Name: Wykrywanie glikogenu w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej za pomocą barwienia Schiffa kwasem okresowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Poznaj metodę barwienia Schiffa kwasem okresowym do wizualizacji glikogenu w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Technika ta umożliwia badanie składu polisacharydowego komórek immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało wsparte grantem z programu NSERC Discovery o numerze grantu RGPIN 418522-2013. Dziękujemy R. Kilgourowi za pomocne dyskusje oraz Katelin Gresty i dr A. Berghdalowi za dostarczenie sekcji mięśni myszy.

Badania z próbkami ludzkiej krwi zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersytetu Concordia, numer certyfikatu 10000618. Praca nad mięśniami myszy została zatwierdzona przez Concordia University Ethics Review Board, numer certyfikatu 2010BERG.
1. Izolacja PBMC z krwi pełnej
UWAGA: Przeprowadź tę procedurę w komorze bezpieczeństwa biologicznego, używając sterylnej techniki i sprzętu wysterylizowanego przez producenta.
<ol>
	<li>Ostrożnie wlej 10-15 ml krwi pełnej z probówek do pobierania krwi heparynizowanej (antykoagulantowej) do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. W przypadku drobnych rozlanych wycieków krwi przetrzyj ddH2O i 70% EtOH za pomocą chusteczki czyszczącej.</li>
	<li>Rozcieńczyć krew w stożkowej probówce w stosunku 1:1 roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS 1x) o pH 7,4. Upewnij się, że maksymalna całkowita objętość nie przekracza 30 ml.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać za pomocą serologicznego pistoletu do pipet, unikając pęcherzyków powietrza. 
	UWAGA: NIE mieszaj przez odwrócenie probówki, aby uniknąć gromadzenia się krwi w nasadce i późniejszego przesiąkania podczas wirowania.</li>
	<li>Dodać 13 ml Ficoll-paque (patrz tabela materiałów i wyposażenia) do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Trzymaj rurkę pionowo w stojaku.</li>
	<li>Za pomocą pipety transferowej pobrać rozcieńczoną krew, dotknąć końcówki pipety transferowej do wewnętrznej ścianki rurki w pobliżu góry. Z powolnym i stałym ciśnieniem przenieś krew wzdłuż wewnętrznej ścianki rurki, tworząc warstwę krwi na wierzchu warstwy sacharozy. Wykonaj ten krok kilka razy, aż cała krew zostanie przeniesiona.</li>
	<li>Szczelnie zamknij probówkę i odwiruj probówkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut przy 700 x g w wirniku obrotowym ze średnim przyspieszeniem ustawionym na 5 i opóźnieniem ustawionym na ZERO.</li>
	<li>Powoli wyjmij probówkę i nie naruszając warstw, zanieś ją z powrotem do szafki bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Ostrożnie zebrać kożuchową powłokę (cienką, mętną białą warstwę), w której znajdują się PBMC, umieszczoną między warstwami PBS/plazmy i fikolu za pomocą pipety transferowej. Unikaj zbierania warstwy sacharozy i nie naruszaj warstwy czerwonych krwinek.</li>
	<li>Przenieś kożuchową powłokę do nowej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Może minąć kilka razy powtórzenie kroku 1.8 w celu zebrania wszystkich PBMC.</li>
	<li>Dodać PBS pH 7,4 do probówki z PBMC i napełnić do oznaczenia 45 ml. Dokładnie wstrząśnij tubką. Nie wirować.</li>
	<li>Mycie 1: Wirować przez 15 minut przy 480 x g z maksymalnym przyspieszeniem i opóźnieniem ustawionym na 9. Obserwuj tworzenie się osadu PBMC na dnie stożkowej rurki.</li>
	<li>Wylać PBS (supernatant) do plastikowej zlewki z 10 ml wybielacza.</li>
	<li>Poluzuj granulat komórkowy, delikatnie "uderzając" o pofałdowaną powierzchnię (tj. Pusty stojak). Nie wirować.</li>
	<li>Do probówki dodać 25 ml świeżego PBS o pH 7,4. Jeśli przetwarzana jest więcej niż jedna probówka, na tym etapie połącz pelety.</li>
