Name: Hybrydowa metoda ekstrakcji DNA do jakościowej i ilościowej oceny zbiorowisk bakteryjnych z próbek produkcyjnych drobiu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Poznaj hybrydową metodę ekstrakcji DNA łączącą homogenizację mechaniczną z enzymatyczną do analizy zbiorowisk bakteryjnych z próbek drobiu. Technika zapewnia lepszą jakościową i ilościową ocenę mikrobiomu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Latoyi Wiggins i Katelyn Griffin za pomoc w pozyskiwaniu próbek, a także Laurze Lee Rutherford za pomoc w pobieraniu próbek i analizach molekularnych. Chcielibyśmy również podziękować Sarah Owens z Argonne National Lab za przygotowanie i sekwencjonowanie próbek mikrobiomicznych. Badania te były wspierane w równym stopniu przez Służbę Badań Rolniczych, projekty USDA CRIS "Redukcja patogenów i parametry przetwarzania w systemach przetwórstwa drobiu" #6612-41420-017-00 oraz "Podejścia molekularne do charakterystyki patogenów przenoszonych przez żywność u drobiu" #6612-32000-059-00.

1. Mechaniczna homogenizacja próbek środowiskowych produktów drobiarskich
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Przed ekstrakcją należy ustawić łaźnię wodną na 95 °C i odczekać, aż łaźnia wodna osiągnie tę temperaturę.</li>
	<li>Odważyć 0,33 g gleby lub materiału kałowego do probówki Lysing Matrix E o pojemności 2 ml.
	<ol>
		<li>Nie przekraczaj 0,33 g sample w probówce, ponieważ spowoduje to, że następujące roztwory przekroczą pojemność probówki.</li>
		<li>Rozmrozić zamrożone próbki do RT przed ważeniem.</li>
		<li>Aby przeanalizować łącznie 1 g gleby/kału, należy odważyć 3 powtórzone próbki po 0,33 g dla każdej pojedynczej próbki środowiskowej.</li>
		<li>W razie potrzeby próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C w stożkowych probówkach matrycowych przed ekstrakcją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 825 μl buforu fosforanu sodu i 275 μl roztworu PLS do probówki z próbką. Mieszać za pomocą wiru przez ~15 sekund, a następnie odwirowywać próbki przy 14 000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i dodać 700 μl buforu ASL. Mieszaj za pomocą wiru przez 5 sekund.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że w tym momencie w stożkowej rurze jest dostępna przestrzeń nad głową (~10% całkowitej objętości). Jeśli nie ma przestrzeni nad roztworem, probówki będą miały tendencję do przeciekania podczas następnego etapu homogenizacji, co może prowadzić do zanieczyszczenia krzyżowego i/lub utraty próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść próbki w urządzeniu FastPrep 24 i homogenizuj próbki z prędkością 6,0 m/s przez 40 sekund.</li>
	<li>Odwirować homogenizowaną próbkę o masie 14 000 x g przez 5 minut. Przenieść supernatant do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Aby zmaksymalizować odzysk DNA z próbki, powtórz kroki od 1,4 do 1,6, łącząc supernatanty w tej samej sterylnej probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml.</li>
</ol>
2. Hamowanie enzymatyczne inhibitorów z homogenatów próbek
UWAGA: Ten protokół korzysta z QIAamp DNA Stool Mini Kit.
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Inkubować supernatant w łaźni wodnej o temperaturze 95 °C przez 5 minut, aby zmaksymalizować odzyskiwanie DNA z pozostałych komórek w supernatancie.
	<ol>
		<li>Inkubować w temperaturze 70 °C w przypadku próbek zawierających głównie organizmy Gram-ujemne. Jeżeli jednak obecne są organizmy Gram-dodatnie (co ma miejsce w przypadku próbek kału drobiu), należy je inkubować w temperaturze 95 °C.</li>
		<li>Użyj plastikowych klipsów blokujących na probówkach do mikrowirówek, aby upewnić się, że probówki nie "pękną" i nie stracą objętości próbki, ponieważ może wzrosnąć ciśnienie w tych szczelnych probówkach do mikrowirówek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz każdą probówkę do mikrowirówki, aby uwolnić ciśnienie, ponownie zakręć probówki do mikrowirówek i mieszaj za pomocą wiru przez 15 sekund.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 14 000 x g przez 1 minutę, usunąć 1,2 ml supernatantu i umieścić go w nowej, sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Dodaj 1 tabletkę InhibitEx do każdej próbki i mieszaj za pomocą wiru, aż próbka stanie się jednolicie biała/biaława cieczą.
	<ol>
		<li>Unikaj dotykania tabletki InhibitEx podczas umieszczania jej w probówce mikrowirówki zawierającej próbkę. W tym celu należy umieścić blister zawierający tabletkę bezpośrednio nad otwartą probówką do mikrowirówki i delikatnie wypchnąć wypustkę z blistra do probówki do mikrowirówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować próbkę przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (~ 25 °C) i wirować przy 14 000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Przenieś cały płyn do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwiruj przy 14 000 x g przez 5 minut.
	<ol>
		<li>Unikaj wszelkich pozostałych cząstek stałych, które mogły osadzać się na dnie probówki mikrowirówki na końcu kroku 2.5 podczas przenoszenia cieczy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Automatyczne oczyszczanie DNA za pomocą zrobotyzowanej stacji roboczej QIAcube
UWAGA: Liczba plastikowych materiałów eksploatacyjnych, rozmieszczenie adapterów wirnika próbki w wirówce oraz wymagane objętości/roztworów zależą od liczby próbek, które są w trakcie badania.
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Dodaj probówki elucyjne i rurki filtracyjne do odpowiednich szczelin w adapterach wirnika. Dla każdej próbki dodać 400 μl do środkowej szczeliny adaptera wirnika. Umieść adaptery wirnika w wirówce stacji roboczej w odpowiednim układzie, w zależności od liczby oczyszczanych próbek.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że wszystkie pokrywy probówek do mikrowirówek są odpowiednio zabezpieczone w adapterze wirnika, ponieważ niezastosowanie się do tego może spowodować ścinanie podczas jednego z etapów wirowania w protokole oczyszczania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj wymaganą liczbę końcówek filtrujących 1 000 μl i 200 μl do stacji roboczej i napełnij dostarczone butelki buforowe wymaganą objętością. 
