Name: Izolacja miofibroblastów z przełyku myszy i człowieka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Naucz się izolować pierwotne miofibroblasty z przełyku myszy i człowieka. Metoda obejmuje trawienie kolagenazą i hodowlę komórek do badań interakcji nabłonkowo-międzykomórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół przeprowadzania eksperymentów na zwierzętach, uzasadnienie i cele badań, zostały przedłożone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Południowej Kalifornii.
Protokół tworzenia kultur pierwotnych z pozbawionych tożsamości próbek ludzkiej esofagektomii został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu Południowej Kalifornii.
1. Uzyskaj przełyk myszy lub człowieka
<ol>
	<li>Uzyskaj przełyk myszy:
	<ol>
		<li>Poddaj eutanazji 8-12-dniową mysz za pomocą 2% przedawkowania izofluranu wziewnego, a następnie zwichnięcia szyjki macicy.</li>
		<li>Przygwoźdź zwierzę brzuchem do góry i zwilż powierzchnię brzuszną 70% etanolem. Za pomocą kleszczy chwyć i podnieś skórę przed otworem cewki moczowej za pomocą kleszczy. Użyj standardowych prostych nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć wzdłuż brzusznej linii środkowej od ujścia cewki moczowej do podbródka. Uważaj, aby przeciąć tylko skórę.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie od ujścia cewki moczowej w dół do kolana po obu stronach zwierzęcia, tworząc odwrócone "Y". Wykonaj kolejne nacięcie po obu stronach zwierzęcia wzdłuż klatki piersiowej.</li>
		<li>Ostrożnie oderwij skórę po obu stronach, od leżącej poniżej otrzewnej i klatki piersiowej, a następnie połóż na bokach. Zbadaj klatkę piersiową leżącą nad jamą piersiową i otrzewną leżącą nad jamą brzuszną.
		<ol>
			<li>Podnieś otrzewną kleszczami i przetnij ją aż do przepony i klatki piersiowej, kierując nożyczki do góry, aby zapobiec uszkodzeniu treści brzusznej. Delikatnie podnieś lewy płat wątroby, odsłoń leżący pod spodem żołądek, połączenie przełykowo-żołądkowe i brzuszną część przełyku.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Użyj autoklawowanych nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć mostek i klatkę piersiową wzdłuż linii środkowej aż do obręczy szyjnej. Skieruj nożyczki do góry, aby zapobiec uszkodzeniu treści klatki piersiowej. Całkowicie odsłoń zawartość klatki piersiowej, pociągając klatkę piersiową na boki.</li>
		<li>Delikatnie usuń serce i oba płaty płuc. Wchłoń nadmiar krwi za pomocą patyczków higienicznych. Przełyk piersiowy jest wąską, elastyczną rurką leżącą z tyłu tchawicy i z przodu kręgu piersiowego. 
		UWAGA: Przełyk może być trudny do zidentyfikowania u mysich noworodków. Lokalizacja połączenia przełykowo-żołądkowego sprawia, że identyfikacja przełyku jest prosta.</li>
		<li>Ostrożnie podążaj za przełykiem w górę od żołądka, preparując otaczające naczynia krwionośne, tłuszcz i krezkę aż do początku przełyku w jamie szyjki macicy. Najlepiej sprawdzają się w tym celu nożyczki chirurgiczne z końcówką.</li>
		<li>Wyciąć całą długość przełyku i umieścić w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS) w celu dalszego przetwarzania opisanego poniżej. W razie potrzeby usuń część żołądka w celach orientacyjnych. 
		UWAGA: Ze względu na mały rozmiar tkanki, oddzielenie mięśni właściwych od błony śluzowej mięśni nie jest możliwe do osiągnięcia w przełyku u noworodków mysich i cały przełyk jest poddawany przetwarzaniu opisanemu poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj ludzki przełyk:
	<ol>
		<li>Umyj próbki do resekcji przełyku (zwykle 5 cm lub mniej) HBSS i usuń przyczepioną tkankę łączną, tłuszcz lub naczynia krwionośne.</li>
		<li>Wyciąć część próbki i umieścić ją w formalinie do przyszłego badania histologicznego, jeśli jest to pożądane.</li>
		<li>Oddziel pozostałą błonę śluzową od leżących pod nią mięśni właściwych przez ostre rozwarstwienie.</li>
		<li>Pokrój błonę śluzową na subcentymetrowe fragmenty i postępuj zgodnie z protokołem opisanym poniżej. 
		UWAGA: Resekcje ludzkiego przełyku mogą być przechowywane w PBS do 6 godzin przed przetwarzaniem opisanym poniżej. Źródło próbek z przełyku będzie dyktować rozmiar próbki i będzie zależne od laboratorium.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wyizoluj mysie i ludzkie komórki zrębu przełyku
<ol>
	<li>Izoluj komórki zrębu przełyku z tkanki mysiej i ludzkiej przez połączenie trawienia mechanicznego i enzymatycznego.
	<ol>
		<li>Trawienie mechaniczne poprzez mielenie tkanki nożyczkami i wielokrotne płukanie HBSS. Trawienie enzymatyczne poprzez inkubację tkanki z 300 U/ml kolagenazy XI i 0,1 mg/ml dypazy przez 25 minut (tkanka mysie) lub do 6 godzin (tkanka ludzka). Upewnij się, że narzędzia używane do mielenia zostały autoklawowane i wysterylizowane. 