	<li>Mycie 2: Wirować probówkę przez 12 minut przy 480 x g z maksymalnym przyspieszeniem i opóźnieniem ustawionym na 9.</li>
	<li>Wylać PBS (supernatant) do plastikowej zlewki z odrobiną wybielacza.</li>
	<li>Delikatnie "stojak" na pofałdowanej powierzchni (tj. pustym stojaku). Nie wirować.</li>
	<li>Dodać 25 ml świeżego PBS do probówki.
	<ol>
		<li>Wyjmij 50 μl komórek i przenieś do probówki mikrowirówkowej w celu zliczenia żywotności.</li>
		<li>Dodać równą ilość (50 μl) błękitu trypanowego (barwnik o żywotności) i delikatnie wymieszać, pipetować w górę i w dół. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobrać 10 μl i przenieść je do hemocytometru, aby sprawdzić żywotność komórek na ml. Zapisać liczbę komórek/ml.</li>
	<li>Wyjmij żądaną ilość komórek i odwiruj probówkę przez 12 minut przy 480 x g z maksymalnym przyspieszeniem i opóźnieniem ustawionym na 9.</li>
	<li>Wylać PBS (supernatant) do zlewki z wybielaczem.</li>
	<li>Delikatnie "stojak" na pofałdowanej powierzchni (tj. pustym stojaku). Dodać 80 μl PBS do probówki.</li>
</ol>
2. Tworzenie ślizgu PBMC
<ol>
	<li>Umieścić 80 μl komórek na szkiełku mikroskopowym. Rozsmaruj kroplę za pomocą innego szkiełka lub umieść 2 krople po 40 μl każda na obu końcach szkiełka.</li>
	<li>Pozostaw szkiełko w komorze bezpieczeństwa biologicznego do wyschnięcia. Oznacz szkiełko ołówkiem po matowej stronie.</li>
</ol>
3. Ustalanie próbek na szkiełkach
<ol>
	<li>Przygotować roztwór utrwalający, mieszając 0,5 ml 37% formaldehydu z 4,5 ml 99% etanolu.</li>
	<li>Po wysuszeniu szkiełek należy wyjąć 2 ml świeżo przygotowanego roztworu utrwalającego i wylać go na szkiełko tak, aby pokryć całą powierzchnię szkiełka.</li>
	<li>Pozostaw roztwór na szkiełku na 1 minutę. Płucz szkiełko przez 1 minutę wodą z kranu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.</li>
</ol>
4. Przygotowanie roztworu amylazy do kontroli negatywnej
<ol>
	<li>Weź 0,25 g proszku amylazy i rozpuść w 50 ml wody destylowanej. Wlej roztwór do czystej zlewki o pojemności 100 ml.</li>
	<li>Zanurzyć szkiełko w zlewce w taki sposób, aby połowa szkiełka została poddana działaniu środka, a druga połowa pozostała niepoddana działaniu środka, a następnie inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej (rysunek 1C).</li>
	<li>Zanotuj, po której stronie szkiełka podawana jest amylaza. Narysuj linię na odwrocie szkiełka wskazującą granicę między leczeniem a kontrolą.</li>
	<li>Umyj szkiełka preparatem ddH2O, aby usunąć roztwór amylazy i pozostawić szkiełko do wyschnięcia na powietrzu.</li>
</ol>
5. Wykonaj barwienie i obrazowanie metodą Periodic Acid Schiff (PAS)
UWAGA: Odczynniki PAS są toksyczne przez wdychanie i są, więc kroki muszą być wykonane w dygestoriach chemicznych, a produkty przemiany materii muszą być odpowiednio zutylizowane zgodnie z wytycznymi instytucji.
<ol>
	<li>Umieść szkiełko na płaskiej powierzchni i wlej 1,50-2,00 ml roztworu kwasu okresowego na próbkę. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Opłucz szkiełka w kilku wsadach wody destylowanej.</li>
	<li>Wlać 1,50-2,00 ml odczynnika Schiffa na szkiełko i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min.</li>
	<li>Umyj szkiełko wodą destylowaną przez 5 minut i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Nałożyć 10 μl podłoża montażowego na szkiełko podstawowe i przykryć dwoma małymi szkiełkami nakrywkowymi lub nałożyć 50 μl i użyć jednego dużego szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Nałóż bezbarwny lakier do paznokci na krawędzie szkiełka nakrywkowego, pozostaw do wyschnięcia na noc.</li>
</ol>
6. Uzyskiwanie obrazów za pomocą mikroskopu dwuokularowego przy użyciu obiektywu 100X

