Name: Minimalnie inwazyjny zabieg chirurgiczny indukcji zawału mięśnia sercowego u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Poznaj minimalnie inwazyjną metodę indukcji zawału mięśnia sercowego u myszy. Technika zapewnia wysoką powtarzalność, przeżywalność zwierząt i zgodność z zasadą 3R w badaniach kardiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych IZKF Aachen (młodsza grupa badawcza E.A.L.) na wydziale Medycyny Uniwersytetu RWTH w Akwizgranie. Jesteśmy wdzięczni dr Rusu i Ashley Christinie Vourakis za krytyczną recenzję manuskryptu oraz Pani Royi Soltan za profesjonalną pomoc w barwieniu immunohistochemicznym.

UWAGA: Eksperymenty przedstawione w tym artykule są przeprowadzane zgodnie z niemieckimi i europejskimi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Zwierzęta są hodowane w Instytucie Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych Szpitala Uniwersyteckiego w Akwizgranie w Niemczech, pod nadzorem prof. dr R. Tolba i dr A. Teubnera (inspektora ds. dobrostanu zwierząt).
1. Opieka nad zwierzętami
<ol>
	<li>Trzymaj myszy w specjalistycznym oddziale opieki, zapewniając odpowiedni dostęp do pożywienia oraz specjalistyczną kontrolę i leczenie weterynaryjne. Jeśli zwierzęta są przenoszone lub kupowane z zewnątrz, prosimy o zapewnienie tygodniowego zakwaterowania przed poddaniem się zabiegowi.</li>
</ol>
2. Intubacja
<ol>
	<li>Znieczulić 8-10 tygodniowe samce myszy typu dzikiego C57Bl/6, 25-27 g, podając dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Monitoruj poziom znieczulenia za pomocą odruchów szczypania palców u stóp. Umieść maść weterynaryjną na oczach, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego należy przeprowadzić terapię przeciwbólową buprenofiną w dawce 0,1 mg/kg masy ciała podskórnie, postępując zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami obowiązującymi w Twojej placówce.</li>
	<li>Zapewnij utrzymanie sterylnych warunków, aby uniknąć infekcji podczas operacji, używając sterylnych materiałów i narzędzi.</li>
	<li>Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na rozgrzanym stole operacyjnym. Usuń włosy z obu brzusznych części szyi i lewej połowy klatki piersiowej za pomocą małej maszynki do golenia i zdezynfekuj 70% alkoholem przed nacięciem.
	<ol>
		<li>Wykonaj małe środkowe nacięcie 0,5 cm za pomocą nożyczek chirurgicznych na środku szyi. Pod skórą przejdź przez 2 ciała tłuszczowe za pomocą sterylnych zakrzywionych kleszczy i uwidocznij tchawicę pod mikroskopem stereoskopowym przez przezroczystość mięśnia pokrywającego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wprowadzić doustnie kaniulę intubacyjną do tchawicy view za pomocą stereomikroskopu (ryc. 1A). Rozróżnij metalową kaniulę przez przezroczystą tkankę. I w każdej chwili sprawdź pozycję i lokalizację podczas operacji (Rysunek 1B).</li>
	<li>Podłącz kaniulę do respiratora dla małych zwierząt i dostosuj ustawienia wentylacji zgodnie z wytycznymi producenta (objętość oddechowa między 100-150 μl i częstość oddechów między 100-150 na minutę).</li>
</ol>
3. Indukcja zawału mięśnia sercowego
<ol>
	<li>Wykonaj nacięcie skóry w odległości mniejszej niż 0,5 cm w środku linii między ksyloidem a lewą osią. Użyj kleszczy, aby oddzielić warstwę mięśniową od leżących pod nią żeber.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie między żebrami za pomocą małych nożyczek, aż jama piersiowa zostanie otwarta17. W przypadku przewlekłego zawału należy wykonać nacięcie w 5. przestrzeni międzyżebrowej (ryc. 1C) i/lub w przypadku modelu niedokrwienia/reperfuzji, w 4. przestrzeni międzyżebrowej (ryc. 1D): dla łatwiejszego podejścia należy policzyć odpowiednio poniżej 2. i 3. przestrzeni międzyżebrowej).</li>
	<li>Umieść retraktory w nacięciu, aby otworzyć klatkę piersiową i uwidocznić serce.</li>
	<li>Ostrożnie usuń osierdzie, aby zapobiec nadmiernym procesom zwłóknienia.</li>
	<li>Wyobraź sobie lewą zstępującą tętnicę wieńcową (LAD) jako głęboko osadzone jasnoczerwone naczynie. Jeśli nie można zwizualizować LAD, należy wziąć pod uwagę kilka punktów odniesienia, aby zwiększyć odtwarzalność.
	<ol>
		<li>W przypadku modelu przewlekłego zawału należy umieścić ligaturę pośrodku brzusznej strony serca (między małżowiną uszną a wierzchołkiem), mając jako odniesienie żyłę, jak pokazano na rycinie 1C. Zwiąż obie gałęzie tętnicy za pomocą jedwabnego szwu 0/7, aby uzyskać przezścienny przedni i tylny zawał. Kolor szary wskazuje położenie ligatury i w razie potrzeby można go powtórzyć (Rysunek 1C).</li>
