Name: Jednoczesna kwantyfikacja kręgów wycinania receptora komórek T (TREC) i kręgów wycinania rekombinacji z delecją K (KREC) za pomocą PCR w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnej kwantyfikacji TREC i KREC za pomocą PCR w czasie rzeczywistym do oceny aktywności grasicy i szpiku kostnego. Ta technika umożliwia badanie odporności u dzieci i dorosłych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

<ol><li>Douek, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+thymic+function+with+age+and+during+the+treatment+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection.</a> Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).</li>
<li>Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+history+of+B+lymphocytes+reveals+homeostatic+proliferation+and+extensive+antigen-induced+B+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion.</a> J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).</li>
<li>Fronkova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+reconstitution+after+allogeneic+SCT+impairs+minimal+residual+disease+monitoring+in+children+with+ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL.</a> Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).</li>
<li>Sottini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+recent+thymic+T-cell+and+bone+marrow+B-cell+emigrants+in+patients+with+primary+immunodeficiency+undergone+to+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation.</a> Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).</li>
<li>Serana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+and+bone+marrow+output+in+patients+with+common+variable+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency.</a> J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).</li>
<li>Zanotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+effects+of+interferon-%CE%B2+on+new+B+and+T+cell+release+from+production+sites+in+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis.</a> J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).</li>
<li>Zanotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+accumulation+of+newly+produced+T+and+B+lymphocytes+in+natalizumab-treated+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients.</a> Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).</li>
<li>Sottini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+T-+and+B-cell+defects+in+one+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient.</a> PLoS One. 7, e34493(2012).</li>
<li>Quiros-Roldan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+combined+antiretroviral+therapy+on+B-+and+T-cell+release+from+production+sites+in+long-term+treated+HIV-1%2B+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients.</a> J. Transl. Med. 10, 94(2012).</li>
<li>Mensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+TREC+and+KREC+quantification+for+the+monitoring+of+early+T-+and+B-cell+neogenesis+in+adult+patients+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.</a> J. Transl. Med. 11, 188(2013).</li>
<li>Serana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+different+extent+of+B+and+T+cell+immune+reconstitution+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation+and+enzyme+replacement+therapies+in+SCID+patients+with+adenosine+deaminase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency.</a> J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).</li>
<li>Borte, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+screening+for+severe+primary+immunodeficiency+diseases+using+high-throughput+triplex+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR.</a> Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).</li>
<li>Baker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+routine+testing+for+severe+combined+immunodeficiency+within+Wisconsin%27s+newborn+screening+program%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Health+Rep%22%5BJournal%5D)">Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin's newborn screening program.</a> Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).</li>
<li>Lorenzi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+thymic+function+directly+from+peripheral+blood%3A+a+validated+modification+to+an+established+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method.</a> J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).</li>
<li>De Boer, R. J., Perelson, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+T+lymphocyte+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantifying T lymphocyte turnover.</a> J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kwantyfikacja TREC i KREC może być uważana za dobre oszacowanie niedawnej produkcji grasicy i szpiku kostnego, pod warunkiem uwzględnienia pewnych zastrzeżeń. Mimo że bezwzględna metoda kwantyfikacji wykorzystująca krzywą standardową wymaga większej liczby odczynników i więcej miejsca na płytce reakcyjnej PCR w czasie rzeczywistym, zapewnia bardzo dokładne wyniki ilościowe, ponieważ nieznane ilości próbek są interpolowane z krzywych standardowych zbudowanych na znanych ilościach materiału wyjściowego. Co więcej, metoda t...

