li>
	<li>Umieść komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 2 dni przy minimalnych zakłóceniach fizycznych (najlepiej płytki po wejściu do inkubatora nie są w żaden sposób bezpośrednio dotykane), aby umożliwić maksymalne przywiązanie. 
	UWAGA: Ogniwa będą wymagały codziennej wymiany nośników. Ważne będzie ciągłe pasażowanie co 4 dni. Za pomocą igły o rozmiarze 21 przejdź tylko te części kolonii, które mają optymalną morfologię podobną do ESC (wysoki stosunek nukleocytoplazmatyczny). Zapewni to selekcję odpowiednich kolonii hiPSC, które będą dobrze rosły i ostatecznie dały jednorodne kolonie. Całkowity czas do wyprowadzenia kolonii podobnych do ESC wynosi od 15 do 20 dni po początkowej połączonej zmianie pożywki.</li>
	<li>Zamrozić po wycięciu hiPSC klasy GMP, najpierw kreskując wszystkie kolonie za pomocą igły o rozmiarze 18. Za pomocą pipetora o pojemności 200 μl pobrać wszystkie kawałki i przenieść wszystkie podłoża zawierające komórki do stożkowej fiolki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Podczas wirowania komórek należy przygotować pożywkę do zamrażania składającą się z równych objętości zimnej pożywki złożonej 2 i pożywki do zamrażania o końcowym stężeniu DMSO 7,5%.</li>
	<li>Po granulowaniu komórek odessać stare podłoże i kroplami ponownie zawiesić osad za pomocą pożywki do zamrażania. Natychmiast przenieść do fiolek do zamrażania i umieścić w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
5. Charakterystyka poprodukcyjnych hiPSC klasy GMP
<ol>
	<li>Aby zapewnić prawidłową ekspresję markerów pluripotencji po konwersji, należy użyć QPCR do ilościowego określenia ekspresji kluczowych markerów pluripotencji (SOX2, OCT4 i NANOG) przy użyciu starterów wymienionych w tabeli 1 z tymi samymi krokami, jak wspomniano w kroku 3. Metodologie QPCR wykonują te same kroki, które wymieniono w kroku 3.</li>
	<li>Za pomocą cytometrii przepływowej wykryć kwas sjalowy Neu5Gc (kwas N-glikolyloneuraminowy) zgodnie ze standardowymi warunkami wymienionymi w zestawie, jak wcześniej opublikowano10.</li>
	<li>Delikatnie umyj płytki z kulturami komórkowymi za pomocą 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Zdysocjuj kolonie za pomocą 1x odczynnika dysocjacyjnego przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Podczas 5-minutowego czasu inkubacji, o którym mowa w kroku 5.4, przygotuj roztwór blokujący (dostarczony w zestawie), wytwarzając 0,5% środek blokujący w lodowatym PBS.</li>
	<li>Oznaczyć następujący zestaw probówek do analizy cytometrii przepływowej: Niebarwione; 4′,6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) DAPI; Przeciwciało kontrolne 1:200; Przeciwciało pierwszorzędowe 1:200; Przeciwciało drugorzędowe 1:200 IgG przeciwko kurczakom osła (H+L); Przykładowe MEF-y; Próbka komórek po wycięciu na matrycy; i Próbka komórek po wycięciu na podłożu syntetycznym.</li>
	<li>Delikatnie usunąć agregaty komórkowe z kroku 5.4, dodając 2 ml roztworu blokującego i przenieść zawartość do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 80 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie roztworem blokującym i odwirować, jak podano w kroku 5.7.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić około 1 x 106 komórek w 100 μl roztworu blokującego z odpowiednią objętością rozcieńczenia każdego przeciwciała. Inkubować z delikatnym kołysaniem w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Powtórz pranie trzy razy, jak w kroku 5.8.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w 400 μl buforu rozcieńczalnika (z zestawu) z 1:100 DAPI dla probówek 2, 6, 7 i 8, jak podano w kroku 5.6.</li>
	<li>Przecedzić komórki przez sitko 40 μM i przepuścić przez cytometr przepływowy.</li>
</ol>