		<li>W przypadku modelu niedokrwienia/reperfuzji umieść ligaturę pod małżowiną uszną, nad głównym korpusem LAD (ryc. 1D). Ligatura znajduje się nad silikonową rurką, aby chronić integralność naczynia. Szary kolor oznacza obszar zawału i powinien pojawić się w całym sercu (ryc. 1D). Zakładaj szwy skroniowe na żebra w okresie niedokrwienia i zwilż kompresem, aby uniknąć wysuszenia tkanek. Po niedokrwieniu usuń silikonową rurkę i przetnij szew małymi nożyczkami, aby uwidocznić reperfuzję.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oprócz środków znieczulających i przeciwbólowych stosowanych na początku zabiegu (kroki 2.1 i 2.2), podczas operacji należy stosować 0,5% izofluranu, aby zapewnić odpowiedni komfort zwierzęcia, lub postępować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami obowiązującymi w Twojej placówce.</li>
</ol>
4. Szwy i rekonwalescencja
<ol>
	<li>Wyeliminuj resztki powietrza z klatki piersiowej, wypełniając go ciepłym roztworem soli izotonicznej.</li>
	<li>Zamknij klatkę piersiową za pomocą 3 szwów 0/6 (jak pokazano na rycinie 2A i 2B). Umieścić szwy przyśrodkowe pod kątem 90°, aby zapewnić szczelne zamknięcie żeber, jak pokazano na rysunku 2 (rysunek 2A, B).</li>
	<li>Zamknij warstwę mięśniową za pomocą 2 szwów (ryc. 2C), a skórę za pomocą 3-4 szwów 0/6 (ryc. 2D). Szwy te należy wykonać osobno, aby uzyskać odpowiednie okno do dalszych pomiarów echokardiograficznych.</li>
	<li>Odłącz kaniulę intubacyjną od respiratora i pozwól na spontaniczny oddech. W celu późniejszej identyfikacji oznacz mysz za pomocą lokalnego systemu (zapytaj urzędnika ds. dobrostanu zwierząt w swojej placówce).</li>
	<li>Połóż mysz po lewej stronie pod czerwoną lampą, aż się obudzi. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności. Nie pozwól, aby zwierzę, które przeszło operację, przebywało w towarzystwie innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje.</li>
	<li>Terapię przeciwbólową należy podawać buprenofiną w dawce 0,1 mg/kg masy ciała podskórnie przez następne 3 dni, postępując zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami obowiązującymi w Twojej placówce.</li>
</ol>
5. Analiza zawału mięśnia sercowego
<ol>
	<li>Regularnie monitoruj czynność serca za pomocą echokardiografii (ryc. 3A): frakcji wyrzutowej, skrócenia frakcyjnego, pojemności minutowej serca i wymiarów serca.</li>
	<li>Znieczulić zwierzęta za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Potwierdź prawidłowe znieczulenie przed zabiegiem poprzez brak odruchów.</li>
	<li>Otwórz klatkę piersiową i wytnij serce, umieszczając je w sterylnym roztworze PBS, obficie przepłukując pozostałą krew.</li>
	<li>W razie potrzeby należy pobrać krew bezpośrednio z serca, unikając uszkodzenia obszarów podnóża lub po usunięciu serca z jamy klatki piersiowej.</li>
	<li>Po umyciu zatrzymaj serce w diastoli w nasyconym roztworze KCl (sterylnie przefiltrowany 3M KCl w PBS). W celu analizy histologicznej zamocuj serce w 10% formalinie i przejdź do kroku 5.7.</li>
	<li>W razie potrzeby zmierz żywotność komórek serca za pomocą barwienia chlorkiem Evansa-Niebieskiego / Trifenylotetrazolium (TTC). Po odbudowaniu ligatury w początkowym miejscu, należy wykonać perfuzję serca za pomocą 200 μl 1% roztworu Evans Blue za pomocą kaniuli aortalnej i zamrozić serce w małej plastikowej torbie w temperaturze -20 °C, bez mycia.
	<ol>
		<li>Po 2 godzinach wykonać 5 szkiełek podstawowych w kierunku poprzecznym za pomocą ostrego skalpela i inkubować je przez 10-15 minut w roztworze TTC w temperaturze 37 °C, zgodnie z opisem producenta. Utrwal szkiełka na 10 minut w 10% formalinie i umieść je między mikroskopijnymi szkiełkami w celu dalszej analizy.</li>
		<li>Osadź tkankę serca w parafinie, umieszczając serce na końcówce, aby wykonać przekroj poprzeczny. Wykonać przekrój szeregowy 5 μm. Zbierz pierwsze 20 sekcji i wyrzuć następne 300 μm. Kontynuuj protokół sekcji, aż do osiągnięcia poziomu zastawki mitralnej (ryc. 3A, B). Pobierane są odcinki seryjne w odstępach 400 μm wzdłuż całego serca, które można barwić w celu przeprowadzenia analizy jakościowej i ilościowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz rozmiar zawału za pomocą jednoetapowego barwieniaGomoriego 6-8.</li>
	<li>Analizuj angiogenezę, zawartość kolagenu lub rekrutację komórek zapalnych w sekcji szeregowej przy użyciu zwykłego barwienia immunohistologicznego.</li>
</ol>