	UWAGA: wymagane do tego protokołu oczyszczania (AL, AW1, AW2 i AE) są zawarte w zestawie QIAamp DNA Stool Mini Kit. Użytkownik musi dostarczyć 100% etanol, który jest potrzebny do AW oraz jako roztwór stosowany w procesie oczyszczania.</li>
	<li>Dodać wymaganą objętość dostarczonego roztworu proteinazy K do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i umieścić ją w szczelinie A na stacji roboczej. Należy również dodać wymaganą liczbę (równą liczbie oczyszczanych próbek) probówek RB z mikrowirówki o pojemności 2 ml z bezpiecznym zamknięciem do sekcji wytrząsarki stacji roboczej.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że pokrywki probówek z próbkami są bezpiecznie umieszczone w odpowiednich szczelinach na stacji roboczej, ponieważ niewykonanie tego spowoduje błąd, gdy urządzenie początkowo skanuje stację roboczą, aby upewnić się, że wszystkie potrzebne tworzywa sztuczne i płyny są dostępne do żądanego przebiegu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Korzystając z ekranu dotykowego na stacji roboczej, wybierz Protokół wykrywania DNA Stolec – Ludzki Stolec – Patogen Detection Protocol i czytaj kolejne ekrany, aby upewnić się, że stacja robocza została załadowana poprawnie. Po przejściu wszystkich ekranów sprawdzających wybierz pozycję Uruchom, aby uruchomić ten protokół.
	<ol>
		<li>W przypadku ekstrakcji DNA z więcej niż 12 próbek należy rozpocząć proces homogenizacji (krok 1) dla następnego zestawu próbek, ponieważ seria 12 próbek zajmuje ~72 minuty na stacji roboczej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjąć próbki z adapterów wirnika, przykryć je i umieścić w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będą potrzebne do dalszych analiz.
	<ol>
		<li>W tym momencie należy połączyć 3 powtórzone oczyszczania dla pojedynczej próbki (całkowita analizowana ilość = 1 g) za pomocą systemu opartego na wirowaniu/odparowywaniu. Połączyć kontrpróby i ponownie eluować do końcowej objętości 100 μl buforu Tris-ETDA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+currently+used+commercial+DNA-extraction+methods+give+different+results+of+clostridial+and+actinobacterial+populations+derived+from+human+fecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+ecology%22%5BJournal%5D)">The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples.</a> FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).</li>
<li>Tang, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+method+for+isolation+of+DNA+from+pig+faeces+and+comparison+of+five+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological%22%5BJournal%5D)">An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods.</a> Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).</li>
<li>McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+five+methods+for+extraction+of+bacterial+DNA+from+human+faecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological%22%5BJournal%5D)">A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples.</a> Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).</li>
<li>Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+DNA+extraction+kits+for+PCR-DGGE+analysis+of+human+intestinal+microbial+communities+from+fecal+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+journal%22%5BJournal%5D)">Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens.</a> Nutrition journal. 9, 23(2010).</li>
<li>Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+method+affects+microbial+community+profiles+from+soils+and+sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+microbiology+and+biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment.</a> Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).</li>
<li>Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimising+Bacterial+DNA+Extraction+from+Faecal+Samples%3A+Comparison+of+Three+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22The+Open+microbiology+journal%22%5BJournal%5D)">Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods.</a> The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).</li>
<li>Claassen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+efficiency+of+five+different+commercial+DNA+extraction+kits+for+extraction+of+DNA+from+faecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological%22%5BJournal%5D)">A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples.</a> Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).</li>
<li>Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+DNA+extraction+methods+for+analysis+of+turkey+cecal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota.</a> Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).</li>
<li>Salonen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+fecal+DNA+extraction+methods+with+phylogenetic+microarray%3A+effective+recovery+of+bacterial+and+archaeal+DNA+using+mechanical+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological+methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis.</a> Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).</li>
<li>Peng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+direct+boiling+method+with+commercial+kits+for+extracting+fecal+microbiome+DNA+by+Illumina+sequencing+of+16S+rRNA+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological%22%5BJournal%5D)">Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags.</a> Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).</li>
<li>Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+for+the+extraction+and+purification+of+DNA+from+the+human+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome.</a> PloS one. 7, 33865(2012).</li>