<ol><li>Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+field+of+induced+pluripotency%3A+Recent+progress+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges.</a> J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).</li>
<li>Lu, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+xeno-free+and+feeder-free+culture+system+for+the+derivation%2C+expansion+and+direct+differentiation+of+transgene-free+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).</li>
<li>Karumbayaram, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+skin+biopsy+to+neurons+through+a+pluripotent+intermediate+under+Good+Manufacturing+Practice+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols.</a> Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).</li>
<li>Mostoslavsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+magic+act+of+generating+induced+pluripotent+stem+cells%3A+many+rabbits+in+the+hat%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat.</a> Stem Cells. 30, 28-32 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 27, 543-549 (2009).</li>
<li>Somers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgene-free+lung+disease-specific+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+single+excisable+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excision+of+reprogramming+transgenes+improves+the+differentiation+potential+of+iPS+cells+generated+with+a+single+excisable+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector.</a> Stem Cells. 28, 64-74 (2010).</li>
<li>Papapetrou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+safe+harbors+permit+high+beta-globin+transgene+expression+in+thalassemia+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).</li>
<li>Awe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+conversion+to+putative+clinical-grade+status%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status.</a> Stem Cell Res Ther. 4, (2013).</li>
<li>Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Geron+Corporation+Press+Release%22">Geron Corporation Press Release</a>. , Geron. (2009).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).</li>
<li>Mitani, K., Kubo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+as+an+integrating+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adenovirus as an integrating vector.</a> Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).</li>
<li>Patterson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+nature+of+human+pluripotent+stem+cell+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny.</a> Cell Res. 22, 178-193 (2012).</li>
<li>Schroder, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+integration+in+the+human+genome+favors+active+genes+and+local+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots.</a> Cell. 110, 521-529 (2002).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).</li>
</ol>

James A. Byrne (JAB) i Agustin Vega-Crespo otrzymują fundusze na badania od Fibrocell Science, Inc. JAB jest konsultantem naukowym Fibrocell Science, Inc. Żaden inny autor nie ma żadnych konkurencyjnych interesów do ujawnienia.

Opisujemy metodologię wyprowadzania hiPSC wolnych od czynników i nadawania im znaczenia klinicznego poprzez przekształcanie tych komórek w warunki klasy GMP w celu dalszego różnicowania komórek w przyszłych terapiach dla ludzi. Chociaż protokół ten ma szerokie zastosowanie do różnych typów komórek, zdecydowaliśmy się przeprogramować ludzkie fibroblasty skórne ze względu na łatwość ekstrakcji od pacjenta i możliwość ich zastosowania w spersonalizowanych terapiach dla ludzi. Po usunięciu ograniczeń w zakresie pełnego różni...

