FIM Imaging i FIMtrack: dwa nowe narzędzia umożliwiające wysokowydajną i ekonomiczną analizę lokomocji

Ogólnym celem poniższej metodologii jest wizualizacja i ilościowe określenie lokomocji larw Drosophila Melan Gaster, co pozwoli na wysokoprzepustowe badania przesiewowe w warunkach swobodnego ruchu. Osiąga się to poprzez utworzenie powierzchni śledzenia w konfiguracji FIM i wykorzystanie sfrustrowanego całkowitego odbicia wewnętrznego do oświetlenia pośredniego. Larwy o różnych genotypach są następnie umieszczane na powierzchni i rejestrowane jest zachowanie pełzania w odpowiedzi na gradient ciepła.

Filmy są następnie analizowane przez FIM Track. Uzyskane oprogramowanie i dane są wykorzystywane do generowania wykresów opisujących różnice w larwach, wzorcach lokomocji. Wyniki pokazują, że precyzyjne, wysokowydajne, elastyczne i łatwe w użyciu oznaczanie ilościowe larw.

Lokomocja może być wykonywana w oparciu o technikę obrazowania FIM i powiązany program toru FIM. Główną zaletą tej techniki obrazowania w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak użycie światła padającego lub przechodzącego, jest to, że widoczne są tylko zwierzęta dotykające powierzchni, co skutkuje doskonałym kontrastem tła na pierwszym planie bez niepokojących artefaktów, chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w biologię lawy oph. Może być również stosowany do badania zachowań chodzenia, much i lokomocji innych organizmów mono, takich jak elegancja morska, plenarne, a nawet wzrost korzeni roślin.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie dla przekonania innych, że złożona technologia jest łatwa w użyciu. Pierwszym krokiem jest stworzenie wilgotnej, pełzającej powierzchni dla metody obrazowania opartej na FITR lub fim. Aby to zrobić, zagotuj 0,8% świdra spożywczego w dejonizowanej ultraczystej wodzie.

Wlej gorący ślimak na talerz ze szkła akrylowego. Nie mieszaj ślimaka po ugotowaniu i ciągle wlewaj. Aby uniknąć pęcherzyków w tej temperaturze, należy utworzyć płytę o grubości dwóch milimetrów.

Użyj pozostałego roztworu ślimaka, aby napełnić standardowe sześciocentymetrowe szalki Petriego. Zostaną one użyte do sortowania, czyszczenia i przyzwyczajenia larw przed eksperymentem. Następnie przytnij około dwóch centymetrów od obwodu płyty ślimaka, aby uzyskać zwykłą kwadratową powierzchnię do nagrywania.

Przenieś płytę ślimaka do konfiguracji FIM bezpośrednio po schłodzeniu. Delikatnie popychając ślimak przez krawędź płyty ze szkła akrylowego, ślimak powinien ślizgać się na miejscu. Jesteś teraz gotowy do przygotowania do obrazowania, aby uwzględnić awersyjną barierę ślimakową w powierzchni pełzania.

Zagotuj 2,5% świdra spożywczego z trzema molowymi NACL w dejonizowanej ultraczystej wodzie. Następnie wytnij wcięcie o szerokości dwóch centymetrów otaczające pole widzenia w wcześniej wylanej powierzchni pełzającej. Gdy będziesz gotowy, wypełnij wycięcie ślimakiem solnym o 0,1 do 0,3 centymetra wyższym niż powierzchnia śledzenia.

Następnie przygotuj urządzenie do gradientu ciepła. Urządzenie jest aluminiową płytą pokrytą powierzchnią izolacyjną i przepuszczaną wodą z pomp na obu końcach. Aby umożliwić kontrolę temperatury, włącz urządzenie gradientu ciepła na godzinę przed użyciem i umieść je nad konfiguracją, aby umożliwić mu osiągnięcie żądanej temperatury.

Ten czas można przeznaczyć na dalsze przygotowania. Gdy będziesz gotowy, przenieś ślimak do powierzchni pełzającej z barierą solną do zestawu. Umieść płytę chłodnicy nad ślimakiem i wyreguluj odstęp między płytą a powierzchnią pełzającą do dwóch milimetrów.