<ol><li>Rich, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+machinery+of+keilin%27s+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">The molecular machinery of keilin's respiratory chain.</a> Biochem. Soc. Trans. 31 (Pt 6), 1095-1105 (2003).</li>
<li>Peter, J. B., Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Gillespie, C. A., Stempel, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiles+of+three+fiber+types+of+skeletal+muscle+in+guinea+pigs+and+rabbits%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiles of three fiber types of skeletal muscle in guinea pigs and rabbits).</a> Biochemistry. 11 (14), 2627-2633 (1972).</li>
<li>Jones, R. V., Goffi, G. P., Hutt, M. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+glycogen+content+in+various+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte glycogen content in various disease.</a> J. Clin. Pathol. 15 (1), 36-39 (1962).</li>
<li>Scott, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+in+human+peripheral+blood+leukocytes.+I.+characteristics+of+the+synthesis+and+turnover+of+glycogen+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Glycogen in human peripheral blood leukocytes. I. characteristics of the synthesis and turnover of glycogen in vitro.</a> J. Clin. Invest. 47 (2), 344-352 (1968).</li>
<li>Fedele, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((positive+index+of+lymphocytes+and+metabolic+control+in+insulin-treated+and+type+II+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabete+Metab%22%5BJournal%5D)">positive index of lymphocytes and metabolic control in insulin-treated and type II diabetes mellitus.</a> Diabete Metab. 9 (3), 188-192 (1983).</li>
<li>Brelińska-Peczalska, R., Mackiewicz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+peripheral+blood+granulocytes+and+lymphocytes+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Pol.Med.Sci.Hist.Bull%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of peripheral blood granulocytes and lymphocytes in patients with systemic lupus erythematosus.</a> Pol.Med.Sci.Hist.Bull. 15 (2), 231-234 (1976).</li>
<li>Yunis, A. A., Arimura, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymes+of+glycogen+metabolism+in+white+blood+cells.+I.+glycogen+phosphorylase+in+normal+and+leukemic+human+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%2C+Res%22%5BJournal%5D)">Enzymes of glycogen metabolism in white blood cells. I. glycogen phosphorylase in normal and leukemic human leukocytes.</a> Cancer, Res. 24, 489-492 (1964).</li>
<li>Hagemans, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAS-positive+lymphocyte+vacuoles+can+be+used+as+diagnostic+screening+test+for+pompe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inherit.+Metab.+Dis%22%5BJournal%5D)">PAS-positive lymphocyte vacuoles can be used as diagnostic screening test for pompe disease.</a> J. Inherit. Metab. Dis. 33 (2), 133-139 (2010).</li>
<li>Totsuka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+performance+and+soleus+muscle+fiber+composition+in+wild-derived+and+laboratory+inbred+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Physical performance and soleus muscle fiber composition in wild-derived and laboratory inbred mouse strains.</a> 95 (2), 720-727 (2003).</li>
<li>Murat, J. C., Serfaty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+enzymatic+determination+of+polysaccharide+%28glycogen%29+content+of+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Simple enzymatic determination of polysaccharide (glycogen) content of animal tissues.</a> Clin. Chem. 20 (12), 1576-1577 (1974).</li>
<li>Arrizabalaga, O., Lacerda, H. M., Zubiaga, A. M., Zugaza, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+protein+regulates+glycogen+phosphorylase+activation+and+controls+interleukin+%28IL%29-2-dependent+T+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rac1 protein regulates glycogen phosphorylase activation and controls interleukin (IL)-2-dependent T cell proliferation.</a> J. Biol. Chem. 287 (15), 11878-11890 (2012).</li>
<li>Pelletier, J., G, J., Mazure, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+titration+of+glycogen+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Biochemical titration of glycogen in vitro.</a> J.Vis.Exp. (81), (2013).</li>
<li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagliabracci+V.S.+Glycogen+and+its+metabolism%3A+Some+new+developments+and+old+themes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.J%22%5BJournal%5D)">Tagliabracci V.S. Glycogen and its metabolism: Some new developments and old themes.</a> Biochem.J. 441 (3), 763-787 (2012).</li>
<li>Salmoral, E. M., Tolmasky, D. S., Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+presence+of+glycogen+in+rat+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence for the presence of glycogen in rat thymus.</a> Cell Mol.Biol. 36 (2), 163-174 (1990).</li>
<li>Darlington, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+Th17+%28not+Th1%29+responses+underlie+multiple+sclerosis+disease+abrogation+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.Neurol%22%5BJournal%5D)">Diminished Th17 (not Th1) responses underlie multiple sclerosis disease abrogation after hematopoietic stem cell transplantation.</a> Ann.Neurol. 73 (3), 341-354 (2013).</li>
<li>Multiple Sclerosis International Federation Atlas of MS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atlasofms.org">http://www.atlasofms.org</a> (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kluczowymi etapami tego artykułu wideo były mycie i leczenie komórek amylazą. Podczas mycia szkiełek kluczowym krokiem było użycie plastikowej, wyciskanej butelki do mycia i pozostawienie, aby woda delikatnie przepływała przez próbkę na szkiełku, a nie kierowała się bezpośrednio na próbki. Nawet najmniejsze bezpośrednie ciśnienie wody spowodowałoby, że ogniwa odpadłyby ze zjeżdżalni. Kolejnym kluczowym krokiem było użycie tego samego szkiełka do ± warunkach amylazy. Po przyklejeniu PBMC do szkiełka, szkiełko ostrożnie um...