Wykazano, że dorosłe komórki ludzkie są zdolne do przechodzenia epigenetycznej przebudowy i przeprogramowania, w wyniku opartej na lentiwirusie ekspresji czterech kluczowych czynników transkrypcyjnych4,5. Ważnym postępem w dziedzinie przeprogramowania było zastosowanie pojedynczej kasety z lentiwirusowymi komórkami macierzystymi (STEMCCA) podlegającej karetce, w której znajdowały się wszystkie cztery czynniki transkrypcyjne przeprogramowywania, co umożliwiło precyzyjny stosunek stechiometryczny ekspresji białka6. Dodatkowo, po transdukcji w określonej liczbie zakresów infekcji, STEMCCA może prowadzić głównie do pojedynczych zdarzeń integracji genomowej podczas procesu przeprogramowania7. Wprowadzenie akcyzowej wersji STEMCCA, która wykorzystuje technologię Cre/loxP, a następnie wycięcie wektora przeprogramowującego po wyprowadzeniu linii komórek macierzystych, umożliwiło wyprowadzenie linii indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC)bez czynników 8. Ponadto, w celu zwiększenia zastosowań terapeutycznych hiPSC, konieczne było wdrożenie nowatorskiej, szybkiej i łatwej do zastosowania metodologii konwersji linii komórkowych klasy dobrej praktyki wytwarzania (GMP) z warunków zawierających ksenozę do warunków wolnych od ksenoterapii. W tym miejscu omawiamy odpowiednią metodologię, która dokładniej ocenia zintegrowane różnice w ekspresji genów, szczególnie po zintegrowaniu z intronem, oraz konwersję komórek klasy klinicznej do przypuszczalnych warunków GMP. 
Poprzednie badania wykorzystywały tylko stosunkowo nieczułą analizę transkrypcyjną mikromacierzy do analizy różnic w ekspresji genów w zintegrowanych genach po transdukcji STEMCCA3,9. W tym miejscu przedstawiamy metodologię czułej ilościowej analizy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu dalszego zbadania zintegrowanych różnic w ekspresji genów. Co ważne, obecne kryteria "bezpiecznej przystani" odrzucają hiPSC, które mają geny z integracją wirusową, ograniczając w ten sposób możliwość zastosowania tych komórek w dalszych terapiach komórkowych u ludzi9. Sugerujemy, że status quo może ulec zmianie przy użyciu w pełni scharakteryzowanych i wolnych od transgenów intronnie przeprogramowanych hiPSC. Dodatkowo wprowadzamy solidny protokół konwersji komórek klasy GMP, który można łatwo zastosować do wielu różnych typów komórek, które pierwotnie uzyskano w warunkach zawierających ksenotyp10. Stwarza to znaczące możliwości rozwoju przyszłych eksperymentów z przeprogramowywaniem komórek, które wymagają warunków klinicznych, aby zachować znaczenie terapeutyczne dla ludzi. 
Te metodologie stanowią podstawę, na której obecne kryteria "bezpiecznej przystani" mogą zostać rozszerzone o scharakteryzowane przeprogramowane linie hiPSC STEMCCA, które utrzymują normalny profil ekspresji genów po wycięciu STEMCCA ze zintegrowanego intronu. Ponadto, pełna konwersja do warunków klinicznych, wolnych od antygenów zwierzęcych innych niż ludzie, pomoże włączyć znacznie więcej typów komórek, które wcześniej zostały przeprogramowane i scharakteryzowane tylko w warunkach zawierających kseno. Łączne te metodologie stanowią przekonującą podstawę dla amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) do rozważenia rozszerzenia swojego ograniczonego zatwierdzenia z terapii opartych na ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (ESC) na terapie oparte na hiPSC11. 
Niedawno szczegółowo opisaliśmy wyprowadzenie wolnej od czynników linii hiPSC, która została w pełni scharakteryzowana i przekształcona w domniemane warunki kliniczne10. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół wyprowadzania hiPSC z wykorzystaniem lentiwirusa STEMCCA. Te komórki macierzyste są następnie poddawane procesowi wycinania, po którym następuje charakterystyka ekspresji genów. Na koniec hiPSC są przekształcane w warunki klasy GMP za pomocą metodologii powolnej konwersji.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Pożywki i odczynniki</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (podłoże podstawowe)</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium (MEM) aminokwasy endogenne (NEAA), 100x</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep, penicylina-streptomycyna, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Rozmrażanie w 4 &stopni; C, podwielokrotność i przechowywać w &minus; 20 &stopni; C</td></tr><tr><td>Zamiennik serum nokautującego</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>Rozmrażanie w 4 &stopniach; C, podwielokrotność i przechowywać w &minus; 20 &stopni; C</td></tr><tr><td>Trypsyna / EDTA, 0,5%</td> <td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>Rozcieńczyć zapas do 0,05% w 1x PBS</td></tr><tr><td>Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów</td><td>GlobalStem (Rockville, MD, USA)</td> <td>GSR-2001</td><td>Repuszcza do 10 &mikro; g/ml zapasu w 0,1% albuminy surowicy bydlęcej rozpuszczonej w 1x PBS i przechowywać w temperaturze &minus; 80 stopni Celsjusza; C</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Millipore (Billerica, MA, USA)</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (matryca błony podstawnej)</td><td>BD Biosciences (San Jose, CA, USA)</td><td>356231</td><td>Rozcieńczyć fiolkę Matrigel w 10 ml DMEM/F12 na lodzie w celu rozcieńczenia 1:2. Podwielokrotność i przechowywać w &minus; 20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>CELLstart (Podłoże syntetyczne)</td><td>Invitrogen</td><td>A1014201</td><td></td></tr><tr><td>Stemmolecule Y27632</td><td>Stemgent (Cambridge, MA, USA)</td><td>04-0012-02</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Probes Master</td><td>Roche (Bazylea, Szwajcaria)</td><td>4707494001</td><td></td></tr><tr><td>ProFreeze-CDM Medium/medium do zamrażania</td><td>Lonza (Bazylea, Szwajcaria)</td><td>12-769E</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>100 BP DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628019</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Bezpieczny barwnik żelowy DNA 10,000x</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)</td><td>161-3101</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry wieprzowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>Sporządzić zapas w stężeniu 0,2% w PBS, autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies (Vancouver, BC, Kanada)</td><td>5850</td><td>Połącz suplement 5x z podłożem podstawowym, podwielokrotnością i przechowuj w temperaturze 4 stopni; C do 2 tygodni.</td></tr><tr><td>Stemedia NutriStem XF/FF Pożywka</td> hodowlana <td>Stemgent</td><td>05-100-1A</td><td>Rozmrozić w 4 & stopniach; C O/N, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze 4 & deg; C do 2 tygodni.</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen (San Diego, CA, USA)</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Accutase (odczynnik dysocjacyjny)</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anty-Chicken IgG AlexaFluor 488</td><td>Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)</td><td>703-546-155</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene/środek transfekcyjny</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Plasticware</ mocne></td></tr><tr><td>12-dołkowe płytki</td><td>VWR (West Chester, PA, USA)</td><td>29442-038</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>VWR</td><td>29442-042</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 10-centymetrowe</td><td>Igła Sigma-Aldrich</td><td>Z688819</td><td></td></tr><tr><td>o rozmiarze 18 Fisher</td><td>Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>148265D</td><td></td></tr><tr><td>Igła o rozmiarze 21 Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-829-10D</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>BD LSRII Cytometr przepływowy</td><td>KSystem firmy Nikon (Tokio, Japonia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Wersja 6.1.3 Oprogramowanie</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Kits</td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K182000</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do PCR KAPA HiFi Hotstart ReadyMix</td><td>KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA)</td><td>KK2601</td> Zestaw do izolacji RNA o wysokiej czystości Roche 11828665001 <td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA z transkryptorem</td><td>Roche</td><td>4379012001</td><td></td></tr><tr><td>Sialix Anti-Neu5Gc Basic Pack Kit</td><td>Sialix (Newton, MA, USA)</td><td>Pakiet</td><td></td></tr><tr> podstawowy<td colspan="4">Media<tr><td></td><td></td><td></td>Połączone media 1 Technologie StemCell oraz <td></td></tr></td></tr><tr><td></td><td> Stemgent</td><td></td><td>Składa się w równych częściach z mTeSR1 i Nutristem</td></tr><tr><td>Combined media 2</td><td>StemCell Technologies i Stemgent</td><td></td><td>Składa się z równych części TeSR2 i Nutristem</td></tr><tr><td>HUF Media</td><td></td><td></td><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium / F12 [DMEM / F12] uzupełniony o 10% płodową surowicę bydlęcą, 1x aminokwasy endogenne, 1x Glutamax i 1x Primocin</td></tr><tr><td>Human Pluripotent Stem Cell Media</td><td></td><td></td><td>DMEM / F12 uzupełnione o 20% zamiennik surowicy nokautującej, 1x Glutamax, 1x aminokwasy endogenne, 1x Primocin, 1x &beta;-merkaptoetanol i 10 ng / ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów.</td></tr><tr><td colspan="4">DMEM/F12, Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s średni/F12; PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami.</td></tr></tbody></table>