Kręgi wycinania receptora limfocytów T (TREC) i kręgi wycinania rekombinacji delokacji K (KREC) to małe okrągłe elementy DNA, które są wycinane odpowiednio w proporcji limfocytów T i B podczas procesu rekombinacji genomowego DNA, co prowadzi do powstania wysoce zróżnicowanego repertuaru receptorów komórek T i B. Nie pełnią żadnej funkcji, ale ponieważ są stabilne i nie mogą być replikowane, są rozcieńczane po każdym podziale komórki, dzięki czemu utrzymują się tylko w jednej z dwóch komórek potomnych. W związku z tym ich poziomy we krwi obwodowej można przyjąć jako oszacowanie ilości grasicy i szpiku kostnego.
Podczas gdy test TREC był głównie używany w ciągu ostatnich 15 lat do oceny zasięgu produkcji grasicy,1 test KREC, który początkowo został opracowany do pomiaru proliferacji komórek B i ich wkładu w homeostazę komórek B w zdrowiu i chorobie,2 został dopiero niedawno zaproponowany jako marker produkcji szpiku kostnego. 3,4 W tym miejscu opisujemy opracowaną przez nas metodę jednoczesnej kwantyfikacji zarówno TREC, jak i KREC. 4
Dzięki tej połączonej metodzie, zmienność związana z kwantyfikacją DNA za pomocą PCR w czasie rzeczywistym jest eliminowana dzięki zastosowaniu unikalnej krzywej standardowej uzyskanej przez rozcieńczenie plazmidu z potrójną insercją zawierającego fragmenty TREC, KREC i genu TCRAC (T-cell receptor alpha constant) w stosunku 1:1:1. Pozwala to na dokładniejszą ocenę numeru kopii TREC i KREC. Co więcej, jednoczesna kwantyfikacja dwóch celów w tej samej reakcji pozwala na obniżenie kosztów odczynników.
Proponowany test TREC/KREC może być przydatny do pomiaru zakresu produkcji komórek T i B u dzieci i dorosłych z ciężkim złożonym niedoborem odporności (SCID),4 Powszechnym zmiennym niedoborem odporności,5 chorobami autoimmunologicznymi,6-8 i zakażeniem HIV. 9 Ponadto może być stosowany do monitorowania odzyskiwania odporności po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych10, wymianie enzymów11 oraz terapiach przeciwwirusowych9 lub immunomodulujących. 6-8 Wreszcie, ponieważ pacjenci z SCID są rozpoznawani za pomocą testu TREC pomimo podstawowych wad genetycznych, a pacjenci z agammaglobulinemią mogą być identyfikowani za pomocą kwantyfikacji KREC, test TREC / KREC może być również stosowany do wykrywania niedoborów odporności w programach badań przesiewowych noworodków. 12 W takim przypadku badanie musi być przeprowadzone na DNA wyekstrahowanym z małych plamek krwi osuszonych i wysuszonych na bibule filtracyjnej, musi być bardzo czułe i specyficzne dla chorób docelowych, a także wysoce powtarzalne i opłacalne.
Wprowadzenie kwantyfikacji KREC do testu powinno poprawić wyniki badań przesiewowych noworodków pod kątem niedoborów odporności, które są rutynowo przeprowadzane w niektórych częściach USA (WI, MA, CA) od 2008 roku, kiedy Wisconsin jako pierwszy wprowadził analizę TREC do swojego programu badań przesiewowych po porodzie. 13

<table><tbody><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>10771-500 ML</td><td>metoda separacji gradientu gęstości</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>51106</td><td>Ekstrakcja DNA</td></tr><tr><td>Niezmodyfikowane oligonukleotydy DNA HPSF 0,01 mmol</td><td>Odczynniki Eurofins MWG Operon/Carlo Erba S.r.l&nbsp;</td><td></td><td>Zawiesić liofilizowany produkt do 100 pmol/&mikro; l</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA AmpliTaq: w tym 10x bufor II i 25 mM MgCl2</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>N8080156</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp dNTP Blend (100 mM)</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>N8080261</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do klonowania TOPO TA do subklonowania</td><td>Invitrogen/Life-Technologies</td><td>K4500-01</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue Kompetentne komórki do subklonowania</td><td>Stratagene</td><td>200130</td><td></td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Miniprep System</td><td>Promega</td><td>A1223</td><td></td></tr><tr><td>SpeI 500U</td><td>New England Biolabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF 10,000 U</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Midiprep System</td><td>Promega</td><td>A2492</td><td></td></tr><tr><td>XhoI 5,000 U</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Utrapure</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TE bufor (1 mM TRIS i 0,1 mM EDTA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master</td><td>Mix Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>4364338</td><td></td></tr><tr><td>Podwójnie znakowane sondy HPLC 0,01 mmol</td><td>Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagenty S.r.l&nbsp;</td><td></td><td>Zawiesić liofilizowany produkt do 100 pmol/&mikro; l</td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop 2000c</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Fast 7500 Real-Time PCR System Applied</td><td>Biosystems/Life-Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do wykrywania sekwencji SDS 1.4</td><td>Biosystemy stosowane/Technologie</td><td></td><td></td> życia</tr></tbody></table>

jednoczesna kwantyfikacja kręgów wycinania receptora komórek t (trec) i kręgów wycinania rekombinacji z delecją k (krec) za pomocą pcr w czasie rzeczywistym