<ol><li>Liehn, E. A., Postea, O., Curaj, A., Marx, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+after+myocardial+infarction%2C+between+fantasy+and+reality%3A+the+role+of+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Repair after myocardial infarction, between fantasy and reality: the role of chemokines.</a> J Am Coll Cardiol. 58 (23), 2357-2362 (2011).</li>
<li>Liehn, E. A., Radu, E., Schuh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+contribution+in+stem+cell+engraftment+into+the+infarcted+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Chemokine contribution in stem cell engraftment into the infarcted myocardium.</a> Curr Stem Cell Res Ther. 8 (4), 278-283 (2013).</li>
<li>Alexander, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+transplantation+of+different+cell+types+sequentially+improves+heart+function+after+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Repetitive transplantation of different cell types sequentially improves heart function after infarction.</a> J Cell Mol Med. 16 (7), 1640-1647 (2012).</li>
<li>Liehn, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+protective+and+detrimental+effects+of+endogenous+macrophage+migration-inhibitory+factor+mediated+by+CXCR2+in+a+mouse+model+of+myocardial+ischemia%2Freperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized protective and detrimental effects of endogenous macrophage migration-inhibitory factor mediated by CXCR2 in a mouse model of myocardial ischemia/reperfusion.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (9), 2180-2186 (2013).</li>
<li>Liehn, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ccr1+deficiency+reduces+inflammatory+remodelling+and+preserves+left+ventricular+function+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Ccr1 deficiency reduces inflammatory remodelling and preserves left ventricular function after myocardial infarction.</a> J Cell Mol Med. 12 (2), 496-506 (2008).</li>
<li>Liehn, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+monocyte+chemotactic+protein-1%2Fchemokine+CC+motif+ligand-2+competitor+limiting+neointima+formation+and+myocardial+ischemia%2Freperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">A new monocyte chemotactic protein-1/chemokine CC motif ligand-2 competitor limiting neointima formation and myocardial ischemia/reperfusion injury in mice.</a> J Am Coll Cardiol. 56 (22), 1847-1857 (2010).</li>
<li>Liehn, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-edged+role+of+the+CXCL12%2FCXCR4+axis+in+experimental+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Double-edged role of the CXCL12/CXCR4 axis in experimental myocardial infarction.</a> J Am Coll Cardiol. 58 (23), 2415-2423 (2011).</li>
<li>Oral, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXC+chemokine+KC+fails+to+induce+neutrophil+infiltration+and+neoangiogenesis+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">CXC chemokine KC fails to induce neutrophil infiltration and neoangiogenesis in a mouse model of myocardial infarction.</a> J Mol Cell Cardiol. 60, 1-7 (2013).</li>
<li>Projahn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+intramyocardial+release+of+engineered+chemokines+by+biodegradable+hydrogels+as+a+treatment+approach+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Controlled intramyocardial release of engineered chemokines by biodegradable hydrogels as a treatment approach of myocardial infarction.</a> J Cell Mol Med. 18 (5), 790-800 (2014).</li>
<li>Schuh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+into+the+mechanism+of+cell-based+therapy+after+chronic+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Discoveries%22%5BJournal%5D)">Novel insights into the mechanism of cell-based therapy after chronic myocardial infarction.</a> Discoveries. 1 (2), e9(2014).</li>
<li>Schuh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+SDF-1+alpha+on+Endogenous+Mobilized+and+Transplanted+Stem+Cells+in+Regeneration+after+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Effect of SDF-1 alpha on Endogenous Mobilized and Transplanted Stem Cells in Regeneration after Myocardial Infarction.</a> Curr Pharm Des. 20 (12), 1964-1970 (2013).</li>
<li>Zaragoza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Animal models of cardiovascular diseases.</a> J Biomed Biotechnol. 2011, 497841(2011).</li>
<li>Kanzler, I., Liehn, E. A., Koenen, R. R., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+therapeutic+approaches+to+reduce+acute+atherosclerotic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory therapeutic approaches to reduce acute atherosclerotic complications.</a> Curr Pharm Biotechnol. 13 (1), 37-45 (2012).</li>
<li>Liehn, E. A., Zernecke, A., Postea, O., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines%3A+inflammatory+mediators+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Chemokines: inflammatory mediators of atherosclerosis.</a> Arch Physiol Biochem. 112 (4-5), 229-238 (2006).</li>
<li>Kolk, M. V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAD-Ligation%3A+A+Murine+Model+of+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction.</a> J. Vis. Exp. (32), 1438(2009).</li>
