Name: Obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj zoptymalizowany protokół obrazowania projekcji czuciowych aksonów w zarodkach myszy. Metoda umożliwia szybką ocenę fenotypów wzrostu bólowych aksonów u płodów myszy genetycznie modyfikowanych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Louisowi Reichardtowi za myszy TrkA taulacZ oraz dr Annette Markus za wnikliwą dyskusję i sugestie. Praca ta była wspierana przez fundusze startowe z Fundacji Burke'a, a także grant badawczy Fundacji Whitehall 2010-08-61, grant badawczy z Fundacji Wings for Life (WFL-US-028/14), grant ZB1-1102-1 z Fundacji Christophera i Dany Reeve oraz granty 1R01EY022409 i 3R01EY022409-01S1 z National Eye Institute, dla JZ. KJO jest stypendystą Goldsmitha.

UWAGA: Wszystkie procedury są zgodne z Przewodnikiem NIH dotyczącym użytkowania i opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi. Protokół na zwierzętach został zatwierdzony przez IACUC w Weill Cornell Medical College.
1. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Eutanazja samic w ciąży w czasie przez zwichnięcie szyjki macicy15. Rozbioruj zarodki E16 - E18 od samic w ciąży w czasie ciąży i umieść zarodki pojedynczo w dołkach 6-dołkowego naczynia, wypełnionego zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS).</li>
	<li>Opłucz zarodki w zimnym PBS.</li>
	<li>Usunąć niewielką część błony owodniowej zarodka i umieścić we wcześniej przygotowanym roztworze proteinazy K w celu późniejszego genotypowania. Alternatywnie, jeśli błona owodniowa zostanie utracona, usuń niewielką część końcówki ogona zarodka i umieść ją w roztworze proteinazy K</li>
	<li>Zrób w skórze wokół zarodka za pomocą szpilek do owadów (co najmniej 100 z każdej strony).</li>
	<li>Usuń PBS i powoli dodaj świeży 2% paraformaldehyd (PFA) o pH 7,4 do studzienki.</li>
	<li>Delikatnie wstrząsać przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Opłucz zarodki dwukrotnie w PBS i przechowuj w PBS w temperaturze 4 °C do momentu zabarwienia.</li>
</ol>
2. Genotypowanie
<ol>
	<li>Zanurzyć błony owodniowe lub ogony zarodków w mieszaninie proteinazy K zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 56 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Ekstrahuj DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do oczyszczania DNA.</li>
	<li>Pobrać 0,5 μl z całkowitej ilości 200 μl oczyszczonego roztworu genomowego DNA, połączyć go z 0,5 μl każdego ze specyficznych dla genu starterów sensownych i antysensownych (10 μM), 2 μl dNTP Mix (2,5 mM dATP, dCTP, dGTP i dTTP), 0,2 μl polimerazy Taq (5 U/μl) i 2 μl buforu PCR (10x), dodaćH2Odo całkowitej objętości 20 μl. 
	UWAGA: Sekwencje starterów są następujące (Tabela 1): 
	TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; Długość fragmentu PCR: 400 par zasad (bp). 
	Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, NeoR: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; Długości fragmentów PCR: typ dziki, 304 pz; Bax null, 507 bp. 
	TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; Długość fragmentu PCR: 360 pz.</li>
	<li>Uruchom PCR z następującym programem dla TrkA: krok 1: 1 min w 95 °C, krok 2: 10 s w 95 °C, krok 3: 20 s w 68 °C, krok 4: 30 s w 72 °C. Powtórz kroki 2 - 4 przez 40 cykli.
	<ol>
		<li>W przypadku LacZ i Bax uruchom PCR z następującym programem: krok 1: 1 min w 95 °C, krok 2: 10 s w 95 °C, krok 3: 1 min w 54 °C, krok 4: 1 min w 72 °C, powtórz kroki 2 - 4 przez 35 cykli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom próbki PCR na 2% żelu agarozowym przy 100 V w 1x buforze Tris-Acetate-EDTA przez 20 minut z pasem drabinki DNA w celu oceny długości fragmentów.</li>
