Obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest skuteczna ocena fenotypów wzrostu aksonów czuciowych u rozwijających się płodów myszy. Osiąga się to poprzez najpierw prawidłową hodowlę i genotypowanie myszy reporterowych tre a laxy, tak aby w drugim etapie można było przeprowadzić dalsze testy barwienia. Zarodki myszy są utrwalane i barwione, aby umożliwić wizualizację projekcji aksonów czuciowych u całego zwierzęcia.

Następnie zarodki są odwadniane i oczyszczane, aby w pełni uwidocznić głęboko leżące projekcje aksonów, które w przeciwnym razie nie byłyby widoczne. Wyniki pokazują, że metody te są skutecznym sposobem szybkiej oceny embrionalnych nocyceptywnych fenotypów wzrostu aksonów. Korzystając ze ścieżki reportera Tau Lae, metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wzrostu aksonów czuciowych, umożliwiając naukowcom skrzyżowanie interesującego ich genu na tle tlac Z i ekranie pod kątem wszelkich zmian w fenotypach wzrostu aksonów czuciowych.

Implikacje naszej techniki rozciągają się w kierunku terapii w tym sensie, że naukowcy mogą użyć naszej techniki do sprawdzenia, czy znane wrodzone mutacje mogą powodować fenotypy wzrostu aksonów czuciowych. Aby rozpocząć eutanazję samic w ciąży w czasie przez zwichnięcie szyjki macicy, jak wspomniano w protokole tekstowym, przystąp do sekcji embrionalnych zarodków E 16 do E 18 od samic w ciąży w czasie, a następnie umieść zarodki pojedynczo w dołkach sześciodołkowej naczynia wypełnionego zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem lub PBS. Po wypłukaniu zarodków w zimnym PBS należy usunąć niewielką część błony owodniowej zarodka i umieścić ją w przygotowanym roztworze proteinazy K z zestawu do oczyszczania DNA lub późniejszego genotypowania.

Alternatywnie, jeśli błona owodniowa zostanie utracona, usuń niewielką część końcówki ogona zarodka i umieść ją w roztworze proteinazy K. Następnie wbij się w skórę wokół zarodka za pomocą szpilek przeciw owadom, robiąc około 100 otworów z każdej strony. Usuń PBS i powoli dodaj świeży 2% aldehyd paraform lub PFA pH 7,4 do studzienki po delikatnym wstrząsaniu przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Opłucz zarodki dwukrotnie w PBS i przechowuj w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu barwienia w celu genotypowania. Zanurz błony owodniowe lub ogony zarodków w mieszaninie proteinazy K zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Po ekstrakcji DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do oczyszczania DNA, użyj 0,5 mikrolitra z całkowitych 200 mikrolitrów oczyszczonego roztworu genomowego DNA do przygotowania reakcji PCR zgodnie z opisem w protokole tekstowym, a następnie przystąp do uruchomienia programu PCR zgodnie z opisem w tym dokumencie. Po PCR uruchom próbki PCR na 2% żelu aros o napięciu 100 woltów w jednym dodatkowym buforze EDTA z octanu przez 20 minut. Dołącz pas z drabinką DNA, aby ocenić długość fragmentów i wybarwić żel przy użyciu rutynowych protokołów.

Analizuj zarodki pod kątem obecności typu dzikiego, ścieżki a, ścieżki tau lae i wstecznych alleli zerowych. Barwienie zarodków. Użyj komercyjnego zestawu do luźnego barwienia e z opisanymi tutaj modyfikacjami.

Na początek zanurz zarodki w buforze A na co najmniej godzinę, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. Następnie bezpośrednio zanurz zarodki w buforze B na co najmniej 15 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. Następnie rozcieńczyć 40 miligramów na mililitr roztworu podstawowego xal w wstępnie podgrzanym roztworze na bazie tkanek o stężeniu jednego miligrama na mililitr.