<li>Ryu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+bone+marrow+mononuclear+cells+using+injectable+fibrin+matrix+enhances+neovascularization+in+infarcted+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Implantation of bone marrow mononuclear cells using injectable fibrin matrix enhances neovascularization in infarcted myocardium.</a> Biomaterials. 26 (3), 319-326 (2005).</li>
<li>Frobert, A., Valentin, J., Cook, S., Lopes-Vicente, J., Giraud, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+Therapy+for+Heart+Failure+in+Rat%3A+Double+Thoracotomy+for+Myocardial+Infarction+and+Epicardial+Implantation+of+Cells+and+Biomatrix%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell-based Therapy for Heart Failure in Rat: Double Thoracotomy for Myocardial Infarction and Epicardial Implantation of Cells and Biomatrix.</a> J. Vis. Exp. (91), e51390(2014).</li>
<li>Xu, Z., Alloush, J., Beck, E., Weisleder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Murine+Model+of+Myocardial+Ischemia-reperfusion+Injury+through+Ligation+of+the+Left+Anterior+Descending+Artery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery.</a> J. Vis. Exp. (86), e51329(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podczas zabiegu należy zwrócić uwagę na kilka krytycznych punktów: intubację, otwarcie klatki piersiowej i podwiązanie LAD. Pierwszym krytycznym krokiem jest intubacja zwierzęcia przed doświadczeniami. Wiele grup używa pionowego wspornika do mocowania myszy i źródła światła do wprowadzania kaniuli bezpośrednio do tchawicy. Metoda ta jest niepewna co do prawidłowego wprowadzenia kaniuli do tchawicy i jest najbardziej podatna na niepowodzenia przez nowicjuszy. Wykonując małe nacięcie, położenie kaniuli może być kontrolowane podczas całego manewru, zmniejszając w ten sposób domyślną stawkę. Co więcej, tracheotomia zostaje przekroczona, co zmniejsza powikłania i skraca czas operacji.
Kolejnym krytycznym krokiem jest otwarcie jamy klatki piersiowej. Środkowa sternotomia stanowi manewr wysokiego ryzyka, opóźniający powrót zwierząt do zdrowia. Boczne lewe nacięcie oznaczające przecięcie 2-3 żeber15 prowadzi do niedostatecznej rekonwalescencji i zwiększonej śmiertelności. Zastosowaliśmy w modelu małe, dyskretne nacięcie między żebrami zapewniające minimalne obciążenie. Zwierzęta bardzo szybko wracają do zdrowia po operacji i nie wykazują wad ani zaburzonego gojenia. Za punkt odniesienia przyjmuje się dolną przestrzeń międzyżebrową. Biorąc to pod uwagę, prawidłowy i zróżnicowany dostęp do miejsca podwiązania dla modelu przewlekłego i niedokrwienno-reperfuzyjnego, nie rodzi poważnych problemów.
Sama ligatura stanowi najbardziej krytyczny krok. Lewa zstępująca tętnica wieńcowa jest trudna do uwidocznienia i często musi być związana bez widoku. Dlatego wskazane są pewne anatomiczne punkty odniesienia, aby pomóc chirurgowi w wykonaniu prawidłowego podwiązania. W przypadku modelu przewlekłego zawału ligaturę umieszcza się pośrodku brzusznej strony serca, między małżowiną uszną a wierzchołkiem, powyżej zakończenia głównej żyły przedniej (ryc. 2B). Wydajność można kontrolować, wizualizując wygląd szarego koloru w dotkniętych obszarach. Jeśli obszar zawału wydaje się być przedni i nie obejmuje tylnej ściany, nowy szew można założyć po lewej stronie pierwszego szwu. Główny korzeń LAD jest zawsze widoczny pod małżowiną uszną18, dlatego nie stwarza poważnych problemów z wykryciem tej części. Jednak małżowina uszna stwarza duże ryzyko krwawienia i należy się z nią obchodzić ostrożnie.
Procedura jest ograniczona przez istnienie odpowiedniego sprzętu. Respirator i odpowiedni system znieczulenia dla małych zwierząt są drogie i wymagają podłączenia do systemu gazowego i wentylacyjnego pomieszczenia. Ponadto konieczny jest ścisły nadzór nad zwierzętami w pierwszym tygodniu po zabiegu, aby wykryć możliwe objawy kliniczne. Aby zbadać czynność serca podczas eksperymentu, wymagane są badania ultrasonograficzne o wysokiej rozdzielczości, złożony system perfuzji Langendorfa lub pomiary małego cewnika dokomorowego, co wiąże się z wysokimi kosztami i dodatkową wiedzą specjalistyczną.
Biorąc pod uwagę zawał mięśnia sercowego, nie ma dostępnych alternatywnych metod odtwarzania złożoności zdarzeń in vitro. W zależności od interesującego nas miejsca, perfuzja ex vivo izolowanego serca w systemie Langendorffa dostarcza informacji o kurczliwości, funkcji serca i żywotności mięśnia sercowego w odpowiedzi na różne bodźce lub leki. Wyklucza jednak wszelkie ingerencje składników krwi i układu odpornościowego i nie jest wskazany do długich badań nad przebudową i gojeniem po zawale mięśnia sercowego.
Po wykonaniu zabiegu zawału mięśnia sercowego można przeprowadzić wszystkie inne analizy funkcjonalne, takie jak pomiary ciśnienia dokomorowego, ultrasonografia (systemy ultrasonograficzne dla małych zwierząt) lub izolowana perfuzja Langendorffa serca. Co więcej, wszystkie analizy biologiczne i molekularne mogą być wykonywane w celu identyfikacji komórek, białek, mRNA, mikroRNA, genów lub innych biomarkerów, które mogą być wykorzystane jako cele terapeutyczne do opracowania nowych strategii leczenia zawału mięśnia sercowego.