uzyskanie i charakterystyka wolnej od transgenów indukowanej przez człowieka pluripotencjalnej linii komórek macierzystych i konwersja do określonych stanów klinicznych

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) mogą być generowane za pomocą metodologii przeprogramowania opartej na lentiwirusach. Jednak ślady genów potencjalnie onkogennych pozostające w aktywnie transkrybowanych regionach genomu ograniczają ich potencjał do wykorzystania w zastosowaniach terapeutycznych u ludzi1. Ponadto antygeny inne niż ludzkie, pochodzące z przeprogramowania lub różnicowania komórek macierzystych w pochodne istotne z terapeutycznego punktu widzenia, uniemożliwiają zastosowanie tych hiPSC w kontekście klinicznym u ludzi2. W tym filmie przedstawiamy procedurę przeprogramowania i analizy hiPSC wolnych od czynników zewnętrznych. Te hiPSC mogą być następnie analizowane pod kątem nieprawidłowości ekspresji genów w specyficznym intronie zawierającym lentiwirusa. Analizę tę można przeprowadzić przy użyciu czułej ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), która ma przewagę nad mniej czułymi technikami stosowanymi wcześniej do wykrywania różnic w ekspresji genów3. Pełna konwersja do warunków dobrej praktyki wytwarzania (GMP) klasy klinicznej pozwala na kliniczne znaczenie dla ludzi. Nasz protokół oferuje inną metodologię – pod warunkiem, że obecne kryteria "bezpiecznej przystani" zostaną rozszerzone i obejmą charakteryzowane pochodne hiPSC do zastosowań terapeutycznych u ludzi – do wyprowadzania hiPSC klasy GMP, co powinno wyeliminować wszelkie ryzyko immunogenności spowodowane antygenami innymi niż ludzkie. Protokół ten ma szerokie zastosowanie do przeprogramowanych komórek lentiwirusowych dowolnego typu i zapewnia powtarzalną metodę przekształcania przeprogramowanych komórek w warunki klasy GMP.

Przedstawiamy protokół otrzymywania hiPSC klasy klinicznej, wolnych od czynników, z wykorzystaniem metody reprogramowania opartej na lentiwirusie STEMCCA. Rycina 1A przedstawia reprezentacyjny obraz trzech różnych linii hiPSC po wycięciu transgenów, po reprogramowaniu metodą STEMCCA na warstwie MEF. Główną zaletą podejścia STEMCCA jest powtarzalność sukcesu reprogramowania osiągana przez wielu naukowców w różnych grupach badawczych i lokalizacjach. Rycina 1B przedstawia żel po odwrotnej ...

Opisujemy protokół wyprowadzania opartych na lentiwirusach, przeprogramowanych i scharakteryzowanych, bezczynnikowo indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i przekształcania ich w domniemane warunki kliniczne.

Uzyskanie i charakterystyka wolnej od transgenów indukowanej przez człowieka pluripotencjalnej linii komórek macierzystych i konwersja do określonych stanów klinicznych