		UWAGA: Kolagenazy to enzymy, które rozkładają kolagen, białko macierzy zewnątrzkomórkowej odpowiedzialne za utrzymywanie razem tkanki zwierzęcej. Kolagenaza XI ma wysoką aktywność kolagenazy i odniosła sukces w tym protokole izolacji. Dyspaza jest enzymem bakteryjnym o łagodnej proteolitycznej aktywności dysocjacji, który zachowuje aktywność błony komórkowej i jest stosowany w połączeniu z kolagenazą jako enzym drugorzędny.</li>
		<li>Fragmenty błony śluzowej uzyskane z tkanek mysich lub ludzkich należy umieścić odpowiednio w mikrowirówce o pojemności 1,7 ml lub probówkach o pojemności 5 ml zawierających HBSS. Zmiel tkankę dalej na kawałki o średnicy 2-3 mm za pomocą nożyczek z otwartą końcówką, która będzie pasować do odpowiednich tubek. Odczekaj wystarczająco dużo czasu, aby fragmenty błony śluzowej przełyku osiadły na dnie probówki.</li>
		<li>Powoli zdekantować HBSS, uważając, aby przypadkowo nie wyrzucić tkanki. Zastąp świeżym HBSS, a następnie delikatnie potrząśnij. Alternatywnie, usunąć HBSS za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
		<li>Umyj chusteczkę w ten sposób w sumie 8 razy, delikatnie potrząsając między praniami, pozostawiając czas na osadzenie się fragmentów przełyku między każdym myciem. 
		UWAGA: Tkanka ludzka będzie wymagała większego rozdrobnienia niż tkanka myszy noworodka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować tkankę mysią z 300 j./ml kolagenazy XI i 0,1 mg/ml dispazy przez 25 minut na kołyszącym się wytrząsarce ustawionej na niskich obrotach w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Inkubować tkankę ludzką z kolagenazą 300 U/ml XI i 0,1 mg/ml dypazy przez okres do 6 godzin, na kołyszącym się wytrząsarce ustawionym na niską prędkość w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Dostępność ludzkiego przełyku jest zmienna. Ludzka błona śluzowa przełyku inkubowana z enzymami przez okres do 6 godzin skutkuje udanym generowaniem kultur pierwotnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po trawieniu enzymatycznym rozdrobnić tkankę nożyczkami i odwirować przy 200 x g przez 10 min.</li>
	<li>Odrzucić supernatant. Przenieś osad, składający się z zawiesiny mieszanych komórek, do probówki o pojemności 5 ml i przemyj 5 razy w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 2% sorbitolem w celu wyeliminowania niezdolnych do życia komórek i zanieczyszczeń.</li>
	<li>Komórki nasienne w płytkach 6-dołkowych i hodowla w DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 10 mg / ml insuliny, 10 μg / ml transferyny, 10 μg / ml gentamycyny i 2 ng / ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF). Filtr próżniowy (0,22 μm) wszystkie składniki z wyjątkiem EGF, który można dodać po filtracji. Umieść komórki uzyskane z próbek do resekcji u ludzi na wielu płytkach 6-dołkowych, w zależności od wielkości resekcji.</li>
	<li>Gdy studzienki są w 80% zlewne, przejdź przylegające komórki do kolb T25 za pomocą 0,05% trypsyny / kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Zneutralizować pożywką i odwirować z prędkością 400 x g.
	<ol>
		<li>W przypadku przejścia 6-dołkowego do kolby T25, komórki pasażowe w stosunku 1:1. Kolby Confluent T25 mogą być przepuszczane w stosunku 1:2 lub 1:3. Aby przejść z kolby T25 do kolby T75, należy użyć proporcji 1:1. Zmieniaj media co 2-3 dni niezależnie od naczynia.</li>
		<li>Hodować komórki w temperaturze 37 ºC w nawilżonym inkubatorze 5% CO2 i hodować w pożywkach miofibroblastów opisanych powyżej. 
		UWAGA: Komórki nabłonkowe nie przeżywają w tych warunkach hodowli lub pasażu. Komórki użyte do charakterystyki i w badaniach opisanych poniżej znajdują się między pasażami 5 i 15.</li>
		<li>Kriokonserwuj komórki w cieczyN2 przez dodanie 10% dimetylosulfotlenku do pożywki miofibroblastów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Charakterystyka mysich i ludzkich komórek zrębowych przełyku
<ol>
	<li>Zbadaj morfologię komórek za pomocą odwróconego mikroskopu. Obserwuj wrzecionowatą morfologię przylegających komórek (ryc. 1).</li>
	<li>Scharakteryzuj hodowane komórki, oceniając następujące markery cytoszkieletu: α-SMA, wimentyna, desmina i cytokeratyna. Komórki zrębu o fenotypie podobnym do miofibroblastów wyrażają markery miofibroblastów cytoszkieletu α-SMA i wimentyna (ryc. 2).
	<ol>
		<li>Aby jeszcze bardziej odróżnić hodowane komórki zrębu od komórek mięśniowych, barwnik immunologiczny dla desminy. Aby przeprowadzić barwienie immunologiczne na hodowanych komórkach, należy umieścić 1,5 x 104 komórki w 4-dołkowych szkiełkach komórkowych i hodować w pożywkach miofibroblastów przez 24 godziny. Komórki zrębu o fenotypie podobnym do miofibroblastów będą miały słabą lub nieobecną ekspresję desminy. W komórkach zrębu brakuje ekspresji markera nabłonkowego pan-cytokeratyny (dane nie pokazane). 