Zawał mięśnia sercowego jest jedną z głównych przyczyn zgonów w krajach uprzemysłowionych. Pomimo niezaprzeczalnego postępu w zakresie metod diagnostycznych i terapeutycznych, choroby układu krążenia nadal są główną przyczyną śmiertelności. Biorąc pod uwagę poprawę średniej długości życia i zagrożeń związanych z życiem, w przyszłości spodziewany jest ciągły wzrost zachorowalności na choroby sercowo-naczyniowe. W związku z tym istnieje silna potrzeba ustanowienia i walidacji nowych podejść do leczenia chorób sercowo-naczyniowych. Informacje z badań na ludziach cierpią z powodu swoich ograniczeń, badania te są na ogół niewystarczające do wyjaśnienia i zrozumienia mechanizmów na poziomie molekularnym, nie będąc w stanie zapewnić rozwiązań tych głównych problemów zdrowotnych.
Ponadto, badania podstawowe zostały ograniczone ze względu na złożoność i trudności w odtworzeniu mechanizmów chorób sercowo-naczyniowych w laboratorium. Dlatego, aby poszerzyć naszą wiedzę na temat patofizjologii chorób sercowo-naczyniowych, niezbędna jest walidacja modeli zwierzęcych1,2. Jednak, aby zidentyfikować wszystkie kaskady zdarzeń molekularnych zaangażowanych w gojenie po zawale mięśnia sercowego, konieczna jest analiza w różnych punktach czasowych, co powoduje dużą liczbę eksperymentów na zwierzętach.
Eksperymenty z zawałem mięśnia sercowego są często przeprowadzane przy użyciu modeli zwierzęcych. Indukowanie zawału mięśnia sercowego u małych zwierząt3-11 jest najbardziej odpowiednim i skutecznym modelem stosowanym do badania zdarzeń komórkowych i molekularnych niż duże modele zwierzęce. Co więcej, żaden inny gatunek nie wykazuje takiej dostępności szczepów transgenicznych lub nokautujących jak myszy12. Te mysie modele są bardzo przydatne w innych chorobach, w tym patologiach sercowo-naczyniowych (takich jak miażdżyca, restenoza stentu)13,14. Ponadto krótki okres ciąży i duża liczba potomstwa kwalifikują modele mysie jako najbardziej atrakcyjny system do badania mechanizmów molekularnych zawału mięśnia sercowego12.
Niemniej jednak, wielkość serca u myszy oczekuje wysokiej precyzji manipulacji podczas mikrochirurgii. Szkolenie tak wykwalifikowanego i wykwalifikowanego personelu chirurgicznego jest procesem czasochłonnym i pracochłonnym. Dlatego przedstawiamy tutaj szczegółową procedurę mikrochirurgiczną, w tym wskazówki i porady, które pomogą współpracownikom nawet o przeciętnych kwalifikacjach, takim jak studenci lub technicy, wykonać złożony model zawału mięśnia sercowego u myszy.
Początkowo intubacja odbywa się za pomocą krótkiej kaniuli bez użycia tracheotomii. Nacięcie klatki piersiowej znajduje się w obszarze międzyżebrowym, co pozwala uniknąć uszkodzenia żeber i/lub otaczających tkanek. Ten podetap jest bardzo istotny, aby zapewnić szybki powrót do zdrowia i gojenie15. Podwiązanie jest zróżnicowane dla modeli przewlekłego niedokrwienia i niedokrwienia/reperfuzji, co zapewnia wysoki wskaźnik przeżycia przy jednoczesnym zachowaniu znacznego rozmiaru zawału. Z naszego doświadczenia wynika, że stosowanie szwów jedwabnych zapewnia wyższą powtarzalność w porównaniu z kriourazami16.
Podsumowując, opisana tutaj metoda ma zastosowanie zarówno w modelach przewlekłego niedokrwienia, jak i niedokrwienia/reperfuzji u małych zwierząt. Porady i wskazówki przedstawione w tej procedurze mają na celu umożliwienie personelowi o nawet niskich lub średnich kwalifikacjach zastosowania jej w modelach małych zwierząt.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZ/X9</td><td></td></tr><tr><td>Wentylator myszy</td><td>Aparat Harvard</td> Model <td>730043</td> Podwójny system anestezjologiczny <td>Minient 845</td></tr><tr><td>(wersja stołowa)</td><td>Aparat</td><td></td> Harvard <td>Samodzielna jednostka anestezjologiczna na bazie izofluranu do użytku na stołach laboratoryjnych, o kompaktowej powierzchni 8 "x 11".</td></tr><tr><td>Kaniula intubacyjna</td><td>Aparat Harvard 732737</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>FST, Niemcy</td><td>9119700</td><td>standardowa końcówka zakrzywiona 0,17 mm x 0,1 mm</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>FST, Niemcy</td><td>9146011</td><td>proste</td></tr><tr><td>nożyczki Vannas</td><td>Aesculap, Niemcy</td><td>OC 498 R</td><td></td></tr><tr><td>Retraktory</td><td>FST, Niemcy</td><td>1820010</td><td>Zwijacze o szerokości 2,5 mm</td></tr><tr><td></td><td>FST, Niemcy</td><td>1820011</td><td>szerokość 5 mm</td></tr><tr><td>Uchwyty druciane</td><td>FST, Niemcy</td><td>1820005</td><td>&nbsp; 10 cm</td></tr><tr><td>Uchwyty druciane</td><td>FST, Niemcy</td><td>1820006</td><td>&nbsp; 14 cm</td></tr><tr><td>Ketamina 10%</td><td>CEVA, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna 2%</td><td>Medistar, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bepanthene krem pod oczy i nos</td><td>Bayer, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurka silikonowa</td><td>IFK Isofluor, Niemcy</td><td>na zamówienie&nbsp;</td><td>średnica produktu 500 &mikro; m</td></tr><tr><td>grubość przekroju 100 &mikro; m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cewnik</td><td></td><td></td><td></td>politetrafluoroetylenowy</tr><tr><td>Szew PROLENE 6/0&nbsp;</td><td>ETHICON</td><td>8707H</td><td>polipropylenowy szew monofilamentowy, niewchłanialny, igła CC1, 13 mm, 3/8 Circle</td></tr><tr><td>7/0 Silk</td><td>Seraflex</td><td>IC 1005171Z</td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwięki&nbsp;</td><td>Vevo, Kanada</td><td>770 Vevo</td><td></td></tr></tbody></table>

