Name: Modelowanie kandydozy błony śluzowej u larw danio pręgowanego przez wstrzyknięcie do pęcherza pławnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Poznaj metodę modelowania kandydozy błony śluzowej u larw Danio rerio przez wstrzyknięcie Candida albicans do pęcherza pławnego. Technika ta umożliwia obserwację interakcji patogen-zwierzę w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. Le Trinh i Dr. Tobinowi za hojne dostarczenie linii α-katenin:cytryn oraz Billowi Jackmanowi za umożliwienie nam filmowania w jego laboratorium. Autorzy wymieniają źródła finansowania: National Institutes of Health (granty 5P20RR016463, 8P20GM103423 i R15AI094406) oraz USDA (Projekt # ME0-H-1-00517-13). Rękopis ten został opublikowany jako publikacja Głównej Stacji Doświadczalnej Rolnictwa i Leśnictwa nr 3371.

UWAGA: Wszystkie protokoły opieki nad danio pręgowanym i eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi NIH zgodnie z protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) A2012-11-03.
1. Hodowla danio pręgowanego do 4 dni po zapłodnieniu
<ol>
	<li>Zbierz AB danio pręgowanego lub inne linie transgeniczne w ciągu pierwszych 3 godzin po zapłodnieniu, jak pokazano na innym filmie34.</li>
	<li>Inkubować 120 jaj na 15-centymetrowych szalkach Petriego zawierających 150 ml pożywki E3 (5 mM NaCl; 0,17 mM KCl; 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgCl2; 2 mM HEPES; pH 6,8) z błękitem metylenowym (0,3 μg/ml stężenie końcowe) w inkubatorze o temperaturze 33 °C z fotoperiodem 12/12 jasny/ciemny</li>.
	<li>Po 6 godzinach zastąp pożywkę E3 + PTU (1-fenylo-2-tiomocznik, końcowe stężenie 10 μg/ml) i usuń martwe jaja.</li>
	<li>Inkubować przez 4 dni w temperaturze 33 °C, wymieniając pożywkę na świeżą pożywkę E3 + PTU po 2 dniach.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mikroigieł do iniekcji
<ol>
	<li>Pociągnij kapilę borokrzemianową (średnica zewnętrzna 1,2 mm; ID 0,69 mm) do mikroigły za pomocą ściągacza igłowego z następującymi ustawieniami (550 Ciepło; 0 Ciągnięcie; 130 Prędkość; 110 Czas). 
	UWAGA: Ustawienia będą się różnić w zależności od filamentu, aby uzyskać mikroigły o podobnym kształcie (patrz Rysunek 1) i będą musiały być ponownie regulowane za każdym razem, gdy instalowany jest nowy filament.</li>
	<li>Napełnij mikroigłę 3 μl soli fizjologicznej z przefiltrowanym buforem fosforanowym o stężeniu 0,4 μm (PBS; 137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 10 mM Na2HPO4; 1,8 mM KH2PO4; pH 7,4) za pomocą końcówki do pipety z mikroładowarką o pojemności 20 μl.</li>
	<li>Ustawić mikroigłę na uchwycie mikropipety na mikromanipulatorze podłączonym do ciśnieniowego systemu iniekcyjnego. Ustaw ciśnienie wtrysku na 30 PSI, a czas trwania impulsu na 30 ms.</li>
	<li>Używając szalki Petriego z wodą destylowaną, opuść mikroigłę, aż 1/5 igły znajdzie się w wodzie. Przytnij mikroigłę delikatną pęsetą tuż pod poziomem wody. Wyjmij mikroigłę z wody i naciśnij pedał kilka razy, aż pojawi się bolus.</li>
	<li>Zmierz średnicę bolusa, opuszczając mikroigłę na hemocytometrze pokrytym jedną kroplą olejku immersyjnego typu A. Dostosuj czas trwania impulsu, aby uzyskać żądaną głośność (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Ustawić ciśnienie wsteczne, aby bolus pozostał stabilny w oleju (zmniejszyć ciśnienie, jeśli bolus zwiększa objętość, i zwiększyć ciśnienie wsteczne, jeśli objętość bolusa maleje). Zapisz czas trwania impulsu dla każdej mikroigły.</li>
	<li>Wyjmij PBS z mikroigły, zasysając ją za pomocą końcówki pipety do mikroładowarki i wyrzuć resztki PBS, umieszczając je z powrotem na wtryskiwaczu i obracając przełącznik impulsów ciągłych. Zarezerwuj każdą mikroigłę.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do Candidy
<ol>