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wyprowadzenie pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka na bazie lentiwirusów, przeprogramowanych, wolnych od czynników ludzkich i przekształcenie tych komórek w przypuszczalne stany kliniczne. Osiąga się to poprzez uprzednie przeprogramowanie dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych za pomocą pojedynczej, dużej kasety z lentiwirusowymi komórkami macierzystymi lub samochodu macierzystego w PSC HI. Następnie przeprogramowane PSC HI są wystawiane na działanie wirusa mruczenia adeno Cree w celu pełnego wycięcia i usunięcia macierzystego samochodu z genomu gospodarza.Następnie ekstrakcja genomowego DNA z wolnych od feedera HI PSC, a następnie analiza agel potwierdza prawidłowe wycięcie wagonu macierzystego. Wreszcie, czynnik trzeci H IPC są przekształcane w przypuszczalne warunki klasy GMP za pomocą metodologii powolnej konwersji do w pełni zdefiniowanych warunków wolnych od ksenomorfozy. Ostatecznie, wirusowe przeprogramowanie dorosłych fibroblastów skóry i pełna konwersja H IPC do warunków klinicznych podkreśla szerokie zastosowanie tej metodologii do przeprogramowania dorosłych komórek ludzkich i przekształcania ich w stany klinicznie istotne.Implikacje tej techniki rozciągają się na zastosowania kliniczne ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, ponieważ są one całkowicie wolne od czynników i przekształcane do warunków klinicznych, dzięki czemu są kompatybilne z ludzkimi terapiami. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ przeprogramowanie, wycięcie i etapy konwersji klasy klinicznej są trudne do nauczenia się ze względu na główne skomplikowane i specyficzne procedury, których należy przestrzegać, aby uzyskać czynnik trzeci i klinicznie indukowane ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste Aby rozpocząć rozmrażanie. Dorosłe ludzkie fibroblasty skórne lub HAF w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty.Należy uważać, aby nie zanurzyć górnej części fiolki w wodzie. Umieść jednomililitrową zawiesinę komórek w 15-mililitrowej fiolce kroniki, aby ponownie zawiesić komórki i rozcieńczyć DMSO w sposób kroplowy. Powoli dodaj cztery mililitry wstępnie podgrzanego podłoża huff, odwiruj fiolet 200 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie zasysaj sup, nacent i reus. Zawieś komórki w pożywce do 100 000 komórek na mililitr w jednym dołku sześciodołkowej płytki preco do 0,2% żelatyny. Dodaj dwa mililitry zawiesiny komórek, a następnie dodaj dwa mililitry zawiesiny na sekundę.Cóż, aby można je było wykorzystać do pomiaru wielokrotności infekcji lub MOI, kołysz płytką na boki i tam iz powrotem, aby równomiernie rozprowadzić komórki przed inkubacją przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w wilgotnej komorze. 24 godziny później, po zliczeniu komórek, rozmrozić dwukrotnie osiem jednostek transdukcji lub S równoważnego koncentratu lentiwirusowego i użyć pożywki do rozcieńczenia do 10 razy do ośmiu t na mililitr przy użyciu połowy pożywki uzupełnionej ośmioma mikrogramami na mililitr odczynnika do transfekcji. Transdukuj komórki przy współczynniku 10 wielokrotności infekcji.Równomiernie wymieszać dołki transdukcyjne i inkubować przez noc około 24 godziny po transdukcji lentiwirusa. Usuń pożywkę i zastąp ją standardową pożywką z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych lub pożywką PSC. Zmieniaj pożywkę codziennie w dniach od drugiego do szóstego dnia na dwie 0,2% pokryte żelatyną 10-centymetrowe talerze 1,5 do 1,75 razy 10 do sześciu mysich fibroblastów embrionalnych pochodzących z pierwszego czynnika składnika dopełniacza lub mukowiscydozy jednej myszy w połowie pożywki w siódmym dniu.Dodaj wycieczki w temperaturze pokojowej do jednej studzienki z sześciodołkowej płytki przeprogramowanych fibroblastów. Delikatnie zdejmuje komórki i obraca 100 razy G ze świeżą ludzką pożywką PSC wszystkie komórki w stosunku od 1 do 16 na dwóch 10-centymetrowych płytkach metamfetaminy CFI. Rozprowadzić agregaty ruchem spiralnym zgodnie z ruchem wskazówek zegara i inkubować przez około 48 godzin przed wymianą pożywki.Po trzech do czterech tygodniach użyj igły o rozmiarze 21, aby wybrać od ośmiu do 10 pojedynczych kawałków określonych kolonii o typowej morfologii podobnej do ESC i po ekspansji sklonować je do indywidualnych studzienek CFI MFS. Potwierdzić, że komórki są pluripotencjalne poprzez tworzenie ciała zarodka i analizę ekspresji markerów po zweryfikowaniu miejsca integracji samochodu macierzystego, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym. Samochód z trzpieniem akcyzowym, najpierw odsysając starą pożywkę PSC dla ludzi do trzech mililitrów