minimalnie inwazyjny zabieg chirurgiczny indukcji zawału mięśnia sercowego u myszy

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Zawał mięśnia sercowego nadal pozostaje główną przyczyną zgonów w krajach zachodnich, pomimo znacznego postępu w dziedzinie rozwoju stentów w ostatnich dziesięcioleciach. W celu wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw i opracowania nowych strategii terapeutycznych dostępność odpowiednich modeli zwierzęcych jest obowiązkowa. Ponieważ do walki z zawałem mięśnia sercowego potrzebne są nowe informacje na temat patomechanizmów chorób sercowo-naczyniowych w warunkach in vivo, kluczowym aspektem jest trafność modelu zwierzęcego. W tym kontekście bardzo istotna jest jednak ochrona zwierząt. Dlatego tworzymy minimalnie inwazyjny i prosty model zawału mięśnia sercowego u myszy, który zapewnia wysoką odtwarzalność i przeżywalność zwierząt. Tym samym model ten spełnia wymagania zasady 3R (Replacement, Refinement and Reduction) dla doświadczeń na zwierzętach i zapewnia informacje naukowe potrzebne do dalszego rozwoju strategii terapeutycznych w chorobach sercowo-naczyniowych.

Procedura wywołania zawału mięśnia sercowego trwa od 25 do 30 min, a śmiertelność wynosi 10%. Po zabiegu myszy budzą się z narkozy w ciągu kolejnych 15 min. U operowanych myszy nie zaobserwowano upośledzenia sprawności fizycznej. Istnieje jednak wyższe ryzyko pęknięcia serca tydzień po przewlekłym zawale mięśnia sercowego, jeśli procesy naprawcze zostaną zaburzone w fazie zapalnej. Ponieważ serce potrafi znacząco zmieniać swoje wymiary podczas pompowania, istotne jest, aby wszystkie pobrane serca zostały zatrzymane w tej samej pozycji, na przykład w rozkurczu. Można to osiągnąć poprzez perfuzję serca nasyconym roztworem KCl. Zwiększone stężenie K+ w przestrzeni pozakomórkowej blokuje pompy jonowe i obniża potencjał spoczynkowy błony komórek serca, co prowadzi do zatrzymania aktywności serca w rozkurczu.
Obszar zawału można zaobserwować w analizie ultrasonograficznej (Rysunek 3A, dolny panel). W porównaniu do prawidłowego mięśnia sercowego, obszary niedokrwienne wydają się cienkie i hipokinetyczne (Rysunek 3A, górny panel). W zależności od zastosowanego modelu wielkość zawału będzie się różnić. Przewlekły model zawału indukuje kolisty, transmuralny zawał wierzchołka (Rysunek 3B), podczas gdy model niedokrwienia/reperfuzji indukuje cienki zawał w obrębie środkowej ściany w całym sercu (Rysunek 3C). Istnieje wiele metod określania wielkości zawału. Jeśli celem jest analiza bezpośredniego wpływu na żywotność serca, wskazane jest przeprowadzenie barwienia Evans-Blue/TTC18 co najmniej 2 godziny po reperfuzji, aby móc zaobserwować wszelkie zmiany w mięśniu sercowym. Przekroje można analizować natychmiast (Rysunek 3B, środkowy panel) po barwieniu lub przechowywać między szkiełkami w formalinie przez 2-3 dni (Rysunek 3C, środkowy panel). Niebieski obszar reprezentuje zdrowe mięśnie sercowe, nieobjęte niedokrwieniem. Czerwony obszar reprezentuje żywotny mięsień sercowy w obrębie obszaru niedokrwiennego (mięsień zagrożony), a biały obszar reprezentuje martwą tkankę. Zazwyczaj wielkość zawału wyraża się jako procent obszaru zagrożonego.
Dojrzałą bliznę powstałą w wyniku procesów przebudowy można łatwo zmierzyć za pomocą immunohistochemii, stosując jednokrokową metodę barwienia Gomori. Niebiesko zabarwione obszary zawałowe oraz czerwono zabarwione zdrowe obszary komory (Rysunek 3B oraz C, panele prawe) są wyznaczane w pierwszym przekroju z każdego poziomu, aż do zastawki mitralnej. Aby uniknąć zmienności wynikającej z wiązania LAD na różnych poziomach, bierze się pod uwagę zawał ze wszystkich przekrojów i wyraża go jako procent całkowitej objętości lewej komory. W modelu zawału przewlekłego można uzyskać objętość zawału rzędu 15-20%, a w modelu niedokrwienia/reperfuzji 10-15%. Ponadto model zawału przewlekłego indukuje nasilone rozszerzenie, którego nie obserwuje się w modelu niedokrwienia/reperfuzji (Rysunek 3B oraz C, panel prawy).
Można zastosować konwencjonalne procedury barwienia, takie jak: barwienie CD31 w celu uwidocznienia angiogenezy (czerwony, Rysunek 4A) lub barwienie na aktynę mięśni gładkich w celu zidentyfikowania myofibroblastów (zielony, Rysunek 4B). Można również zastosować podwójne barwienie fluorescencyjne w celu identyfikacji różnych cząsteczek docelowych w obszarze zawału, ponieważ brak kardiomiocytów sprawia, że nie występuje autofluorescencja immunologiczna (Rysunek 4C).
<img alt="Ilustracje operacji serca myszy; schematy przedstawiające nacięcie i zawał w badaniach nad LAD." src="/files/ftp_upload/52197/52197fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Nacięcie w linii pośrodkowej i wprowadzenie kaniuli intubacyjnej (A). Wizualizacja stereomikroskopowa metalowej kaniuli przez prześwit tkanki (B). Wskazano pierścienie tchawicy (niebieskie strzałki) oraz kaniulę (czarna strzałka). Nacięcie międzyżebrowe dla modelu przewlekłego zawału i podwiązanie LAD (C). Podwiązanie znajduje się w środkowej części serca (pomiędzy uszkiem a wierzchołkiem, kolor czarny na dolnym panelu), przyjmując za punkt odniesienia koniec żyły (schemat na niebiesko, dolny panel). Obie gałęzie tętnicy powinny zostać podwiązane (kolor czerwony na dolnym panelu). Kolor szary oznacza obszar zawału, który pojawia się w dolnej połowie serca (prawy dolny panel). Podwiązanie dla modelu niedokrwienia/reperfuzji wykonuje się pod uszkiem, wiążąc główny pień LAD (kolor czerwony na dolnym panelu) nad rurką silikonową (prawa strona) (D). Kolor szary oznacza obszar zawału, który obejmuje całe serce (prawy dolny panel). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52197/52197fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schematy szwów chirurgicznych A, B oraz obrazy C szwów żeber, mięśni i skóry do celów badań medycznych." src="/files/ftp_upload/52197/52197fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Szew żeber zamyka nacięcie klatki piersiowej, jeśli szwy przyśrodkowe są ustawione pod kątem 90° zarówno w modelu przewlekłym (A), jak i w modelu niedokrwienia/reperfuzji (B, panel lewy). Obrazowanie in vivo szwu żeber (C, panel lewy), szwu mięśniowego (C, panel środkowy) oraz szwu skóry (C, panel prawy). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52197/52197fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Ultradźwięki serca prawidłowego i zzawałowanego; schemat zawału przewlekłego, niedokrwienia/reperfuzji, wyniki barwienia TTC i Gomoriego." src="/files/ftp_upload/52197/52197fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Obrazy echokardiograficzne. Obrazy obszarów prawidłowych (A, górny panel) oraz zzawałowanych (A, dolny panel) wykonane w osi długiej (podłużnie, lewe panele) lub w osi krótkiej (poprzecznie, prawe panele). Zawał wywołany przewlekłym podwiązaniem (B) oraz jedną godziną niedokrwienia z następującą po niej reperfuzją (C). Barwienie błękitem Evansa/TTC pozwala na identyfikację obszarów ukrwionych (niebieskich) i nieukrwionych, a także żywotnego (czerwonego) i martwego (białego) mięśnia sercowego (B, C, środkowe panele). Jednoetapowe barwienie metodą Gomoriego umożliwia identyfikację obszarów zzawałowanych (niebieskich) i odróżnienie ich od regionów prawidłowych (czerwonych) (B, C, prawe panele). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52197/52197fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii immunofluorescencyjnej pokazujące CD31 i aktynę mięśni gładkich z nakładką DAPI." src="/files/ftp_upload/52197/52197fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: W obszarze zawału można przeprowadzić różne barwienia, takie jak barwienie na CD31 w celu opisania neoangiogenezy (A, czerwony, pojedyncze strzałki), lub na aktynę mięśni gładkich dla miofibroblastów (B, zielony, pojedyncze strzałki), a także barwienie podwójne (C, CD31-czerwony/aktyna mięśni gładkich-zielony), z przeciwbarwieniem jąder DAPI (niebieski). Miofibroblasty można łatwo odróżnić od komórek mięśni gładkich małych lub dużych tętnic, którym zawsze towarzyszy warstwa śródbłonka (C, strzałki). Podwójne strzałki wskazują autofluorescencję erytrocytów. Pasek skali 50 µm.

Opisano wysoce powtarzalny model zawału mięśnia sercowego u myszy z minimalnymi inwazyjnymi manipulacjami. Model można łatwo wykonać, co skutkuje wysoką odtwarzalnością i wskaźnikiem przeżycia. W związku z tym opisany model zmniejszy liczbę wymaganych zwierząt, zgodnie z zasadą 3R (Replacement, Refinement and Reduction).

Minimalnie inwazyjny zabieg chirurgiczny indukcji zawału mięśnia sercowego u myszy