	<li>Analizuj zarodki pod kątem obecności alleli zerowych typu dzikiego TrkA, TrkA-tauLacZ i Bax. Genotypy zarodków doświadczalnych to TrkAtaulacZ/WT : Bax -/- i TrkAtaulacZ/taulacZ : Bax-/-, w zależności od pytań doświadczalnych. Zarodki pozbawione reportera tauLacZ będą ujemne pod względem barwienia aksonów i dlatego mogą służyć jako kontrola ujemna w celu kalibracji procesu barwienia.</li>
</ol>
3. Barwienie zarodków
<ol>
	<li>Użyj komercyjnego zestawu do barwienia lacZ z pewnymi modyfikacjami, jak opisano poniżej w sekcjach 3.2 - 3.8. Tutaj użyj zestawu Millipore.</li>
	<li>Zanurz zarodki w buforze A na co najmniej 1 godzinę, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Bezpośrednio zanurzyć zarodki w buforze B na co najmniej 15 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Gdy zarodki znajdują się w buforze A/B, należy wstępnie ogrzać roztwór zasady tkankowej w temperaturze 37 °C. Użyć 5 ml roztworu zasady tkankowej na zarodek.</li>
	<li>Gdy zarodki znajdują się w buforze A/B, przygotuj świeży 5-bromo-4-chloro-3-indolyl α-D-galaktopyranozyd (X-gal) w stężeniu 40 mg/ml w 100% dimetylosulfotlenku (DMSO).</li>
	<li>Rozcieńczyć X-gal we wstępnie podgrzanym roztworze bazy tkankowej o stężeniu 1 mg/ml i dodać 5 ml mieszaniny X-gal/zasady tkankowej do szklanej fiolki scyntylacyjnej.</li>
	<li>Przenieść zarodki do szklanej fiolki scyntylacyjnej zawierającej mieszaninę X-gal/zasady tkankowej. Uszczelnić pokrywę Parafilmem i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc, sprawdzając, czy nie ma niebieskiej plamy.</li>
	<li>Zarodki postfiksowe ze świeżym 4% PFA, pH 7,4. Delikatnie wstrząsać przez 4 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Opłucz zarodki dwukrotnie w zimnym PBS.</li>
</ol>
4. Odwodnienie i oczyszczanie tkanek
<ol>
	<li>Umieść zarodki w mieszaninie 50% metanolu/50% PBS na 30 minut w temperaturze pokojowej, wstrząsając szklanymi fiolkami.</li>
	<li>Kontynuuj odwadnianie w 75% metanolu / 25% PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, wstrząsając szklanymi fiolkami.</li>
	<li>Kontynuuj odwadnianie w 90% metanolu / 10% PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, wstrząsając szklanymi fiolkami.</li>
	<li>Kontynuuj odwadnianie w 100% metanolu przez 30 minut (2x) w temperaturze pokojowej, wstrząsając szklanymi fiolkami.</li>
	<li>Podczas odwadniania zarodków przygotuj mieszaninę alkoholu benzoilowego i benzoesanu benzoilu w proporcji 1:1 (v:v). 
	UWAGA: Alkohol benzoilowy i benzoesan benzoilu są toksyczne.</li>
	<li>Zanurz zarodki w mieszaninie 1:1 (v:v) 100% metanolu: 100% BABB na 15 minut. Używaj tylko szkła, ponieważ BABB rozpuści plastik.</li>
	<li>Zanurz zarodki w 100% BABB, aby całkowicie oczyścić tkankę i uwidocznić barwienie X-gal w oczyszczonym zarodku. 
	UWAGA: Obraz tak szybko, jak to możliwe, ponieważ plama X-gal z czasem wyblaknie.</li>
</ol>
5. Obrazowanie całego mocowania
<ol>
	<li>Ustabilizuj zarodek, zanurzony w 100% BABB, pod odpowiednimi kątami do fotografii za pomocą metalowych kleszczyków. Oświetlaj za pomocą kombinacji źródeł światła w górę i w dole.</li>
	<li>Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w kamerę cyfrową. Wykonaj wiele ekspozycji w jasnym polu w pięciu kolejnych płaszczyznach ogniskowych oddalonych od siebie o 0,5 mm wzdłuż osi Z. Czasy naświetlania i przysłony mogą się różnić w zależności od oświetlenia i specyfikacji aparatu i muszą być zoptymalizowane dla każdej konfiguracji.</li>
	<li>Użyj standardowego oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby przetwarzać obrazy nakładkowe i generować fotomontaże.</li>
</ol>