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Kręgi wycinania receptora limfocytów T (TREC) i kręgi wycinania rekombinacji delokacji K (KREC) są kolistymi elementami DNA powstającymi podczas procesu rekombinacji, które tworzą receptory komórek T i B. Ponieważ TREC i KREC nie są w stanie się replikować, są rozcieńczane po każdym podziale komórki, a zatem utrzymują się w komórce. Ich ilość we krwi obwodowej można traktować jako oszacowanie wydalania grasicy i szpiku kostnego. Łącząc dobrze ugruntowany i powszechnie stosowany test TREC ze zmodyfikowaną wersją testu KREC, opracowaliśmy dupleksowy ilościowy PCR w czasie rzeczywistym, który umożliwia ilościowe oznaczanie zarówno nowo wytworzonych limfocytów T, jak i B w jednym teście. Liczbę TREC i KREC uzyskuje się za pomocą krzywej standardowej przygotowanej przez seryjne rozcieńczanie stawów sygnałowych TREC i KREC sklonowanych w plazmidzie bakteryjnym, wraz z fragmentem genu stałej receptora komórek T, który służy jako gen odniesienia. Wyniki są podawane jako liczba TREC i KREC/106 komórek lub na ml krwi. Okazało się, że kwantyfikacja tych fragmentów DNA jest przydatna do monitorowania rekonstytucji immunologicznej po przeszczepie szpiku kostnego zarówno u dzieci, jak i dorosłych, w celu lepszej charakterystyki niedoborów immunologicznych lub lepszego zrozumienia niektórych działań leków immunomodulujących.

Analizę przeprowadzono na reprezentatywnej próbie 87 zdrowych osób z grupy kontrolnej: 42 dzieci w wieku 0 – 17 lat (mężczyzn/kobiet: 25/17) oraz 45 dorosłych w wieku 24 – 60 lat (mężczyzn/kobiet: 29/16). Wyniki określono jako liczbę TRECs i KRECs na 106 PBMC, a następnie obliczono liczbę TRECs i KRECs na ml krwi.
Liczba TRECs spada wraz z wiekiem ze względu na regresję grasicy,4 w szczególności w sposób bardzo gwałtowny od 0 do 3–4 roku życia. U dorosłych liczba TREC zal...

Tutaj opisujemy metodę jednoczesnej kwantyfikacji okręgów wycinania receptora limfocytów T (TREC) i kręgów wycinania rekombinacji deklacyjnej K (KRECs). Test TREC/KREC może być stosowany jako marker wydalania grasicy i szpiku kostnego.

Jednoczesna kwantyfikacja kręgów wycinania receptora komórek T (TREC) i kręgów wycinania rekombinacji z delecją K (KREC) za pomocą PCR w czasie rzeczywistym

