Mikroskopia sił atomowych fotoreceptorów światła czerwonego przy użyciu ilościowego mapowania właściwości nanomechanicznych PeakForce
October 24th, 2014
Metoda badania struktury fotoreceptora białkowego za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) jest opisana w tym artykule. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) ujawnia nienaruszone dimery białkowe na powierzchni miki.
Ogólnym celem tej procedury jest zebranie obrazów białek fotoreceptorowych w wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopii sił atomowych. Osiąga się to poprzez uprzednie uzyskanie próbki fotoreceptora i jej rozcieńczenie. Drugim krokiem jest nałożenie próbki białka na świeżo rozszczepioną i czystą powierzchnię miki na około 30 sekund.
Następnie MICA jest płukany buforem w celu usunięcia niezwiązanych i luźno przyczepionych cząsteczek. Następnie próbka jest dołączana do ciekłej celi, która jest wyposażona w odpowiednią sondę. Ten zestaw jest ładowany do skanera.
Po napełnieniu kuwety cieczowej roztworem buforowym, połącz końcówkę z próbką i rozpocznij skanowanie. Ostatecznie, mikroskopia sił atomowych z uwzględnieniem siły szczytowej. Ilościowe mapowanie właściwości nanomechanicznych służy do zbierania obrazów pojedynczego białka fotoreceptora na powierzchni próbki.
Mikroskopia sił atomowych, która obejmuje siłę szczytową q i m, może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii molekularnej, takie jak ważne cechy strukturalne i chemiczne, które decydują o funkcji biologicznie aktywnych makrocząsteczek. Główną przewagą tej techniki nad obecnymi metodami, takimi jak NMR i krystalografia rentgenowska, jest to, że obrazy o wysokiej rozdzielczości nienaruszonych białek i innych makrocząsteczek biologicznych można uzyskać w biologicznie odpowiednim środowisku. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, zmagają się z tym, ponieważ dostrojenie sondy i roztworu wymaga wielu kroków, z których niektóre są dość złożone.
Dzięki sile szczytowej q i m oraz zautomatyzowanemu oprogramowaniu kilka z tych kroków jest prostszych, co znacznie ułatwia proces nowym użytkownikom i studentom studiów licencjackich. Tę procedurę zademonstrują trzy studentki z mojego laboratorium badawczego: Marie Kroger, Blair Sorenson i Jessica Thomas. Studenci ci w nadchodzącym roku będą kontynuować studia podyplomowe na kierunkach mikrobiologia, inżynieria chemiczna i chemia.
Te elementy muszą być włączone w określonej kolejności. Najpierw komputer, potem kontroler, a na końcu światło światłowodowe. Mikroskop musi odczytywać FM i LF fm.
Kamera musi być wyśrodkowana nad głowicą optyczną FM w oprogramowaniu. Należy wybrać następujące opcje. Kategoria eksperymentu to właściwości mechaniczne.
Grupa eksperymentalna to ilościowe mapowanie nanomechaniczne, a eksperyment to siła szczytowa q i m w płynie. Po prawidłowym wybraniu ustawień eksperyment można załadować i skonfigurować. Ostrość kamery należy najpierw ustawić za pomocą obiektywu Z, a następnie za pomocą elementów sterujących kursem do ustawienia stolika, celem jest umieszczenie otworu głowicy FM A na jeden milimetr przed powierzchnią sceny, aby manipulować krążkami próbki ze świeżo rozciętą miką i okrągłymi pęsetami chwytającymi dyski.
Zacznij od zmontowania ogniwa płynu z nieskazitelnie oczyszczonych części. Najpierw podłącz adapter węża do portu w komórkach czystego płynu. Następnie bardzo delikatnie za pomocą pęsety z płaską główką wciśnij O-ring w jego wgłębienie w komórce płynu.
Następnie na zacisku ustalającym sondę lekko dociśnij sprężynę i odkręć ją od rowka. Za pomocą tej samej pęsety chwyć sondę i wsuń ją w rowek, tak aby końcówka była skierowana w stronę środka komórki. Następnie zabezpiecz sondę za pomocą klipsa.
Następnym krokiem jest sprawdzenie, czy zacisk na A FM.It musi być całkowicie schowany. Umieść zespół skierowany w dół na górze sample. Zamontuj zespół na kołkach A FM w celu stabilizacji.