standardowego podłoża PSC łącznie.45 mikrolitrów skoncentrowanego adeno Cree pur lub wirusa z ośmioma mikrogramami na mililitr środków do transfekcji. Następnie dodać do komórek i inkubować przez 24 godziny po inkubacji, zassać supinat wirusa, skłonić ludzką pożywkę PSC do dwukrotnego przemycia komórek. Następnie dodaj pożywkę HPSC z dwoma mikrogramami na mililitr czystej mycyny i wymieniaj codziennie po pięciu dniach, subklonuj pozostałe kolonie i rozwijaj je zgodnie z opisem wcześniej w filmie.Następnie rozmrozić jedną fiolkę z matrycą błony podstawnej pre Eloqua na lodzie i rozcieńczyć zimną pożywkę podstawową do końcowego stężenia od jednego do 30. Użyj jednego mililitra na studzienkę, aby pokryć żądaną liczbę dołków sześciodołkowej płytki i pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej na jedną godzinę. Następnie za pomocą igły o rozmiarze 18 kreskuj co najmniej 20 do 30 kolonii ze studni wcześniej pokrytej mes.Zadbaj o to, aby ograniczyć podnoszenie na duchu i przenoszenie komórek z płytki. Po godzinnej inkubacji odessać matrycę z pokrytej studzienki pipetą o pojemności 200 mikrolitrów. Usuń kawałki kolonii, delikatnie zeskrobując je ze starej płytki i ostrożnie umieść je w trzech mililitrach świeżo połączonego podłoża, po jednym na płytce pokrytej matrycą.Po inkubacji przez 48 godzin zmieniaj podłoże codziennie, gdy wycięte po wycięciu i bez karmienia przekształcone HI PSC osiągną płynność 80% CO. Użyj komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA, aby wyekstrahować genomowe DNA za pomocą pokazanych tutaj starterów, które są specyficzne dla egzogennych integracji lentiwirusa macierzystego. Przeanalizuj DNA metodą PCR pod kątem prawidłowego wycięcia w celu przejścia po wycięciu HI PSC do warunków klasy GMP.Wymieszaj pożywkę kombinowaną HPSC jeden i pożywkę zgodną z GMP klasy klinicznej lub pożywkę kombinowaną dwa w stosunku 80 do 20 podgrzanych do 37 stopni Celsjusza. Odessać starą pożywkę pożywkę pożywkę ze komórek i zastąpić trzema mililitrami nowego roztworu ciepłej pożywki. Wymieniaj pożywkę codziennie przez trzy dni, pasażując zgodnie z protokołem tekstowym, aby utrzymać odpowiednią wielkość i gęstość kolonii w czwartym dniu, zastąp pożywkę mieszanką 50-50 ciepłych połączonych pożywek jeden i dwa inkubować przez trzy dni.Wymieniając pożywkę codziennie w siódmym dniu, zmień stosunek 20 do 80 podgrzanych połączonych pożywek odpowiednio jeden i dwa i wymieniaj codziennie przez trzy dni. W dniu 10 zmień na ciepłe, w 100% połączone podłoże dwa i zmieniaj codziennie. Komórki znajdują się teraz na całkowicie zdefiniowanym podłożu wolnym od kseno.Następnie, po użyciu zdefiniowanego substratu wolnego od ksenotypów do pokrycia jednej studzienki z sześciodołkowej płytki, zastąp wolne od ksenoizolacji podłoże w studzience komórek konfluencji świeżym podłożem zawierającym jedną x skałę. Po inkubacji przez godzinę użyj igły o rozmiarze 18, aby mechanicznie umieścić komórki w świeżo przygotowanym roztworze. Cóż, pozwól komórkom inkubować się bez zakłóceń przez dwa dni, aby umożliwić maksymalne przywiązanie przed scharakteryzowaniem komórek zgodnie z protokołem tekstowym.Ten rysunek przedstawia reprezentatywny obraz trzech różnych wstępnie wyciętych linii H-I-P-S-C po przeprogramowaniu z podejściem do samochodu macierzystego na warstwie mes pokazany tutaj jest żel PCR z odwrotną transkrypcją po wycięciu, pokazujący jeden konkretny subklon całkowicie wolny od lentiwirusa macierzystego, o czym świadczy brak prążka amplikonu specyficznego dla określonej sekwencji endogennej dla samochodu macierzystego. Na tym rysunku przedstawiono wstępnie przekształcone IPC na matrycy zawierającej kseno i IPC wolne od ksenozy GMP klasy H po akcyzie na matrycy syntetycznej przedstawiono ilościowo standardowe czynniki związane z pluripotencją, w tym SOX dwa, OCT cztery i nanog. Korzystanie z QPCR jest zilustrowane tutaj.Wreszcie, jak widać tutaj, PSC HI przekształcone przed konwersją i po konwersji do warunków klasy GMP przetestowano za pomocą cytometrii przepływowej pod kątem kwasu sjalowego i glikolu kwasu neuronowego wskazujących na antygeny inne niż ludzkie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprogramować ludzkie dorosłe fibroblasty skóry za pomocą wirusa przeprogramowania stemco, wyciąć wirusa z genomu, a następnie w pełni przekształcić te HI PSC w warunki kliniczne w pełni kompatybilne z terapiami dla ludzi. Nie zapominaj, że praca ze staca, wektorem przeciwwirusowym trzeciej generacji, może być niezwykle niebezpieczna i wymaga środków ostrożności.Podczas wykonywania tej procedury należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej i pomieszczenia do hodowli tkankowych VSL two plus.