<ol><li>Verze, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+innervation+in+hereditary+sensory+and+autonomic+neuropathy+type+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV.</a> Neurology. 55, 126-128 (2000).</li>
<li>Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+sensory+abnormalities+in+children+and+adolescents+with+complex+regional+pain+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes.</a> Pain. 131, 153-161 (2007).</li>
<li>Uceyler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+fibers+in+Fabry+disease%3A+baseline+and+follow-up+data+under+enzyme+replacement+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Peripher+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy.</a> J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).</li>
<li>Reichardt, L. F., Mobley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+the+distance%2C+or+not%2C+with+neurotrophin+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Going the distance, or not, with neurotrophin signals.</a> Cell. 118, 141-143 (2004).</li>
<li>White, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+onset+of+NGF+and+TrkA+survival+dependence+in+developing+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia.</a> J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).</li>
<li>Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neurotrophin+and+Trk+receptor+functions+in+developing+sensory+ganglia%3A+direct+NT-3+activation+of+TrkB+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo.</a> Neuron. 21, 325-334 (1998).</li>
<li>Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raf+and+akt+mediate+distinct+aspects+of+sensory+axon+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth.</a> Neuron. 35, 65-76 (2002).</li>
<li>Kuruvilla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neurotrophin+signaling+cascade+coordinates+sympathetic+neuron+development+through+differential+control+of+TrkA+trafficking+and+retrograde+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling.</a> Cell. 118, 243-255 (2004).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raf+kinase+signaling+functions+in+sensory+neuron+differentiation+and+axon+growth+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo.</a> Nature. 10, 598-607 (2007).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+sensory+map+develops+in+the+absence+of+normal+projection+neurons+or+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons.</a> Neuron. 21, 1273-1282 (1998).</li>
<li>Moqrich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressing+TrkC+from+the+TrkA+locus+causes+a+subset+of+dorsal+root+ganglia+neurons+to+switch+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate.</a> Nature. 7, 812-818 (2004).</li>
<li>Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax-deficient+mice+with+lymphoid+hyperplasia+and+male+germ+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death.</a> Science. 270 (5233), 96-99 (1995).</li>
<li>Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+support+the+development+of+diverse+sensory+axon+morphologies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies.</a> J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).</li>
<li>Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+sensory+neurons+in+the+absence+of+NGF%2FTrkA+signaling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo.</a> Neuron. 25, 345-357 (2000).</li>
<li>Donovan, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-RAF+kinase+drives+developmental+axon+growth+and+promotes+axon+regeneration+in+the+injured+mature+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS.</a> The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).</li>
<li>Mercer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+endogenous+oncogenic+V600EB-raf+induces+proliferation+and+developmental+defects+in+mice+and+transformation+of+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts.</a> Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).</li>
<li>Tronche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+glucocorticoid+receptor+gene+in+the+nervous+system+results+in+reduced+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety.</a> Nature genetics. 23, 99-103 (1999).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI-labeling+of+DRG+neurons+to+study+axonal+branching+in+a+whole+mount+preparation+of+mouse+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie ma sprzecznych interesów.

Opisana powyżej procedura barwienia X-gal embrionalnych myszy TrkAtaulacZ pozwala na szybką i szczegółową wizualizację projekcji aksonów na duże odległości w nienaruszonym utrwalonym zarodku. Ze względu na zerowe tło Bax , myszy te pozwalają na sondowanie mechanizmów sygnałowych, które mogą przyczyniać się zarówno do wzrostu aksonów, jak i przeżycia neuronów. Kojarzenie się z interesującymi myszami transgenicznymi lub nokautowymi pozwala na kompleksową ocenę fenotypów aksonalnych i m...