<li>Qu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Metagenomics+Reveals+Host+Specific+Metavirulomes+and+Horizontal+Gene+Transfer+Elements+in+the+Chicken+Cecum+Microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome.</a> PloS one. 3, 2945(2008).</li>
<li>Sekelja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abrupt+temporal+fluctuations+in+the+chicken+fecal+microbiota+are+explained+by+its+gastrointestinal+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin.</a> Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).</li>
<li>Oakley, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Poultry-Associated+Microbiome%3A+Network+Analysis+and+Farm-to-Fork+Characterizations%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations.</a> PloS one. 8, 57190(2013).</li>
<li>Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+nitrogen+retention+and+microbial+populations+in+poultry+litter+treated+with+chemical%2C+biological+or+adsorbent+amendments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+environmental+management%22%5BJournal%5D)">Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments.</a> Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).</li>
<li>Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+mineralization+of+organic+nitrogen+forms+in+poultry+litters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+environmental+quality%22%5BJournal%5D)">Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters.</a> Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).</li>
<li>Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+alum+addition+on+microbial+communities+in+poultry+litter%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+science%22%5BJournal%5D)">The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter.</a> Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+QIAamp+DNA+Stool+Mini+Kit+for+ecological+studies+of+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological%22%5BJournal%5D)">Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota.</a> Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).</li>
<li>Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precalence+of+Methanobrevibacter+smithii+and+Methanosphaera+stadtmanae+detected+in+the+human+gut+using+an+improved+DNA+detection+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol.</a> PloS one. 4, 7063(2009).</li>
<li>Harms, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+quantification+of+nitrifying+bacteria+in+a+municipal+wastewater+treatment+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+science+and+technology%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant.</a> Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).</li>
<li>Rothrock, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microvolume+DNA+quantification+methods+for+use+with+volume-sensitive+environmental+DNA+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+natural+and+environmental+sciences%22%5BJournal%5D)">Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts.</a> Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).</li>
<li>Navas-Molina, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNavas-Molina%2C+JA+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+patterns+of+16S+rRNA+diversity+at+a+depth+of+millions+of+sequences+per+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature methods. 7, 335-336 (2010).</li>
<li>Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCHIME+improves+sensitivity+and+speed+of+chimera+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection.</a> Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).</li>
<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search+and+clustering+orders+of+magnitude+faster+than+BLAST%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST.</a> Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).</li>
<li>DeSantis, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greengenes%2C+a+chimera-checked+16S+rRNA+gene+database+and+workbench+compatible+with+ARB%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB.</a> Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PyNAST%3A+a+flexible+tool+for+aligning+sequences+to+a+template+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment.</a> Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).</li>
<li>Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FastTree+2%E2%80%93approximately+maximum-likelihood+trees+for+large+alignments%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments.</a> PloS one. 5, 9490(2010).</li>
<li>Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+changes+in+the+microbial+community+in+an+anaerobic+swine+waste+treatment+lagoon%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon.</a> Anaerobe. 16, 74-82 (2010).</li>
<li>Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+alum+treatment+on+the+concentration+of+total+and+ureolytic+microorganisms+in+poultry+litter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+environmental+quality%22%5BJournal%5D)">Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter.</a> Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).</li>
<li>Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+shifts+in+microbial+population+structure+within+poultry+litter+associated+with+physicochemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+science%22%5BJournal%5D)">Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties.</a> Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zastosowana metoda ekstrakcji DNA wpłynęła na ilościowe i jakościowe szacunki całkowitej społeczności bakteryjnej zarówno dla próbek kału, jak i ściółki, potwierdzając zależny od analiz próbek charakter metod ekstrakcji DNA obserwowanych wcześniej1,3,6. Zarówno w przypadku próbek kału, jak i ściółki, kolejność wykonywania metod ekstrakcji DNA była różna dla ilościowych (mechanicznych > hybrydowych > enzymatycznych) i jakościowych (enzymatycznych > hybrydowych > mechanicznych) szacunków całkowitej społeczności ...