		UWAGA: Ocena kultur obejmuje ocenę markerów cytoszkieletu za pomocą immunocytochemii i markerów powierzchniowych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Immunocytochemia jest stosowana jako podstawowa metoda charakterystyki, ponieważ profil ekspresji białek cytoszkieletu jest unikalny dla fibroblastów, miofibroblastów lub komórek mięśniowych. Cytometria przepływowa ustala czystość hodowli poprzez ocenę ekspresji markerów komórek nabłonkowych, śródbłonkowych i krwiotwórczych na powierzchni komórki. CD90 jest pomocny jako wspomagająca metoda identyfikacji ludzkich komórek zrębu, ponieważ ulega ekspresji zarówno na ludzkich fibroblastach, jak i miofibroblastach. CD90 nie jest pomocny w charakterystyce mysich komórek zrębu, ponieważ ulega również ekspresji przez mysie limfocyty T.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 60% konfluencji, przepłucz szkiełka solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i utrwal metanolem. Inkubować komórki w metanolu przez 10 minut w temperaturze -20 °C, a następnie przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem barwienia immunologicznego.</li>
	<li>Krótko, przed zastosowaniem przeciwciała pierwszorzędowego, zablokuj utrwalone komórki 5% kozią surowicą w PBS. Rozcieńczyć również przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe w 5% surowicy koziej.
	<ol>
		<li>Do wykrywania α-SMA i wimentyny należy stosować następujące przeciwciała i stężenia: mAB myszy do α-SMA w rozcieńczeniu 1:250 i pAB królika do wimentyny w rozcieńczeniu 1:500.</li>
		<li>Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze pokojowej przez noc w temperaturze 4 °C, przepłukać 3 razy PBS i dodać przeciwciała drugorzędowe Koniugacja Rodaminy Koza anty mysz w rozcieńczeniu 1:200 i Cy2 sprzężona Koza anty Królik w rozcieńczeniu 1:1,000 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wybarwić jądra przeciwstawne 4', 6-diamidyno-2fenyloindolem (DAPI) w stężeniu 1 μg/ml przez 1 minutę, a następnie przemyć PBS. Analizuj szkiełka za pomocą odwróconego mikroskopu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustalić czystość kultur, badając mysie i ludzkie komórki przełyku pod kątem markerów powierzchni komórek krwiotwórczych (CD45) i śródbłonka (CD31) za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 3). Scharakteryzuj komórki ludzkie dalej przez ekspresję markera powierzchni komórek zrębu CD90. 
	UWAGA: CD90 nie może być używany do identyfikacji mysich komórek zrębu, ponieważ mysie limfocyty T również wyrażają CD90.
	<ol>
		<li>Odłączyć hodowane komórki zrębu przełyku myszy od kolb hodowlanych przez traktowanie nieenzymatycznym roztworem do dysocjacji komórek w temperaturze 37 °C przez 10 minut, dwukrotnie przemyć buforem FACS, policzyć i wybarwić FITC-CD45 i APC-CD31 z odpowiednimi kontrolami izotypu, zgodnie ze standardowymi procedurami barwienia.</li>
		<li>Zbieraj komórki za pomocą FACS CAlibur i analizuj dane za pomocą oprogramowania FlowJo. Przed barwieniem komórek zoptymalizuj przeciwciała i miareczkuj stężenia za pomocą kontroli izotypu, normalnej śledziony myszy i komórek szpiku kostnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+stromal+stem+cells+in+tissue+regeneration+and+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair.</a> Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).</li>
<li>Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cells+of+the+intestinal+lamina+propria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria.</a> Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).</li>
<li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Helper+2+Cytokines%2C+Transforming+Growth+Factor+beta1%2C+and+Eosinophil+Products+Induce+Fibrogenesis+and+Alter+Muscle+Motility+in+Patients+With+Eosinophilic+Esophagitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis.</a> Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).</li>
<li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+cells+important+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Paracrine cells important in health and disease.</a> The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).</li>
<li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+subepithelial+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intestinal subepithelial myofibroblasts.</a> The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).</li>
<li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+participate+in+the+murine+esophageal+mucosal+injury+response%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).</li>
<li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epimorphin+deletion+protects+mice+from+inflammation-induced+colon+carcinogenesis+and+alters+stem+cell+niche+myofibroblast+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).</li>
<li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).</li>
<li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li>
<li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastroesophageal+reflux+disease-associated+esophagitis+induces+endogenous+cytokine+production+leading+to+motor+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities.</a> Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).</li>
</ol>