derivation-characterization-transgene-free-human-induced-pluripotent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pomimo niedawnych postępów w modyfikacjach genetycznych, transfekcja ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (HESCs) pozostaje procesem nieprzewidywalnym. Według naszej wiedzy, w literaturze nie opisano systematycznych i wydajnych metod transfekcji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs). W niniejszej pracy opisujemy niezawodne protokoły wydajnej transfekcji i nukleofekcji ludzkich iPSCs.

Transfekcja i nukleofekcja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

Przedstawiamy protokół efektywnego przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) przy użyciu wektorów retrowirusowych kodujących Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-myc (OSKM) oraz metodę identyfikacji prawidłowo przeprogramowanych hiPSC poprzez barwienie żywych komórek przeciwciałem Tra-1-81.

Wybór i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z fibroblastów dorosłych

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Tutaj prezentujemy naszą sprawdzoną metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na wolne od transgenów ludzkie iPSC z wirusem Sendai, która wykazuje spójne wyniki i zwiększoną efektywność.

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Ten protokół opisuje, jak generować indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach wolnych od karmy, używając kombinacji wektorów matrigelu i wirusa Sendai zawierających czynniki przeprogramowujące.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich obwodowych limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai w warunkach wolnych od żywiciela

Regularna charakterystyka indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), w celu zapewnienia utrzymania ich stanu pluripotencjalnego, jest ważnym krokiem przed wykorzystaniem tych komórek do innych zastosowań. W tym miejscu opisujemy metodę rozmnażania ludzkich iPSC na małą skalę, zaprojektowaną specjalnie w celu umożliwienia ich łatwej i rutynowej charakterystyki za pomocą immunocytochemii.

Rozmnażanie na małą skalę ludzkich iPSC w warunkach wolnych od surowicy w rutynowej charakterystyce immunocytochemicznej

Ten protokół opisuje przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i błonowych mezenchymalnych komórek macierzystych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu nieintegrującego podejścia epizodycznego w pełni zdefiniowanych chemicznie warunkach. Szczegółowo opisano procedury ekstrakcji, hodowli, przeprogramowania i charakterystyki powstałych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą rygorystycznych metod.

Przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów

Solidne pochodzenie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPS) zostało osiągnięte dzięki zastosowaniu nieintegrującego wirusa Sendai (SeV) wektorowego przeprogramowania fibroblastów skóry. Utrzymanie komórek hiPS i ekspansja klonalna przeprowadzono przy użyciu wolnych od ksenotypów i chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli z rekombinowaną ludzką lamininą 521 (LN-521) i podłożem Essential E8 (E8).

Bezintegracyjne wyprowadzanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu matrycy Laminin 521

Tutaj prezentujemy protokół precyzyjnego tworzenia hemogennego śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w stanie wolnym od karmów i kseno. Metoda ta będzie miała szerokie zastosowanie w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych pod kątem związków terapeutycznych.

Różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu

Poznaj metodę uzyskiwania wolnych od czynników ludzkich komórek pluripotencjalnych hiPSC z fibroblastów skórnych i ich konwersję do warunków klinicznych. Protokół obejmuje reprogramowanie lentiwirusowe, ekscyzję kasyety Cre i przygotowanie GMP.

Uzyskanie i charakterystyka wolnej od transgenów indukowanej przez człowieka pluripotencjalnej linii komórek macierzystych i konwersja do określonych stanów klinicznych (Wideo) | JoVE Journal

Uzyskanie i charakterystyka wolnej od transgenów indukowanej przez człowieka pluripotencjalnej linii komórek macierzystych i konwersja do określonych stanów klinicznych

Przeglądaj więcej filmów