Podczas analizy złożonych próbek klinicznych lub środowiskowych (np. kału, gleby), istnieją dwie główne metodologie stosowane do ekstrakcji DNA. Pierwszym z nich jest mechaniczne rozerwanie macierzy za pomocą intensywnego etapu uderzania w koraliki, podczas gdy drugim jest enzymatyczne rozerwanie macierzy w celu chemicznego uwolnienia komórek bakteryjnych i jednoczesnego zahamowania inhibitorów PCR z matrycy. Biorąc pod uwagę różne sposoby, za pomocą których działają te dwa rodzaje metod ekstrakcji, nie jest zaskakujące, że poprzednie badania wykazały, że odpowiednia metoda ekstrakcji DNA jest w dużym stopniu zależna zarówno od próbki, jak i analizy. Porównawcze badania ekstrakcji DNA wykazały wcześniej, że niektóre metody są bardziej odpowiednie do poprawy jakości i ilości DNA z próbek środowiskowych1-3, podczas gdy inne wykazały poprawę w analizach na poziomie społeczności, takich jak denaturująca gradientowa elektroforeza żelowa (DGGE)4-6, polimorfizm długości końcowych fragmentów restrykcyjnych (T-RFLP)7, zautomatyzowana analiza międzygenowej przekładki rybosomalnej (ARISA)8 i mikromacierze filogenetyczne9. W związku z tym należy stosować lub opracowywać odpowiednie metody ekstrakcji DNA, w zależności od rodzajów próbek środowiskowych i rodzajów analiz przeprowadzanych na tych próbkach, zwłaszcza biorąc pod uwagę ostatnie postępy w analizach społeczności bakteryjnych. 
Sekwencjonowanie nowej generacji, w połączeniu z bardziej ilościowymi ocenami społeczności (np. ilościowym PCR (qPCR)), staje się coraz bardziej powszechne w naukach środowiskowych i klinicznych, jednak przeprowadzono bardzo niewiele badań w celu określenia wpływu metod ekstrakcji DNA na te zestawy danych. Większość badań porównawczych ekstrakcji DNA dotyczyła szacunków społeczności mikrobiomicznej z próbek modeli ludzkichlub ludzkich 10,11, a nie próbek zwierząt rolniczych. Nieliczne badania sekwencjonowania nowej generacji skoncentrowane na drobiu dotyczyły specyficznych pytań metagenomicznych12,13 lub mikrobiomicznych14; Nie dyskutowali o wpływie metody ekstrakcji DNA na uzyskane analizy mikrobiomiczne. Biorąc pod uwagę złożony charakter próbek środowiskowych związanych z produkcją drobiu (np. kał, ściółka/ściółka, gleba na pastwiskach), należy starannie dobierać metody ekstrakcji DNA. Wiadomo, że próbki środowiskowe związane z drobiem zawierają dużą liczbę inhibitorów PCR, a do PCR i późniejszej analizy wymagane jest do 500-krotnego rozcieńczenia ekstraktu DNA15-17. Dlatego ważne jest, aby metody ekstrakcji DNA były zoptymalizowane dla tego typu próbek, aby nie tylko fizycznie zakłócić matrycę, ale także aby móc zmniejszyć/wyeliminować dużą liczbę obecnych inhibitorów. 
Zestaw QIAamp DNA Stool Mini Kit, metoda ekstrakcji enzymatycznej, została uznana za "złoty standard" podczas ekstrakcji DNA z trudnych próbek jelit / kału1,18,19 i została z powodzeniem zastosowana do próbek środowiskowych drobiu8,14. Enzymatyczne usuwanie inhibitorów PCR poprzez zastosowanie zastrzeżonej matrycy jest jedną z największych zalet stosowania tej metody do tego typu próbek środowiskowych, podobnie jak możliwość znacznego zwiększenia przepustowości (i zmniejszenia błędu przetwarzania próbek) przy użyciu zautomatyzowanych stacji roboczych. Jedną z głównych wad jest brak etapu mechanicznej homogenizacji, który fizycznie oddzielałby komórki bakteryjne od matrycy środowiskowej. Podczas badania próbek jelit i kału pochodzenia niedrobiowego dodanie etapu bicia kulek lub mechanicznego przerywania w protokole ekstrakcji DNA znacznie zwiększyło wydajność ekstrakcji9, wydajność/jakość DNA1,4,5 i znacznie poprawiło dalsze analizy społeczności pod względem bogactwa, różnorodności i zasięgu5,6,11. W badaniach tych porównano nie tylko mechaniczne metody bicia koralików z metodą enzymatyczną "złotego standardu", ale niektóre dodały również etap mechanicznego bicia koralików do protokołu enzymatycznego, aby poprawić wyniki6,9,11. 
Zgodnie z wynikami powyższych badań, analizy społeczności bakteryjnej (zarówno jakościowe, jak i ilościowe) mogłyby zostać ulepszone na podstawie próbek środowiskowych związanych z drobiem poprzez dodanie etapu mechanicznej homogenizacji do metody enzymatycznej. Dlatego cel tego badania był dwojaki: (1) opracowanie nowatorskiej techniki ekstrakcji DNA, która wykorzystuje najbardziej pożądane aspekty zarówno metod ekstrakcji mechanicznej (potężny etap homogenizacji), jak i enzymatycznych (usuwanie inhibitorów PCR i automatyzacja) oraz (2) porównanie ilościowych (za pomocą qPCR) i jakościowych (za pomocą mikrobiomii) ocen społeczności bakteryjnej tej nowej metody z reprezentatywnymi metodami mechanicznymi i enzymatycznymi.

