Produkcja i wykorzystanie lentiwirusa do selektywnej transdukcji pierwotnych komórek prekursorowych oligodendrocytów do testów mielinizacji in vitro

Ogólnym celem tej procedury jest wirusowe manipulowanie komórkami prekursorowymi oligodendrocytów lub OPC w celu nadmiernej ekspresji białek będących przedmiotem zainteresowania. W przypadku badania in vitro narodu mielinizacji OUN odbywa się to poprzez najpierw sklonowanie wektora lentiwirusowego. Kolejnym krokiem jest wyprodukowanie lentiwirusa i określenie optymalnego stężenia wirusa dla eksperymentu.

Następnie wypreparowane i wyhodowane OPC są transdukowane lentiwirusem. Ostatnim krokiem jest zasianie transdukowanych OPC w hodowanych neuronach wypreparowanych z DRG. Ostatecznie mielinizujące się kultury kogeneracyjne są oceniane pod kątem ekspresji białka mieliny za pomocą analizy western blot i wizualizowane pod kątem tworzenia mielinizowanych segmentów aksonalnych przez barwienie immunologiczne.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak narzędzia farmakologiczne, jest to, że podejście lentiwirusowe pozwala nam na selektywną nadekspresję białek typu dzikiego lub zmutowanego w pożądanym typie komórek, takich jak w tym przypadku oligodendrocyty W przygotowaniu klonuj wymagane 2K siedem lent wektorów, jak opisano w protokole tekstowym rano w dniu transfekcji, przygotować 32 miliony limfocytów T HEK 2 93 w kolbie T 1 75 zawierającej 25 mililitrów pożywki. Krytycznie, komórki te muszą zostać przyklejone przed transfekcją, więc w razie potrzeby należy je pokryć wcześniej. W 50-mililitrowej probówce Falcon przygotuj mieszankę wzorcową do transfekcji kolby T 1 75, jak opisano w tabeli pierwszej, dodaj DNA do ciepłego wiru DMEM, a następnie dodaj sterylny PEI na końcu, aby uniknąć przedwczesnego wytrącania.

Dobrze wymieszaj, odwracając rurkę trzy lub cztery razy, a następnie inkubuj mieszankę przez około 15 minut na ławce. Zmień pożywkę na komórkach, a następnie dodaj mieszaninę transfekcji. DROPWISE delikatnie wymieszaj pożywkę z komórkami, a następnie inkubuj komórki przez noc.

Następnego dnia. Ekspresję GFP można sprawdzić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. 48 godzin po transfekcji zbierz pierwszą partię supernatantu wirusa i dodaj 25 mililitrów świeżej pożywki do komórek.

Odwirować supernatant wirusa w temperaturze 1,140 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś supernatant wirusa bez osadu z resztek komórek do nowej probówki i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia, po 72 godzinach od transfekcji, zebrać ostatnią partię wirówki supernatantu wirusowego w celu usunięcia resztek komórek i połączyć z pierwszą partią oczyszczonego supernatantu wirusowego.

Następnie zagęścić wirusa przez ultra odwirowanie supernatantu wirusa w temperaturze 170 000 G przez 90 minut. W czterech stopniach Celsjusza. Rozładuj ultra wirówkę i wylej supernatant, pozostawiając podniebienie z wytrąconego PEI i wirusa, który nie jest widoczny na dnie 30-mililitrowej probówki.

Powtórz ten proces. Odwirowanie całego supernatu wirusa w partiach w tych samych 30-mililitrowych probówkach w celu zagęszczenia wirusa w celu ponownego zawieszenia wirusa w każdej probówce ultrawirówkowej. Dodaj 500 mikrolitrów pożywki Sato i przykryj probówkę folią.

Następnie wiruj probówkę przez 30 sekund i mechanicznie usuń osad za pomocą końcówki pipety. Powtórz ten cykl usuwania wiru około sześć razy, aby upewnić się, że osad jest całkowicie zawieszony w pożywce Sato. Teraz zbierz cały zawieszony wirus w Sato w świeżej mikroprobówce.