I dodaj pięć mililitrów powstałej mieszaniny do szklanej fiolki scyntylacyjnej. Przenieść zarodki do szklanej fiolki scyntylacyjnej zawierającej mieszaninę na bazie tkanek xal. Uszczelnij pokrywkę perfilem i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Sprawdzanie obecności niebieskiej plamy. Następnie zamocuj zarodki świeżym 4% PFA o pH 7,4. Delikatnie wstrząsaj przez cztery godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie dwukrotnie spłucz zarodki w zimnym PBS w celu odwodnienia tkanki, umieść zarodki w mieszaninie 50% metanolu i 50% PBS na 30 minut w temperaturze pokojowej, wstrząsając w szklance.

Kontynuuj odwadnianie w temperaturze pokojowej, wstrząsając szklanymi plikami w 75% metanolu przez 30 minut, a następnie 90% metanolem przez 30 minut. Na koniec odwodnij się dwukrotnie w 100% metanolu przez 30 minut. Następnie zanurz zarodki w mieszaninie 100% metanolu i 100% alkoholu benzoilowego i benzoesanu benzoilu lub BABB jeden do jednego na 15 minut.

Upewnij się, że używasz szkła, ponieważ BABB rozpuści plastik w ostatnim kroku. Zanurz zarodki w 100% BABB, aby całkowicie oczyścić tkankę i uwidocznić barwienie X cal w oczyszczonym zarodku lub zamontuj obrazowanie, w razie potrzeby ustabilizuj zarodek zanurzony w 100% BABB pod odpowiednimi kątami do fotografii za pomocą metalowych kleszczy. Oświetlaj za pomocą kombinacji światła górnego i dolnego.

Źródła światła. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w kamerę cyfrową. Wykonaj wiele ekspozycji w jasnym polu w pięciu kolejnych płaszczyznach ogniskowych.

0,5 milimetra od siebie wzdłuż osi Z. Czasy naświetlania i przysłony mogą się różnić w zależności od oświetlenia i specyfikacji aparatu i muszą być zoptymalizowane dla każdej konfiguracji. Użyj standardowego oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby przetwarzać obrazy nakładkowe i generować fotomontaże.

Genotypy homozygot A tal Lai są wstecz zerowe, a heterozygoty A tal Lai wstecz. Zarodki snu można jednoznacznie określić za pomocą standardowego genotypowania PCR. Barwienie ALS pokazuje szczegółowe podskórne obwodowe altanki aksonalne w zarodkach, projekcje aksonów ze zwojów nerwu trójdzielnego i tułowia oraz głowy są pokazane w nieoczyszczonym zarodku.

W tym przypadku barwienie ex GS pokazuje szczegółowe obwodowe altanki aksonalne w wypustkach ze zwojów korzenia grzbietowego w środkowej części tułowia przed i po oczyszczeniu z BABB w zarodkach, które są całkowicie pozbawione sygnalizacji Track A, ale przenoszą konstytutywnie aktywowaną kinazę. Mutacja BRAF pod kontrolą gniazda specyficznego dla neuronu. U promotora morfologia projekcji obwodowych nocyceptorów rozwijała się prawie normalnie.

Pokazuje to kluczową funkcję sygnalizacji BRAF we wzroście aksonów obwodowych i pokazuje, że funkcje promujące przeżycie i wzrost aksonów sygnalizacji ścieżki A mogą być oddzielone za pomocą wstecznego zerowego tła genetycznego zastępującego utratę sygnalizacji przeżycia zależnej od ścieżki A. Ważne jest, aby nie przesadzić z mocowaniem zarodków, co mogłoby zagrozić aktywności enzymatycznej beta glaces. Pamiętaj również, że BABB jest materiałem bardzo niebezpiecznym i podczas pracy z nim zawsze należy stosować odpowiednią wentylację i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie przetwarzać, barwić i wizualizować luźne, poplamione aksony u nienaruszonego zwierzęcia.