<table><tbody><tr><td>Lysing Matrix E tube</td><td>MPBio</td><td>6914-050</td><td>Dostępne różne rozmiary i ostatnie 3 cyfry kota. Nie. wskazać rozmiar (-050 = 50 probówek, -200 = 200 probówek, -1000 = 1,000 probówek)</td></tr><tr><td>Roztwór fosforanu sodu</td><td>MPBio</td><td>6570-205</td><td>Można kupić pojedynczo lub również w zestawie FastDNA Spin Kit na kał (Kat. Nr 116570200)</td></tr><tr><td>PLS Bufor</td><td>MPBio</td><td>6570-201</td><td></td></tr><tr><td>Bufor ASL (560 ml)</td><td>Qiagen</td><td>19082</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep 24 homogenizator</td><td>MPBio</td><td>116004500</td><td>48 x 2 ml adapter HiPrep (Kat. Nr 116002527) dostępny do podwojenia przepustowości etapu homogenizacji mechanicznej</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Stool Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51504</td><td></td></tr><tr><td>QIAcube24 (110V)</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>Wstępne wyniki pokazują, że QIAcube HT (Kat. Nr 9001793) może być używany w celu zwiększenia przepustowości, ale od tej maszyny wymagane są różne materiały eksploatacyjne i należy wykonać bardziej porównawcze prace.</td></tr><tr><td>Końcówki filtrujące, 1 000 ml (1024)</td><td>Qiagen</td><td>990352</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki filtrujące, 200 ml (1024)</td><td></td>Adaptery wirnika <td>Qiagen</td> 990332 <td></td></tr><tr><td>QIAcube (10 x 24)</td><td>Qiagen</td><td>990394</td><td>Do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml dołączonych do zestawu adaptera wirnika dostępna jest alternatywa. Jest to Sarstedt Micro tube 1,5 ml Nasadka zabezpieczająca, Kat. Nr 72.690</td></tr><tr><td>Probówki RB (2 ml)</td><td>Qiagen</td><td>990381</td><td>Alternatywa: Mikroprobówka Eppendorf Safe-Lok, Kat. Nr 022363352</td></tr></tbody></table>