Opuść zacisk. Aby sprawdzić O-ring, naciśnij przełącznik w dół na mikroskopie, aż O-ring będzie widoczny. Powinien być mocno ściśnięty między dyskiem nośnym a ogniwem płynu.
Komórkę płynu można ustawić w ostrości za pomocą pokrętła regulacji zgrubnej. Następnie, korzystając z regulacji XY, skup się na końcówce sondy. Wygląda jak metaliczny złoty trójkąt.
Teraz za pomocą dolnej dźwigni pizo przesuń końcówkę blisko powierzchni próbki, ustaw ostrość na końcówkach, odbiciu i monitoruj położenie wsporników w stosunku do tego odbicia. Obecnie powinny być ściśle wyrównane, ale nie całkowicie na siebie. Teraz przygotuj strzykawkę.
Napełnij go jednym mililitrem roztworu buforowego i podłącz adapter. Następnie podłączyć strzykawkę do węża wyrzutowego i całkowicie wysunąć tłok. Następnie podłącz wąż do celi płynu za pomocą adaptera, aby napełnić komorę, delikatnie naciśnij tłok, aż środek komory będzie pełny.
Nie powinno być żadnych pęcherzyków powietrza ani rozlewania się z komórki płynu na mikroskop. Następnie umieścić strzykawkę w dobrze podpartej pozycji nad komorą. Następnie użyj pokręteł kanału kamery i translacji XY.
Aby zlokalizować laser na ekranie, powinien on wyglądać jak rozproszona czerwona kropka. Po zlokalizowaniu użyj laserowych elementów sterujących, aby przesunąć go do sondy. Teraz na koniec wyreguluj sterowanie laserem i lustrem, aż suma sygnału na mikroskopie zostanie zmaksymalizowana do zakresu od czterech do sześciu, wyreguluj diodę kwadrantową.
Następnie za pomocą pokręteł na głowicy skanującej wyreguluj odchylenia w pionie i poziomie, aż wartości na mikroskopie powrócą do jak najbardziej zbliżonego do zera. Pamiętaj, aby wybrać odpowiednie opcje nabycia, zanim przejdziesz dalej. Ustaw szybkość skanowania na około jeden herc w oknie próbek na wiersz.
Wpisz 256. Do automatycznego sterowania wspomaganiem skanowania. Wybierz pojedynczą opcję automatycznego limitu Z wspomagania skanowania, wybierz wyłączoną.
Limit Z powinien wynosić 500 nanometrów, a rozmiar skanu powinien wynosić jeden mikron. Po prawidłowym ustawieniu ustawień zmierz sondę. Obserwuj zmianę napięcia Z pazo, gdy końcówka sondy zbliża się do powierzchni.
Jeśli końcówka wyjdzie poza zakres, wycofaj się i zbliż ponownie, może być konieczna wymiana końcówki sondy. Jeśli to nie zadziała, gdy końcówka jest włączona, w każdym z okien akwizycji powinny pojawić się linie, które skonstruują obraz. Rozpocznij ciągłe rejestrowanie obrazów miki.
Powoli powiększaj, aby upewnić się, że powierzchnia MICA jest zarówno płaska, jak i czysta. Przygotować czterokomorową szalkę Petriego ze schłodzonym roztworem buforowym do obrazowania. Każda komora potrzebuje co najmniej pięciu mililitrów.
Przed pobraniem porcji rozcieńczonego białka delikatnie wymieszaj ją mikropipetą. Następnie weź podwielokrotność 200 mikrolitrów i nałóż rozcieńczone białko na powierzchnię MICA. Odczekaj około 30 sekund, aż roztwór znajdzie się na powierzchni.
Następnie za pomocą chwytaków talerzowych podnieś tarczę bez jej przechylania i natychmiast zanurz ją w pierwszej puli roztworu buforowego. Przez jedną sekundę upewnij się, że tarcza pozostaje równoległa do stołu. Bardzo ważne jest, aby próbka była utrzymywana równolegle do szalki Petriego na etapie płukania.
Te miękkie, elastyczne cząsteczki mogą być zniekształcone na powierzchni przez silne prądy roztworu wodnego. Następnie na krótko zanurz dysk w każdym z pozostałych trzech basenów na jedną sekundę na każdą pulę. Następnie przenieś płytę do suchej i odpylonej szmatki.
