Wysokoprzepustowa technika fluorometryczna do oceny fagocytozy makrofagów i polimeryzacji aktyny

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowe określenie zmian w procesie fagocytarnym lub działaniu w polimeryzacji po dodaniu agonistów lub antagonistów. Osiąga się to poprzez dodanie fluorescencyjnie znakowanych cząstek do komórek fagocytarnych i pozostawienie wystarczającej ilości czasu na fagocytozę. Drugim krokiem do zatrzymania fagocytozy jest traktowanie komórek błękitem triamowym w celu wygaszenia fluorescencji niezinternalizowanych cząstek, przemytych, a następnie utrwalonych paraldehydem.

Dalej jest barwienie i kwantyfikacja. Aby ułatwić fluorescencyjne wykrywanie komórek i cząstek, komórek podtrzymywanych przez DPI lub aktynę, wyniki pokazują wpływ leczenia na fagocytozę i polimeryzację aktyny, określoną ilościowo za pomocą stosunku fluorescencji zielono-czerwonej do niebieskiej na podstawie analizy fluorometrycznej. Główną przewagą techniki fluorometrycznej nad istniejącymi metodami jest to, że jest to wysokoprzepustowa, opłacalna metoda oceny fagocytozy.

Pozwala na minimalną manipulację próbką i szybkie ilościowe określenie intensywności fluorescencji na komórkę. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii i biologii komórki, takie jak skuteczność i szybkość usuwania patogenu. Polimeryzacja czynnościowa zmieniająca się podczas fagocytozy i jak fagocytoza lub polimeryzacja aksonów jest modulowana przez agonistów lub antagonistów.

Aby rozpocząć płytkę zabiegową, makrofagi z linii komórkowej Murine J 7 74 na 96-dołkowej płytce z przezroczystym lub czarnym dnem inkubują przylegające komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin, aby umożliwić adion na płytce. Następnie dodać do komórek pożądanych agonistów lub antagonistów lub kontrolę nośnika w stężeniu dwa razy w 50 mikrolitrach PBS lub pożywki z dodatkiem i inkubować przez żądany okres czasu. Na tym etapie upewnij się, że cząstki fluorescencyjne i etykiety są chronione przed światłem przez cały czas podczas przetwarzania, mycia i inkubacji.

Aby zapobiec fotowybielaniu, należy użyć cząstek w zawiesinie, takich jak znakowane fluorescencyjnie dextra perełki lub przelać roztwór podstawowy na jedną minutę. Następnie dodaj równą ilość odczynnika opsonizującego do cząstek fluorescencyjnych i energicznie wiruj przez kolejną minutę. Następnie inkubować mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę po odwirowaniu inkubacji, cząstki miały pięć minut.

Przy 500 razy G. Usunąć supernatant S zawierający nadmiar odczynnika opsonizującego. Następnie umyj cząstki 100 mikrolitrami PBS. Wirować próbkę, aby ponownie zawiesić osad i odwirowywać go przez pięć minut od 500 do razy G. Powtórz te kroki jeszcze dwa razy, aby zapewnić prawidłową optymalizację i usunięcie niezwiązanego przeciwciała.

Aby przygotować roztwór roboczy zjonizowanych cząstek, ponownie zawiesić cząstki w pięciu mililitrach pożywki. Następnie przechowuj go z dala od światła do czasu dalszego użycia. Teraz umieść roztwór roboczy cząstek w sterylnym zbiorniku odczynnika.

Dodaj 50 mikrolitrów cząstek opsonizowanych do przygotowanych wcześniej komórek do końcowego stężenia 15 nanogramów na mililitr i pozwól fagocytozie wystąpić w standardowych warunkach hodowli komórkowej. W przypadku metody fagocytozy ciągłej należy odczekać od 30 minut do jednej godziny, aby cząstki fluorescencyjne dotarły do dna studzienki i weszły w kontakt z komórkami. Jeśli przeprowadzasz eksperyment z biegiem czasu, dodaj bakterie w różnych odstępach czasu i zatrzymaj całą płytkę reakcji w tym samym czasie.