hybrydowa metoda ekstrakcji dna do jakościowej i ilościowej oceny zbiorowisk bakteryjnych z próbek produkcyjnych drobiu

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

Skuteczność protokołów ekstrakcji DNA może być wysoce zależna zarówno od rodzaju badanej próbki, jak i od rodzaju przeprowadzanych dalszych analiz. Biorąc pod uwagę, że stosowanie nowych technik analizy społeczności bakteryjnych (np. mikrobiomika, metagenomika) staje się coraz bardziej powszechne w naukach rolniczych i środowiskowych, a wiele próbek środowiskowych w tych dyscyplinach może być unikalnych pod względem fizjochemicznym i mikrobiologicznym (np. próbki kału i ściółki/ściółki ze spektrum produkcji drobiu), należy starannie wybrać odpowiednie i skuteczne metody ekstrakcji DNA. W związku z tym opracowano nowatorską, półautomatyczną metodę hybrydowej ekstrakcji DNA przeznaczoną specjalnie do stosowania z próbkami z produkcji drobiu w środowisku naturalnym. Metoda ta jest połączeniem dwóch głównych rodzajów ekstrakcji DNA: mechanicznej i enzymatycznej. Dwuetapowy, intensywny etap homogenizacji mechanicznej (przy użyciu ubijania kulek specjalnie opracowany dla próbek środowiskowych) został dodany do początku metody "złotego standardu" enzymatycznej ekstrakcji DNA dla próbek kału w celu usprawnienia usuwania bakterii i DNA z matrycy próbki oraz poprawy regeneracji członków społeczności bakterii Gram-dodatnich. Po zainicjowaniu części ekstrakcji enzymatycznej metody hybrydowej, pozostały proces oczyszczania został zautomatyzowany za pomocą zrobotyzowanej stacji roboczej w celu zwiększenia przepustowości próbki i zmniejszenia błędu przetwarzania próbki. W porównaniu ze ścisłymi mechanicznymi i enzymatycznymi metodami ekstrakcji DNA, ta nowatorska metoda hybrydowa zapewniła najlepszą ogólną łączną wydajność, biorąc pod uwagę ilościowe (przy użyciu 16S rRNA qPCR) i jakościowe (przy użyciu mikrobiomii) szacunki całkowitych społeczności bakteryjnych podczas przetwarzania kału drobiu i próbek ściółki.