	<li>Smuga Candida albicans przekształcona za pomocą zoptymalizowanego pod kątem kodonów dTomato, GFP, BFP, EOS lub Far Red z zamrożonego wywaru (-80 °C bulion w 25% glicerolu) za pomocą sterylnego drewnianego kołka na płytce agarowej z dekstrozą peptynową (YPD) (10 g/l ekstraktu drożdżowego, 20 g/l peptonu, 20 g/l dekstrozy, 20 g/l agaru; autoklawowane i wlane 25 ml na szalki Petriego) i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Pobrać jedną kolonię za pomocą sterylnego drewnianego kołka i zaszczepić 5 ml płynu YPD (10 g/l ekstraktu drożdżowego, 20 g/l peptonu, 20 g/l dekstrozy, autoklawowane i aseptycznie porcjowane w 5 ml w szklanych probówkach hodowlanych o wymiarach 16 x 150 mm).</li>
	<li>Inkubować przez noc w temperaturze 30 °C w bębnie rolkowym z prędkością 60 obr./min.</li>
	<li>Zebrać 1 ml kultury C. albicans i przenieść do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,7 ml.</li>
	<li>Wirować przy 5 000 x g przez kilka sekund. Opróżnić supernatant i dodać 1 ml sterylnego PBS, dokładnie odmieszać. Powtórz to dwa razy.</li>
	<li>Policzyć kolonie za pomocą hemocytometru, rozcieńczając 1 ml bulionu w stosunku 1:1,000 w sterylnym PBS.</li>
</ol>
4. Wstrzykiwanie danio pręgowanego do pęcherza pławnego
<ol>
	<li>Ogrzewać naczynie iniekcyjne (2% agarozy) przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 33 °C.</li>
	<li>W pożądanym czasie należy pobrać 100 ze 150 ml E3 + PTU z 15 cm płytki Petriego zawierającej rybę do wstrzyknięcia za pomocą pipety o pojemności 25 ml, nie odsysając danio pręgowanego.</li>
	<li>Znieczulić 4 dpf danio pręgowanego, dodając 2 ml buforowanego bulionu sulfonianu metanu trikainy (TR) o stężeniu 4 mg/ml do pozostałych 50 ml pożywki (stężenie końcowe 200 μg/ml) i odczekać 15 minut.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym wybierz ryby z napompowanym pęcherzem pławnym. W tym czasie ryby mogą być również badane pod kątem jednorodnego fenotypu, takiego jak rozmieszczenie neutrofili w linii mpo:GFP za pomocą mikroskopu preparacyjnego epifluorescencji.</li>
	<li>Rozcieńczyć zapas C. albicans od jego pierwotnego stężenia (krok 3.8) do 1,5 x 107 jednostek tworzących kolonie na ml (jtk/ml) w PBS.</li>
	<li>Przenieś 30 danio pręgowanego na naczynie iniekcyjne za pomocą plastikowej pipety transferowej i usuń nadmiar pożywki.</li>
	<li>Za pomocą narzędzia z drutu wędkarskiego (żyłka o średnicy 0,012 cala wklejona w kapilę borokrzemianową) wykonaj 3 linie po 10 ryb, trzymając naczynie iniekcyjne pionowo i ustaw rybę pionowo.</li>
	<li>Usuń nadmiar nośnika.</li>
	<li>Dokładnie przemieszać probówkę z 1,5 x 107 jtk/ml C. albicans.</li>
	<li>Napełnij jedną mikroigłę 3 μl C. albicans za pomocą nowej końcówki do pipety mikroładowarki i ustaw czas trwania impulsu na odpowiednie ustawienie (patrz krok 2.9).</li>
	<li>Obrócić naczynie iniekcyjne tak, aby uzyskać kąt 20° między mikroigłą a głową ryby, kierując się w stronę tylnej części pęcherza pławnego (Rysunek 3A).</li>
	<li>Wciśnij mikroigłę do pęcherza pławnego, upewniając się, że otwór igły znajduje się w świetle i naciśnij raz pedał.</li>
	<li>Powtórzyć tę czynność dla każdej ryby i przenieść do naczynia regeneracyjnego (25 ml E3 + PTU), zalewając naczynie E3 i opróżniając je do naczynia regeneracyjnego.</li>
	<li>Przenieś kolejne 30 ryb do naczynia do wstrzykiwań.</li>
	<li>Powtórzyć wstrzyknięcie za pomocą nowej mikroigły wypełnionej dokładnie zawirowanymi C. albicans.</li>
	<li>Na koniec wstrzyknąć kontrolkę PBS, jeśli to konieczne, używając innego naczynia iniekcyjnego w celu uniknięcia zanieczyszczenia i przenieść do oddzielnego naczynia do odzyskiwania (krok 4.10).</li>
</ol>
5. Badanie ryb pod kątem pożądanego inokulum
<ol>
	<li>Przygotować 40 ml 0,4% niskotopliwego roztworu agarozy (LMA), dodając 160 mg niskotopliwej agarozy do 40 ml E3, gotując w kuchence mikrofalowej aż do rozpuszczenia i schładzając do 37 °C. Po schłodzeniu dodać 400 μl TR (stężenie końcowe 200 μg/ml).</li>
	<li>Po 30 minutach rekonwalescencji znieczulić rybę zgodnie z opisem (krok 4.3 przy użyciu tylko 1 ml TR w 25 ml E3 + PTU, końcowe stężenie 200 μg/ml).</li>
	<li>Przenieś 30 ryb (z jak najmniejszą ilością pożywki) do 2 ml LMA w łodzi obciążeniowej.</li>
