Hybrydowa metoda ekstrakcji DNA do jakościowej i ilościowej oceny zbiorowisk bakteryjnych z próbek produkcyjnych drobiu

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest opracowanie nowatorskiej techniki ekstrakcji DNA, która łączy mechaniczną homogenizację DNA z usuwaniem inhibitorów PCR oraz złotym standardem i metodą ekstrakcji somatycznej do próbek środowiskowych wzdłuż ciągłości produkcji drobiu. Osiąga się to poprzez najpierw podzielenie próbki środowiskowej na mikroprobówki wirówkowe zawierające mieszaninę kulek w celu skutecznej homogenizacji złożonych próbek środowiskowych. Drugim krokiem jest umieszczenie probówek w homogenizatorze o dużej mocy, aby skutecznie uwalniać kwasy nukleinowe z komórek bakteryjnych i matrycy środowiskowej.

Następnie homogenat jest używany jako materiał wyjściowy do złotej metody enzymatycznej ekstrakcji DNA w fazie wiązania inhibicji PCR. Ostatnim krokiem jest umieszczenie próbek w zrobotyzowanej stacji roboczej do ekstrakcji DNA, aby zapewnić użytkownikowi wyekstrahowane próbki DNA nadające się do wielu dalszych zastosowań, ostatecznie ilościowych PCR i analizy mikrobiomu przy użyciu aluminiowej platformy MiSeq, które zostały wykorzystane do pokazania, że ta nowatorska metoda hybrydowa zapewnia najlepsze połączenie jakościowych i ilościowych ocen całkowitych społeczności bakteryjnych w porównaniu z przetwarzaniem próbek metodą ekstrakcji mechanicznej lub enzymatycznej sam. Metoda ta zapewnia wgląd w analizę zbiorowisk mikrobiologicznych wzdłuż kontinuum produkcji drobiu, ale może być również stosowana do innych systemów rolniczych, takich jak produkcja trzody chlewnej, bydła lub roślin roślinnych, które zawierają podobnie złożone próbki środowiskowe.

Dzisiaj tę procedurę zademonstruje Kaitlyn Griffin, studentka w moim laboratorium. Aby rozpocząć eksperyment, ustaw łaźnię wodną na 95 stopni Celsjusza. Następnie odważ trzy powtórzenia po 0,33 grama, aby przeanalizować łącznie jeden gram temperatury pokojowej, gleby lub materiału kałowego do dwumililitrowych rękawic do wymiany probówek ET z matrycą lizy między próbkami.

Dodać 825 mikrolitrów buforu fosforanu sodu i 275 mikrolitrów roztworu do lizy wstępnej lub PLS do probówki z próbką. Następnie wirować próbki przez 15 sekund po wymieszaniu, odwirować probówki w temperaturze 14 000 G przez pięć minut. Zdekantować supernatant i dodać 700 mikrolitrów buforu A SL. Następnie wiruj rurkę przez pięć sekund.

Otwieraj jedną probówkę na raz, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Następnie upewnij się, że w stożkowej probówce jest 10% całkowitej objętości przed umieszczeniem próbek w urządzeniu do szybkiego przygotowania 24. Homogenizować próbki z prędkością sześciu metrów na sekundę przez 40 sekund.

Zwróć uwagę na różnicę między szybkim przygotowaniem 24 a wirowaniem po homogenizacji. Odwirować próbkę o sile 14 000 g przez pięć minut. Przenieść supernatant do sterylnej dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej do pozostałej próbki w probówce ET z matrycą lizującą przy dodatkowych 700 mikrolitrach buforu SL, ponownie homogenizować i odwirować.

Korzystając z poprzednich ustawień, umieść plastikowe klipsy blokujące na probówkach z próbkami, aby upewnić się, że nie pękną i inkubuj supernatanty w łaźni wodnej o temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie otwórz każdą probówkę z mikrowirówką, aby zwolnić ciśnienie, ponownie zamknij probówki i wiruj je przez 15 sekund. Odwirować próbki w temperaturze 14 000 g przez jedną minutę.

Po odwirowaniu przenieś 1,2 mililitra supernatantu do sterylnej dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Następnie umieścić blister zawierający tabletkę bezpośrednio nad otwartą probówką mikrowirówki i delikatnie wypchnąć tabletkę z blistra do probówki. Aby uniknąć kontaktu między tabletką inhibit X a probówką, do każdej próbki dodać jedną tabletkę inhibit X.

Następnie wiruj probówki, aż próbki zamienią się w jednolicie białawą ciecz. Inkubować próbki przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i odwirowywać je w temperaturze 14 000 serów przez pięć minut, unikając wszelkich pozostałych cząstek na dnie probówek. Przenieś cały płyn do sterylnej mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra.

Następnie odwiruj probówki na pełnych obrotach przez pięć minut. Przed rozpoczęciem automatycznego oczyszczania DNA upewnij się, że stacja robocza zawiera odpowiednią ilość końcówek filtrujących i. Następnie dodaj rurki ellucjanowe i rurki filtracyjne do adapterów wirnika i dodaj 400 mikrolitrów każdej próbki do środkowej szczeliny adaptera wirnika.

Umieść adaptery wirnika w wirówce stacji roboczej i upewnij się, że wszystkie pokrywy probówek mikrowirówek są prawidłowo zamocowane w adapterze wirnika. Dodaj roztwór proteinazy K do sterylnej 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki i umieść ją w gnieździe A na stacji roboczej. Dodaj dwie mililitrowe mikroprobówki wirówkowe z bezpiecznym zamkiem do sekcji wytrząsarki stacji roboczej i upewnij się, że pokrywki probówek z próbkami są bezpiecznie umieszczone.

Korzystając z ekranu dotykowego na stacji roboczej, wybierz protokół wykrywania patogenów ludzkiego kału DNA w stolcu i przeczytaj kolejne ekrany, aby upewnić się, że stacja robocza została prawidłowo załadowana. Po przejściu wszystkich ekranów sprawdzających wybierz start, aby uruchomić protokół. Następnie wyjmij próbki z adapterów wirnika.

Połączyć trzy powtórzone procesy oczyszczania dla pojedynczej próbki za pomocą systemu opartego na odparowywaniu wirowania. Ponownie eluować próbkę do końcowej objętości 100 mikrolitrów za pomocą buforu tris EDTA. Na koniec należy zakryć próbki i umieścić je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne do dalszej analizy.

Wykres ten pokazuje, że metoda mechaniczna konsekwentnie zapewniała ogólnie najwyższe szacunki całkowitej liczebności znormalizowanych genów bakteryjnych dla próbek kału i ściółki. Metoda enzymatyczna miała najniższe oszacowania we wszystkich przypadkach. Nowatorska metoda ekstrakcji hybrydowej pozwoliła uzyskać najlepszą kombinację jakościowych i ilościowych szacunków całkowitej społeczności bakteryjnej.

Z trzech badanych metod ekstrakcji. Teraz powinieneś lepiej zrozumieć, jak przeprowadzić tę nowatorską, półautomatyczną hybrydową metodę ekstrakcji DNA i dostrzec jej przydatność w jakościowej i ilościowej ocenie społeczności drobnoustrojów na podstawie złożonych próbek środowiskowych.