Name: Produkcja i wykorzystanie lentiwirusa do selektywnej transdukcji pierwotnych komórek prekursorowych oligodendrocytów do testów mielinizacji in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj metodę produkcji lentiwirusa do selektywnej transdukcji komórek prekursorowych oligodendrocytów OPCs w badaniach mielinizacji OUN in vitro. Technika umożliwia nadekspresję białek w celu analizy ich roli w procesie mielinizacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Australijską Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych (stypendium NHMRC #454330 dla JX, grant projektowy #628761 dla SM i APP1058647 dla JX), Multiple Sclerosis Research Research Australia (MSRA #12070 dla JX), University of Melbourne Research Grant Support Scheme i Melbourne Research CI Fellowship dla JX, a także Australia Postgraduate Scholarships dla HP i AF. Chcielibyśmy podziękować za Schemat Infrastruktury Operacyjnej Departament Innowacji, Przemysłu i Rozwoju Regionalnego, Wiktoria Australia.

<ol><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).</li>
<li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDGAs+interact+selectively+with+neuroligin-2+but+not+other+neuroligins+to+regulate+inhibitory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+exerts+contrasting+effects+on+peripheral+myelination+of+NGF-dependent+and+BDNF-dependent+DRG+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons.</a> J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).</li>
<li>Chan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Promotes+Central+Nervous+System+Myelination+via+a+Direct+Effect+upon+Oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes.</a> Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).</li>
<li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin+and+BDNF+induce+a+switch+to+NMDA+receptor-dependent+myelination+by+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes.</a> PLoS Biology. 11 (12), e1001743(2013).</li>
<li>Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleitman%2C+N+%22Tissue+culture+methodes+for+the+study+of+myelination%22">Tissue culture methodes for the study of myelination</a>. , MIT Press. Cambridge, MA. (1991).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+1%2F2+signaling+promotes+oligodendrocyte+myelination+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro.</a> J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).</li>
<li>Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglial+expression+of+TrkB+independently+regulates+myelination+and+progenitor+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+Characterization+and+Expression+of+miR-15a-3p+and+miR-15b-3p+in+Dairy+Cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2014).</li>
<li>Emery, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+gene+regulatory+factor+is+a+critical+transcriptional+regulator+required+for+CNS+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination.</a> Cell. 138 (1), 172-185 (2009).</li>
<li>Murai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+receptor+TLX+stimulates+hippocampal+neurogenesis+and+enhances+learning+and+memory+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma konfliktu interesów w związku z tymi badaniami.

Mielinizacja aksonów jest procesem kluczowym dla optymalnego funkcjonowania zarówno ośrodkowego, jak i obwodowego układu nerwowego kręgowców. Wytwarzanie i utrzymywanie mielinizowanych aksonów jest złożonym i skoordynowanym procesem obejmującym interakcje molekularne między białkami neuronalnymi, glejowymi (z komórek Schwanna lub oligodendrocytów) i zewnątrzkomórkowymi. Znaczenie i możliwość zastosowania tego protokołu polega na tym, że umożliwia on manipulowanie białkami w jednym określonym typie komórki w mieszanych wa...