	<li>Odessać poszczególne ryby za pomocą pipety transferowej i umieścić rybę na płytce z 1 kroplą LMA w 96-dołkowej płytce obrazowej, używając tylko 10 x 6 dołków centralnych.</li>
	<li>Powtarzaj tę czynność, aż wszystkie ryby do przesiewania zostaną załadowane na płytkę obrazową.</li>
	<li>Pozwól pożywce zestalić się w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Ułóż rybę na boku, upewniając się, że stykają się ze szklanym dnem.</li>
	<li>Używając obiektywu 20X w odwróconym mikroskopie epifluorescencyjnym/konfokalnym i odpowiednim filtrze, zapisz liczbę komórek drożdży C. albicans w pęcherzu pławnym każdej ryby.</li>
	<li>Wybierz rybę z 15-25 komórkami drożdży w pęcherzu pławnym (lub pożądanym inokulum), poddaj eutanazji niewybrane ryby (800 μg/ml TR w E3) i wróć wybrane ryby na głęboką szalkę Petriego z 50 ml E3 + PTU, dodając 3 krople E3 do płytki obrazowej wybrane studzienki i odsysając rybę plastikową pipetą transferową.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 33 °C przez żądany czas.</li>
</ol>
6. Obrazowanie ryb po badaniu przesiewowym
<ol>
	<li>W żądanym czasie usunąć 25 z 50 ml pożywki E3 + PTU z głębokiej szalki Petriego zawierającej rybę do zobrazowania.</li>
	<li>Znieczulić rybę zgodnie z opisem (krok 4.3 używając tylko 1 ml TR w 25 ml E3 + PTU pozostałe, końcowe stężenie 200 μg/ml).</li>
	<li>Umieść rybę na 96-dołkowej płytce obrazowej i odpowiednio ją umieść (kroki 5.3 - 5.7).</li>
	<li>Obraz za pomocą skaningowej mikroskopii konfokalnej z wykorzystaniem odpowiednich laserów i filtrów emisyjnych. Najpierw skup się na rybach za pomocą obiektywu 4X przy różnicowym kontraście interferencyjnym (DIC) i uzyskaj obrazy obszaru zainteresowania za pomocą obiektywu 20X za pomocą laserów konfokalnych w trybie skanowania z prędkością 2 μs/piksel i proporcjami pikseli 1024 x 600. Uzyskaj stosy Z z krokiem 1 μm, stosując tryb filtra Kalmana składający się z 3 klatek.</li>
	<li>Powrócić do głębokiej płytki Petriego z 50 ml E3 + PTU lub do indywidualnych studzienek (24-dołkowe szalka hodowlana, 3 ml E3 + PTU) i inkubować w temperaturze 33 °C.</li>
</ol>
7. Sekcja pęcherza pławnego
<ol>
	<li>Napełnić strzykawkę o pojemności 10 ml smarem wysokopróżniowym.</li>
	<li>Przygotować 2% LMA (krok 5.3 z 160 mg niskotopliwej agarozy w 8 ml E3).</li>
	<li>W pożądanym czasie znieczulij rybę (krok 5.2).</li>
	<li>Przenieść 10 ryb do probówki wirówkowej o pojemności 1,7 ml z 1 ml E3 i poddać eutanazji poprzez dodanie 200 μl 4 mg/ml trikainy (końcowe stężenie 800 μg/ml) do probówki wirówkowej i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować szkiełko obrazowe, umieszczając 4 krople smaru próżniowego w kwadracie w odległości 1 cm od siebie na mikroszkiełku (75 x 25 mm, Rysunek 2).</li>
	<li>Umieść 2 krople 2% LMA na środku kwadratu.</li>
	<li>Umieść jedną rybę na osobnym szklanym szkiełku pod mikroskopem preparacyjnym i sprawdź, czy serce przestało bić, usuń nadmiar wody.</li>
	<li>Za pomocą cienkiej pęsety rozetnij pęcherz płyński, utrzymując głowę w ustalonej pozycji za pomocą lewej pęsety i ciągnąc w dół przedni odcinek jelita za pomocą prawej pęsety (ryc. 4A).</li>
	<li>Podnieś pęcherz pławny za kanał pneumatyczny za pomocą lewej pęsety, oddzielając go od przewodu pokarmowego, i umieść go na środku 2% LMA, zanim zastygnie.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe (18 x 18 mm) na szkiełku obrazowym i dociśnij je, aż dotknie smaru próżniowego oraz LMA (Rysunek 2).</li>
	<li>Obraz w ciągu 10 minut od sekcji, jak opisano w kroku 6.4. Powtórz kroki 7.7 - 7.11 z innymi rybami.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Postępy i ograniczenia modelu choroby mikroiniekcyjnej w pęcherzu pławnym
Prezentowany tutaj model jest rozszerzeniem modelu zanurzenia w kandydozie błony śluzowej opisanego w Gratacap et al. (2013); Dodaje korzyści w postaci kontrolowanego czasu infekcji, wysoce powtarzalnej dawki infekcji, a tym samym lepszej wydajności. Demonstrujemy tutaj nowe metody, które pozwalają na nieinwazyjną dokumentację czasową dynamiki infekcji w bardzo szczegółowy sposób, a także obrazowanie ex vivo</e...