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest oszacowanie wydajności grasicy i szpiku kostnego poprzez ilościowe określenie zarówno kręgów wycinania receptora komórek T, jak i okręgów wycinania rekombinacji REX i K lub korekt w jednym teście. Osiąga się to poprzez najpierw skonstruowanie plazmidu z potrójną insercją zawierającego fragmenty sekwencji DNA korekt TRX oraz pojedynczej kopii genu referencyjnego w celu utrzymania stosunku jeden do jednego do jednego między trzema celami po amplifikacji DNA. Następnie budowana jest krzywa wzorcowa, wykonując seryjne rozcieńczenia plazmidu z potrójną wstawką, co pozwala na bezwzględną kwantyfikację trzech sekwencji docelowych za pomocą rzeczywistego PCR w czasie rzeczywistym.Na koniec przeprowadzany jest test PCR w czasie rzeczywistym, który prowadzi do bezwzględnej kwantyfikacji pęknięć i pęknięć. Przedstawione wyniki wskazują na zmiany pojemności wyjściowej grasicy i szpiku kostnego wraz z wiekiem i płcią u zdrowych dzieci i dorosłych. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy musieliśmy przeanalizować zarówno szpik kostny, jak i wydajność grasicy u noworodków lub niemowląt, biorąc pod uwagę, że ilość zwykle pobieranej krwi jest niewielka w porównaniu z dorosłymi.Dlatego zdecydowaliśmy się połączyć dwie metody śledzenia i korygowania kwantyfikacji w jeden test, aby zoptymalizować koszty przygotowania próbki i odczynników. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozy pierwotnych i nabytych niedoborów odporności, ale metoda może być również stosowana we wszystkich chorobach związanych z utratą komórek TMB, a także do badania nowej rekonstytucji po przeszczepie szpiku kostnego. Może być również stosowany w badaniach podstawowych, głównie dotyczących homeostazy limfocytów.Główną zaletą jest to, że dzięki zastosowaniu potrójnej nadwyżki w środku potrzebne jest tylko jedno standardowe utwardzenie, co zmniejsza zmienność eksperymentalną. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mogą mieć trudności z powodu długotrwałej procedury wymaganej do przygotowania plazmidu z potrójną insercją lub z powodu problemów związanych z przygotowaniem krzywej standardowej. Na początek należy uzyskać próbkę zawierającą komórki, które z dużym prawdopodobieństwem mają TRX i pęknięcia wykrywalne metodą PCR, takie jak krew obwodowa młodego, zdrowego osobnika zebrana do probówek EDTA przy użyciu standardowej metody separacji gradientu gęstości.Oddziel komórki jednojądrzaste krwi obwodowej po ekstrakcji DNA z komórek zgodnie z protokołem tekstowym, użyj specyficznych dla starterów genu stałej alfa Fort TRX REX i TCR do amplifikacji sygnału Rex, stawu sygnału Rex i fragmentów genu stałej alfa TCR. Wstaw produkt PCR złącza sygnałowego Trax w miejscu akceptora TA wektora topo PCR 2.1 i użyj plazmidowego DNA do przekształcenia XL one niebieskich chemicznie kompetentnych komórek przez szok termiczny wyizoluj odporne na ampicylinę białe kolonie, które utraciły komplementację beta laktazy, na nową płytkę wzorcową i użyj PCR do identyfikacji kolonii zawierających fragment trek. Po wyhodowaniu jednej z kolonii trek-dodatnich i wyizolowaniu DNA, użyj SP one do trawienia plazmidu i produktu amplifikowanego genu TCR alfa constant i ligacji fragmentu genu TCR alpha constant do plazmidu.Powtórz transformację, selekcję i ekspansję kolonii oraz izolację DNA, aby wstawić właściwy fragment, użyj tylnych trzech, a nie SP jeden, aby strawić plazmid i prawidłowy fragment PCR i powtórzyć proces, aby podwiązać i wyizolować DNA. Po zweryfikowaniu sekwencji trzech insercji, rozwiń kolonię i oczyść plazmidowe DNA przez przygotowanie MIDI zgodnie z protokołem tekstowym, aby przygotować