Na potrzeby niniejszego badania pobrano świeże próbki odchodów oraz ściółki z komercyjnej kurnika dla brojlerów (~25 000 ptaków) w południowo-wschodniej części USA. Brojlery (Gallus gallus) były krzyżówkami rasy Cobb-500 i w momencie pobierania próbek miały 59 dni. Świeże próbki odchodów i ściółki pobrano z czterech oddzielnych obszarów wewnątrz kurnika (w pobliżu paneli chłodzących, w pobliżu linii poidła/karmideł, pomiędzy liniami poidła/karmideł oraz w pobliżu wentylatorów wyciągowych); próbki z każdego z tyc...

Nowatorska półautomatyczna hybrydowa metoda ekstrakcji DNA do użytku z próbkami środowiskowymi z produkcji drobiu została opracowana i wykazała ulepszenia w stosunku do powszechnej metody ekstrakcji mechanicznej i enzymatycznej pod względem ilościowych i jakościowych szacunków całkowitych społeczności bakteryjnych.

Hybrydowa metoda ekstrakcji DNA do jakościowej i ilościowej oceny zbiorowisk bakteryjnych z próbek produkcyjnych drobiu

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest opracowanie nowatorskiej techniki ekstrakcji DNA, która łączy mechaniczną homogenizację DNA z usuwaniem inhibitorów PCR oraz złotym standardem i metodą ekstrakcji somatycznej do próbek środowiskowych wzdłuż ciągłości produkcji drobiu. Osiąga się to poprzez najpierw podzielenie próbki środowiskowej na mikroprobówki wirówkowe zawierające mieszaninę kulek w celu skutecznej homogenizacji złożonych próbek środowiskowych. Drugim krokiem jest umieszczenie probówek w homogenizatorze o dużej mocy, aby skutecznie uwalniać kwasy nukleinowe z komórek bakteryjnych i matrycy środowiskowej.Następnie homogenat jest używany jako materiał wyjściowy do złotej metody enzymatycznej ekstrakcji DNA w fazie wiązania inhibicji PCR. Ostatnim krokiem jest umieszczenie próbek w zrobotyzowanej stacji roboczej do ekstrakcji DNA, aby zapewnić użytkownikowi wyekstrahowane próbki DNA nadające się do wielu dalszych zastosowań, ostatecznie ilościowych PCR i analizy mikrobiomu przy użyciu aluminiowej platformy MiSeq, które zostały wykorzystane do pokazania, że ta nowatorska metoda hybrydowa zapewnia najlepsze połączenie jakościowych i ilościowych ocen całkowitych społeczności bakteryjnych w porównaniu z przetwarzaniem próbek metodą ekstrakcji mechanicznej lub enzymatycznej sam. Metoda ta zapewnia wgląd w analizę zbiorowisk mikrobiologicznych wzdłuż kontinuum produkcji drobiu, ale może być również stosowana do innych systemów rolniczych, takich jak produkcja trzody chlewnej, bydła lub roślin roślinnych, które zawierają podobnie złożone próbki środowiskowe.Dzisiaj tę procedurę zademonstruje Kaitlyn Griffin, studentka w moim laboratorium. Aby rozpocząć eksperyment, ustaw łaźnię wodną na 95 stopni Celsjusza. Następnie odważ trzy powtórzenia po 0,33 grama, aby przeanalizować łącznie jeden gram temperatury pokojowej, gleby lub materiału kałowego do dwumililitrowych rękawic do wymiany probówek ET z matrycą lizy między próbkami.Dodać 825 mikrolitrów buforu fosforanu sodu i 275 mikrolitrów roztworu do lizy wstępnej lub PLS do probówki z próbką. Następnie wirować próbki przez 15 sekund po wymieszaniu, odwirować probówki w temperaturze 14 000 G przez pięć minut. Zdekantować supernatant i dodać 700 mikrolitrów buforu A SL. Następnie wiruj rurkę przez pięć sekund.Otwieraj jedną probówkę na raz, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Następnie upewnij się, że w stożkowej probówce jest 10% całkowitej objętości przed umieszczeniem próbek w urządzeniu do szybkiego przygotowania 24. Homogenizować próbki z prędkością sześciu metrów na sekundę przez 40 sekund.Zwróć uwagę na różnicę między szybkim przygotowaniem 24 a wirowaniem po homogenizacji. Odwirować próbkę o sile 14 000 g przez pięć minut. Przenieść supernatant do sterylnej dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej do pozostałej próbki w probówce ET z matrycą lizującą przy dodatkowych 700 mikrolitrach buforu SL, ponownie homogenizować i odwirować.Korzystając z poprzednich ustawień, umieść plastikowe klipsy blokujące na probówkach z próbkami, aby upewnić się, że nie pękną i inkubuj supernatanty w łaźni wodnej o temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie otwórz każdą probówkę z mikrowirówką, aby zwolnić ciśnienie, ponownie zamknij probówki i wiruj je przez 15 sekund. Odwirować próbki w temperaturze 14 000 g przez jedną minutę.Po odwirowaniu przenieś 1,2 mililitra supernatantu do sterylnej dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Następnie umieścić blister zawierający tabletkę bezpośrednio nad otwartą probówką mikrowirówki i delikatnie wypchnąć tabletkę z blistra do probówki. Aby uniknąć kontaktu między tabletką inhibit X a probówką, do każdej próbki dodać jedną tabletkę inhibit X.Następnie wiruj probówki, aż próbki zamienią się w jednolicie białawą ciecz. Inkubować próbki przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i odwirowywać je w temperaturze 14 000 serów przez pięć minut, unikając wszelkich pozostałych cząstek na dnie probówek. Przenieś cały płyn do sterylnej mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra.Następnie odwiruj probówki na pełnych obrotach przez pięć minut. Przed rozpoczęciem automatycznego oczyszczania DNA upewnij się, że stacja robocza zawiera odpowiednią ilość końcówek filtrujących i. Następnie dodaj rurki ellucjanowe i rurki filtracyjne do adapterów wirnika i dodaj 400 mikrolitrów każdej próbki do środkowej szczeliny adaptera wirnika.Umieść adaptery wirnika w wirówce stacji roboczej i upewnij się, że wszystkie pokrywy probówek mikrowirówek są prawidłowo zamocowane w adapterze wirnika. Dodaj roztwór proteinazy K do sterylnej 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki i umieść ją w gnieździe A na stacji roboczej. Dodaj dwie mililitrowe mikroprobówki wirówkowe z bezpiecznym zamkiem do sekcji wytrząsarki stacji roboczej i upewnij się, że pokrywki probówek z próbkami są bezpiecznie umieszczone.Korzystając z ekranu dotykowego na stacji roboczej, wybierz protokół wykrywania patogenów ludzkiego kału DNA w stolcu i przeczytaj kolejne ekrany, aby upewnić się, że stacja robocza została prawidłowo załadowana. Po przejściu wszystkich ekranów sprawdzających wybierz start, aby uruchomić protokół. Następnie wyjmij próbki z adapterów wirnika.Połączyć trzy powtórzone procesy oczyszczania dla pojedynczej próbki za pomocą systemu opartego na odparowywaniu wirowania. Ponownie eluować próbkę do końcowej objętości 100 mikrolitrów za pomocą buforu tris EDTA. Na koniec należy zakryć próbki i umieścić je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne do dalszej analizy.Wykres ten pokazuje, że metoda mechaniczna konsekwentnie zapewniała ogólnie najwyższe szacunki całkowitej liczebności znormalizowanych genów bakteryjnych dla próbek kału i ściółki. Metoda enzymatyczna miała najniższe oszacowania we wszystkich przypadkach. Nowatorska metoda ekstrakcji hybrydowej pozwoliła uzyskać najlepszą kombinację jakościowych i ilościowych szacunków całkowitej społeczności bakteryjnej.Z trzech badanych metod ekstrakcji. Teraz powinieneś lepiej zrozumieć, jak przeprowadzić tę nowatorską, półautomatyczną hybrydową metodę ekstrakcji DNA i dostrzec jej przydatność w jakościowej i ilościowej ocenie społeczności drobnoustrojów na podstawie złożonych próbek środowiskowych.

a-hybrid-dna-extraction-method-for-qualitative-quantitative

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Dwie uzupełniające analizy atmosferycznych cząstek biologicznych z filtrów próbek powietrza są opisane tutaj: ekstrakcja i wykrywanie endotoksyny oraz DNA.

Analiza filtra z próbką powietrza pod kątem endotoksyn i zawartości DNA

Opisujemy wydajną, solidną i opłacalną metodę ekstrakcji kwasu nukleinowego z wymazów w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA. Metoda ta pozwala na zastosowanie wspólnego podejścia do przetwarzania wielu typów próbek i uwzględnia szereg dalszych procesów analitycznych.