Infekcje błony śluzowej mogą prowadzić do zagrażających życiu zakażeń krwi z powodu uszkodzenia bariery nabłonkowej, która umożliwia patogenom dostęp do środowiska ogólnoustrojowego1,2. Ponadto infekcje błony śluzowej mogą również powodować znaczną immunopatologię, nawet jeśli są zawarte na zewnątrz3-5. Komensalny grzyb jednokomórkowy Candida albicans występuje u większości populacji w jamie ustnej i innych miejscach błony śluzowej6-9. Chociaż zwykle są one powstrzymywane przez wrodzoną i nabytą odpowiedź immunologiczną, wrodzone defekty immunologiczne i interwencje medyczne mogą prowadzić do ciężkiej kandydozy błony śluzowej. Atak na barierę nabłonkową skutkuje zwiększonym ryzykiem zagrażającej życiu choroby rozsianej, a także immunopatologii, podobnie jak w przypadku kandydozy sromu i pochwy, dodatkowo kolonizacja C. albicans została powiązana z homeostazą immunologiczną płuc10,11. Rozsiana kandydoza jest obecnie czwartym najczęstszym zakażeniem krwi na oddziałach intensywnej terapii12, a śmiertelność sięgająca 40% sprawia, że jest to poważny problem. Ze względu na wzrost leczenia immunomodulującego u pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi, nowotworami lub przeszczepami narządów, konieczne jest zrozumienie interakcji między tym patogenem a przedziałem immunologicznym błony śluzowej.
Większość biologicznych osiągnięć komórek dotyczących interakcji C. albicans-komórka na poziomie błony śluzowej pochodzi z modeli in vitro13-15 i mysich16-18. Oba te podejścia mają wyraźne zalety, ale możliwość obrazowania żywych komórek w wysokiej rozdzielczości w nienaruszonym gospodarzu ograniczyła czasową i przestrzenną charakterystykę infekcji. W przypadku tych badań potrzebny jest model in vivo, w którym można uwidocznić interakcję patogenu, wrodzonych komórek odpornościowych i nabłonkowych w nienaruszonym żywicielu kręgowców.
Danio pręgowany stał się nieocenionym narzędziem do zrozumienia ludzkich chorób, głównie ze względu na jego przejrzystość i podatność na manipulacje genetyczne. Rozwój komórek i narządów został zobrazowany w najdrobniejszych szczegółach, co doprowadziło do opisu nowych zachowań komórek odpornościowych, takich jak zachowanie limfocytów T w rozwijającej się grasicy19 lub walka między wewnątrzkomórkowymi prątkami a fagocytami20-22. Ostatnie prace opisały interakcje mikroorganizm-gospodarz w jelitach u danio pręgowanego i wykazały, że mikrobiologiczna kolonizacja przewodu pokarmowego wpływa na fizjologię jelit gospodarza i odporność na inne infekcje23,24. Ponadto infekcja przez nabłonek jelitowy została opisana dla kilku patogenów.
W przeciwieństwie do przewodu pokarmowego, pęcherz pławny reprezentuje bardziej izolowany i komplementarny model błony śluzowej. Narząd ten jest przedłużeniem rozwijającej się cewy jelitowej i tworzy się z przodu do wątroby i trzustki25,26. Wytwarza środki powierzchniowo czynne, śluz i peptydy przeciwdrobnoustrojowe27,28, a anatomicznie, a także ontogenetycznie narząd ten jest uważany za homolog płuc ssaków29,30. Ponieważ przewód pneumatyczny pozostaje połączony z jelitem u danio pręgowanego, pozwala to na naturalne wystąpienie infekcji przez zanurzenie. Co ciekawe, jedynymi znanymi naturalnie występującymi infekcjami ryb gatunkami Candida są infekcje C. albicans w pęcherzu pławnym31. Niedawno opisaliśmy eksperymentalny model infekcji immersyjnej, w którym C. albicans infekuje pęcherz pławny i stwierdziliśmy, że ta infekcja podsumowuje niektóre cechy charakterystyczne interakcji C. albicans z nabłonkiem in vitro32,33. 
W przedstawionej tutaj metodzie, oryginalny model infekcji immersyjnej jest ulepszany poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie C. albicans do pęcherza pływackiego zebry pręgowanego 4 dni po zapłodnieniu (dpf). Pozwala to na precyzyjną kontrolę czasową infekcji, a także na wysoce powtarzalne inokulum. Pozwala to na szczegółowe obrazowanie przyżyciowe w połączeniu z wszechstronnością modelu danio pręgowanego. Jako przykład tego, co można zrobić za pomocą tej metody, przedstawiamy czasoprzestrzenną dynamikę wzrostu C. albicans wraz z rekrutacją neutrofili do miejsca infekcji. Ponieważ tkanka pęcherza pławnego danio pręgowanego jest trudna do zobrazowania śródżyłowego, przedstawiamy również technikę szybkiej sekcji pęcherza pławnego, która poprawia sygnał fluorescencyjny i rozdzielczość mikroskopową. Metody te poszerzają zestaw narzędzi do badań nad grzybami, immunologią i akwakulturą, a także opisują nową drogę infekcji, którą można przełożyć na modelowanie innych infekcji grzybiczych, bakteryjnych lub wirusowych powierzchni błony śluzowej.

<table><tbody><tr><td>Probówki 1,7 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Głębokie szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-726</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-264</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta drobnoziarnista (Dumont Dumoxel #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Kołki drewniane</td><td>VWR Scientific</td><td>10805-018</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-722</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet Flaming Brown</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara borokrzemianowa</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>System iniekcyjny MPPI-3</td><td>Stosowane oprzyrządowanie naukowe</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka przeciwciśnienia</td><td>Stosowane oprzyrządowanie naukowe</td><td></td> Zestaw uchwytów do mikropipet BPU <td></td></tr><tr><td></td><td>Stosowane oprzyrządowanie naukowe</td> Przełącznik nożny <td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Applied Scientific Oprzyrządowanie</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Stosowane oprzyrządowanie naukowe</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>Podstawa magnetyczna</td><td>Zastosowane oprzyrządowanie naukowe</td><td>Podstawa</td><td></td>magnetyczna</tr><tr><td>Sulfonian metanu trikainy</td><td>Western Chemical Inc.</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus</td><td>SZ61 górna podstawa SZX-ILLB2-100 Mikroskop</td><td></td></tr><tr><td>konfokalny</td><td>Olympus</td><td>IX-81 z laserowym skaningowym systemem konfokalnym FV-1000</td> Obiektyw mikroskopowy 20X Olympus UPlanSApo 20x/0,75 Bęben rolkowy New Brunswick Scientific TC-7 Końcówki do pipet do mikroładowarek <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Szklane probówki hodowlane (16 x 150 mm)</td><td>VWR Scientific</td><td>60825-435</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4534-500GP</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4532-500GP</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH0246-500GP</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Corning)</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4520-500GP</td><td></td></tr><tr><td>Glinka dla dzieci (Play-Doh)</td><td>Hasbro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>Błękit metylenowy</td><td>VWR Scientific</td><td>VW6276-0</td><td></td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td></td><td></td> Hemocytometr FB0875712 <td></td>Fisher Scientific</tr><tr><td>( Hausser scientific)</td><td>VWR Scientific</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>Olejek immersyjny typu A</td><td>Blue Marble Products</td><td>51935</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>VWR Scientific</td><td>14216-184</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza (Lonza)</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-870</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 </td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Drut wędkarski</td><td>Stren</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka obrazowa (Sensoplate)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655892</td><td></td></tr><tr><td>Smar wysokopróżniowy (Dow Corning)</td><td>VWR Scientific</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>Mikroszkiełko (25 x 75 mm)</td><td>VWR Scientific</td><td>48300-025</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe (18 x 18 mm), nr 1,5</td><td>VWR Scientific</td><td>48366-045</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 15 cm (tworzywa sztuczne Olympus)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-106</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol (chemikalia EMD)</td><td>VWR Scientific</td><td>EMGX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe naczynie do hodowli (tworzywa sztuczne Olympus)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>Łodzie wagowe (8,9 cm)</td><td>VWR Scientific</td><td>89106-766</td><td></td></tr></tbody></table>

modelowanie kandydozy błony śluzowej u larw danio pręgowanego przez wstrzyknięcie do pęcherza pławnego

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Wczesna obrona przed patogenami błony śluzowej składa się zarówno z bariery nabłonkowej, jak i wrodzonych komórek odpornościowych. Kompetencja immunologiczna obu tych czynników i ich wzajemna komunikacja mają zasadnicze znaczenie dla ochrony przed infekcjami. Interakcje nabłonkowych i wrodzonych komórek odpornościowych z patogenem najlepiej badać in vivo, gdzie złożone zachowanie rozwija się w czasie i przestrzeni. Istniejące modele nie pozwalają jednak na łatwe obrazowanie czasoprzestrzenne walki z patogenami na poziomie błony śluzowej.
Opracowany tutaj model tworzy infekcję błony śluzowej poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie patogenu grzybowego, Candida albicans, do pęcherza pławnego młodego danio pręgowanego. Powstała infekcja umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości zachowania nabłonka i wrodzonych komórek odpornościowych przez cały okres rozwoju choroby błony śluzowej. Wszechstronność tej metody pozwala na przesłuchanie gospodarza w celu zbadania szczegółowej sekwencji zdarzeń immunologicznych prowadzących do rekrutacji fagocytów oraz zbadania roli poszczególnych typów komórek i szlaków molekularnych w ochronie. Ponadto zachowanie patogenu w funkcji ataku immunologicznego można obrazować jednocześnie za pomocą fluorescencyjnego C. albicans wykazującego ekspresję białka. Zwiększona rozdzielczość przestrzenna interakcji gospodarz-patogen jest również możliwa przy użyciu opisanej techniki szybkiej sekcji pęcherza pławnego.
Opisany tutaj model infekcji błony śluzowej jest prosty i wysoce powtarzalny, co czyni go cennym narzędziem do badania kandydozy błony śluzowej. System ten może być również szeroko przenoszony na inne patogeny błony śluzowej, takie jak prątki, drobnoustroje bakteryjne lub wirusowe, które normalnie infekują przez powierzchnie nabłonka.

Mikroiniekcja do tylnego pęcherza pławnego
Opisana tutaj metoda eksperymentalna dotyczy wstrzykiwania stałej dawki komórek drożdżaków C. albicans do pęcherza pławnego 4-dniowych (dpf) zarodków danio pręgowanego. Wcześniejsze prace z wykorzystaniem modelu imersyjnego sugerują, że odpowiedź immunologiczna pęcherza pławnego na C. albicans jest podobna do błon śluzowych kandydozy u ssaków32. Przedstawiamy tutaj zmodyfikowaną metodę zakażenia, która jest prostsza, bardziej...

In vivo czasoprzestrzenne interakcje patogenów i obrony immunologicznej na poziomie błony śluzowej nie są łatwe do zobrazowania u istniejących kręgowców gospodarzy. Przedstawiona metoda opisuje wszechstronną platformę do badania kandydozy błony śluzowej u żywych kręgowców przy użyciu pęcherza pławnego młodego danio pręgowanego jako miejsca zakażenia.

Modelowanie kandydozy błony śluzowej u larw danio pręgowanego przez wstrzyknięcie do pęcherza pławnego

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Ogólnym celem tej procedury jest modelowanie kandydozy błony śluzowej na przykładzie młodego danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez uprzednie załadowanie roztworu zawierającego żywe albicany do mikroigły. W drugim etapie określona objętość komórek drożdży jest wstrzykiwana do pęcherza pławnego młodego danio pręgowanego.Następnie ryby są przesiewane pod kątem jednorodnego inokulum i inkubowane przez żądany czas. W ostatnim etapie stosuje się mikroskopię konfokalną, aby śledzić dynamiczną interakcję patogenu z układem odpornościowym danio pręgowanego. Dodatkowo pęcherz pławny może być poddawany mikrosekcji w celu uzyskania obrazów konfokalnych o wyższej rozdzielczości.Metoda, którą tutaj prezentujemy, odpowiada na kluczowe pytania immunologii grzybów, a także mikrobiologii, takie jak dokładna sekwencja zdarzeń prowadzących do nieudanej odpowiedzi immunologicznej na patogen grzybowy i sygnalizatory kandydowe na powierzchni błony śluzowej. Przed rozpoczęciem zabiegu należy ogrzać naczynie iniekcyjne zawierające 2%aros w inkubatorze o temperaturze 33 stopni Celsjusza. Po 30 minutach użyj pipety o pojemności 25 mililitrów, aby usunąć 100 mililitrów pożywki E trzy plus PTU z talerza czwartego dnia, po zapłodnieniu rybę danio pręgowanego, uważając, aby nie zassać żadnej z ryb, i dodaj dwa mililitry po cztery miligramy na mililitr.Sulfonian trica metanu jest dostarczany do pożywki w celu znieczulenia zwierząt. Po 15 minutach użyj mikroskopu preparacyjnego, aby zidentyfikować ryby z napompowanymi pęcherzami pławnymi i użyj plastikowej pipety do przenoszenia, aby przenieść 30 ryb danio pręgowanego na wstępnie rozgrzane naczynie do wstrzykiwań. Usuń nadmiar pożywki, a następnie trzymaj naczynie pod kątem i użyj żyłki o średnicy 0,012 cala super przyklejonej do kapilary z krzemianu boro, aby wykonać trzy linie po 10 pionowo ustawionych w pionie Ryby, z których każda następnie dokładnie wiruje rurkę świeżo przygotowanych albicanów morskich w stężeniu 1,5 razy 10 do siódmych CFU na mililitr.A następnie załaduj trzy mikrolitry roztworu drożdży do mikroigły z klipsem EC. Ustaw czas trwania impulsu na odpowiednie ustawienie. Następnie obrócić naczynie iniekcyjne, aby osiągnąć kąt 20 stopni między mikroigłą a głową ryby, kierując się w stronę tylnej części pęcherza pławnego.Teraz wepchnij mikroigłę do pęcherza pławnego, upewniając się, że otwór igły znajduje się w świetle i naciśnij kałużę. Po zweryfikowaniu, które ryby zostały wstrzyknięte, jest stosunkowo łatwe, ponieważ bolus wypiera pęcherzyk powietrza, a tył pęcherza pławnego jest następnie wypełniany pożywką, wstrzyknięcie czerwieni fenolowej za pomocą bolusa może dodatkowo ułatwić wizualizację udanego wstrzyknięcia. Po wstrzyknięciu wszystkich 30 ryb zalej naczynie pożywką E trzy, a następnie opróżnij rybę do naczynia do odzyskiwania.Przenieś 10 zwierząt do 1,7 mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej jeden mililitr pożywki E trzy i poddaj ryby eutanazji 200 mikrolitrami trica. Następnie dla każdego zwierzęcia ułóż cztery krople tłuszczu próżniowego w kwadracie w odległości jednego centymetra od siebie na mikroszkiełku i dodaj dwie krople świeżo przygotowanej, 2% niskotopliwej kropli na środek kwadratu. Następnie umieść jedną rybę na osobnym szklanym szkiełku pod mikroskopem preparacyjnym i sprawdź, czy serce zwierzęcia przestało bić i usuń nadmiar wody.Teraz użyj jednej pary cienkiej pęsety, aby utrzymać głowę w ustalonej pozycji, a drugiej, aby pociągnąć w dół przedni odcinek jelita. Podnieś pęcherz pławny za przewód pneumatyczny, oddzielając go od przewodu pokarmowego, i umieść go na środku jednego z przygotowanych mikroszkiełek, zanim agro zastygnie. Na koniec umieść szkiełko nakrywkowe na chusteczce, delikatnie dociskając w dół, aż dotknie tłuszczu próżniowego i agarozy, a następnie zobrazuj pęcherz pławny w ciągu 10 minut od zbioru.Wstrzyknięcie czterech nanolitrów albikanów morskich w ilości od jednego do 1,5 razy 10 siódmego. CFU na mililitr daje najbardziej spójne dane, co daje zakres od 10 do 50 komórek drożdży na rybę. Zawężenie inokulum do 15 do 25 komórek drożdży daje jeszcze ściślejszy fenotyp i odpowiedź.Neutrofile odgrywają kluczową rolę w odporności na kandydozę u myszy i ludzi, a zakażenie pęcherza pławnego zebry żywymi albicanami prowadzi do szybkiej i trwałej rekrutacji neutrofili. Nie dzieje się tak, gdy wstrzykiwane są komórki drożdży zabijające ciepło. Włókna rozwijają się szybko po wstrzyknięciu komórek drożdży, a nitkowaty wzrost trwa przez pierwsze 24 godziny po wstrzyknięciu, po czym liczba ta zaczyna się zmniejszać zdolność do nieinwazyjnego śledzenia poszczególnych ryb umożliwia te badania podłużne i podkreśla indywidualne różnice w postępie choroby i odpowiedziach gospodarza.Protokół eksperymentalny, który pozostaje niepraktyczny w obrazowaniu myszy, interakcje komórek odpornościowych lub nabłonkowych z c albicans są stosunkowo łatwe w przedstawionym tutaj modelu. Jednak wypreparowanie pęcherza pławnego, jak właśnie wykazano, znacznie poprawia jakość obrazowania. Jest to szczególnie przydatne podczas wizualizacji transgenicznych linii ryb, w których fluorescencja jest wszechobecna, a w otaczającej tkance występuje zewnętrzna fluorescencja, jak zaobserwowano na tych obrazach wypreparowanego pęcherza pławnego z linii ryb cytrynowych alfa Catine.Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak technologia morfologiczne lub leczenie hamowaniem chemicznym, mogą być wykorzystane do odpowiedzi na pytanie, jaka jest rola określonej komórki odpornościowej lub szlaku sygnałowego w kandydozie błony śluzowej.

modeling-mucosal-candidiasis-larval-zebrafish-swimbladder

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Szybki rozwój, niewielki rozmiar i przezroczystość danio pręgowanego stanowią ogromne zalety w badaniach nad wrodzonym immunologicznym kontrolowaniem infekcji1-4. W niniejszej pracy prezentujemy techniki zakażania larw danio pręgowanego grzybiczym patogenem Candida albicans za pomocą mikroiniekcji – metodologii wykorzystanej niedawno do wykazania roli aktywności NADPH oksydazy fagocytów w kontrolowaniu dimorfizmu grzybów5.

