Procedura wszczepienia komory rdzeniowej do podłużnego obrazowania in vivo rdzenia kręgowego myszy

W tym filmie opisujemy procedurę wszczepienia przewlekłej komory obrazowania optycznego do grzbietowego rdzenia kręgowego żywej myszy. Komora, zabieg chirurgiczny i przewlekłe obrazowanie są oceniane i demonstrowane.

Ogólnym celem tej procedury jest wszczepienie komory obrazowania nad grzbietowym rdzeniem kręgowym myszy, aby umożliwić wzdłużne obrazowanie optyczne bez konieczności powtarzania napadów chirurgicznych. Osiąga się to poprzez najpierw odsłonięcie trzech kręgów piersiowych i usunięcie tkanki miękkiej powyżej kręgosłupa. Drugim krokiem jest zaciśnięcie odsłoniętych kręgów za pomocą bocznych części komory i wykonanie laminektomii grzbietowej.

Następnie górna płyta komory jest mocno przymocowana do odsłoniętego rdzenia kręgowego i uszczelniona za pomocą elastomeru silikonowego i szkła nakrywkowego. Ostatnim krokiem jest uszczelnienie skóry wokół implantu za pomocą klejów i umożliwienie zwierzęciu powrotu do zdrowia. Ostatecznie wielofotonowa mikroskopia fluorescencyjna służy do obrazowania zachowania komórek i struktury tkanek w rdzeniu kręgowym z rozdzielczością subkomórkową w czasie.

Główną przewagą naszej nowej metodologii nad istniejącymi metodami, takimi jak wielokrotne chirurgiczne otwieranie rdzenia kręgowego, jest możliwość uzyskania niemal dowolnej liczby punktów czasowych obrazowania rozłożonych w długim okresie czasu bez powikłań związanych z powtarzaną operacją, takich jak potencjalna infekcja, uraz chirurgiczny lub stres zwierząt. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zastanawialiśmy się nad wcześniejszym sukcesem obrazowania podłużnego po urazie rdzenia kręgowego u przezroczystej ryby danio pręgowanej. Następnie zdecydowaliśmy się rozszerzyć ten paradygmat na model ssaków.

Rozpocznij tę procedurę od ogolenia obszaru łuku piersiowego myszy znieczulonej za pomocą izofluoru. Następnie usuń przycięte włosy. Następnie podaj myszowi podskórnie mieszaninę soli fizjologicznej, ketoprofenu i deksametazonu.

Za pomocą bawełnianych wacików. Wykonaj trzy naprzemienne płukania jodem i 70% etanolem i odczekaj minutę między praniami. Następnie podaj podskórnie 100 mikrolitrów 0,125% bupiwakainy na środek ogolonego plastra, aby zmniejszyć ból w miejscu nacięcia.

Następnie przenieś mysz do niestandardowych ataków stereo. Włożyć termometr doodbytniczy i odczekać około 10 minut, aż bupiwakaina zacznie działać pod mikroskopem. Wykonaj pięciomilimetrowe nacięcie nad kręgami za pomocą ostrza skalpela.

Następnie zwiększ rozmiar otworu w skórze przez rozwarstwienie. Następnie delikatnie odłącz powięź łączną między skórą a leżącym pod nią mięśniem. Przytrzymaj skórę z tyłu, aby uzyskać większy obszar roboczy za pomocą zwijaczy i uważaj, aby nie zwiększyć ciężaru na klatce piersiowej i nie utrudnić oddychania.

Następnie chwyć za nerwy rostralne, najbardziej wysunięty kręg, który będzie odsłonięty przez leżący nad nim mięsień, za pomocą kleszczy. Odetnij tkankę po obu stronach wyrostka grzbietowego z dala od trzech kręgów. Następnie usuń całą leżącą na wierzchu tkankę z laminatu grzbietowego.

Następnie ostrożnie odetnij ścięgna przyczepione do kręgów na obu bocznych krawędziach kręgosłupa. Delikatnie usuń jak najwięcej tkanki z bocznych krawędzi kolumny kręgowej, aby zapewnić czystą powierzchnię zaciskową. Następnie delikatnie oczyść kręgi z pozostałych tkanek miękkich.

Za pomocą skrobaka do kości i wacika odetnij wszelkie niepasujące tkanki za pomocą nożyczek chirurgicznych. Następnie wyreguluj zwijacze, aby utrzymać tkankę otaczającą kolumnę kręgową. Wraz ze skórą przymocuj pręty boczne implantu do zębów na słupkach porodowych i umieść je w uchwytach wkładu.

Następnie zaciśnij trzy kręgi. Korzystanie z prętów bocznych, wywierając nacisk wystarczający do ich bezpiecznego trzymania. Następnie użyj kleszczy, aby zapewnić wypoziomowane zaciśnięcie trzech kręgów.

Upewnij się, że pręty boczne są zarówno wypoziomowane, jak i równoległe przed wykonaniem laminektomii. Następnie dokładnie oczyść i osusz grzbietową powierzchnię zaciśniętych kręgów za pomocą bawełnianych wacików. W tej procedurze włóż końcówki nożyczek Vana do przestrzeni zewnątrzoponowej przyśrodkowego zaciśniętego kręgu i lekko ściśnij uchwyty.