Mielinizacja aksonów jest kluczowa dla szybkiego i efektywnego przekazywania potencjałów czynnościowych zarówno w ośrodkowym, jak i obwodowym układzie nerwowym. Wyspecjalizowane komórki, komórki Schwanna w obwodowym układzie nerwowym i oligodendrocyty w ośrodkowym układzie nerwowym, owijają się wokół i otaczają aksony mieliną, skutecznie izolując nerw i ułatwiając przewodnictwo solne1. Proces mielinizacji można badać in vitro przy użyciu neuronów zwojowych siatkówki2, zmodyfikowanych nanowłókien3 lub neuronów zwoju grzbietowego korzenia współhodowanych z komórkami Schwanna4 lub oligodendrocytami5-7. Test mielinizacji in vitro jest uznanym modelem do badania mielinizacji układu nerwowego i replikuje wiele podstawowych procesów zachodzących podczas mielinizacji in vivo5-8. Test polega na kokulturze oczyszczonych populacji neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) z OPC (dla mielinizacji OUN) lub komórkami Schwanna (dla mielinizacji PNS). W określonych warunkach te mielinizujące się komórki otaczają aksony DRG w uporządkowanym, ultra strukturalnie zweryfikowanym, wielopłytkowym arkuszu izolującej błony plazmatycznej, która wyraża ten sam zestaw białek specyficznych dla mieliny obecnych in vivo.
Najczęściej używanym modelem komórkowym do badania mielinizacji OUN in vitro są kokultury neuronów DRG i OPC, które zostały z powodzeniem wykorzystane do badania wpływu czynników egzogennych, takich jak neurotrofiny, na mielinizację OUN in vitro5,6. Czynniki egzogenne, takie jak czynniki wzrostu lub małocząsteczkowe inhibitory farmakologiczne, są szeroko stosowane do badania roli szlaków sygnałowych w mielinizacji przy użyciu modelu kokultury DRG-OPC7,9. Jednak w mieszanych warunkach kohodowlanych, które zawierają zarówno neurony, jak i oligodendrocyty, formalnie możliwe było, że czynniki wzrostu lub inhibitory farmakologiczne mogły wywierać wpływ zarówno na neurony DRG, jak i oligodendrocyty (OL). Daje to możliwość specyficznego przeanalizowania ról, jakie białka wyrażane tylko przez DRG lub oligodendroglia wywierają na mielinizację przy użyciu tego podwójnego systemu komórkowego. Aby jednoznacznie potwierdzić, że szlak sygnałowy w oligodendroglialu bezpośrednio reguluje mielinizację, transdukcja lentiwirusowa OPC, przed wysiewem do neuronów DRG w teście mielinizacji in vitro, okazała się eleganckim sposobem na nadekspresję zarówno białek typu dzikiego, jak i zmutowanych, a także na obniżenie ekspresji konstytutywnie wyrażanych białek przez oligodendrocyty. W związku z tym podejście to oferuje drogę do specyficznego badania i manipulowania szlakami sygnałowymi w oligodendrocytach w celu badania mielinizacji9,10.
W tym artykule opisujemy metody, które opracowaliśmy w celu selektywnej nadekspresji interesującego białka w oligodendrocytach za pomocą podejścia lentiwirusowego do badania mielinizacji in vitro. Technika rozpoczyna się od wygenerowania wektorów ekspresyjnych zawierających interesujący gen, niezależnie od tego, czy jest to typ dziki, konstytutywnie aktywna lub dominująca forma ujemna, które są następnie klonowane do wektora pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Ten wektor (zawierający interesujący gen), dawca promotora CMV (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) i lentiwektor 2K7 są łączone w reakcji enzymatycznej w celu wytworzenia wektora 2K7 zawierającego promotor CMV, gen będący przedmiotem zainteresowania, wewnętrzne rybosomalne miejsce wejścia i GFP (ryc. 1). Ten sklonowany przez Gateway konstrukt 2K7 w połączeniu z PMD2. Otoczka wirusa G i pakiet wirusa pBR8.91 mogą być kotransfekowane do komórek HEK293T w celu wytworzenia lentiwirusa, który może być następnie wykorzystany do transdukcji OPC. Po zakażeniu lentiwirusem OPC wyrażają wysoki poziom białka będącego przedmiotem zainteresowania. Te OPC mogą być następnie wysiewane w kulturach neuronów DRG i można zbadać wpływ, jaki ekspresja wysokiego poziomu pożądanego białka wywiera na mielinizację. Kokultury są oceniane pod kątem ekspresji białka mieliny za pomocą analizy western blot i wizualizowane pod kątem tworzenia mielinizowanych segmentów aksonalnych za pomocą immunocytochemii.