Prace te są wspierane przez NIH/NCI K08CA153036-01A1 (AS), AGA-General Mills Bell Institute of Health and Nutrition Research Award in Gut Physiology and Health (AS) oraz Wright Foundation Pilot Award (AS).

Techniki generowania kultur pierwotnych są na ogół podobne w przypadku stosowania tkanki mysiej lub ludzkiej, z czasami mielenia i trawienia dostosowanymi do wielkości tkanki. Nasze doświadczenia z tkankami mysimi sugerują, że stosowanie opisanych powyżej metod konsekwentnie prowadzi do pomyślnego założenia kultur pierwotnych. Krytyczne kroki w ramach protokołu obejmują sterylizację sprzętu chirurgicznego i przestrzeganie standardowych sterylnych technik hodowli tkankowej. Wiek myszy jest również krytycznym krokiem. Nowo...

Interakcje nabłonkowo-zrębowe są zaangażowane w regulację różnych funkcji przewodu pokarmowego, w tym regeneracji błony śluzowej, naprawy, zwłóknienia i kancerogenezy1,2. Interakcje te zostały najlepiej zbadane w jelicie cienkim i okrężnicy i mogą podobnie odgrywać rolę w zaburzeniach błony śluzowej przełyku3. Wykazano, że subpopulacja komórek zrębu jelit i okrężnicy, zwana miofibroblastami, uczestniczy w pośredniczeniu w uszkodzeniu tkanek, zapaleniu i naprawie4,5. W dystalnym przewodzie pokarmowym te wrzecionowate komórki znajdują się w sąsiedztwie błony podstawnej na granicy między nabłonkiem a blaszką właściwą i są zdefiniowane jako α-SMA i wimentyna dodatnie, pan-cytokeratyny ujemne i słabo dodatnie lub desminaujemna 5.
Zrąb przełyku nie został rygorystycznie scharakteryzowany na poziomie komórkowym czy molekularnym. Nasze badania nad mysim przełykiem wykazały α-SMA i komórki wimentyny w zrębie przełyku, czasami podległe nabłonkowipłaskonabłonkowi 6. Interakcje nabłonkowo-zrębowe są związane z zaburzeniami błony śluzowej przełyku, takimi jak uraz za pośrednictwem żołądka i przełyku6 i eozynofilowe zapalenie przełyku3. Zwężenia zwłóknieniowe są również znanym powikłaniem uszkodzenia przełyku, a komórki zrębu są zaangażowane w patogenezę zwłóknienia przewodu pokarmowego. Izolacja tych komórek pomoże w przeprowadzeniu niezbędnych badań w celu zbadania zaburzonych szlaków sygnałowych.
To zgłoszenie dostarcza technik niezbędnych do stworzenia pierwotnych kultur miofibroblastów α-SMA dodatnich, wimentyno-dodatnich, dzięki czemu istniejące luki w wiedzy na temat szlaków sygnałowych pośredniczących w tych interakcjach mogą zostać wypełnione. Opisana technika została z powodzeniem zastosowana przez autorów do ustalenia pierwotnych mysich miofibroblastów okrężnicy7 i dalej zaadaptowana do tworzenia mysich 6 i ludzkich komórek zrębu przełyku podobnych do miofibroblastów.
Tutaj opisujemy warunki potrzebne do stworzenia i scharakteryzowania tych kultur założonych z przełyku myszy lub człowieka przed ich użyciem w przyszłych badaniach funkcjonalnych. Kultury mogą być uprawiane i wykorzystywane do 15 pasaży. Izolacja i założenie kultur pierwszorzędowych za pomocą metod opisanych poniżej powoduje uzyskanie komórek zrębu o fenotypie miofibroblastów; α-SMA, wimentyna dodatnia i słabo dodatnia lub ujemna dla desminy i cytokeratyny ujemnej. Ten fenotyp różni się od fenotypu fibroblastu przełyku, który jest głównie wimentyno-dodatni, α-SMA ujemny3 lub α-SMA dodatni, wimentynowo-ujemny fenotyp błony śluzowej mięśni6.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynniki do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F42442</td><td></td></tr><tr><td>Transferyna</td><td>Roche</td><td>10-652-202-001</td><td></td></tr><tr><td>trypsyna/EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Odczynniki do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Mysz mAB do &alfa;-SMA&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab7817</td><td></td></tr><tr><td>Królik pAB do wimentyny</td><td>abcam</td><td>ab45939</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 sprzężony Koza anty Rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-225-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>CD31 sprzężony z eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>CD90 sprzężony z APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0909-41</td><td></td></tr><tr><td>Aneksyna V i 7AAD</td><td>BD Pharmigen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>Blok Fc myszy do CD16/CD32</td><td>BD Pharmigen</td><td>2136662</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Sprzęt</td></tr><tr><td>Probówka 5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td></td></tr><tr><td>Komora bezpieczeństwa biologicznego i inkubatory</td><td>Nuaire</td><td></td><td><a href="http://www.nuaire.com/products/" target="_blank">http://www.nuaire.com/products/</a></td></tr><tr><td>4-dołkowe szkiełka komorowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Próżniowy system filtracyjny</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>T25 Kolby</td><td>TRP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T75 Kolby</td><td>Corning</td><td>43064</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>preparacyjne</td></tr><tr><td>Końcówki Q z pojedynczą końcówką</td><td>Kendall</td><td>540500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Oprogramowanie</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Metamorph (Urządzenia molekularne)</td>Urządzenia <td></td><td></td><td>molekularne</td></tr><tr><td>FACSCAlibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja miofibroblastów z przełyku myszy i człowieka