Tworzenie precyzyjnych sieci neuronowych to złożony proces rozwojowy, niezbędny dla funkcjonowania układu nerwowego. Zaburzenie tego procesu prowadzi do dysfunkcji neuronów, która jest związana z chorobami neurologicznymi człowieka1-3. Aby zbadać mechanizmy molekularne leżące u podstaw wzrostu aksonów i unerwienia docelowego u ssaków, opracowaliśmy protokół wizualizacji trajektorii aksonów neuronów czuciowych wyrażających TrkA przy użyciu kombinacji dwóch genetycznie zmodyfikowanych linii myszy.
TrkA jest receptorem dla czynnika wzrostu nerwów NGF i jest funkcjonalnym markerem nocyceptywnych neuronów czuciowych4. TrkA ulega silnej ekspresji w neuronach nocyceptywnych we wczesnym okresie rozwoju i pośredniczy w zależnym od NGF przetrwaniu neuronów, wzroście aksonów, arboryzacji i unerwieniu celu5-9. U myszy TrkAtaulacZ gen TrkA typu dzikiego jest zastępowany kasetą ekspresji taulacZ 10, tak że morfologię aksonalną przypuszczalnych neuronów TrkA-dodatnich można uwidocznić za pomocą barwienia β-gal (X-gal)11. Korzystając z heterozygotycznej linii TrkAtaulacZ/WT, możemy badać czynniki, które mogą regulować lub zakłócać rozwój sensorycznych projekcji aferentnych in vivo.
Ponadto, ekspresja TrkA nie występuje u homozygotycznych myszy TrkAtaulacZ/taulacZ, co może być zatem wykorzystane do oceny mechanizmów sprzyjających wzrostowi aksonów przy braku sygnalizacji NGF/TrkA. Ponieważ neurony nocyceptywne zależą od sygnalizacji NGF / TrkA nie tylko dla wzrostu aksonów, ale także dla przetrwania, zatrudniamy inną linię myszy, pozbawioną proapoptotycznego genu Bax, do hamowania apoptozy w embrionalnych neuronach DRG, ratując je przed śmiercią komórki, która jest obserwowana w przypadku braku sygnalizacji TrkA. Tło Bax-/- 12 pozwala zatem na molekularną dyssekcję szlaków sygnałowych, które specyficznie wpływają na wzrost aksonów7-9,13-15. U myszy TrkA-/-: Bax-/- neurony DRG przeżywają, ale unerwienie czuciowo-aferentne w skórze jest całkowicie zniesione14,15. Możemy selektywnie aktywować szlaki sygnałowe, aby określić ich odpowiedni wkład w rozwój projekcji aksonów. Użyteczność tej metody polega na tym, że umożliwia ona ocenę zmian w fenotypach wzrostu aksonów, gdy różne modyfikacje genetyczne są hodowane na tłach TrkAtaulacZ / taulacZ : Bax-/- lub TrkAtaulacZ / WT : Bax-/-.