<table><tbody><tr><td>2K7 lentiwektor&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Miły prezent od dr Suter9</td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime;-deoksyurydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Koza anty-mysia IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115545205</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 koza anty-królicza IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 kozia anty-mysia IgG (H+L)</td><td>Life Technologie</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 kozia anty-królicza IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>B27 - NeuroCul SM1 Neuronal Suplement</td><td>Technologie komórek macierzystych&nbsp;</td><td>5711</td><td></td></tr><tr><td>BDNF (Człowiek)</td><td>Peprotech</td><td>PT450021000</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna (d-Biotyna)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Bradford</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6916-500ML&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378-100G</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Peprotech</td><td>450-13020</td><td></td></tr><tr><td>DAKO fluorescencyjny nośnik montażowy</td><td>DAKO</td><td>S302380-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza, pirogronian, bez glutaminy</td><td>Life Technologies</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>DNaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-375KU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, wapń, magnez</td><td>Life Technologies</td><td>14040182</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101</td><td></td></tr><tr><td>Wektory wejściowe dla promotora i genu będącego przedmiotem zainteresowania</td><td></td><td></td><td>Generuj zgodnie z protokołami 1-2</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza (D-glukoza)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Chem Supply</td><td>GL010-500M</td><td>Zobacz roztwory podstawowe</td></tr><tr><td>Kozia Anty-Mysia IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115005003</td><td></td></tr><tr><td>Koza Anty-Mysia IgM&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115005020</td><td></td></tr><tr><td>Kozia IgG Anty-Szczura</td><td>Jackson</td><td>ImmunoResearch 112005167</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma</td><td>Aldrich I3021-100ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Insulina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Laminin&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>LB Medium</td><td></td><td></td><td>Zobacz roztwory podstawowe</td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td></td><td></td><td>Zobacz roztwory podstawowe</td></tr><tr><td>L-Cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7477</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>L-glutaminian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina- 200 mM (100x) płyn</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase II Plus enzym</td><td>Life Technologies</td><td>12538-120</td><td></td></tr><tr><td>MEM, NEAA, bez Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>10370088</td><td></td></tr><tr><td>Mouse &alpha; &beta; III Tubulina&nbsp;</td>Mysz <td>Promega</td><td>G7121</td><td></td></tr><tr><td>i alfa; MBP (monoklonalny)</td><td>Millipore</td><td>MAB381</td><td></td></tr><tr><td>Na pirogronian&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>NcoI-HF</td><td>NEB</td><td>R3193S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 4 NEB</td><td></td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF (mysz)</td><td>Alomone Labs</td><td>N-100</td><td></td></tr><tr><td>NT-3</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp; 450-03</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało O1 - Mysi anty-O1</td><td>Millipore</td><td>MAB344</td><td>Alternatywa, jeśli komórki hybrydoma O1 są niedostępne</td></tr><tr>Komórki <td></td><td></td><td>hybrydoma O1</td><td>Kondycjonowana pożywka zawierająca przeciwciało anty-O1 do stosowania do immunopanującego</td></tr><tr><td>przeciwciała O4 - Mysi anty-O4</td><td>Millipore</td><td>MAB345</td><td>Alternatywa, jeśli komórki hybrydoma O4 są niedostępne</td></tr><tr><td>Komórki</td><td></td> <td>hybrydoma O4</td><td>Kondycjonowana pożywka zawierająca przeciwciało anty-O4 do stosowania do immunopanowania</td></tr><tr><td>Kompetentne komórki</td><td>Life Technologies</td><td>A10460</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl kompetentne komórki</td><td>Life Technologies</td><td>C7373-03</td><td></td></tr><tr><td>Zawiesina papainy</td><td>Worthington/Cooper</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>pBR8.91</td><td></td><td></td><td>Uprzejmy prezent od dr Denham10</td></tr><tr><td>PDGF-AA (Człowiek)</td><td>Peprotech</td><td>PT10013A500&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna 100x roztwór</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pENTRY4IRES2GFP</td><td>Invitrogen</td><td>11818-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenina (PEI)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornityna&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Tabletka inhibitora proteazy (kompletna mini)</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td></td><td></td><td>Dostarczana z enzymem klonazy</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-5780</td><td></td></tr><tr><td>Królik i alfa</td><td>neurofilament Millipore</td><td>AB1987&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Królik i alfa; MBP (poliklonalne)</td> <td>Millipore</td><td>AB980</td><td></td></tr><tr><td>Komórki hybrydoma Ran2</td><td>ATCC</td><td>TIB-119</td><td>Kondycjonowana pożywka zawierająca przeciwciało anty-Ran2 do stosowania do immunopanowania</td></tr><tr><td>Szczurze przeciwciało anty CD140A/PDGFRa</td><td>BD Pharmingen</td><td>558774</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>NEB</td><td>R0157</td><td></td></tr><tr><td>SOC</td><td></td><td></td><td>Dostarczane z kompetentnymi bakteriami</td></tr><tr><td>Selenin sodu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Spe I</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Bufor ligazy DNA</td><td>NEB</td><td>B0202S</td> Bufor TE pH8 Zobacz roztwory <td></td></tr><tr><td></td><td>podstawowe</td>Bufor do lizy TNE Pierwiastki śladowe B Cellgro&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>99-175-CI</td><td></td></tr><tr><td>Transferyna (apo-Transferyna człowiek)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9201-1G</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny z białka jaja kurzego</td><td>Roche</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (1x), czerwień fenolowa (0,05%)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Niesprzężona lektyna Griffonia simplicifolia BSL-1</td><td>Laboratoria wektorowe&nbsp;</td><td>L-1100</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja i wykorzystanie lentiwirusa do selektywnej transdukcji pierwotnych komórek prekursorowych oligodendrocytów do testów mielinizacji in vitro