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Mysie i ludzkie miofibroblasty przełyku są generowane przez trawienie enzymatyczne. Mysi przełyk noworodka (8-12 dni) jest zbierany, mielony, myty i poddawany trawieniu enzymatycznemu z kolagenazą i dypazą przez 25 minut. Próbki z resekcji ludzkiego przełyku są pozbawiane muscularis propria i adventitia, a pozostała błona śluzowa jest mielona i poddawana trawieniu enzymatycznemu z kolagenazą i dypazą przez okres do 6 godzin. Hodowane komórki eksprymują α-SMA i wimentynę, a desminę wyrażają słabo lub wcale. Warunki hodowli nie sprzyjają wzrostowi komórek nabłonkowych, krwiotwórczych ani śródbłonka. Czystość hodowli jest dodatkowo potwierdzana przez cytometryczną ocenę cytometrii przepływowej ekspresji markerów powierzchniowych komórek potencjalnie zanieczyszczających komórek krwiotwórczych i śródbłonka. Opisana technika jest prosta i skutkuje konsekwentnym wytwarzaniem niehematopoetycznych, nieśródbłonkowych komórek zrębu. Ograniczenia tej techniki są nieodłącznie związane z wykorzystaniem kultur pierwotnych w badaniach biologii molekularnej, tj. nieuniknioną zmiennością występującą między kulturami ustalonymi na różnych myszach lub ludziach. Hodowle pierwotne są jednak bardziej reprezentatywnym odzwierciedleniem stanu in vivo w porównaniu z liniami komórkowymi. Metody te dają również badaczom możliwość izolowania i hodowli komórek zrębu z różnych warunków klinicznych i eksperymentalnych, umożliwiając porównania między grupami. Scharakteryzowane komórki zrębu przełyku mogą być również wykorzystywane w badaniach funkcjonalnych badających interakcje nabłonkowo-zrębowe w zaburzeniach przełyku.