Barwienie kwasem okresowym i Schiffem (PAS) jest techniką immunohistochemiczną szeroko stosowaną w badaniach i diagnostyce mięśni. Wykorzystywana jest również jako narzędzie diagnostyczne w badaniach próbek krwi. Technika ta polega na naniesieniu na próbkę roztworu kwasu okresowego, który utlenia jednostki w polisacharydach, tworząc grupy aldehydowe reagujące z bezbarwnym odczynnikiem Schiffa, co prowadzi do powstania produktu o głębokim purpurowym kolorze. Etapy tej procedury przedstawiono na Rysunku 1. Barwnik zabarwia na purpurowo wszystkie struktury zawierające polisacharydy, w tym glikogen, glikoproteiny, glikolipidy, mucyny oraz inne cząsteczki z frakcjami polisacharydowymi.
Barwienie PAS jest często stosowane do pomiaru poziomu glikogenu w włóknach mięśniowych. Przekroje tkanki mięśniowej są idealne do tej techniki, ponieważ mocno przylegają do szkiełka i wytrzymują wielokrotne etapy płukania i barwienia. Glikogen występuje najintensywniej w szybkokurczliwych włóknach mięśniowych typu II, które charakteryzują się wysokim zapotrzebowaniem na szybką produkcję ATP, wymagającą glikogenu dla osiągnięcia maksymalnej wydajności1,2. Glikogen jest rozgałęzionym polimerem glukozy, który może zostać rozkładany do wolnej glukozy poprzez działanie enzymów glikogenofosforylaz. W okresach spoczynku i wystarczającej podaży składników odżywczych glikogen jest uzupełniany w procesie glikogenezy, natomiast w stanach niedoboru składników odżywczych lub wysokiego zapotrzebowania energetycznego glikogen jest rozkładany do glukozy w procesie glikogenolizy. Już od lat 50. XX wieku naukowcy-klinicyści badali barwienie PAS w próbkach krwi w celu analizy zawartości glikogenu w różnych chorobach3-7. Na przykład w chorobie Pompego – klasycznej chorobie składowania glikogenu – leukocyty kumulują duże ilości glikogenu, co znacząco różni się od wyników w grupach kontrolnych osób zdrowych8.
Niniejszy artykuł wideo demonstruje dostosowaną wersję barwienia PAS do zastosowania w próbkach mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) pobranych z krwi żylnej zdrowych ochotników. PBMC składają się głównie z limfocytów z grup limfocytów T i limfocytów B, a także innych komórek odpornościowych, takich jak komórki NK (natural killer) i monocyty. Pierwszy etap oczyszczania pozwala na usunięcie erytrocytów, neutrofili i innych granulocytów. Technika ta dostarcza danych dotyczących skoncentrowanej frakcji limfocytów, co umożliwia dokładniejsze zliczanie komórek PAS-dodatnich w porównaniu do analizy rozmazów z krwi pełnej.
<img alt="Schemat procesu przetwarzania krwi i barwienia; izolacja PBMC, barwienie odczynnikiem Schiffa." src="/files/ftp_upload/52199/52199fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Metodologia barwienia PAS w PBMC krok po kroku. (A) W pierwszej kolejności izolację PBMC przeprowadza się za pomocą gradientu Ficoll; lewy panel przedstawia preparat przed wirowaniem, a prawy panel przedstawia go po wirowaniu, gdzie w centrum probówki widoczna jest warstwa leukocytowa (buffy coat) zawierająca PBMC. (B) Izolowane PBMC są utrwalane na szkiełku za pomocą roztworu utrwalającego formalinowo-etanolowego. Szkiełko jest delikatnie płukane wodą destylowaną z plastikowej butelki płuczki. (C) Następnie szkiełko umieszcza się w zlewce o pojemności 100 ml wypełnionej do połowy roztworem amylazy, która rozpuści glikogen. Szkiełko jest delikatnie płukane. (D) Szkiełko poddaje się działaniu roztworu kwasu okresowego, w którym zachodzi utlenianie sacharydów. Szkiełka są delikatnie płukane, co usuwa nadmiar kwasu okresowego i zatrzymuje etap utleniania. (E) Po dodaniu do szkiełek odczynnika Schiffa, zareaguje on z aldehydami powstałymi podczas etapu utleniania. Ten bezbarwny odczynnik doprowadzi do powstania produktu o głębokim czerwono-magenta kolorze. Szkiełka są delikatnie płukane w celu usunięcia nadmiaru odczynnika Schiffa.

