Modelowanie kandydozy błony śluzowej u larw danio pręgowanego przez wstrzyknięcie do pęcherza pławnego

Ogólnym celem tej procedury jest modelowanie kandydozy błony śluzowej na przykładzie młodego danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez uprzednie załadowanie roztworu zawierającego żywe albicany do mikroigły. W drugim etapie określona objętość komórek drożdży jest wstrzykiwana do pęcherza pławnego młodego danio pręgowanego.

Następnie ryby są przesiewane pod kątem jednorodnego inokulum i inkubowane przez żądany czas. W ostatnim etapie stosuje się mikroskopię konfokalną, aby śledzić dynamiczną interakcję patogenu z układem odpornościowym danio pręgowanego. Dodatkowo pęcherz pławny może być poddawany mikrosekcji w celu uzyskania obrazów konfokalnych o wyższej rozdzielczości.

Metoda, którą tutaj prezentujemy, odpowiada na kluczowe pytania immunologii grzybów, a także mikrobiologii, takie jak dokładna sekwencja zdarzeń prowadzących do nieudanej odpowiedzi immunologicznej na patogen grzybowy i sygnalizatory kandydowe na powierzchni błony śluzowej. Przed rozpoczęciem zabiegu należy ogrzać naczynie iniekcyjne zawierające 2%aros w inkubatorze o temperaturze 33 stopni Celsjusza. Po 30 minutach użyj pipety o pojemności 25 mililitrów, aby usunąć 100 mililitrów pożywki E trzy plus PTU z talerza czwartego dnia, po zapłodnieniu rybę danio pręgowanego, uważając, aby nie zassać żadnej z ryb, i dodaj dwa mililitry po cztery miligramy na mililitr.

Sulfonian trica metanu jest dostarczany do pożywki w celu znieczulenia zwierząt. Po 15 minutach użyj mikroskopu preparacyjnego, aby zidentyfikować ryby z napompowanymi pęcherzami pławnymi i użyj plastikowej pipety do przenoszenia, aby przenieść 30 ryb danio pręgowanego na wstępnie rozgrzane naczynie do wstrzykiwań. Usuń nadmiar pożywki, a następnie trzymaj naczynie pod kątem i użyj żyłki o średnicy 0,012 cala super przyklejonej do kapilary z krzemianu boro, aby wykonać trzy linie po 10 pionowo ustawionych w pionie Ryby, z których każda następnie dokładnie wiruje rurkę świeżo przygotowanych albicanów morskich w stężeniu 1,5 razy 10 do siódmych CFU na mililitr.

A następnie załaduj trzy mikrolitry roztworu drożdży do mikroigły z klipsem EC. Ustaw czas trwania impulsu na odpowiednie ustawienie. Następnie obrócić naczynie iniekcyjne, aby osiągnąć kąt 20 stopni między mikroigłą a głową ryby, kierując się w stronę tylnej części pęcherza pławnego.

Teraz wepchnij mikroigłę do pęcherza pławnego, upewniając się, że otwór igły znajduje się w świetle i naciśnij kałużę. Po zweryfikowaniu, które ryby zostały wstrzyknięte, jest stosunkowo łatwe, ponieważ bolus wypiera pęcherzyk powietrza, a tył pęcherza pławnego jest następnie wypełniany pożywką, wstrzyknięcie czerwieni fenolowej za pomocą bolusa może dodatkowo ułatwić wizualizację udanego wstrzyknięcia. Po wstrzyknięciu wszystkich 30 ryb zalej naczynie pożywką E trzy, a następnie opróżnij rybę do naczynia do odzyskiwania.

Przenieś 10 zwierząt do 1,7 mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej jeden mililitr pożywki E trzy i poddaj ryby eutanazji 200 mikrolitrami trica. Następnie dla każdego zwierzęcia ułóż cztery krople tłuszczu próżniowego w kwadracie w odległości jednego centymetra od siebie na mikroszkiełku i dodaj dwie krople świeżo przygotowanej, 2% niskotopliwej kropli na środek kwadratu. Następnie umieść jedną rybę na osobnym szklanym szkiełku pod mikroskopem preparacyjnym i sprawdź, czy serce zwierzęcia przestało bić i usuń nadmiar wody.

Teraz użyj jednej pary cienkiej pęsety, aby utrzymać głowę w ustalonej pozycji, a drugiej, aby pociągnąć w dół przedni odcinek jelita. Podnieś pęcherz pławny za przewód pneumatyczny, oddzielając go od przewodu pokarmowego, i umieść go na środku jednego z przygotowanych mikroszkiełek, zanim agro zastygnie. Na koniec umieść szkiełko nakrywkowe na chusteczce, delikatnie dociskając w dół, aż dotknie tłuszczu próżniowego i agarozy, a następnie zobrazuj pęcherz pławny w ciągu 10 minut od zbioru.

Wstrzyknięcie czterech nanolitrów albikanów morskich w ilości od jednego do 1,5 razy 10 siódmego. CFU na mililitr daje najbardziej spójne dane, co daje zakres od 10 do 50 komórek drożdży na rybę. Zawężenie inokulum do 15 do 25 komórek drożdży daje jeszcze ściślejszy fenotyp i odpowiedź.

Neutrofile odgrywają kluczową rolę w odporności na kandydozę u myszy i ludzi, a zakażenie pęcherza pławnego zebry żywymi albicanami prowadzi do szybkiej i trwałej rekrutacji neutrofili. Nie dzieje się tak, gdy wstrzykiwane są komórki drożdży zabijające ciepło. Włókna rozwijają się szybko po wstrzyknięciu komórek drożdży, a nitkowaty wzrost trwa przez pierwsze 24 godziny po wstrzyknięciu, po czym liczba ta zaczyna się zmniejszać zdolność do nieinwazyjnego śledzenia poszczególnych ryb umożliwia te badania podłużne i podkreśla indywidualne różnice w postępie choroby i odpowiedziach gospodarza.

Protokół eksperymentalny, który pozostaje niepraktyczny w obrazowaniu myszy, interakcje komórek odpornościowych lub nabłonkowych z c albicans są stosunkowo łatwe w przedstawionym tutaj modelu. Jednak wypreparowanie pęcherza pławnego, jak właśnie wykazano, znacznie poprawia jakość obrazowania. Jest to szczególnie przydatne podczas wizualizacji transgenicznych linii ryb, w których fluorescencja jest wszechobecna, a w otaczającej tkance występuje zewnętrzna fluorescencja, jak zaobserwowano na tych obrazach wypreparowanego pęcherza pławnego z linii ryb cytrynowych alfa Catine.

Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak technologia morfologiczne lub leczenie hamowaniem chemicznym, mogą być wykorzystane do odpowiedzi na pytanie, jaka jest rola określonej komórki odpornościowej lub szlaku sygnałowego w kandydozie błony śluzowej.