Jeśli kość jest sucha, powinna pęknąć wzdłuż blaszki grzbietowej. Powtórz tę procedurę po stronie przeciwległej, aby uwolnić blaszkę, jednocześnie chwytając luźną blaszkę Delikatnie wyrostkiem grzbietowym za pomocą kleszczy, ostrożnie odetnij tkankę łączną na końcach rostralnych i rozpieszczonych blaszki. Następnie dokładnie zmyj krew pokrywającą rdzeń kręgowy 0,9% solą fizjologiczną lub sztucznym mózgowym rdzeniem rdzeniowym, wchłonij nadmiar płynu bawełnianymi wacikami.

Następnie przytnij boczne krawędzie kości i przejdź do bocznych prętów implantu. Następnie zatamuj krwawienie za pomocą wacików i soli fizjologicznej. W przypadku, gdy część okostnej oderwała się i pokrywa rdzeń kręgowy, delikatnie usuń tkankę za pomocą bawełnianych wacików i igły o rozmiarze od 29 do 30.

Uważaj, aby nie uszkodzić rdzenia kręgowego i nie myl luźnej okostnej z ciasno owiniętym datorem. Na końcu. Uszczelnij pozostałe odsłonięte krawędzie kości za pomocą środka dentystycznego, akrylowego i cyjanoakrylu.

Zachowaj szczególną ostrożność, aby klej nie dostał się na odsłonięty rdzeń kręgowy. Teraz ostrożnie umieść górną płytkę na zwierzęciu, tak aby cztery szczeliny pokrywały się z czterema otworami w prętach bocznych, a otwór pokrywał się z odsłoniętym rdzeniem kręgowym. Za pomocą śrubokręta jubilerskiego ostrożnie zacznij od pierwszej, stabilizując trzonek śrubokręta kolejną parą kleszczyków.

Nie dokręcaj na tym etapie, ale włóż ją tak, aby kilka pierwszych gwintów było zazębionych. Powtórz ten proces dla pozostałych trzech. Po wkręceniu wszystkich czterech dokręcaj każdą naprzemiennie w tych samych małych odstępach, aż wszystkie zostaną mocno dokręcone.

Następnie użyj elastomeru silikonowego marki quick sill, aby wypełnić przestrzeń między rdzeniem kręgowym a szklanym okienkiem i nałóż go na odsłonięty rdzeń kręgowy. Pamiętaj, aby pozbyć się wszelkich pęcherzyków powietrza zawierających silikon z końcówki mieszającej przed jej nałożeniem. Następnie szybko umieść pięciomilimetrową szkiełko nakrywkowe we wkładce w górnej płycie.

Zastosuj wystarczający nacisk, aby stopniowo ścisnąć płynny elastomer, aby otoczyć rdzeń kręgowy, ale nie powodując ucisku rdzenia kręgowego. Następnie pokryj krawędzie wysiękowego elastomeru zębowym, akrylowym i cyjanoakrylowym, a następnie użyj klejów, aby jak najbardziej przykleić elastomer do otaczającej kości, aby zapobiec przesuwaniu się elastomeru po powierzchni rdzenia kręgowego. Następnie wyjmij retraktory i pociągnij skórę do góry wokół krawędzi implantu.

Użyj cyjanoakrylanu, aby przykleić skórę do krawędzi implantu. Następnie włóż w skrzydła górnej płyty. Następnie uszczelnij szczeliny w otworach na górnej płyty za pomocą akrylu dentystycznego przed umieszczeniem zwierzęcia z powrotem w klatce w celu odzyskania.

Przed sesjami obrazowania należy ponownie znieczulić mysz i przymocować odsłonięte implantu do gwintowanych słupków w celu stabilizacji. Rysunek ten pokazuje, że przewlekła komora kręgosłupa pozostaje optycznie przezroczysta przez wiele tygodni. Są to obrazy rdzenia kręgowego od białego do jasnego od kilku minut do trzech tygodni po operacji.

Naczyniowe punkty orientacyjne są rozpoznawalne we wszystkich punktach czasowych. Niewielka zmiana jest widoczna w ciągu jednego dnia po operacji. Gęsty włóknisty przerost występuje w części okna już po trzech dniach i powoduje częściowe zaciemnienie obszaru obrazowania.

Łagodna neowaskularyzacja jest również obecna, ale nie przesłania pierwotnego układu naczyniowego w świetle białym lub dwóch obrazach PEF. Przewlekła komora kręgosłupa umożliwia wielokrotne obrazowanie wielofotonowe bez konieczności wielokrotnych operacji. Oto obrazy transgenicznej myszy wykazującej ekspresję YFP w podzbiorze aksonów DRG w grzbietowym fii rdzenia kręgowego.

Układ naczyniowy został oznaczony przez donaczyniowe wstrzyknięcie barwnika pokazane na czerwono. Aktywność mikrogleju można również śledzić w czasie u myszy podwójnie transgenicznych uda, YFP, CX, trzech CR, jednej GFP, podczas gdy aksony i mikroglej pozostają widoczne. Kontrast i rozdzielczość nieznacznie spadają z czasem.

Raz opanowane. Tę technikę można wykonać w około godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo po jej opracowaniu. Ta technika utorowała nam drogę do zbadania czasowej i przestrzennej niejednorodności zamierania aksonów po urazie rdzenia kręgowego.

I myszy.