Minimalnie inwazyjny zabieg chirurgiczny indukcji zawału mięśnia sercowego u myszy

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie wysoce powtarzalnego zawału mięśnia sercowego u myszy za pomocą minimalnie inwazyjnych manipulacji. Osiąga się to poprzez intubację pod mikroskopem stereoskopowym w celu kontrolowania pozycji kaniuli intubacyjnej podczas zabiegu. W drugim etapie wykonuje się dyskretne boczne lewe nacięcie między żebrami, aby otworzyć klatkę piersiową i ułatwić szybkie gojenie.

Podwiązanie lewej zstępującej tętnicy wieńcowej jest następnie umieszczane zgodnie z odpowiednią manipulacją w dół. Ostatecznie wielkość i kształt zawału można ocenić za pomocą standardowej analizy morfometrycznej immunohisto. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że jest minimalnie inwazyjna, wysoce powtarzalna i łatwa do wykonania, co umożliwia badaczom z nawet minimalnym doświadczeniem w stosowaniu metody w małych modelach zwierzęcych.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ rozmiar serca myszy wymaga dużej precyzji manipulacji. Podczas mikrochirurgii. Zacznij od umieszczenia znieczulonego ośmio- do 10-tygodniowego samca, myszy typu dzikiego C 57 BL six w pozycji leżącej na rozgrzanym stole operacyjnym.

Po potwierdzeniu odpowiedniego poziomu sedacji przez uszczypnięcie palca u nogi, nałóż na zwierzę maść do oczu i za pomocą małej brzytwy usuń włosy z brzusznej okolicy szyi, a lewą połowę klatki piersiowej zdezynfekuj skórę 70% etanolem i skórą właściwą. Następnie wykonaj małe 0,5-centymetrowe środkowe nacięcie na środku szyi. Po znalezieniu się pod skórą przełóż parę sterylnych zakrzywionych kleszczy przez dwa ciała tłuszczowe, aby ułatwić wizualizację tchawicy przez mięsień pokrywający.

Za pomocą mikroskopu stereoskopowego wprowadzić doustnie kaniulę intubacyjną do tchawicy. Kaniulę należy obserwować przez przezroczystą tkankę. Po potwierdzeniu prawidłowego umieszczenia instrumentu podłącz kaniulę do respiratora dla małych zwierząt i dostosuj ustawienia wentylacji do objętości oddechowej od 100 do 150 mikrolitrów i częstości oddechów od 100 do 150 aspiracji na minutę, aby wywołać zawał mięśnia sercowego.

Następnie wykonaj nacięcie o długości mniejszej niż 0,5 centymetra w skórze między wyrostkiem mieczykowatym a lewym Xi.Następnie za pomocą kleszczy oddziel warstwę mięśniową od leżących poniżej żeber w przypadku przewlekłego zawału. Wykonaj nacięcie w piątej przestrzeni międzyżebrowej dla modelu reperfuzji niedokrwiennej. Wykonaj nacięcie w czwartej przestrzeni międzyżebrowej.

Następnie umieść retraktory w nacięciu, aby otworzyć klatkę piersiową i uwidocznić serce. Następnie ostrożnie usuń osierdzie, aby zapobiec nadmiernym procesom zwłóknieniowym i uwidocznić lewą zstępującą tętnicę wieńcową jako głęboko osadzone jasnoczerwone naczynie. W przypadku modelu przewlekłego zawału umieść ligaturę pośrodku brzusznej strony serca między wyrocznią a wierzchołkiem, używając lewej zstępującej tętnicy wieńcowej jako odniesienia.

Następnie, aby uzyskać przezścienny przedni i tylny zawał, użyj jedwabnego szwu zero seven, aby związać obie gałęzie tętnicy. W przypadku modelu reperfuzji niedokrwiennej umieść ligaturę pod wyrocznią i nad silikonową rurką oraz głównym korpusem lewej zstępującej tętnicy wieńcowej. W okresie niedokrwienia należy założyć szwy skroniowe na żebra, zwilżając szwy kompresem, aby uniknąć wysuszenia tkanki.

Następnie po niedokrwieniu wyjmij silikonową rurkę i przetnij szew małymi nożyczkami, aby uwidocznić reperfuzję. Po wywołaniu zawału należy napełnić klatkę piersiową ciepłym izotonicznym roztworem soli, aby usunąć resztki powietrza. Następnie zamknij klatkę piersiową za pomocą 3 0 6 szwów, ustawiając szwy przyśrodkowe pod kątem 90 stopni, aby zapewnić szczelne zamknięcie żeber.