Pozwól, aby nadmiar wilgoci przeniósł się na szmatkę, ale nie pozwól, aby dysk całkowicie wyschł. Nie pozwól, aby szmatka dotykała sample Ostrożnie wyjmij sample ze szmatki za pomocą chwytaków do tarcz i umieść sample na skanerze A FM. Umieść celę płynu na wierzchu próbki i kontynuuj konfigurację i obrazowanie.
Po ustaleniu wszystkich parametrów sondy, rozmiar sprężyny i promień końcówki są odpowiednio ustawione. Oceń sondę tak, jak podczas obrazowania. Micah, obserwuj ZP azo, gdy końcówka zbliża się do powierzchni.
Podczas robienia zdjęć pozwól skanerowi na obrazowanie tego samego obszaru przez co najmniej dwa kolejne przejścia. Użyj przechwytywania ciągłego, aby zapisać każdy obraz. Dostosuj rozmiar i położenie obrazu zgodnie z potrzebami.
Gdy zautomatyzowane oprogramowanie zakończy dostosowywanie parametrów skanowania do określonego rozmiaru obrazu. Wyłącz oprogramowanie w porządku. Dostosuj ostrość obrazu ręcznie, dostosuj szybkość skanowania, limit Z, liczbę linii i wartość zadaną.
Jeśli obraz stanie się zbyt nieostry, włącz ponownie oprogramowanie, aby powrócić do pierwotnej pozycji początkowej. Podczas powiększania białka zmniejsz szybkość skanowania i proporcjonalnie zwiększ liczbę linii, aby zwiększyć rozdzielczość obrazu. Później. Analizując obrazy, najpierw spłaszcz obraz, klikając ikonę spłaszczania.
Wybierz kolejność zerową i wykonaj operację. Czasami konieczne jest użycie zwykłego pasowania, aby uzyskać odpowiednio płaskie obrazy. Wybierz ikonę zwykłego dopasowania i użyj kursora, aby narysować płaszczyznę nad płaskim obszarem na obrazie.
Wykonaj gładkie pasowanie i powtórz operację w razie potrzeby. Następnie wybierz zakładkę przekrój poprzeczny, aby zmierzyć wymiary białka. Narysuj linię z kursorem nad cząsteczką lub obszarem, który ma być analizowany.
Powtórz ten proces w wielu obszarach. Jeśli pożądana jest nakładka, można badać dowolną liczbę cząsteczek biologicznych za pomocą FM dla białka fotoreceptorowego w stanie przystosowanym do światła, świeżo rozcięty substrat miki jest odpowiednią płaską powierzchnią do wchłaniania białka. Dimery pojedynczych białek fotoreceptorowych można było zaobserwować przy użyciu trybu QNM siły szczytowej.
Strzałki wskazują poszczególne dimery, a gwiazdka oznacza agregat białkowy za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Przekroje czynne białek można mierzyć po spłaszczeniu obrazu. Dane XY korelują z pomiarami wysokości.
Można ich używać do różnych obliczeń. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie skonfigurować eksperyment A FM w celu zebrania obrazów białek w wysokiej rozdzielczości na powierzchni w biologicznie istotnym środowisku. Wykorzystanie siły szczytowej q i m Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu około trzech do czterech godzin.
Dlatego siła szczytowa q i m jest odpowiednią formą mikroskopii sił atomowych, którą należy wprowadzić dla studentów studiów licencjackich zapisanych na kursy laboratoryjne, takie jak analiza instrumentalna, biochemia i fizyka nowoczesna. Po opracowaniu, metoda ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mikroskopią skaningową do badania cząsteczek biologicznych, takich jak białka, kwasy nukleinowe, a nawet żywe komórki w biologicznie istotnych podłożach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejszy dokument opisuje metodę badania struktury fotoreceptorów białkowych za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM). Zastosowano technikę PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM), aby ujawnić nietknięte dimeryzujące białka na powierzchni miki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biofizyka
- Biologia strukturalna
Tło
- Fotoreceptory białkowe odgrywają kluczową rolę w różnych procesach biologicznych.
- Mikroskopia sił atomowych pozwala na wysokorozdzielcze obrazowanie biocząsteczek.