krzywą standardową. Po obliczeniu masy i stężenia plazmidu, jak pokazano tutaj, rozmrozić podwielokrotność plazmidu i pokazać jeden, aby zlinearyzować dwa mikrogramy ze zlinearyzowaną podwielokrotnością DNA.Użyj wzoru C jeden V jeden równa się C dwa V dwa. Aby obliczyć objętość rozcieńczenia potrzebną do przygotowania pierwszego punktu krzywej wzorcowej z serii, jak pokazano poniżej, należy przygotować serię od jednego do 10 rozcieńczeń, aby uzyskać pozostałe punkty krzywej wzorcowej. Rozcieńczenie plazmidu należy przechowywać w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do czasu użycia Aby przygotować próbki do PCR w czasie rzeczywistym, ułóż płytkę PCR, która zawiera co najmniej dwie kontrpróby dla każdej próbki do analizy w następujący sposób z dwiema oddzielnymi probówkami, jedną dla Rex i pęknięć, a drugą dla stałej alfa TCR.Przygotuj mieszanki wzorcowe na całkowitą liczbę potrzebnych studzienek. Dodaj 20 mikrolitrów do dołków płytki. Następnie dodaj pięć mikrolitrów genomowego DNA wyekstrahowanego z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub P BMC.Dodaj pięć mikrolitrów wody do studzienek kontrolnych bez szablonu przed użyciem optycznej osłony samoprzylepnej do uszczelnienia płytki reakcyjnej. Następnie rozmrozić rozcieńczenie krzywej wzorcowej plazmidowego DNA i przygotować najwyższe rozcieńczenie. Odkryj tylko studnie znajdujące się między rzędami od A do H i kolumnami od pierwszej do czwartej.A po krótkim wirowaniu dodaj pięć mikrolitrów każdego punktu rozcieńczenia do wyznaczonego. Dobrze upewnij się, że na dnie studzienek nie ma pęcherzyków i że odczynniki są osadzone na dnie. Użyj systemu PCR w czasie rzeczywistym, aby uruchomić test z następującym protokołem.50 stopni Celsjusza przez dwie minuty i wstępne ogrzewanie w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie 45 cykli denaturacji w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 sekund. I połączona sonda starter e klękanie i wydłużanie w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Aby przeanalizować dane PCR w czasie rzeczywistym, otwórz zapisany plik wyników w oprogramowaniu i kliknij zakładkę wyników w górnej części okna.Kliknij menu analizy i wybierz ustawienia analizy. Pozwól oprogramowaniu automatycznie określić próg, wybierając wszystkie detektory i automatyczny CT dla cyklu progowego. Pozwól oprogramowaniu domyślnie ustawić automatyczną linię bazową do eliminacji tła.Kliknij zakładkę o nazwie wykres amplifikacji, a następnie w prawej części okna wybierz jeden z trzech detektorów z odpowiedniego menu rozwijanego. Tuż poniżej wybierz ręczny CT, aby ręcznie ustawić próg w dolnej części okna, wybierz dołki odpowiadające punktom rozcieńczenia krzywej standardowej wybranego detektora, aby wyświetlić wykresy wzmocnienia, klikając i przeciągając myszą po odpowiednich komórkach tabeli. Aby ręcznie dostosować próg, przeciągnij czerwoną linię progu w górę i w dół, a następnie kliknij przycisk Analizuj, aby ponownie przeanalizować wyniki.Aby sprawdzić, jak ustawienie progu wpływa na wyniki, wybierz zakładkę raport i zobacz wynikowy CT odpowiednich punktów rozcieńczenia krzywej standardowej. Przesuwając próg w celu uzyskania optymalnego umieszczenia na karcie wykresu wzmocnienia, sprawdź, czy próg znajduje się w obszarze wykładniczego wzmocnienia wystarczająco powyżej szumu tła, ale poniżej fazy plateau. Jeśli wykres wzmocnienia nie jest pokazany w skali logarytmicznej, kliknij wykres prawym przyciskiem myszy, aby przywołać ustawienia wykresu i ustaw ustawienie Y ais po uruchomieniu jako log.Ustaw próg w połowie długości liniowej części wykresu i obserwuj krzywe wzmocnienia w przybliżeniu równoległe do