<table><tbody><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6418</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Tech</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do płukania tkanek A</td><td>Milipore</td><td>BG-6-B</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do płukania tkanek B</td><td>Millipore</td><td>BG-7-B</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór bazowy do barwienia tkanek</td><td>Milipore</td><td>BG-8-C</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>Szklana fiolka scyntykalizacyjna</td><td>Kimble Chase</td><td>74500-20</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Labline</td><td>Model 120</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki do owadów</td><td>FST</td><td>26000-30</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa miska</td><td>USA Scientific</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>Startery</td><td>IDT</td><td>niestandardowe startery</td><td></td> DNA</tr><tr><td>Mieszanina Takara dNTP</td><td>Takara</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Takara LA</td><td>Takara</td><td>RR002A</td><td></td></tr><tr><td>Takara LA Taq</td><td>Takara</td><td>RR002A</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>DNA Engine Dyad</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol benzylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-1042</td><td></td></tr><tr><td>Benzoesan benzylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-6630</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica</td><td>M205A</td><td></td></tr><tr><td>Aparat</td><td>Leica</td><td>DFC310FX</td><td></td></tr><tr><td>Lampa pierścieniowa</td><td>Leica&nbsp;</td><td>MEB110</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Photoshop 4.0</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Wizualizacja pełnej długości projekcji neuronalnych w zarodkach jest niezbędna do zrozumienia, jak rozwijają się sieci neuronalne ssaków. W tym miejscu opisujemy metodę oznaczania in situ podzbioru projekcji aksonów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) w celu oceny ich cech fenotypowych przy użyciu kilku genetycznie zmodyfikowanych linii myszy. Neurony TrkA-dodatnie są neuronami nocyceptorowymi, przeznaczonymi do przekazywania sygnałów bólowych. Wykorzystujemy linię myszy TrkAtaulacZ do oznaczania trajektorii wszystkich TrkA-dodatnich aksonów obwodowych w nienaruszonym zarodku myszy. Następnie rozmnażamy linię TrkAtaulacZ na tle zerowym Bax, które zasadniczo znosi apoptozę neuronów, w celu oceny pytań związanych ze wzrostem niezależnie od możliwego wpływu manipulacji genetycznych na przeżycie neuronów. Następnie genetycznie zmodyfikowane myszy będące przedmiotem zainteresowania są hodowane z linią zerową TrkAtaulacZ / Bax, a następnie są gotowe do badania przy użyciu technik opisanych w niniejszym dokumencie. Prezentacja ta zawiera szczegółowe informacje na temat planów hodowlanych myszy, genotypowania w czasie sekcji, przygotowania tkanek, barwienia i oczyszczania, aby umożliwić wizualizację trajektorii aksonów na całej długości w preparacji całego wierzchowca.

Genotypy zarodków TrkAWT/taulacZ : Bax-/- oraz TrkAtaulacZ/taulacZ : Bax-/- można jednoznacznie określić za pomocą standardowego genotypowania metodą PCR (Rycina 1). Barwienie X-gal wykazuje szczegółowe obwody aksonalne w obrębie tkanki podskórnej w zarodkach barwionych konwencjonalnie (Ryciny 2, 3a) oraz w całym organizmie zarodka po przejaśnieniu tkanek (Ryciny 3b, 4).
Skrzyżowaliśmy linię TrkA<sup...

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany protokół genotypu, barwienia i przygotowania płodów myszy do obrazowania obwodowych projekcji aksonów nocyceptora u całego zwierzęcia, jako skuteczną metodę oceny fenotypów wzrostu aksonów czuciowych u genetycznie modyfikowanych myszy.

Obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest skuteczna ocena fenotypów wzrostu aksonów czuciowych u rozwijających się płodów myszy. Osiąga się to poprzez najpierw prawidłową hodowlę i genotypowanie myszy reporterowych tre a laxy, tak aby w drugim etapie można było przeprowadzić dalsze testy barwienia. Zarodki myszy są utrwalane i barwione, aby umożliwić wizualizację projekcji aksonów czuciowych u całego zwierzęcia.Następnie zarodki są odwadniane i oczyszczane, aby w pełni uwidocznić głęboko leżące projekcje aksonów, które w przeciwnym razie nie byłyby widoczne. Wyniki pokazują, że metody te są skutecznym sposobem szybkiej oceny embrionalnych nocyceptywnych fenotypów wzrostu aksonów. Korzystając ze ścieżki reportera Tau Lae, metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wzrostu aksonów czuciowych, umożliwiając naukowcom skrzyżowanie interesującego ich genu na tle tlac Z i ekranie pod kątem wszelkich zmian w fenotypach wzrostu aksonów czuciowych.Implikacje naszej techniki rozciągają się w kierunku terapii w tym sensie, że naukowcy mogą użyć naszej techniki do sprawdzenia, czy znane wrodzone mutacje mogą powodować fenotypy wzrostu aksonów czuciowych. Aby rozpocząć e

whole-mount-imaging-of-mouse-embryo-sensory-axon-projections

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Source: &lt; style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/57546/visualization-of-motor-axon-navigation-and-quantification-of-axon-arborization-in-mouse-embryos-using-light-sheet-fluorescence-microscopy'&gt;Liau, E. S. et al. Wizualizacja motorycznej nawigacji aksonów i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą lekkiej mikroskopii fluorescencyjnej. J. Vis. Exp. (2018). Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii...