Aby zwiększyć szybkość przetwarzania komórek adhezyjnych, usuń sennet i dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczonego błękitu triama z PBS w celu wygaszenia fluorescencji niezinternalizowanych bakterii po inkubacji trianów. Umyj płytkę dwa razy PBS, aby usunąć wszelkie pozostałości trianu. Następnie utrwal komórki 50 mikrolitrami 4% paraldehydu i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie umyj płytkę PBS. Usuń cały płyn i dodaj 50 mikrolitrów DPI Po pięciu minutach barwienia umyj płytkę dwukrotnie PBS. Następnie dodaj 50 mikrolitrów PBS do każdej studzienki i zarejestruj fagocytozę po utrwaleniu paraldehydu.

Umyj płytkę dwukrotnie 100 mikrolitrami PBS na studzienkę na każde mycie. Następnie dodaj 50 mikrolitrów 0,1% Triton X 100 w PBS do komórek w celu przenikania i inkubuj je przez trzy do pięciu minut w temperaturze pokojowej. Następnie dwukrotnie zmyj 0,1%Triton X za pomocą PBS.

Następnie zablokuj komórki za pomocą 1% BSA na 20 minut, aby uniknąć niespecyficznego wiązania etykiety. Teraz przygotuj roztwór roboczy barwnika dominowego pręta, dodając 100 mikrolitrów roztworu podstawowego metanolu w pięciu mililitrach PBS. Po zablokowaniu należy natychmiast usunąć roztwór BSA.

Dodaj 50 mikrolitrów foidu żwacza i roztworu roboczego do każdej studzienki i inkubuj komórki w ciemności przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Aby określić ilościowo fagocytozę, umieść płytkę w czytniku płytek fluorescencyjnych Rejestruj zieloną fluorescencję za pomocą filtra wzbudzającego o długości fali 488 nanometrów i filtra emisyjnego o długości fali 518 nanometrów oraz niebieską fluorescencję za pomocą filtra wzbudzającego o długości fali 355 nanometrów i filtra emisyjnego o długości fali 460 nanometrów. Aby określić ilościowo polimeryzację aktyny za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych, należy zarejestrować czerwoną fluorescencję przez filtr wzbudzający o długości fali 584 nanometrów i filtr emisyjny o długości fali 620 nanometrów i niebieską fluorescencję.

Filtr ognia i wzbudzenia o długości fali 355 nanometrów i filtr emisyjny o długości fali 460 nanometrów. Następnie podziel całkowite RFU zielonej lub czerwonej fluorescencji przez odczyt niebieskiej fluorescencji w zależności od etykiety cząstek lub kwantyfikacji fagocytarnej w stosunku do aktyny ze względu na wysoką płytkę. Aby określić wariancję, należy użyć wskaźników względnych, aby jak najlepiej zilustrować obserwowane trendy i ułatwić bardziej wiarygodną analizę statystyczną.

Obraz ten ilustruje zmiany w polimeryzacji aktyny po dodaniu inhibitora. To są formacje pseudopodiów, a oto zmiany w marszczeniu błony. Na tym obrazie komórkom pozwolono na internalizację fitzy sprzężonych koralików X w stosunku 20 do jednego koralika do komórki przez 60 minut.

Następnie komórki zostaną przemyte trianem i PBS utrwalonym paraldehydem, przepuszczalnym acetonem i barwnikiem dla aktyny F Używając dominy pręcikowej, polędwicy i dpi, ciągła fagocytoza opsonizacji i nieutlenionych cząstek jest dość porównywalna. Gdzie komórki J 7 74 internalizują koraliki dextra. Co ciekawe, polimeryzacja aktyny po fagocytozie zwiększa się, zwalniając w późniejszych punktach czasowych, podczas gdy polimeryzacja aktyny po internalizacji cząstek unop nie zwiększa się, żadna z metod fagocytarnych wykorzystujących cząstki dextra nie powoduje zmian w żywotności komórek Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu jednej do dwóch godzin na wielu płytkach jednocześnie, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać analizę metryczną fluoru jako wydajną, opłacalną metodę analizy fagocytozy i innych procesów komórkowych o wysokiej przepustowości