Komórki ziaren przełyku, wyizolowane za pomocą trawienia mechanicznego i enzymatycznego, są początkowo wysiewane i hodowane na płytkach 6-dołkowych. Badanie komórek pod mikroskopem odwróconym w ciągu kilku godzin od wysiania wykazuje mieszaną zawiesinę komórkową słabo przylegającą do dna płytki (Rycina 1A). W ciągu następnych 24 h obserwuje się komórki wrzecionowate, silnie przylegające do dna płytki, które wyłaniają się z mieszanej zawiesiny komórkowej (Rycina 1B). Komórki te pokrywają ...

Przedstawiamy protokół generowania pierwotnych kultur mysich i ludzkich komórek zrębu przełyku z fenotypem miofibroblastów. Hodowane komórki mają morfologię wrzecionowatą, wykazują ekspresję α-SMA i wimentyny oraz nie mają markerów powierzchni komórek nabłonkowych, krwiotwórczych i śródbłonkowych. Scharakteryzowane komórki zrębu mogą być wykorzystane w badaniach funkcjonalnych oddziaływań nabłonkowo-zrębowych.

Izolacja miofibroblastów z przełyku myszy i człowieka

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie pierwotnych miofibroblastów z przełyku myszy i człowieka. Osiąga się to poprzez najpierw pobranie całego przełyku od nowonarodzonej myszy dawcy z ludzką tkanką. Błona śluzowa jest oddzielona od mięśnia właściwego.Drugim krokiem jest zmielenie chusteczki i kilkukrotne umycie w HBSS. Następnie tkanka jest trawiona za pomocą kolagenazy diss i dalej mielona, uwalniając komórki mezenchymalne wraz z przyczepionym nabłonkiem. Heterogeniczna populacja komórek jest następnie hodowana w pożywkach miofibroblastów, w których przylegają miofibroblasty, podczas gdy komórki nabłonkowe nie przeżywają i są wypłukiwane.Ostatecznie immunochemia i cytometria przepływowa są wykorzystywane do potwierdzenia, że komórki w hodowli pierwotnej są miofibroblastami. Procedury zademonstruję ja, Matthew Gargas, technik, i mój nowy, doktor habilitowany z mojego laboratorium, Tori. Po eutanazji myszy w wieku od 8 do 12 dni, przypnij grzbietową stronę zwierzęcia i zwilż powierzchnię brzuszną 70% etanolem.Następnie za pomocą kleszczy chwyć i unieś skórę przed otworem cewki moczowej. Przeciąć wzdłuż brzusznej linii środkowej od ujścia cewki moczowej do podbródka. Przetnij

isolation-of-myofibroblasts-from-mouse-and-human-esophagus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film pokazuje izolację pojedynczych włókien mięśniowych z pobranego mięśnia myszy Extensor Digitorum Longus (EDL). Wyizolowane włókna mięśniowe można hodować w celu zbadania aktywności komórek macierzystych mięśni związanych z włóknami mięśniowymi.

Izolacja włókien mięśniowych: technika uzyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych z zebranego mięśnia prostownika myszy Digitorum Longus (EDL)

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

Miofibroblast jest wpływową komórką zrębu przewodu pokarmowego, która reguluje ważne procesy fizjologiczne zarówno w stanie normalnym, jak i chorobowym. Opisujemy technikę, która pozwala na izolację pierwotnych miofibroblastów zarówno z mysjej, jak i ludzkiej tkanki okrężnicy, którą można wykorzystać do eksperymentów in vitro.