siebie. Kliknij zakładkę raportu, aby zobaczyć wyniki tomografii komputerowej. Upewnij się, że umieszczenie progu dało wyniki, które maksymalizują precyzję dwóch powtórzeń każdej krzywej standardowej.Punkty rozcieńczenia. Sprawdź, czy próg jest umieszczony w punkcie, który najlepiej odzwierciedla skrajne rzędy wielkości punktów rozcieńczania krzywej standardowej na karcie raportu. Przeciągnij ponownie myszą w tabeli w dolnej części okna, aby wybrać komórki odpowiadające studzienkom krzywej standardowej W przypadku wszystkich detektorów sprawdź, czy wynikowa przekładnika prądowa trzech celów jest bardzo podobna w tych samych punktach rozcieńczenia.Na przykład różnica, nie więcej niż 0,5 CT, w razie potrzeby dostosuj progi i ponownie sprawdź w zakładce raportu w dolnej części okna. Wybierz studnie NTC i sprawdź, czy w studzienkach NTC nie ma amplifikacji, co odpowiada nieokreślonemu CT. Wybierz kartę krzywej standardowej i po prawej stronie okna wykresu wybierz detektory z menu rozwijanego i sprawdź, czy zgłoszone nachylenie krzywej standardowej mieści się w zakresie od minus 3,55 do minus 3,32, co odpowiada sprawnościom PCR od 91 do 100%Upewnij się, że współczynnik determinacji lub R kwadrat jest wyższy niż 0,998, sprawdzając jego wartość tuż pod nachyleniem i punktem przecięcia.Kliknij kartę raportu i w odpowiednich komórkach tabeli pod wykresem sprawdź, czy CT kontroli dodatniej jest zgodna z wynikami poprzednich testów na tej samej znanej kontroli dodatniej. Kliknij menu plik, zapisz, a następnie wyeksportuj do pliku CSV, aby wyeksportować ilości wszystkich studzienek w pliku tekstowym zawierającym wartości oddzielone przecinkami. Na koniec zaimportuj plik CSV do arkusza kalkulacyjnego i oblicz liczbę ścieżek lub poprawek na 10 do sześciu PBM, odpowiednio ustawiając następującą formułę.Test opisany w tym filmie został przeprowadzony na reprezentatywnej próbie 87 zdrowych osób z grupy kontrolnej: 42 dzieci w wieku od zera do 17 lat i 45 dorosłych w wieku od 24 do 60 lat. Jak pokazano tutaj, liczba wędrówek gwałtownie zmniejszała się wraz z wiekiem z powodu inwolucji grasicy od zera do trzech do czterech lat u dorosłych.Liczba wędrówek zależy również od płci, ponieważ zmniejsza się szybciej u mężczyzn niż u kobiet, co może wpływać na zdolność do wyznaczenia odpowiednich zakresów odniesienia. Wykresy te pokazują, że liczba pęknięć zmniejszała się jednak wraz z wiekiem, podobnie jak w przypadku T TREXs tylko u dzieci. Natomiast u dorosłych wydajność szpiku kostnego jest dość stabilna przez całe życie i nie zależy od płci.Przygotowanie plazmidu z potrójną wkładką wymaga około dwóch lub trzech tygodni, ale potem przechowywane przydziały plazmidu wytrzymają trzy lata. Pozostałą część techniki można wykonać w ciągu zaledwie czterech do pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby tej procedury bardzo ważne jest, aby wykonać wszystkie manipulacje związane z plazmidem w dedykowanym obszarze, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego DNA.Niezbędne jest również zweryfikowanie stabilności standardowej rurki podczas analizy wyników po jej opracowaniu. Technika ta zapewniła naukowcom zajmującym się immunologią kliniczną lub hematologią ulepszone narzędzie do identyfikacji pierwotnych niedoborów odporności w celu monitorowania wyników rekonstytucji immunologicznej po przeszczepie szpiku kostnego lub po prostu do badania homeostazy limfocytów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać potrójną plazmid, przygotować krzywą wzorcową, przeprowadzić eksperyment PCR w czasie rzeczywistym i wykonać niezbędne obliczenia potrzebne do uzyskania powtarzalnej bezwzględnej kwantyfikacji trax i pęknięć.