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Mielinizacja to złożony proces, który obejmuje zarówno neurony, jak i mielinę, tworząc komórki glejowe, oligodendrocyty w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i komórki Schwanna w obwodowym układzie nerwowym (PNS). Używamy testu mielinizacji in vitro, uznanego modelu do badania mielinizacji OUN in vitro. W tym celu komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPC) są dodawane do oczyszczonych pierwotnych neuronów zwoju korzenia grzbietowego gryzoni (DRG) w celu utworzenia mielinizujących się kokultur. W celu szczegółowego zbadania ról, jakie poszczególne białka wyrażane przez oligodendrocyty odgrywają w mielinizacji, opracowaliśmy protokoły, które selektywnie transdukują OPC przy użyciu lentiwirusa z nadekspresją białek dzikich, konstytutywnie aktywnych lub dominujących ujemnych przed ich wysiewem do neuronów DRG. To pozwala nam na szczegółowe zbadanie roli tych oligodendroglialnych białek w regulacji mielinizacji. Protokoły mogą być również stosowane w badaniu innych typów komórek, zapewniając w ten sposób podejście, które umożliwia selektywną manipulację białkami wyrażanymi przez pożądany typ komórek, takich jak oligodendrocyty, w celu ukierunkowanego badania mechanizmów sygnalizacji i kompensacji. Podsumowując, połączenie testu mielinizacji in vitro z OPC zakażonymi lentiwirusem stanowi strategiczne narzędzie do analizy mechanizmów molekularnych zaangażowanych w mielinizację.

Konstrukt kinazy regulowanej sygnałami zewnątrzkomórkowymi 1 z tagiem Flag (Flag-Erk1) wykorzystany do produkcji lentiwirusów został zweryfikowany poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi użytych konstruktów, w tym zarówno konstruktów 2K7, jak i konstruktów opakowujących i pomocniczych niezbędnych do produkcji wirusa (Rysunek 3).
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej wykazujący rozdzielenie fragmentów DNA; etykiety: pBR8.91, pMDG2, 2K7-GF...

Tutaj prezentujemy protokoły, które oferują elastyczną i strategiczną podstawę do wirusowego manipulowania komórkami prekursorowymi oligodendrocytów w celu nadekspresji interesujących białek w celu specyficznego zbadania ich roli w oligodendrocytach za pomocą modelu mielinizacji ośrodkowego układu nerwowego in vitro.

Produkcja i wykorzystanie lentiwirusa do selektywnej transdukcji pierwotnych komórek prekursorowych oligodendrocytów do testów mielinizacji in vitro