Wydajna ekstrakcja kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek DNA z mikrobiomów żywności i środowiska do wspólnego wykrywania i subtypowania Salmonelli poprzez sekwencjonowanie quasimetagenomiczne. Połączone zastosowanie wzbogacania hodowli, separacji immunomagnetycznej (IMS) i amplifikacji z wielokrotnym przemieszczeniem (MDA) pozwala na skuteczną koncentrację genomowego DNA Salmonelli z próbek żywności i środowiska.

Analiza quasi-metagenomiczna salmonelli z próbek żywności i środowiska

Zrozumienie składu biologicznego pyłu zawieszonego w środowisku jest ważne dla badania jego znaczącego wpływu na zdrowie ludzi i rozprzestrzenianie się chorób. W tym przypadku zastosowaliśmy trzy rodzaje metod pobierania próbek bioaerozoli oraz analizę biologiczną drobnoustrojów unoszących się w powietrzu, aby lepiej zbadać społeczności drobnoustrojów unoszących się w powietrzu w różnych warunkach środowiskowych.

Analiza składu i rozmieszczenia bioaerozoli w różnych warunkach środowiskowych

To oparte na molekularnym podejściu do określania sprawności bakterii umożliwia precyzyjne i dokładne wykrywanie mikroorganizmów za pomocą unikalnych kodów kreskowych genomowego DNA, które są określane ilościowo za pomocą cyfrowego PCR. W protokole opisano obliczanie indeksu konkurencyjnego dla szczepów Salmonella; Technologia ta jest jednak łatwa do zaadaptowania do protokołów wymagających bezwzględnej kwantyfikacji każdego genetycznie plastycznego organizmu.

Cyfrowy indeks konkurencyjności oparty na PCR do wysokoprzepustowej analizy sprawności w Salmonelli

Tutaj opisujemy metodę generowania piskląt wolnych od zarazków z jaj komercyjnej linii brojlerów, Ross PM3. Metoda ta może być dostosowana do hodowli zwierząt wolnych od zarazków z innych gatunków drobiu.

Produkcja szybko rosnących brojlerów wolnych od zarazków z komercyjnej linii do badań mikrobioty

Ten protokół szczegółowo opisuje kompleksowe podejście do hodowli, sekwencjonowania i hybrydowego składania genomu de novo bakterii moczowych. Zapewnia powtarzalną procedurę generowania kompletnych, kolistych sekwencji genomu przydatnych w badaniu zarówno chromosomalnych, jak i pozachromosomalnych elementów genetycznych przyczyniających się do kolonizacji dróg moczowych, patogenezy i rozprzestrzeniania się oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Hybrydowe składanie genomu de novo w celu generowania kompletnych genomów bakterii moczowych przy użyciu technologii sekwencjonowania krótkiego i długiego odczytu

Protokół przedstawia dwie metodologie poprawy izolacji beztlenowych bakterii jelitowych. Pierwszy z nich koncentruje się na izolacji różnych bakterii przy użyciu różnych pożywek hodowlanych. Drugi koncentruje się na etapach uprawy określonej grupy drobnoustrojów, ewentualnie asymilując mio-inozytol, aby w pełni zrozumieć jego znaczenie ekologiczne.

Strategie mające na celu poprawę hodowli bakterii beztlenowych z przewodu pokarmowego kurczaka

Dokładne określenie ilościowe Salmonelli u drobiu na niskich poziomach jest aktualnym wyzwaniem przemysłowym i regulacyjnym. Protokół ten opisuje test MPN, który umożliwia ilościowe określenie salmonelli w surowych i gotowych do przyrządzenia produktach drobiowych. Metoda ta jest szybka, czuła i zgodna z wytycznymi FSIS, zwiększając bezpieczeństwo żywności i wspierając wysiłki na rzecz zdrowia publicznego.

Zmodyfikowany test liczbowy "Najbardziej prawdopodobny" w celu ilościowego określenia salmonelli w surowych i gotowych do przyrządzenia produktach z kurczaka

Niezawodne i dokładne formy analizy DNA w terenie są kluczowe dla wielu branż. Niniejszy artykuł oferuje dwie metody analizy mikroorganizmów środowiskowych w terenie: 1) izolację DNA mikroorganizmów z próbek środowiskowych za pomocą zestawu terenowego do ekstrakcji biologicznej oraz 2) analizę DNA za pomocą jednostki qPCR w terenie.

Analiza DNA mikroorganizmów w terenie z wykorzystaniem zestawu do ekstrakcji biologicznej oraz jednostki qPCR

Poznaj hybrydową metodę ekstrakcji DNA łączącą homogenizację mechaniczną z enzymatyczną do analizy zbiorowisk bakteryjnych z próbek drobiu. Technika zapewnia lepszą jakościową i ilościową ocenę mikrobiomu.

Hybrydowa metoda ekstrakcji DNA do jakościowej i ilościowej oceny zbiorowisk bakteryjnych z próbek produkcyjnych drobiu

Przeglądaj więcej filmów