<table><tbody><tr><td>Zestaw Periodic Acid Schiff</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/395b?lang=en&amp;amp;region=CA" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>395B</td><td>Przed użyciem doprowadzić do temperatury pokojowej. Materiały w tym zestawie są toksyczne i szkodliwe. Należy zachować ostrożność.</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Amylaza z trzustki świńskiej</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3176?lang=en&amp;amp;region=CA" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>A3176</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop binokularny</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>Axio Lab A0</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania glikogenu</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/mak016?lang=en&amp;amp;region=CA" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>MAK016</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td><a href="https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4779441" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> VWR, GE Healthcare</a></td><td>17-1440-02</td><td>Niejonowy syntetyczny polimer sacharozy.</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td>Do izolacji PBMC zastosowano wirówkę z koszem wahadłowym.</td></tr></tbody></table>

wykrywanie glikogenu w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej za pomocą barwienia schiffa kwasem okresowym

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Barwienie kwasem okresowym Schiffa (PAS) jest techniką immunohistochemiczną stosowaną w biopsjach mięśni i jako narzędzie diagnostyczne dla próbek krwi. Polisacharydy, takie jak glikogen, glikoproteiny i glikolipidy, barwią jasną magentę, co ułatwia wyliczenie pozytywnych i ujemnych komórek w tkance. W komórkach mięśniowych barwienie PAS służy do określania zawartości glikogenu w różnych typach komórek mięśniowych, podczas gdy w próbkach komórek krwi barwienie PAS zostało zbadane jako narzędzie diagnostyczne dla różnych schorzeń. Krew zawiera pewną ilość białych krwinek, które należą do układu odpornościowego. Pogląd, że komórki układu odpornościowego posiadają glikogen i wykorzystują go jako źródło energii, nie został szeroko zbadany. W tym miejscu opisujemy zaadaptowaną wersję protokołu barwienia PAS, który można zastosować do jednojądrzastych komórek odpornościowych krwi obwodowej z ludzkiej krwi żylnej. Zaobserwowano małe komórki z ziarnistościami PAS-dodatnimi i większe komórki z rozlanym barwieniem PAS. Traktowanie próbek amylazą znosi te wzorce, potwierdzając specyficzność plamy. Alternatywna technika oparta na trawieniu enzymatycznym potwierdziła obecność i ilość glikogenu w próbkach. Protokół ten jest przydatny dla hematologów lub immunologów badających zawartość polisacharydów w limfocytach pochodzących z krwi.