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie wysoce powtarzalnego zawału mięśnia sercowego u myszy za pomocą minimalnie inwazyjnych manipulacji. Osiąga się to poprzez intubację pod mikroskopem stereoskopowym w celu kontrolowania pozycji kaniuli intubacyjnej podczas zabiegu. W drugim etapie wykonuje się dyskretne boczne lewe nacięcie między żebrami, aby otworzyć klatkę piersiową i ułatwić szybkie gojenie.Podwiązanie lewej zstępującej tętnicy wieńcowej jest następnie umieszczane zgodnie z odpowiednią manipulacją w dół. Ostatecznie wielkość i kształt zawału można ocenić za pomocą standardowej analizy morfometrycznej immunohisto. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że jest minimalnie inwazyjna, wysoce powtarzalna i łatwa do wykonania, co umożliwia badaczom z nawet minimalnym doświadczeniem w stosowaniu metody w małych modelach zwierzęcych.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ rozmiar serca myszy wymaga dużej precyzji manipulacji. Podczas mikrochirurgii. Zacznij od umieszczenia znieczulonego ośmio- do 10-tygodniowego samca, myszy typu dzikiego C 57 BL six w pozycji leżącej na rozgrzanym stole operacyjnym.Po potwierdzeniu odpowiedniego poziomu sedacji przez uszczypnięcie palca u nogi, nałóż na zwierzę maść do oczu i za pomocą małej brzytwy usuń włosy z brzusznej okolicy szyi, a lewą połowę klatki piersiowej zdezynfekuj skórę 70% etanolem i skórą właściwą. Następnie wykonaj małe 0,5-centymetrowe środkowe nacięcie na środku szyi. Po znalezieniu się pod skórą przełóż parę sterylnych zakrzywionych kleszczy przez dwa ciała tłuszczowe, aby ułatwić wizualizację tchawicy przez mięsień pokrywający.Za pomocą mikroskopu stereoskopowego wprowadzić doustnie kaniulę intubacyjną do tchawicy. Kaniulę należy obserwować przez przezroczystą tkankę. Po potwierdzeniu prawidłowego umieszczenia instrumentu podłącz kaniulę do respiratora dla małych zwierząt i dostosuj ustawienia wentylacji do objętości oddechowej od 100 do 150 mikrolitrów i częstości oddechów od 100 do 150 aspiracji na minutę, aby wywołać zawał mięśnia sercowego.Następnie wykonaj nacięcie o długości mniejszej niż 0,5 centymetra w skórze między wyrostkiem mieczykowatym a lewym Xi.Następnie za pomocą kleszczy oddziel warstwę mięśniową od leżących poniżej żeber w przypadku przewlekłego zawału. Wykonaj nacięcie w piątej przestrzeni międzyżebrowej dla modelu reperfuzji niedokrwiennej. Wykonaj nacięcie w czwartej przestrzeni międzyżebrowej.Następnie umieść retraktory w nacięciu, aby otworzyć klatkę piersiową i uwidocznić serce. Następnie ostrożnie usuń osierdzie, aby zapobiec nadmiernym procesom zwłóknieniowym i uwidocznić lewą zstępującą tętnicę wieńcową jako głęboko osadzone jasnoczerwone naczynie. W przypadku modelu przewlekłego zawału umieść ligaturę pośrodku brzusznej strony serca między wyrocznią a wierzchołkiem, używając lewej zstępującej tętnicy wieńcowej jako odniesienia.Następnie, aby uzyskać przezścienny przedni i tylny zawał, użyj jedwabnego szwu zero seven, aby związać obie gałęzie tętnicy. W przypadku modelu reperfuzji niedokrwiennej umieść ligaturę pod wyrocznią i nad silikonową rurką oraz głównym korpusem lewej zstępującej tętnicy wieńcowej. W okresie niedokrwienia należy założyć szwy skroniowe na żebra, zwilżając szwy kompresem, aby uniknąć wysuszenia tkanki.Następnie po niedokrwieniu wyjmij silikonową rurkę i przetnij szew małymi nożyczkami, aby uwidocznić reperfuzję. Po wywołaniu zawału należy napełnić klatkę piersiową ciepłym izotonicznym roztworem soli, aby usunąć resztki powietrza. Następnie zamknij klatkę piersiową za pomocą 3 0 6 szwów, ustawiając szwy przyśrodkowe pod kątem 90 stopni, aby zapewnić szczelne zamknięcie żeber.Zamknij warstwę mięśniową dwoma szwami, a następnie zamknij skórę trzema lub czterema szwami, jeśli to konieczne. Następnie odłącz kaniulę intubacyjną od respiratora, aby umożliwić spontaniczny oddech oznaczający mysz w celu późniejszej identyfikacji, i umieść zwierzę pod czerwoną lampą, aż się obudzi. Aby przeanalizować dane dotyczące zawału mięśnia sercowego, regularnie monitoruj frakcję wyrzutową, frakcyjne skrócenie pojemności minutowej serca i wymiary serca za pomocą echokardio.W końcowym punkcie eksperymentu otwórz klatkę piersiową i wytnij serce. Umieść chusteczkę w sterylnym PBS w celu intensywnego umycia. Następnie, gdy cała krew zostanie usunięta, zatrzymaj rozkurcz serca nasyconym roztworem chlorku potasu i utrwal tkankę w 10% formalinie na noc.Osadź cienką część tkanki serca w parafinie, umieszczając końcówkę serca na dole bloku montażowego, aby umożliwić poprzeczne przecięcie tkanki. Następnie zbierz 20 szeregowych odcinków o wielkości pięciu mikronów, odrzucając kolejne 300 mikronów. Kontynuuj zbieranie skrawków o grubości 25 mikronów co 300 mikronów, aż do osiągnięcia poziomu zastawki mitralnej.Następnie użyj jednoetapowego barwienia Moriego, aby zmierzyć rozmiar zawału tkanki, aby wykonać barwienie TTC. Odbuduj ligaturę i użyj kaniuli aortalnej, aby perfronować serce za pomocą 200 mikrolitrów 1% niebieskiego roztworu Evansa i zamroź serce w małej plastikowej torbie w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza bez mycia. Po dwóch godzinach za pomocą ostrego skalpela zbierz pięć poprzecznych odcinków z tkanki i inkubuj je przez 10 do 15 minut.W roztworze TTC w temperaturze 37 stopni Celsjusza zgodnie z instrukcją producenta. Po kolejnym 10-minutowym utrwaleniu w 10% formalinie, przenieś skrawki na szklane szkiełka mikroskopowe. Do analizy histologicznej.W zależności od zastosowanego modelu rozmiar zawału będzie się różnił. Model przewlekłego zawału indukuje kolisty zawał przezścienny wierzchołka, podczas gdy model reperfuzji niedokrwiennej indukuje cienką środkową ścianę w całym sercu. Aby przeanalizować bezpośredni wpływ zawału na żywotność serca, barwienie TTC metodą Evansa można zastosować do ujawnienia zdrowego mięśnia sercowego niedotkniętego niedokrwieniem na niebiesko, żywego zagrożonego mięśnia sercowego wewnątrz obszaru niedokrwiennego na czerwono i martwej tkanki na biało.Zwykle wielkość zawału jest wyrażona jako procent obszaru ryzyka Maorysów. Barwienie jednoetapowe umożliwia pomiar dojrzałej blizny, która powstaje w wyniku procesu przebudowy, z zabarwionymi na niebiesko, zawałowymi i czerwonymi obszarami komorowymi analizowanymi w pierwszej sekcji z każdego poziomu tkanki serca nabytej przed zastawką mitralną. Zawał ze wszystkich odcinków jest następnie wyrażany jako procent całkowitej objętości lewej komory.Konwencjonalne procedury barwienia można również wykonać, na przykład na tych obrazach. Barwienie CD 31 i aktyny mięśni gładkich zastosowano w celu ujawnienia obecności odpowiednio angiogenezy i miofibroblastów w tkance zawału. Użyj barwienia podwójnie fluorescencyjnego, aby zidentyfikować różne cząsteczki docelowe w obszarze zawału, ponieważ przy braku kardiomiocytów nie obserwuje się autofluorescencji.Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w 25, 30 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Konieczne jest odpowiednie leczenie bólu, aby zapewnić wysoką odtwarzalność Po tej procedurze. Można przeprowadzić inną analizę funkcjonalną, taką jak pomiary dokomorowe, pomiary ciśnienia, ultradźwięki lub izolowane płuca serca.Koniec perfuzji.