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Ogólnym celem tej procedury jest wirusowe manipulowanie komórkami prekursorowymi oligodendrocytów lub OPC w celu nadmiernej ekspresji białek będących przedmiotem zainteresowania. W przypadku badania in vitro narodu mielinizacji OUN odbywa się to poprzez najpierw sklonowanie wektora lentiwirusowego. Kolejnym krokiem jest wyprodukowanie lentiwirusa i określenie optymalnego stężenia wirusa dla eksperymentu.Następnie wypreparowane i wyhodowane OPC są transdukowane lentiwirusem. Ostatnim krokiem jest zasianie transdukowanych OPC w hodowanych neuronach wypreparowanych z DRG. Ostatecznie mielinizujące się kultury kogeneracyjne są oceniane pod kątem ekspresji białka mieliny za pomocą analizy western blot i wizualizowane pod kątem tworzenia mielinizowanych segmentów aksonalnych przez barwienie immunologiczne.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak narzędzia farmakologiczne, jest to, że podejście lentiwirusowe pozwala nam na selektywną nadekspresję białek typu dzikiego lub zmutowanego w pożądanym typie komórek, takich jak w tym przypadku oligodendrocyty W przygotowaniu klonuj wymagane 2K siedem lent wektorów, jak opisano w protokole tekstowym rano w dniu transfekcji, przygotować 32 miliony limfocytów T HEK 2 93 w kolbie T 1 75 zawierającej 25 mililitrów pożywki. Krytycznie, komórki te muszą zostać przyklejone przed transfekcją, więc w razie potrzeby należy je pokryć wcześniej. W 50-mililitrowej probówce Falcon przygotuj mieszankę wzorcową do transfekcji kolby T 1 75, jak opisano w tabeli pierwszej, dodaj DNA do ciepłego wiru DMEM, a następnie dodaj sterylny PEI na końcu, aby uniknąć przedwczesnego wytrącania.Dobrze wymieszaj, odwracając rurkę trzy lub cztery razy, a następnie inkubuj mieszankę przez około 15 minut na ławce. Zmień pożywkę na komórkach, a następnie dodaj mieszaninę transfekcji. DROPWISE delikatnie wymieszaj pożywkę z komórkami, a następnie inkubuj komórki przez noc.Następnego dnia. Ekspresję GFP można sprawdzić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. 48 godzin po transfekcji zbierz pierwszą partię supernatantu wirusa i dodaj 25 mililitrów świeżej pożywki do komórek.Odwirować supernatant wirusa w temperaturze 1,140 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś supernatant wirusa bez osadu z resztek komórek do nowej probówki i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia, po 72 godzinach od transfekcji, zebrać ostatnią partię wirówki supernatantu wirusowego w celu usunięcia resztek komórek i połączyć z pierwszą partią oczyszczonego supernatantu wirusowego.Następnie zagęścić wirusa przez ultra odwirowanie supernatantu wirusa w temperaturze 170 000 G przez 90 minut. W czterech stopniach Celsjusza. Rozładuj ultra wirówkę i wylej supernatant, pozostawiając podniebienie z wytrąconego PEI i wirusa, który nie jest widoczny na dnie 30-mililitrowej probówki.Powtórz ten proces. Odwirowanie całego supernatu wirusa w partiach w tych samych 30-mililitrowych probówkach w celu zagęszczenia wirusa w celu ponownego zawieszenia wirusa w każdej probówce ultrawirówkowej. Dodaj 500 mikrolitrów pożywki Sato i przykryj probówkę folią.Następnie wiruj probówkę przez 30 sekund i mechanicznie usuń osad za pomocą końcówki pipety. Powtórz ten cykl usuwania wiru około sześć razy, aby upewnić się, że osad jest całkowicie zawieszony w pożywce Sato. Teraz zbierz cały zawieszony wirus w Sato w świeżej mikroprobówce.Krótko odwirować zebrany supernatant z maksymalną prędkością przez jedną minutę. Aby otopić PEI, należy zebrać supernatant zawierający wirusa i przefiltrować, przepuszczając roztwór przez filtr 0,45 mikrona za pomocą strzykawki