W celu walidacji odczynników i podstawowej techniki wykonano barwienie PAS zgodnie z instrukcją producenta na przekrojach mięśnia soleus myszy. Barwienie przeprowadzono w tym samym dniu co uśmiercenie zwierząt, a w ostatnim kroku procedury preparaty utrwalono w ksylenoli. Mięsień soleus znany jest z zawartości ~35% komórek wykazujących dodatnią reakcję na glikogen9. W zabarwionych komórkach mięśniowych zaobserwowano dwie odrębne cechy PAS-dodatnie: punktowe granulki wewnątrz komórki oraz ciągłą linię wyznaczaj...

Barwienie Schiffa kwasem okresowym to technika, która wizualizuje zawartość polisacharydów w tkankach. W artykule przedstawiono protokół barwienia Schiffa kwasem okresowym przystosowany do stosowania na komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej oczyszczonych z ludzkiej krwi żylnej. Takie próbki są wzbogacone o limfocyty i inne białe krwinki układu odpornościowego.

Wykrywanie glikogenu w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej za pomocą barwienia Schiffa kwasem okresowym

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja zawartości glikogenu w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie P BMC z ludzkiej krwi pełnej za pomocą wirowania w gradiacji gęstości. Drugim krokiem jest przygotowanie szkiełek podstawowych poprzez rozmazywanie lub pipetowanie komórek krwi, a następnie potraktowanie ich roztworem utrwalającym, a następnie umycie w celu uzyskania kontroli ujemnej.Połowę szkiełka zanurza się w roztworze amylazy, który rozpuszcza polimery glikogenu, a następnie przemywa się. Teraz próbki są barwione roztworem kwasu okresowego, a następnie przemywane. Ostatnim krokiem jest dodanie odczynnika zmiany, a następnie przepłukanie.Ostatecznie mikroskopia świetlna służy do pokazania zapasów glikogenu wewnątrz komórek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że na jednym szkiełku znajduje się więcej komórek jednojądrzastych w porównaniu z barwieniem krwi pełnej. W związku z tym bardziej efektywna jest analiza zawartości glikogenu i limfocytów, ponieważ neutrofile i czerwone krwinki są nieobecne.Aby rozpocząć tę procedurę w komorze bezpieczeństwa biologicznego, ostrożnie przenieś od 10 do 15 mililitrów krwi pełnej z probówki do heparynizowanej probówki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Następnie rozcieńczyć krew w PBS one X o pH 7,4 w stosunku jeden do jednego i upewnić się, że maksymalna całkowita objętość nie przekracza 30 mililitrów. Delikatnie wymieszać za pomocą serologicznego pistoletu do pipet i unikać tworzenia się pęcherzyków.Następnie przenieś 13 mililitrów niejonowego syntetycznego polimeru sacharozy, FICO do nowej 15-mililitrowej stożkowej probówki. Następnie dodaj rozcieńczoną krew powolnym i stałym ciśnieniem, aby utworzyć warstwę krwi na wierzchu warstwy FICO. Wykonaj ten krok kilka razy, aż cała krew zostanie przeniesiona.Następnie szczelnie zakryj probówkę i odwiruj ją w temperaturze pokojowej przez 30 minut w temperaturze 400 Gs. Następnie powoli wyjmij probówkę i przenieś ją z powrotem do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Następnie ostrożnie zbierz kożuchową powłokę między warstwami plazmy PBS i FICO, w których znajdują się pbmc. Należy unikać gromadzenia warstwy FICO i nie naruszać warstwy czerwonych krwinek.Następnie przenieś płaszcz buffy do nowej sterylnej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Dodaj PBS do probówki z P BMC i napełnij ją do 45 mililitrów. Następnie dokładnie wstrząśnij rurką.Następnie odwiruj go przez 15 minut. Przy 277 gs na dnie stożkowej rurki zostanie utworzona paleta p BMC. Następnie wyrzuć supernatant do plastikowej zlewki z 10 mililitrami wybielacza.Poluzuj granulkę komórkową, delikatnie przyciskając rurkę do pofałdowanej powierzchni. Dodaj 20 mililitrów świeżego PBS do probówki. Jeśli przetwarzana jest więcej niż jedna rura, na tym etapie zbierz granulki.Następnie odwiruj probówkę przez 12 minut w temperaturze 480 