minimal-invasive-surgical-procedure-inducing-myocardial-infarction

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W badaniach nad ostrym uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym oraz przewlekłym przebudowywaniem serca u myszy, w wymiarze czasowym nanosi się liczne manipulacje genetyczne i/lub wewnątrzmięśniowe iniekcje genów, białek, komórek i/lub biomateriałów. Niniejsze wideo ilustruje mikrosurgicalne procedury stosowane w badaniach nad niedokrwieniem/reperfuzją, trwałą ligacją tętnicy wieńcowej oraz iniekcjami wewnątrzmięśniowymi.

Podwiązanie tętnicy wieńcowej i wtryskiwanie domięśniowe w mysim modelu zawału

Procedura chirurgiczna stosowana w celu wywołania eksperymentalnego zawału mięśnia sercowego u myszy rozpoczyna się od lewej torakotomii między trzecim a czwartym żebrem, aby umożliwić wizualizację przedniej powierzchni serca i lewego płuca. Następnie podwiązuje się lewą tętnicę wieńcową, zamyka klatkę piersiową i pozostawia mysz do samoistnego powrotu do sprawności.

Zmodyfikowana technika ligacji tętnicy wieńcowej u myszy

W tym filmie opisujemy zabieg chirurgiczny polegający na wygenerowaniu mysiego modelu zawału mięśnia sercowego poprzez trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej.

Generowanie mysiego modelu zawału mięśnia sercowego: zabieg chirurgiczny trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej w modelu mysim

Wprowadzamy metodę chirurgiczną do wywoływania eksperymentalnego uszkodzenia niedokrwienia/reperfuzji (I/R) symulującego zawał mięśnia sercowego (MI) w modelach mysich, co pozwala na większą przejrzystość w umiejscowieniu podwiązania na lewej tętnicy zstępującej przedniej (LAD) w celu zwiększenia powtarzalności eksperymentów MI u myszy.

Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego poprzez podwiązanie lewej tętnicy zstępującej przedniej

Zapewniamy niezawodną metodę podwiązania lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD) w modelu mysim. Metoda ta jest stosunkowo mniej inwazyjna niż inne metody, obejmujące intubację dotchawiczą, lewostronną torakotomię i toracentezę. Metoda ta może być stosowana jako model zarówno dla ostrego, jak i przewlekłego zawału mięśnia sercowego (MI).

Podwiązanie tętnicy wieńcowej lewej lewej przedniej zstępującej (LAD): ulepszony i uproszczony model zawału mięśnia sercowego

Tutaj opisujemy zabieg chirurgiczny pokazujący, jak osiągnąć trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy. Model ten ma duże znaczenie dla badania patofizjologii zawału mięśnia sercowego i towarzyszących mu procesów biologicznych.

Mysi model zawału mięśnia sercowego z wykorzystaniem trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej

Ten artykuł przedstawia skuteczną metodę przeprowadzenia niedokrwienia mięśnia sercowego i następującej po nim przewlekłej reperfuzji u szczurów przy użyciu minimalnie inwazyjnego podejścia. Ponadto funkcję hemodynamiczną lewej komory szczurów ocenia się za pomocą echokardiografii i izolowanych metod pracy serca.

Półminimalnie inwazyjna metoda indukcji zawału mięśnia sercowego u szczurów i ocena czynności serca przez izolowany działający układ serca

Pod odpowiednim znieczuleniem, serce myszy zostało uzewnętrznione przez przestrzeń międzyżebrową, a zawał mięśnia sercowego został skutecznie wywołany przez podwiązanie lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD) przy użyciu materiałów łatwo dostępnych w większości laboratoriów.

Zmodyfikowana prosta metoda indukcji zawału mięśnia sercowego u myszy

Tutaj opisujemy prostą i powtarzalną metodę, która może wywołać zawał mięśnia sercowego lub uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne mięśnia sercowego u myszy poprzez precyzyjne podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej za pomocą mikromanipulacji.

Indukcja zawału mięśnia sercowego i uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego u myszy

Dostarczanie komórek pod kontrolą ultradźwięków w miejscu zawału mięśnia sercowego u myszy jest bezpiecznym, skutecznym i wygodnym sposobem przeszczepu komórek.

Indukowana ultradźwiękami indukowana pluripotencjalna implantacja kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych u myszy z zawałem mięśnia sercowego

Przedstawiono tutaj zabieg chirurgiczny trwałego podwiązania lewej tętnicy wieńcowej u myszy. Model ten można wykorzystać do zbadania patofizjologii i związanej z nią odpowiedzi zapalnej po zawale mięśnia sercowego.

Podwiązanie lewej tętnicy wieńcowej: chirurgiczny mysi model zawału mięśnia sercowego

Poznaj minimalnie inwazyjną metodę indukcji zawału mięśnia sercowego u myszy. Technika zapewnia wysoką powtarzalność, przeżywalność zwierząt i zgodność z zasadą 3R w badaniach kardiologicznych.

Minimalnie inwazyjny zabieg chirurgiczny indukcji zawału mięśnia sercowego u myszy

Przeglądaj więcej filmów