do owinięcia. Oczyszczony wirus w Sedii należy podzielić na objętości 2050 i 100 mikrolitrów i przechowywać je wszystkie w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.W tym protokole należy mieć pierwotne komórki prekursorowe oligodendrocytów. OPC hodowane na 10-centymetrowych płytkach z 10 mililitrami sedii zawierającej następujące czynniki wzrostu, C-N-T-F-P-D-G-F-N NT trzy, a dla komórek muszą być hodowane przez 24 godziny w temperaturze poniżej 8% dwutlenku węgla. Zacznij od zassania nośnika i całkowicie go usuń.Następnie zastąp go 10 mililitrami tego samego podłoża z czynnikami wzrostu. Zainfekuj swoje OPC lentiwirusem, wyrażając interesujące Cię białko poprzez kroplowe dodawanie wymaganej objętości wirusa do pożywki. Również na oddzielnej płytce OPC wymieszaj kontrolnego lentiwirusa, który wyraża tylko GFP, z hodowlą pożywki, komórkami przez kolejne 48 godzin.Następnie zbierz OPC z płytek w celu wysiewu do hodowanych neuronów GRG. Najpierw dwukrotnie przepłucz każdą płytkę ośmioma mililitrami EBSS. Uzupełnij jeden mililitr trypsyny EDTA 0,05% z dziewięcioma mililitrami ciepłego EBSS.Dodaj pięć mililitrów rozcieńczonej trypsyny do każdej płytki. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza do dwóch minut. Zneutralizuj trypsynę, dodając pięć mililitrów 30% FBS do EBSS.Następnie za pomocą pipety o pojemności 10 mililitrów. Umyj OPC z powierzchni płytki. Za każdym razem obracaj płytkę o ćwierć obrotu, aby zebrać wszystkie komórki.Przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki. Odwirować komórki w temperaturze pokojowej przez 15 minut w temperaturze 180 Gs. Teraz odessać supernatant i resus. Zawieś osad komórkowy w mililitrze ciepłej pożywki saddo bez czynników wzrostu i policz komórki.Następnie przygotuj neurony DRG, które są hodowane na 22-milimetrowych szkiełkach okrywkowych, całkowicie odsysając pożywkę z ich płytki. Następnie delikatnie rozsiaj 200 000 OPC kroplami do każdego szkiełka nakrywkowego. Objętość wysiewu musi być mniejsza niż 200 mikrolitrów na szkiełko nakrywkowe.Pozwól komórkom osiąść bez przesuwania płytki Po 10 minutach przykryj każdą studzienkę mililitrem ciepłego somedu. Teraz odtwórz ponownie pozostałe siostrzane OPC. Ponieważ s omed zawiera czynniki wzrostu, można je później wykorzystać do weryfikacji ekspresji interesującego białka.Flaga oznaczona kinazą związaną z sygnałem zewnątrzkomórkowym. Jeden konstrukt został wykorzystany do ograniczenia produkcji lentiwirusa: Enzymy użyto do weryfikacji konstrukcji opakowania i konstrukcji akcesoriów w celu określenia optymalnego rozcieńczenia wirusa do użycia na OPC. Lentiwirus IR one miareczkowano w limfocytach T HEK 2 93 w zakresie rozcieńczenia wirusa do limfocytów T HEK 2 93.Poziom ekspresji interesującego nas genu wzrastał z czasem. Następnie oczyszczone OPC zostały zakażone i hodowane przez co najmniej dwa dni, aby zapewnić ekspresję transgenu. Poziomy LGR i GFP zostały potwierdzone w siostrzanych OPC.OPC zostały następnie umieszczone na neuronach DRG. OPC następnie zróżnicowały się w oligodendrocyty i, jak ocenili zachodni badacze, zaczęły wyrażać białka mielinowe. Niektóre dojrzałe oligodendrocyty mielinizowane, co zostało uwidocznione przez aksony barwiące MBP, wybarwiono neurofilamentem lub tubuliną beta trzy, aby upewnić się, że gęstości aksonów zostały wzięte pod uwagę.Podczas analizy poziomów mielinizacji Po wysiewie OPC ważne jest, aby hodować. Siostrzane transportery opancerzone. W ten sposób białko będące przedmiotem zainteresowania lub znacznik na białku będącym przedmiotem zainteresowania, ta ekspresja może zostać zweryfikowana w siostrzanych APC, jeśli nie można jej zweryfikować w kokulturze.