simultaneous-quantification-t-cell-receptor-excision-circles-trecs-k

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru aktywności glikozylazy DNA oraz endonukleazy AP w czasie rzeczywistym w lizatach jąder komórkowych. Analiza ta pozwala na wyznaczenie szybkości aktywności naprawy DNA umożliwiającej analizę kinetyczną i może być dostosowana do ilościowego oznaczania aktywności naprawy DNA w lizatach tkanek i nowotworów lub z użyciem oczyszczonych białek.

Ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawy przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla uszkodzeń sond molekularnych (molecular beacons)

Designerskie chromosomy projektu Synthetic Yeast Genome, Sc2.0, można odróżnić od swoich natywnych odpowiedników za pomocą testu genotypowania opartego na PCR zwanego PCRTagging, który ma punkt końcowy obecności/braku. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę wykrywania PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania PCRTag.

Analiza qPCRTag - Wysokoprzepustowy test PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania Sc2.0

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić (pojedyncze cząsteczki) testy oparte na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) w celu zmierzenia dynamiki wiązania między receptorem antygenu limfocytów T (TCR) a cząsteczkami MHC naładowanymi peptydami antygenowymi, które występują w synapsie immunologicznej limfocytu T w kontakcie z funkcjonalizowaną dwuwarstwą lipidową podpartą planarnie.

Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET

Obecny protokół łączy sekwencjonowanie łańcucha alfa i beta TCR w parach pojedynczych komórek z usprawnionym generowaniem wektorów retrowirusowych kompatybilnych z ekspresją TCR in vitro i in vivo.

Usprawniona izolacja TCR z pojedynczych komórek i generowanie wektorów retrowirusowych do ekspresji TCR u ludzi in vitro i in vivo

Ten manuskrypt opisuje procedurę eksperymentalną i analizę oprogramowania dla dwukierunkowego testu miejsca integracji, który może jednocześnie analizować DNA połączenia wektor-gospodarz w górę i w dół. Dwukierunkowe produkty PCR mogą być używane na dowolnej platformie sekwencjonowania niższego szczebla. Uzyskane dane są przydatne do wysokoprzepustowego, ilościowego porównania zintegrowanych celów DNA.

Dwukierunkowa metodologia PCR w miejscu integracji retrowirusowej i przepływ pracy analizy danych ilościowych

Tutaj prezentujemy protokół jakościowego wykrywania ex vivo specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+. Analiza jest możliwa w przypadku zawiesin pojedynczych komórek z narządów lub z niewielkich ilości krwi. Szeroki zakres badań wymaga analizy odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T (badania nad szczepieniami i immunoterapią nowotworów).

Jednoczesna kwantyfikacja limfocytów T CD8 + specyficznych dla antywektorów i anty-transgenów za pomocą barwienia tetramerem MHC I po szczepieniu wektorem wirusowym

Tutaj prezentujemy protokół generowania klonów komórek rakowych zawierających znacznik sekwencji MS2 na pojedynczym subtelomerze. Podejście to, oparte na systemie MS2-GFP, umożliwia wizualizację endogennych transkryptów telomerowego RNA zawierającego powtórzenia (TERRA) wyrażonego z pojedynczego telomeru w żywych komórkach.

Generowanie klonów komórek rakowych w celu wizualizacji telomerowego RNA TERRA zawierającego powtórzenia wyrażonego z pojedynczego telomeru w żywych komórkach

Tutaj opisujemy solidną metodę określania tożsamości i czystości komórek odpornościowych za pomocą sygnatur epigenetycznych wykrytych za pomocą ilościowego PCR (qPCR). Demetylacja DNA w określonym locus służy jako unikalny identyfikator dla określonego typu komórki i umożliwia identyfikację limfocytów T CD8 +, regulatorowych lub Th17.

Oznaczanie tożsamości i czystości komórek odpornościowych za pomocą epigenetycznego ilościowego PCR

Obecny protokół opisuje metodę izolacji DNA z próbek krwi i biopsji jelitowych, generowania bibliotek TCRβ i IGH PCR do sekwencjonowania nowej generacji, wykonywania przebiegu NGS i podstawowej analizy danych.

Analiza repertuaru immunologicznego receptorów limfocytów T i B przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji

Poznaj metodę jednoczesnej kwantyfikacji TREC i KREC za pomocą PCR w czasie rzeczywistym do oceny aktywności grasicy i szpiku kostnego. Ta technika umożliwia badanie odporności u dzieci i dorosłych.

Jednoczesna kwantyfikacja kręgów wycinania receptora komórek T (TREC) i kręgów wycinania rekombinacji z delecją K (KREC) za pomocą PCR w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal

Jednoczesna kwantyfikacja kręgów wycinania receptora komórek T (TREC) i kręgów wycinania rekombinacji z delecją K (KREC) za pomocą PCR w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów