Jednoczesna kwantyfikacja kręgów wycinania receptora komórek T (TREC) i kręgów wycinania rekombinacji z delecją K (KREC) za pomocą PCR w czasie rzeczywistym

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest oszacowanie wydajności grasicy i szpiku kostnego poprzez ilościowe określenie zarówno kręgów wycinania receptora komórek T, jak i okręgów wycinania rekombinacji REX i K lub korekt w jednym teście. Osiąga się to poprzez najpierw skonstruowanie plazmidu z potrójną insercją zawierającego fragmenty sekwencji DNA korekt TRX oraz pojedynczej kopii genu referencyjnego w celu utrzymania stosunku jeden do jednego do jednego między trzema celami po amplifikacji DNA. Następnie budowana jest krzywa wzorcowa, wykonując seryjne rozcieńczenia plazmidu z potrójną wstawką, co pozwala na bezwzględną kwantyfikację trzech sekwencji docelowych za pomocą rzeczywistego PCR w czasie rzeczywistym.

Na koniec przeprowadzany jest test PCR w czasie rzeczywistym, który prowadzi do bezwzględnej kwantyfikacji pęknięć i pęknięć. Przedstawione wyniki wskazują na zmiany pojemności wyjściowej grasicy i szpiku kostnego wraz z wiekiem i płcią u zdrowych dzieci i dorosłych. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy musieliśmy przeanalizować zarówno szpik kostny, jak i wydajność grasicy u noworodków lub niemowląt, biorąc pod uwagę, że ilość zwykle pobieranej krwi jest niewielka w porównaniu z dorosłymi.

Dlatego zdecydowaliśmy się połączyć dwie metody śledzenia i korygowania kwantyfikacji w jeden test, aby zoptymalizować koszty przygotowania próbki i odczynników. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozy pierwotnych i nabytych niedoborów odporności, ale metoda może być również stosowana we wszystkich chorobach związanych z utratą komórek TMB, a także do badania nowej rekonstytucji po przeszczepie szpiku kostnego. Może być również stosowany w badaniach podstawowych, głównie dotyczących homeostazy limfocytów.

Główną zaletą jest to, że dzięki zastosowaniu potrójnej nadwyżki w środku potrzebne jest tylko jedno standardowe utwardzenie, co zmniejsza zmienność eksperymentalną. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mogą mieć trudności z powodu długotrwałej procedury wymaganej do przygotowania plazmidu z potrójną insercją lub z powodu problemów związanych z przygotowaniem krzywej standardowej. Na początek należy uzyskać próbkę zawierającą komórki, które z dużym prawdopodobieństwem mają TRX i pęknięcia wykrywalne metodą PCR, takie jak krew obwodowa młodego, zdrowego osobnika zebrana do probówek EDTA przy użyciu standardowej metody separacji gradientu gęstości.

Oddziel komórki jednojądrzaste krwi obwodowej po ekstrakcji DNA z komórek zgodnie z protokołem tekstowym, użyj specyficznych dla starterów genu stałej alfa Fort TRX REX i TCR do amplifikacji sygnału Rex, stawu sygnału Rex i fragmentów genu stałej alfa TCR. Wstaw produkt PCR złącza sygnałowego Trax w miejscu akceptora TA wektora topo PCR 2.1 i użyj plazmidowego DNA do przekształcenia XL one niebieskich chemicznie kompetentnych komórek przez szok termiczny wyizoluj odporne na ampicylinę białe kolonie, które utraciły komplementację beta laktazy, na nową płytkę wzorcową i użyj PCR do identyfikacji kolonii zawierających fragment trek. Po wyhodowaniu jednej z kolonii trek-dodatnich i wyizolowaniu DNA, użyj SP one do trawienia plazmidu i produktu amplifikowanego genu TCR alfa constant i ligacji fragmentu genu TCR alpha constant do plazmidu.

Powtórz transformację, selekcję i ekspansję kolonii oraz izolację DNA, aby wstawić właściwy fragment, użyj tylnych trzech, a nie SP jeden, aby strawić plazmid i prawidłowy fragment PCR i powtórzyć proces, aby podwiązać i wyizolować DNA. Po zweryfikowaniu sekwencji trzech insercji, rozwiń kolonię i oczyść plazmidowe DNA przez przygotowanie MIDI zgodnie z protokołem tekstowym, aby przygotować krzywą standardową. Po obliczeniu masy i stężenia plazmidu, jak pokazano tutaj, rozmrozić podwielokrotność plazmidu i pokazać jeden, aby zlinearyzować dwa mikrogramy ze zlinearyzowaną podwielokrotnością DNA.

Użyj wzoru C jeden V jeden równa się C dwa V dwa. Aby obliczyć objętość rozcieńczenia potrzebną do przygotowania pierwszego punktu krzywej wzorcowej z serii, jak pokazano poniżej, należy przygotować serię od jednego do 10 rozcieńczeń, aby uzyskać pozostałe punkty krzywej wzorcowej. Rozcieńczenie plazmidu należy przechowywać w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do czasu użycia Aby przygotować próbki do PCR w czasie rzeczywistym, ułóż płytkę PCR, która zawiera co najmniej dwie kontrpróby dla każdej próbki do analizy w następujący sposób z dwiema oddzielnymi probówkami, jedną dla Rex i pęknięć, a drugą dla stałej alfa TCR.

Przygotuj mieszanki wzorcowe na całkowitą liczbę potrzebnych studzienek. Dodaj 20 mikrolitrów do dołków płytki. Następnie dodaj pięć mikrolitrów genomowego DNA wyekstrahowanego z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub P BMC.

Dodaj pięć mikrolitrów wody do studzienek kontrolnych bez szablonu przed użyciem optycznej osłony samoprzylepnej do uszczelnienia płytki reakcyjnej. Następnie rozmrozić rozcieńczenie krzywej wzorcowej plazmidowego DNA i przygotować najwyższe rozcieńczenie. Odkryj tylko studnie znajdujące się między rzędami od A do H i kolumnami od pierwszej do czwartej.

A po krótkim wirowaniu dodaj pięć mikrolitrów każdego punktu rozcieńczenia do wyznaczonego. Dobrze upewnij się, że na dnie studzienek nie ma pęcherzyków i że odczynniki są osadzone na dnie. Użyj systemu PCR w czasie rzeczywistym, aby uruchomić test z następującym protokołem.

50 stopni Celsjusza przez dwie minuty i wstępne ogrzewanie w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie 45 cykli denaturacji w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 sekund. I połączona sonda starter e klękanie i wydłużanie w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Aby przeanalizować dane PCR w czasie rzeczywistym, otwórz zapisany plik wyników w oprogramowaniu i kliknij zakładkę wyników w górnej części okna.

Kliknij menu analizy i wybierz ustawienia analizy. Pozwól oprogramowaniu automatycznie określić próg, wybierając wszystkie detektory i automatyczny CT dla cyklu progowego. Pozwól oprogramowaniu domyślnie ustawić automatyczną linię bazową do eliminacji tła.

Kliknij zakładkę o nazwie wykres amplifikacji, a następnie w prawej części okna wybierz jeden z trzech detektorów z odpowiedniego menu rozwijanego. Tuż poniżej wybierz ręczny CT, aby ręcznie ustawić próg w dolnej części okna, wybierz dołki odpowiadające punktom rozcieńczenia krzywej standardowej wybranego detektora, aby wyświetlić wykresy wzmocnienia, klikając i przeciągając myszą po odpowiednich komórkach tabeli. Aby ręcznie dostosować próg, przeciągnij czerwoną linię progu w górę i w dół, a następnie kliknij przycisk Analizuj, aby ponownie przeanalizować wyniki.

Aby sprawdzić, jak ustawienie progu wpływa na wyniki, wybierz zakładkę raport i zobacz wynikowy CT odpowiednich punktów rozcieńczenia krzywej standardowej. Przesuwając próg w celu uzyskania optymalnego umieszczenia na karcie wykresu wzmocnienia, sprawdź, czy próg znajduje się w obszarze wykładniczego wzmocnienia wystarczająco powyżej szumu tła, ale poniżej fazy plateau. Jeśli wykres wzmocnienia nie jest pokazany w skali logarytmicznej, kliknij wykres prawym przyciskiem myszy, aby przywołać ustawienia wykresu i ustaw ustawienie Y ais po uruchomieniu jako log.

Ustaw próg w połowie długości liniowej części wykresu i obserwuj krzywe wzmocnienia w przybliżeniu równoległe do siebie. Kliknij zakładkę raportu, aby zobaczyć wyniki tomografii komputerowej. Upewnij się, że umieszczenie progu dało wyniki, które maksymalizują precyzję dwóch powtórzeń każdej krzywej standardowej.

Punkty rozcieńczenia. Sprawdź, czy próg jest umieszczony w punkcie, który najlepiej odzwierciedla skrajne rzędy wielkości punktów rozcieńczania krzywej standardowej na karcie raportu. Przeciągnij ponownie myszą w tabeli w dolnej części okna, aby wybrać komórki odpowiadające studzienkom krzywej standardowej W przypadku wszystkich detektorów sprawdź, czy wynikowa przekładnika prądowa trzech celów jest bardzo podobna w tych samych punktach rozcieńczenia.

Na przykład różnica, nie więcej niż 0,5 CT, w razie potrzeby dostosuj progi i ponownie sprawdź w zakładce raportu w dolnej części okna. Wybierz studnie NTC i sprawdź, czy w studzienkach NTC nie ma amplifikacji, co odpowiada nieokreślonemu CT. Wybierz kartę krzywej standardowej i po prawej stronie okna wykresu wybierz detektory z menu rozwijanego i sprawdź, czy zgłoszone nachylenie krzywej standardowej mieści się w zakresie od minus 3,55 do minus 3,32, co odpowiada sprawnościom PCR od 91 do 100%Upewnij się, że współczynnik determinacji lub R kwadrat jest wyższy niż 0,998, sprawdzając jego wartość tuż pod nachyleniem i punktem przecięcia.

Kliknij kartę raportu i w odpowiednich komórkach tabeli pod wykresem sprawdź, czy CT kontroli dodatniej jest zgodna z wynikami poprzednich testów na tej samej znanej kontroli dodatniej. Kliknij menu plik, zapisz, a następnie wyeksportuj do pliku CSV, aby wyeksportować ilości wszystkich studzienek w pliku tekstowym zawierającym wartości oddzielone przecinkami. Na koniec zaimportuj plik CSV do arkusza kalkulacyjnego i oblicz liczbę ścieżek lub poprawek na 10 do sześciu PBM, odpowiednio ustawiając następującą formułę.

Test opisany w tym filmie został przeprowadzony na reprezentatywnej próbie 87 zdrowych osób z grupy kontrolnej: 42 dzieci w wieku od zera do 17 lat i 45 dorosłych w wieku od 24 do 60 lat. Jak pokazano tutaj, liczba wędrówek gwałtownie zmniejszała się wraz z wiekiem z powodu inwolucji grasicy od zera do trzech do czterech lat u dorosłych.

Liczba wędrówek zależy również od płci, ponieważ zmniejsza się szybciej u mężczyzn niż u kobiet, co może wpływać na zdolność do wyznaczenia odpowiednich zakresów odniesienia. Wykresy te pokazują, że liczba pęknięć zmniejszała się jednak wraz z wiekiem, podobnie jak w przypadku T TREXs tylko u dzieci. Natomiast u dorosłych wydajność szpiku kostnego jest dość stabilna przez całe życie i nie zależy od płci.

Przygotowanie plazmidu z potrójną wkładką wymaga około dwóch lub trzech tygodni, ale potem przechowywane przydziały plazmidu wytrzymają trzy lata. Pozostałą część techniki można wykonać w ciągu zaledwie czterech do pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby tej procedury bardzo ważne jest, aby wykonać wszystkie manipulacje związane z plazmidem w dedykowanym obszarze, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego DNA.

Niezbędne jest również zweryfikowanie stabilności standardowej rurki podczas analizy wyników po jej opracowaniu. Technika ta zapewniła naukowcom zajmującym się immunologią kliniczną lub hematologią ulepszone narzędzie do identyfikacji pierwotnych niedoborów odporności w celu monitorowania wyników rekonstytucji immunologicznej po przeszczepie szpiku kostnego lub po prostu do badania homeostazy limfocytów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać potrójną plazmid, przygotować krzywą wzorcową, przeprowadzić eksperyment PCR w czasie rzeczywistym i wykonać niezbędne obliczenia potrzebne do uzyskania powtarzalnej bezwzględnej kwantyfikacji trax i pęknięć.