Nieinwazyjne obrazowanie rozsianej kandydozy u larw rybek danio

Źródło: Li, J. i wsp. Opracowanie modelu zakażenia larw danio pręgowanego w kierunku Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje oparte na mikroiniekcjach dostarczanie znakowanych fluorescencyjnie Clostridioides difficile do światła jelita znieczulonej larwy danio pręgowanego. Przedstawiono w nim etapy przygotowania larw, wstrzyknięcia bakterii i potwierdzenia lokalizacji bakterii w jelicie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Miejscowe dostarczanie bakterii do światła jelita larwy danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji

Źródło: Flores, E. i inni. Wykorzystanie pierwotniaka Paramecium caudatum jako nośnika infekcji pokarmowych u larw danio danio. J. Vis. Exp. (2019).Ten film demonstruje metodę ustalania modelu bakteryjnego zakażenia jelit przenoszonego przez żywność u larw danio pręgowanego poprzez karmienie ich paramecjami zakażonymi fluorescencyjnym E. coli.

Modelowanie infekcji jelit u larw danio pręgowanego przy użyciu bakterii przenoszonych przez żywność

Źródło: Li, J. i inni. Opracowanie modelu infekcji larwal danio pręgowanego dla Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje procedurę mikrogavage, w której znieczulona larwa danio jest unieruchomiona w agarozie i doustnie wstrzykiwana patogenną bakterią za pomocą igły prowadzonej przez śledzenie. Nieinwazyjne podanie naśladuje naturalne zakażenie, umożliwiając analizę replikacji bakterii, uwalniania toksyn oraz uszkodzeń nabłonka jelit.

Opracowanie modelu infekcji larw danio pręgowanego z wykorzystaniem mikrogawage

Pokazano systemiczne i zlokalizowane modele infekcji wirusa grypy A u ludzi. Korzystając z modelu infekcji ogólnoustrojowej, danio pręgowany może być używany do badań przesiewowych leków przeciwwirusowych. Korzystając z modelu infekcji zlokalizowanej, danio pręgowany może być wykorzystany do scharakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza.

Wykorzystanie modeli wirusa grypy pręgowanej u ludzi do badań przesiewowych leków przeciwwirusowych i scharakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza

W tym protokole, fluorescencyjnie znakowane T. cruzi zostały wstrzyknięte do przezroczystych larw danio pręgowanego, a ruchliwość pasożyta zaobserwowano in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego.

Ustanowienie larw danio pręgowanego jako modelu zwierzęcego do badania ruchliwości Trypanosoma cruzi in vivo

Tutaj prezentujemy protokół modelowania ludzkiej gruźlicy u dorosłego danio pręgowanego przy użyciu jego naturalnego patogenu Mycobacterium marinum. Wyekstrahowane DNA i RNA z narządów wewnętrznych zakażonego danio pręgowanego można wykorzystać do ujawnienia całkowitego obciążenia prątkami u ryb i odpowiedzi immunologicznej gospodarza za pomocą qPCR.

Modelowanie gruźlicy u dorosłych ryb pręgowanych zakażonych Mycobacterium marinum

Niniejsze badanie opisuje model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej infekcji związanej z biomateriałem w czasie na podstawie mikroskopii fluorescencyjnej. Model ten jest obiecującym systemem uzupełniającym modele zwierzęce ssaków, takie jak modele mysie, do badania zakażeń związanych z biomateriałem in vivo.

Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem

Tutaj opisujemy syntezę liposomów naładowanych lekiem i ich mikroiniekcję larwom danio pręgowanego w celu ukierunkowania dostarczania leków do komórek z linii makrofagów.

Kierowanie leków na larwy makrofagów danio pręgowanego poprzez wstrzykiwanie liposomów zawierających leki

Przedstawiona tutaj jest bezpieczna i skuteczna metoda infekowania larw danio pręgowanego fluorescencyjnie znakowanym beztlenowym C. difficile za pomocą mikroiniekcji i nieinwazyjnego mikrozgłębnika.

Opracowanie modelu zakażenia larw danio pręgowanego w kierunku Clostridioides difficile

Ten protokół demonstruje mikroiniekcję lipopolisacharydu do obszaru komorowego mózgu w modelu larwalnym danio pręgowanego w celu zbadania wynikowej reakcji neurozapalnej i neurotoksyczności.

Mikroiniekcje lipopolisacharydu do komór mózgowych larwom danio pręgowanego w celu oceny zapalenia nerwów i neurotoksyczności

Poznaj metodę modelowania kandydozy błony śluzowej u larw Danio rerio przez wstrzyknięcie Candida albicans do pęcherza pławnego. Technika ta umożliwia obserwację interakcji patogen-zwierzę w czasie rzeczywistym.

Modelowanie kandydozy błony śluzowej u larw danio pręgowanego przez wstrzyknięcie do pęcherza pławnego

Przeglądaj więcej filmów