g. Wylać supernatant do plastikowej zlewki z odrobiną wybielacza. Następnie delikatnie przyłóż rurkę do pofałdowanej powierzchni.Ponownie po tym dodaj 25 mililitrów świeżego PBS do probówki. Przenieś 50 mikrolitrów komórek do mikroprobówki wirówkowej. Aby uzyskać żywotność, policz, aby policzyć komórki.Dodaj 50 mikrolitrów błękitu trianowego i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Następnie przenieś 10 mikrolitrów mieszaniny do hemocytometru. Aby sprawdzić żywotność komórek i zapisać liczbę komórek na mililitr.Weź żądaną ilość komórek i odwiruj probówkę przez 12 minut w temperaturze 177 g. Następnie wyrzuć natant SUP do zlewki z wybielaczem. Następnie delikatnie przyłóż probówkę do pofałdowanej powierzchni, a następnie dodaj do niej 80 mikrolitrów PBS.Aby wykonać szkiełko PBMC, umieść 80 mikrolitrów komórek na wstępnie oznakowanym szkiełku mikroskopowym, rozsmaruj kroplę za pomocą innego szkiełka lub umieść dwie krople po 40 mikrolitrów na obu końcach szkiełka. Pozostaw szkiełko w komorze bezpieczeństwa biologicznego do wyschnięcia. Następnie przygotuj roztwór utrwalający, mieszając 0,5 mililitra 37% formaldehydu z 4,5 mililitra 99% etanolu.Po wyschnięciu szkiełek dodaj dwa mililitry świeżo przygotowanego roztworu utrwalającego na szkiełko, aby pokryć całą powierzchnię. Pozostawić roztwór na szkiełku na jedną minutę, a następnie spłukać go wodą z kranu przez kolejną minutę. Następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.Teraz rozpuścić. Umieść 25 gramów amylazy w proszku w 50 mililitrach wody destylowanej. Wlej roztwór do 100-mililitrowej zlewki.Następnie zanurz połowę szkiełka w zlewce i inkubuj przez 15 minut. W temperaturze pokojowej zanotuj na stronie, która jest poddawana działaniu amylazy. Narysuj linię na odwrocie szkiełka wskazującą granicę między leczeniem a kontrolą.Następnie umyj szkiełko wodą destylowaną, aby usunąć roztwór amylazy. Następnie pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu Na tym etapie umieść szkiełko na płaskiej powierzchni. Nałóż dwa mililitry roztworu kwasu okresowego na próbkę i inkubuj ją przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie kilkakrotnie przepłucz szkiełko wodą destylowaną. Nałóż dwa mililitry odczynnika Shifts na szkiełko i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie umyj szkiełko wodą destylowaną przez pięć minut, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.Następnie nałóż na szkiełko o pojemności 100 mikrolitrów i przykryj je jednym dużym szkiełkiem nakrywkowym lub nałóż 50 mikrolitrów i użyj dwóch małych szkiełek nakrywkowych. Następnie nałóż bezbarwny lakier do paznokci na krawędzie szkiełka nakrywkowego. Pozostaw je do wyschnięcia na noc.Następnie uzyskaj obrazy za pomocą lornetkowego mikroskopu świetlnego za pomocą obiektywu 100 x PAS. Barwienie przeprowadzono na P BMC z krwi żylnej zdrowych ochotników. BMC P barwione PAS wykazywały różne wzory barwienia.Łatwo zaobserwowano małe komórki z granulkami. Zaobserwowano również odsetek większych komórek z rozproszonym wzorem barwienia. Traktowanie próbek amylazą usunęło sygnał granulek i zmniejszyło rozlaną dodatniość PAS.Barwienie PAS i HEMATYNY wykonano na szkiełku krwi pełnej. Ten PBMC jest otoczony wieloma erytrocytami. 98% PAS dodatnich pbmc to mniejsze komórki, a 40% to większe komórki.Leczenie amylazą wyeliminowało sygnał PAS w małych komórkach i znacznie zmniejszyło sygnał PAS w większych komórkach do 7%Nie zapominaj, że praca z odczynnikami PAS może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej i używanie kaptura chemicznego.

detecting-glycogen-peripheral-blood-mononuclear-cells-with-periodic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje technikę barwienia kwasem okresowym Schiffa do oceny poziomu glikogenu w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej in vitro. Plama nadaje amarantowy kolor wewnątrzkomórkowym granulkom glikogenu, czyniąc je widocznymi pod mikroskopem.