Zamknij warstwę mięśniową dwoma szwami, a następnie zamknij skórę trzema lub czterema szwami, jeśli to konieczne. Następnie odłącz kaniulę intubacyjną od respiratora, aby umożliwić spontaniczny oddech oznaczający mysz w celu późniejszej identyfikacji, i umieść zwierzę pod czerwoną lampą, aż się obudzi. Aby przeanalizować dane dotyczące zawału mięśnia sercowego, regularnie monitoruj frakcję wyrzutową, frakcyjne skrócenie pojemności minutowej serca i wymiary serca za pomocą echokardio.

W końcowym punkcie eksperymentu otwórz klatkę piersiową i wytnij serce. Umieść chusteczkę w sterylnym PBS w celu intensywnego umycia. Następnie, gdy cała krew zostanie usunięta, zatrzymaj rozkurcz serca nasyconym roztworem chlorku potasu i utrwal tkankę w 10% formalinie na noc.

Osadź cienką część tkanki serca w parafinie, umieszczając końcówkę serca na dole bloku montażowego, aby umożliwić poprzeczne przecięcie tkanki. Następnie zbierz 20 szeregowych odcinków o wielkości pięciu mikronów, odrzucając kolejne 300 mikronów. Kontynuuj zbieranie skrawków o grubości 25 mikronów co 300 mikronów, aż do osiągnięcia poziomu zastawki mitralnej.

Następnie użyj jednoetapowego barwienia Moriego, aby zmierzyć rozmiar zawału tkanki, aby wykonać barwienie TTC. Odbuduj ligaturę i użyj kaniuli aortalnej, aby perfronować serce za pomocą 200 mikrolitrów 1% niebieskiego roztworu Evansa i zamroź serce w małej plastikowej torbie w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza bez mycia. Po dwóch godzinach za pomocą ostrego skalpela zbierz pięć poprzecznych odcinków z tkanki i inkubuj je przez 10 do 15 minut.

W roztworze TTC w temperaturze 37 stopni Celsjusza zgodnie z instrukcją producenta. Po kolejnym 10-minutowym utrwaleniu w 10% formalinie, przenieś skrawki na szklane szkiełka mikroskopowe. Do analizy histologicznej.

W zależności od zastosowanego modelu rozmiar zawału będzie się różnił. Model przewlekłego zawału indukuje kolisty zawał przezścienny wierzchołka, podczas gdy model reperfuzji niedokrwiennej indukuje cienką środkową ścianę w całym sercu. Aby przeanalizować bezpośredni wpływ zawału na żywotność serca, barwienie TTC metodą Evansa można zastosować do ujawnienia zdrowego mięśnia sercowego niedotkniętego niedokrwieniem na niebiesko, żywego zagrożonego mięśnia sercowego wewnątrz obszaru niedokrwiennego na czerwono i martwej tkanki na biało.

Zwykle wielkość zawału jest wyrażona jako procent obszaru ryzyka Maorysów. Barwienie jednoetapowe umożliwia pomiar dojrzałej blizny, która powstaje w wyniku procesu przebudowy, z zabarwionymi na niebiesko, zawałowymi i czerwonymi obszarami komorowymi analizowanymi w pierwszej sekcji z każdego poziomu tkanki serca nabytej przed zastawką mitralną. Zawał ze wszystkich odcinków jest następnie wyrażany jako procent całkowitej objętości lewej komory.

Konwencjonalne procedury barwienia można również wykonać, na przykład na tych obrazach. Barwienie CD 31 i aktyny mięśni gładkich zastosowano w celu ujawnienia obecności odpowiednio angiogenezy i miofibroblastów w tkance zawału. Użyj barwienia podwójnie fluorescencyjnego, aby zidentyfikować różne cząsteczki docelowe w obszarze zawału, ponieważ przy braku kardiomiocytów nie obserwuje się autofluorescencji.

Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w 25, 30 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Konieczne jest odpowiednie leczenie bólu, aby zapewnić wysoką odtwarzalność Po tej procedurze. Można przeprowadzić inną analizę funkcjonalną, taką jak pomiary dokomorowe, pomiary ciśnienia, ultradźwięki lub izolowane płuca serca.

Koniec perfuzji.