- Rozumienie struktury tych białek może dostarczyć wglądu w ich funkcję.
- PF-QNM to nowatorska technika, która zwiększa możliwości obrazowania AFM.
Cel badania
- Zebranie wysokorozdzielczych obrazów fotoreceptorów białkowych.
- Zbadanie integralności strukturalnej dimerów białkowych.
- Demonstracja skuteczności PF-QNM w wizualizacji struktur białkowych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie próbki białek fotoreceptorów.
- Rozcieńczenie próbki białkowej przed zastosowaniem.
- Zastosowanie próbki na świeżo ściętej powierzchni miki.
- Płukanie buforem w celu usunięcia niezwiązanych cząsteczek.
Główne wyniki
- Udane obrazowanie nietkniętych dimerów białkowych na miki.
- Demonstracja możliwości PF-QNM w mapowaniu właściwości nanomechanicznych.
- Wysokorozdzielcze obrazy ujawniające szczegóły strukturalne fotoreceptorów.
- Walidacja metody na potrzeby przyszłych badań nad strukturami białek.
Wnioski
- Metoda zapewnia niezawodne podejście do badania fotoreceptorów białkowych.
- PF-QNM zwiększa zrozumienie relacji struktura-funkcja białek.
- Ta technika może być zastosowana do innych biocząsteczek w podobnych badaniach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Atomic force microscopy with PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) enables high-resolution imaging of intact protein photoreceptors in biologically relevant environments, supporting target validation by revealing structural details of light-sensing proteins. This approach reduces reliance on crystallization and NMR, offering a label-free method to assess protein integrity and oligomerization states early in discovery. The automation via ScanAsyst software improves reproducibility and accessibility for screening applications, accelerating mechanistic de-risking of photoreceptor targets in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of protein dimerization and aggregation states to interrogate therapeutic hypotheses about photoreceptor function.
- Operational Value: Provides label-free, native-condition imaging that avoids artifacts from fixation or staining, supporting reliable target confirmation.
- Predictive Value: Supports assessment of structural stability and conformational changes under physiological buffer conditions, informing lead selection.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces quantitative nanomechanical maps (e.g., adhesion, deformation) that serve as functional readouts for compound-induced conformational shifts.
- Reproducibility: ScanAsyst automation minimizes user-dependent variability in probe tuning and scanning parameters, enhancing assay robustness.
- Scalability: Compatible with fluid imaging and routine mica preparation, allowing repeated use across multiple protein targets in discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to photoreceptor proteins involved in optogenetics and circadian signaling pathways, linking structural insights to functional modulation.
- Preclinical Continuity: Enables structural validation of photoreceptor variants or mutants prior to cellular or in vivo testing.
- Mechanistic De-risking: Correlates nanomechanical properties with light-adapted states, reducing uncertainty in target mechanism before downstream investment.
Pipeline & Workflow Integration
PF-QNM fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing structural and mechanical data that inform early go/no-go decisions. It complements biochemical assays by adding direct nanoscale imaging of target engagement and oligomerization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on photoreceptor oligomerization and structural integrity in native-like conditions.
- Screening: Generates reproducible, quantitative topographical and mechanical outputs for assessing compound effects on protein structure.
- Analytics: Delivers height, adhesion, and deformation maps at each pixel, enabling multiparametric comparison of protein states.
- Translational Research: Bridges structural discovery to preclinical validation by confirming target integrity before functional assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable AFM workflow for diverse macromolecules, reducing revalidation effort across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target structure by resolving dimers and aggregates without crystallization.
- Operational Value: Automation via ScanAsyst reduces training burden and improves inter-user consistency.
- Strategic Value: Enables faster structural triage of targets, reducing time spent on low-confidence candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing direct evidence of protein quality and stability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, fluid cell handling, and protein surface chemistry.
- Depends on access to AFM systems with PeakForce QNM and ScanAsyst software, fluid cells, and probes suitable for biological samples.
- Necessitates standardization of sample dilution, mica preparation, and buffer conditions across users and labs.
- Involves adaptation considerations for different protein concentrations, surface treatments, and environmental conditions (e.g., pH, ionic strength).
- Limited by sample adhesion efficiency and potential tip-induced deformation on very soft samples, as noted in the need for parameter optimization.