Wizualizacja projekcji neuronów ruchowych i rozgałęzień aksonów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego

Źródło: Jeong, S. Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje wizualizację projekcji aksonalnych w zarodkach Drosophila. Znakowanie immunologiczne neuronów ruchowych, precyzyjna sekcja w celu odsłonięcia struktur neuronalnych oraz mikroskopia kontrastowa z różnicową interferencją łącznie ujawniają szczegółową architekturę neuronów, podkreślając wzorce projekcji aksonalnej.

Wizualizacja wzorców projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Skóra ssaków zawiera różnorodny wachlarz struktur - takich jak mieszki włosowe i zakończenia nerwowe - które wykazują charakterystyczne wzorce organizacji przestrzennej. Analiza skóry jako płaskiego mocowania wykorzystuje dwuwymiarową geometrię tej tkanki do tworzenia pełnowymiarowych obrazów struktur skóry o wysokiej rozdzielczości.

Obrazowanie skóry myszy metodą flat mount i jego zastosowanie do analizy wzorca mieszków włosowych i morfologii aksonów czuciowych

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji projekcji neuronów ruchowych i arboryzacji aksonów w transgenicznych zarodkach myszy Hb9::GFP. Po barwieniu immunologicznym neuronów ruchowych użyliśmy mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego do obrazowania zarodków do późniejszej analizy ilościowej. Protokół ten ma zastosowanie do innych procesów nawigacji neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Wizualizacja nawigacji aksonów ruchowych i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Połączenie transmisyjnej mikroskopii elektronowej i transdukcji in utero jest potężnym podejściem do badania zmian morfologicznych w ultrastrukturze układu nerwowego podczas rozwoju. Ta połączona metoda pozwala na dogłębny wgląd w zmiany w szczegółach strukturalnych leżących u podstaw neuroplastyczności w odniesieniu do ich reprezentacji topograficznej.

Ocena ultrastrukturalnych parametrów neuroplastyczności po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak mikrowstrzykiwać mieszaninę DNA/DOTAP do pąków ocznych jednodniowych zarodków Xenopus laevis, oraz jak obrazować i rekonstruować indywidualne zielone białko fluorescencyjne (GFP) wyrażające aksonalne trzpienie wzrokowe w tektalnych śródmózgowiu nienaruszonych, żyjących kijanek Xenopus.

Mikroiniekcja DNA do zawiązków ocznych w zarodkach Xenopus laevis i obrazowanie GFP wyrażającego altanki aksonalne wzrokowe w nienaruszonych, żywych kijankach Xenopus

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Badanie to przedstawia podejście in vivo do obrazowania dwufotonowego do wizualizacji struktur niskoprogowych zakończeń aksonów mechanoreceptorów (LTMR) w skórze przedniej łapy myszy. Wykorzystując powtarzalne, wysokorozdzielcze obrazowanie poszczególnych aksonów, metoda ta stanowi nową platformę do badania struktury i funkcji skórnego obwodu czuciowego podczas rozwoju oraz u dorosłych.

Dwufotonowe obrazowanie wewnątrzżyciowe morfologii aksonów dotykowych u skóry myszy

Poznaj zoptymalizowany protokół obrazowania projekcji czuciowych aksonów w zarodkach myszy. Metoda umożliwia szybką ocenę fenotypów wzrostu bólowych aksonów u płodów myszy genetycznie modyfikowanych.

Obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy

Przeglądaj więcej filmów