Okresowe barwienie komórek kwasem Schiffa: technika in vitro do wykrywania poziomów glikogenu w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej

W tym filmie opisujemy jakościowy test spektrofotometryczny, aby określić zakres rozgałęzień w próbce glikogenu o niescharakteryzowanej strukturze. Porównanie maksimów absorbancji próbki niescharakteryzowanej z maksimum polisacharydów o znanych strukturach rozgałęzionych wskazuje na obecność rozgałęzień w próbce niescharakteryzowanej.

Test rozgałęzień glikogenu w celu zmierzenia stopnia rozgałęzienia glikogenu

Opisujemy tutaj dokładną, powtarzalną i wygodną biochemiczną metodę miareczkowania glikogenu in vitro. Technika ta wykorzystuje zestaw do oznaczania glikogenu Abcam i opiera się na sukcesywnej hydrolizie glikogenu do glukozy i miareczkowaniu glukozy przez fluorescencję.

Miareczkowanie biochemiczne glikogenu in vitro

Ten raport opisuje techniki izolacji i oczyszczania siarczanowych glikozaminoglikanów (GAG) z próbek biologicznych oraz metodę elektroforezy w żelu poliakrylamidowym w celu przybliżenia ich wielkości. GAG przyczyniają się do budowy tkanek i wpływają na procesy sygnalizacyjne poprzez oddziaływanie elektrostatyczne z białkami. Długość polimeru GAG przyczynia się do ich powinowactwa do pokrewnych ligandów.

Wykrywanie glikozaminoglikanów za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym i barwienia srebrem

Techniki pomiaru aktywności kluczowych enzymów metabolizmu glikogenu są prezentowane przy użyciu prostego spektrofotometru działającego w zakresie widzialnym.

Metody spektrofotometryczne do badania metabolizmu glikogenu eukariotycznego

Optymalne stężenie sacharozy zostało określone do ekstrakcji glikogenu wątrobowego za pomocą wirowania w gradicynie gęstości sacharozy. Korzystne okazało się dodanie 10-minutowego etapu wrzenia w celu zahamowania enzymów rozkładających glikogen.

Ekstrakcja cząsteczek glikogenu wątrobowego w celu określenia struktury glikogenu

Zmodyfikowana procedura po utrwaleniu zwiększa kontrast cząsteczek glikogenu w tkance. W tym artykule przedstawiono protokół krok po kroku opisujący, jak obchodzić się z tkanką, przeprowadzać obrazowanie i stosować metody stereologiczne w celu uzyskania bezstronnych i ilościowych danych na temat specyficznej dla typu włókien subkomórkowej dystrybucji glikogenu w mięśniach szkieletowych.

Kwantyfikacja subkomórkowego rozkładu glikogenu we włóknach mięśni szkieletowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Nauczanie nauk biologicznych może być bardziej stymulujące dla studentów dzięki zastosowaniu eksperymentów. Ten manuskrypt przedstawia dwa różne, ale uzupełniające się protokoły, które można wykorzystać w klasie, aby zachęcić uczniów do formułowania i testowania hipotez związanych z dietami wysokokalorycznymi, głodówką i starzeniem się.

Stosowanie tanich barwników do wizualizacji akumulacji glikogenu i integralności jelit u Caenorhabditis elegans

Test tkań zwierzęcych wykorzystuje detekcję scyntylacji jądrowej do określenia aktywności enzymatycznej syntazy glikogenu poprzez pomiar włączenia radioaktywnie znakowanej glukozy do glikogenu.

Ocena radiochemiczna aktywności enzymu syntazy glikogenowej w tkankach zwierzęcych

Jama otrzewnowa u ssaków zawiera różne populacje komórek odpornościowych, które są kluczowe dla wrodzonych odpowiedzi immunologicznych. Do biochemicznych i funkcjonalnych analiz tych komórek niezbędna jest wydajna metoda izolacji. W niniejszej pracy przedstawiamy kompleksową metodę izolacji komórek jamy otrzewnowej u myszy.

Izolacja komórek z jamy otrzewnej myszy

Poznaj metodę barwienia Schiffa kwasem okresowym do wizualizacji glikogenu w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Technika ta umożliwia badanie składu polisacharydowego komórek immunologicznych.

Wykrywanie glikogenu w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej za pomocą barwienia Schiffa kwasem okresowym

Przeglądaj więcej filmów