Izolacja pierwotnych miofibroblastów z tkanki okrężnicy myszy i człowieka

Ten manuskrypt opisuje produkcję, charakterystykę i potencjalne zastosowania konstruktu przełyku 3D wykonanego z normalnego pierwotnego ludzkiego fibroblastu przełyku i płaskonabłonkowych komórek nabłonkowych umieszczonych w pozbawionym komórek rusztowaniu wieprzowym. Wyniki wskazują na tworzenie się dojrzałego nabłonka warstwowego podobnego do normalnego ludzkiego przełyku.

Produkcja, charakterystyka i potencjalne zastosowania 3D modelu błony śluzowej przełyku dla człowieka opartego na inżynierii tkankowej

Tutaj przedstawiono protokół izolacji i tworzenia pierwotnych kultur fibroblastów/miofibroblastów (MF) z zamrożonych komórek tkanki żołądka, jelita cienkiego i okrężnicy o fenotypie MF. Komórki te wyrażają CD90, α-SMA i wimentynę. MF mogą być używane do różnych testów funkcjonalnych, w tym aktywności enzymatycznej i produkcji cytokin.

Izolacja fibroblastów/miofibroblastów CD 90+ z ludzkich mrożonych próbek przewodu pokarmowego

Uzyskanie czystej populacji fibroblastów jest kluczowe dla badania ich roli w gojeniu ran i zwłóknieniu. Opisano tutaj szczegółową metodę izolowania fibroblastów i miofibroblastów z nieuszkodzonych i uszkodzonych serc myszy, a następnie scharakteryzowanie ich czystości i funkcjonalności za pomocą immunofluorescencji, RTPCR, sortowania komórek wspomaganego fluorescencją i skurczu żelu kolagenowego.

Izolacja i charakterystyka dorosłych fibroblastów i miofibroblastów serca

Ten protokół ilustruje 1) izolację i hodowlę pierwotnych fibroblastów z mięśnia brzuchatego łydki dorosłej myszy, a także 2) oczyszczanie i charakterystykę egzosomów za pomocą różnicowej metody ultrawirowania w połączeniu z gradientami gęstości sacharozy, a następnie analizami western blot.

Izolacja i charakterystyka egzosomów z fibroblastów mięśni szkieletowych

Tutaj proponujemy metodę efektywnego pozyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych we wczesnych stadiach rozwoju pourodzeniowego z homozygotycznego zmutowanego modelu myszy Lamin Δ8-11, bardzo ciężkiego modelu dystrofii mięśniowej Emery'ego-Dreifussa (EDMD).

Izolacja i hodowla pojedynczych włókien mięśniowych z mysiego modelu dystrofii mięśniowej Embergla-Dreifussa we wczesnym rozwoju poporodowym

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mysich mezenchymów jelitowych, w tym telocytów. Mogą one być wykorzystywane do kilku zastosowań, takich jak współhodowla z organoidami pochodzącymi od myszy lub ludzi, w celu wsparcia wzrostu i lepszego odzwierciedlenia sytuacji w oryginalnej tkance.

Izolacja mysiej mezenchymy jelitowej skutkująca wysoką wydajnością telocytów

Współhodowle organoidów i fibroblastów dostarczają modelu do badania niszy komórek macierzystych in vivo. W tym miejscu opisano protokół dla kokultur organoidów i fibroblastów przełyku. Dodatkowo obrazowanie całego mocowania służy do wizualizacji interakcji fibroblast-organoid.

Charakterystyka funkcjonalna i wizualizacja fibroblastów przełyku przy użyciu kokultur organoidowych

Tutaj dostępny jest protokół hodowli ludzkich organoidów przełykowych i kultury na granicy faz powietrze-ciecz. Kultura granicy faz powietrze-ciecz organoidów przełyku może być wykorzystana do badania wpływu cytokin na barierę nabłonkową przełyku.

Trójwymiarowe modele hodowli komórkowych w celu zbadania bariery nabłonkowej w eozynofilowym zapaleniu przełyku

Naucz się izolować pierwotne miofibroblasty z przełyku myszy i człowieka. Metoda obejmuje trawienie kolagenazą i hodowlę komórek do badań interakcji nabłonkowo-międzykomórkowych.

Izolacja miofibroblastów z przełyku myszy i człowieka

Przeglądaj więcej filmów