Ustal gradient liniowy od 34 stopni Celsjusza do 18 stopni Celsjusza, dostosowując temperaturę obwodów wodnych do jednego stopnia Celsjusza i 45 stopni Celsjusza, co jest odpowiednie dla tego sprzętu. Pozwól, aby powierzchnia pełzająca zrównoważyła się w nachyleniu przez 20 minut. Zanim przejdziesz dalej, przetestuj gradient temperatury za pomocą TER, aby przygotować muchy, wyjmij je z inkubatora o temperaturze 25 stopni Celsjusza i wlej trochę wody do fiolek hodowlanych, aby doprowadzić do późnego trzeciego ruchu larw gwiazd

Następnie zbierz największe larwy ze ścianek fiolki za pomocą małego pędzla, dwie do pięciu minut przed nagraniem przenieś larwy wystarczające na jeden film na szalkę Petriego, która została wcześniej przygotowana. Po ustaleniu gradientu temperatury skonfiguruj oprogramowanie do nagrywania. Określ liczbę klatek w filmie.

Zdefiniuj ścieżkę zapisu i skonfiguruj natychmiastowe nagrywanie w ciągu 20 sekund. Po umieszczeniu larw na pełzającej powierzchni, aby rozpocząć, naocz jedną z larw i dostosuj intensywność oświetlenia, aby uzyskać dobry kontrast. Gdy będziesz gotowy, lekko podnieś płytę chłodnicy i umieść larwy w temperaturze 34 stopni Celsjusza, dwa centymetry od bariery solnej.

Ponownie opuść płytę chłodnicy i rozpocznij nagrywanie w ciemności, aby nie przeszkadzać zwierzętom. Po nagraniu usuń larwy i nawilż powierzchnię. Aby uniknąć rozprzestrzeniania się NACL, nie dotykaj ślimaka solnego podczas pracy, podczas gdy powierzchnia musi być przez cały czas wilgotna, unikaj nadmiernej wilgoci, która może być postrzegana jako aureole lub krople otaczające larwy.

W przypadku nagrań i śledzenia zakłóconego poczekaj, aż powierzchnia ślimaka zrównoważy się przez jedną do dwóch minut przed kontynuowaniem. W tym czasie zapisuj zebrane obrazy i zbieraj nowe zwierzęta. Aby przygotować się do następnego filmu, kontroluj gradient temperatury za pomocą TER co pięć filmów i w razie potrzeby dostosuj urządzenie do temperatury.

Aby rozpocząć śledzenie lokomocji, dostosuj parametry śledzenia za pomocą opcji podglądu. Dostosuj milimetr na piksel w zależności od kamery i pola view. Następnie dostosuj liczbę klatek na sekundę w oparciu o ustawienia aparatu, skorzystaj z informacji zwrotnej podanej w oknie podglądu, aby dostosować progi jasności, aby wszystkie zwierzęta zostały prawidłowo wykryte.

Następnie dostosuj progi wielkości obszaru larwalnego, pojedyncze zwierzęta są podświetlone żółtymi kółkami, zderzające się larwy są podświetlone na czerwono, a obszar każdego zwierzęcia jest podany na niebiesko. Rozpocznij śledzenie za pomocą przycisku w prawym dolnym rogu, po sesji śledzenia, obraz ze śladami larw i plik CSV zawierający obliczone cechy lokomocji i postawy jest przechowywany w katalogu obrazów. Na koniec użyj modułu przeglądarki wyników programu FIM, aby przejrzeć i ręcznie dostosować wyniki śledzenia.

Zdefiniuj orientację pełzania w odniesieniu do gradientu ciepła, aby ocenić dane na podstawie tego bodźca. W przedstawionej tutaj reprezentacji larwy punkt głowy i ogona są zaznaczone między tymi punktami. Za pomocą promienia można ustawić dowolną nieparzystą liczbę punktów kręgosłupa.

Ponadto obliczany jest środek masy i kąt zgięcia korpusu głównego. Pokazane tutaj są wyniki obrazowania i śledzenia FI z różnych kamer. Zdjęcia po lewej stronie ukazują trzy larwy pełzające po etapie śledzenia o wymiarach 10 na 10 centymetrów.

Trajektoria masy i obszar pojedynczej larwy są pokazane po prawej stronie. Czerwona strzałka wskazuje punkt czasowy przyciętego obrazu, który wynika z zastosowania. Bodziec cieplny jest tutaj pokazany jako różnokolorowe trajektorie obliczone za pomocą ścieżki F.

Te obrazy aplikacyjne o wysokiej rozdzielczości trzeciej, drugiej i pierwszej larwy gwiazdy uzyskano za pomocą obiektywu makro. Inne organizmy, takie jak morze, również mogą być łatwo obrazowane. Po opanowaniu można analizować około stu laboratoriów na godzinę na każdą konfigurację śledzenia.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby zawsze nagrywać w tych samych warunkach. Inne metody, takie jak stymulacja optogenetyczna lub wykrywanie aktywności neuronalnej in vivo, mogą być włączone do konfiguracji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak łatwa może być skuteczna analiza lokomocji ulicznej.