production-use-lentivirus-to-selectively-transduce-primary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy protokół oparty na małych cząsteczkach służący do różnicowania mysich embrionalnych komórek macierzystych w komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPC). Protokół ten pozwala na wysokowydajne generowanie komórek OPC Olig2+NG2+ w ciągu 30 dni różnicowania. Opisujemy również metodę generowania „spiking” OPC, które są zdolne do generowania potencjałów czynnościowych.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych w prekursory oligodendrocytów

Opisano protokół ex vivo służący do generowania dojrzałych ludzkich erytrocytów z hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych. Dodatkowo opisano wydajną metodę dostarczania lentiwirusowego w celu wyciszenia czynnika transkrypcyjnego TAL1 w pierwotnych komórkach erytroidalnych. Wydajność dostarczania genów za pomocą lentiwirusów została zademonstrowana z wykorzystaniem wirusów ekspresyjących GFP.

Lentiwirusowy wyciszanie genów podczas erytropoezy ex vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

W niniejszym protokole opisujemy produkcję, oczyszczanie i miareczkowanie wektorów lentiwirusowych. Przedstawiamy przykład dostarczania genów za pomocą wektora lentiwirusowego do pierwotnych hodowli neuronów i astrocytów. Nasze metody mogą mieć zastosowanie również do innych typów komórek in vitro oraz in vivo.

Produkcja wektorów lentiwirusem do transdukcji komórek ośrodkowego układu nerwowego

Film demonstruje protokół różnicowania komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) na oligodendrocyty i indukowania mielinizacji w kokulturze z neuronami zwoju korzenia grzbietowego (DRG). OPC są transdukowane za pomocą wektorów lentiwirusowych kodujących białko sygnałowe, które reguluje mielinizację. Transdukowane OPC są hodowane wspólnie z neuronami DRG w celu oceny różnicowania w oligodendrocyty i mielinizacji indukowanej białkiem sygnałowym.

Test mielinizacji indukowanej transdukcją in vitro dla komórek prekursorowych oligodendrocytów

Oligodendrocyty to komórki mielinizujące ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje metodę izolacji i hodowli ich prekursorów, komórek progenitorowych oligodendrocytów, z kory szczura, a także szybką i wiarygodną metodę ilościową oceny oligodendrogenezy in vitro w odpowiedzi na czynniki eksperymentalne.

Przygotowanie hodowli progenitorowych oligodendrocytów szczurów i kwantyfikacja oligodendrogenezy za pomocą skanowania fluorescencyjnego w podwójnej podczerwieni

Opisujemy immunomagnetyczną izolację pierwotnych oligodendrocytów myszy, która pozwala na szybką i specyficzną izolację komórek do hodowli in vitro.

Szybka i swoista izolacja immunomagnetyczna pierwotnych oligodendrocytów myszy

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Oparta na inżynierii lentiwirusowej in vitro prekursorów neuronów, ich kotransplantacji do mózgów dzikich typów i sparowanej ocenie morfometrycznej pochodnych "testowych" i "kontrolnych", metoda ta pozwala na dokładne modelowanie in vivo kontroli genów morfologii neuronów kory nowej w prosty i niedrogi sposób.

Dokomorowy przeszczep zmodyfikowanych prekursorów neuronalnych do badań neuroarchitektury in vivo

Interakcje neuron-glej w neurodegeneracji nie są dobrze poznane z powodu nieodpowiednich narzędzi i metod. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowane protokoły uzyskiwania indukowanych neuronów, komórek prekursorowych oligodendrocytów i oligodendrocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz podajemy przykłady wartości tych metod w zrozumieniu wkładu specyficznego typu komórki w chorobie Alzheimera.

Generowanie ludzkich neuronów i oligodendrocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty

Używając taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI), wyprodukowaliśmy cząsteczki lentiwirusowe do stabilnej ekspresji shRNA w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych H9 (hESC) i przejściowo transdukowaliśmy neuronalne komórki progenitorowe (NPC) pochodzące z H9 z wysoką wydajnością.

Dostarczanie shRNA za pośrednictwem lentiwirusów do hESC i NPC przy użyciu taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI)

Poznaj metodę produkcji lentiwirusa do selektywnej transdukcji komórek prekursorowych oligodendrocytów OPCs w badaniach mielinizacji OUN in vitro. Technika umożliwia nadekspresję białek w celu analizy ich roli w procesie mielinizacji.

Produkcja i wykorzystanie lentiwirusa do selektywnej transdukcji pierwotnych komórek prekursorowych oligodendrocytów do testów mielinizacji in vitro (Wideo) | JoVE Journal

Produkcja i wykorzystanie lentiwirusa do selektywnej transdukcji pierwotnych komórek prekursorowych oligodendrocytów do testów mielinizacji in vitro

Przeglądaj więcej filmów