Krótko odwirować zebrany supernatant z maksymalną prędkością przez jedną minutę. Aby otopić PEI, należy zebrać supernatant zawierający wirusa i przefiltrować, przepuszczając roztwór przez filtr 0,45 mikrona za pomocą strzykawki do owinięcia. Oczyszczony wirus w Sedii należy podzielić na objętości 2050 i 100 mikrolitrów i przechowywać je wszystkie w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

W tym protokole należy mieć pierwotne komórki prekursorowe oligodendrocytów. OPC hodowane na 10-centymetrowych płytkach z 10 mililitrami sedii zawierającej następujące czynniki wzrostu, C-N-T-F-P-D-G-F-N NT trzy, a dla komórek muszą być hodowane przez 24 godziny w temperaturze poniżej 8% dwutlenku węgla. Zacznij od zassania nośnika i całkowicie go usuń.

Następnie zastąp go 10 mililitrami tego samego podłoża z czynnikami wzrostu. Zainfekuj swoje OPC lentiwirusem, wyrażając interesujące Cię białko poprzez kroplowe dodawanie wymaganej objętości wirusa do pożywki. Również na oddzielnej płytce OPC wymieszaj kontrolnego lentiwirusa, który wyraża tylko GFP, z hodowlą pożywki, komórkami przez kolejne 48 godzin.

Następnie zbierz OPC z płytek w celu wysiewu do hodowanych neuronów GRG. Najpierw dwukrotnie przepłucz każdą płytkę ośmioma mililitrami EBSS. Uzupełnij jeden mililitr trypsyny EDTA 0,05% z dziewięcioma mililitrami ciepłego EBSS.

Dodaj pięć mililitrów rozcieńczonej trypsyny do każdej płytki. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza do dwóch minut. Zneutralizuj trypsynę, dodając pięć mililitrów 30% FBS do EBSS.

Następnie za pomocą pipety o pojemności 10 mililitrów. Umyj OPC z powierzchni płytki. Za każdym razem obracaj płytkę o ćwierć obrotu, aby zebrać wszystkie komórki.

Przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki. Odwirować komórki w temperaturze pokojowej przez 15 minut w temperaturze 180 Gs. Teraz odessać supernatant i resus. Zawieś osad komórkowy w mililitrze ciepłej pożywki saddo bez czynników wzrostu i policz komórki.

Następnie przygotuj neurony DRG, które są hodowane na 22-milimetrowych szkiełkach okrywkowych, całkowicie odsysając pożywkę z ich płytki. Następnie delikatnie rozsiaj 200 000 OPC kroplami do każdego szkiełka nakrywkowego. Objętość wysiewu musi być mniejsza niż 200 mikrolitrów na szkiełko nakrywkowe.

Pozwól komórkom osiąść bez przesuwania płytki Po 10 minutach przykryj każdą studzienkę mililitrem ciepłego somedu. Teraz odtwórz ponownie pozostałe siostrzane OPC. Ponieważ s omed zawiera czynniki wzrostu, można je później wykorzystać do weryfikacji ekspresji interesującego białka.

Flaga oznaczona kinazą związaną z sygnałem zewnątrzkomórkowym. Jeden konstrukt został wykorzystany do ograniczenia produkcji lentiwirusa: Enzymy użyto do weryfikacji konstrukcji opakowania i konstrukcji akcesoriów w celu określenia optymalnego rozcieńczenia wirusa do użycia na OPC. Lentiwirus IR one miareczkowano w limfocytach T HEK 2 93 w zakresie rozcieńczenia wirusa do limfocytów T HEK 2 93.

Poziom ekspresji interesującego nas genu wzrastał z czasem. Następnie oczyszczone OPC zostały zakażone i hodowane przez co najmniej dwa dni, aby zapewnić ekspresję transgenu. Poziomy LGR i GFP zostały potwierdzone w siostrzanych OPC.

OPC zostały następnie umieszczone na neuronach DRG. OPC następnie zróżnicowały się w oligodendrocyty i, jak ocenili zachodni badacze, zaczęły wyrażać białka mielinowe. Niektóre dojrzałe oligodendrocyty mielinizowane, co zostało uwidocznione przez aksony barwiące MBP, wybarwiono neurofilamentem lub tubuliną beta trzy, aby upewnić się, że gęstości aksonów zostały wzięte pod uwagę.

Podczas analizy poziomów mielinizacji Po wysiewie OPC ważne jest, aby hodować. Siostrzane transportery opancerzone. W ten sposób białko będące przedmiotem zainteresowania lub znacznik na białku będącym przedmiotem zainteresowania, ta ekspresja może zostać zweryfikowana w siostrzanych APC, jeśli nie można jej zweryfikować w kokulturze.