Izolacja miofibroblastów z przełyku myszy i człowieka
January 18th, 2015
Przedstawiamy protokół generowania pierwotnych kultur mysich i ludzkich komórek zrębu przełyku z fenotypem miofibroblastów. Hodowane komórki mają morfologię wrzecionowatą, wykazują ekspresję α-SMA i wimentyny oraz nie mają markerów powierzchni komórek nabłonkowych, krwiotwórczych i śródbłonkowych. Scharakteryzowane komórki zrębu mogą być wykorzystane w badaniach funkcjonalnych oddziaływań nabłonkowo-zrębowych.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie pierwotnych miofibroblastów z przełyku myszy i człowieka. Osiąga się to poprzez najpierw pobranie całego przełyku od nowonarodzonej myszy dawcy z ludzką tkanką. Błona śluzowa jest oddzielona od mięśnia właściwego.
Drugim krokiem jest zmielenie chusteczki i kilkukrotne umycie w HBSS. Następnie tkanka jest trawiona za pomocą kolagenazy diss i dalej mielona, uwalniając komórki mezenchymalne wraz z przyczepionym nabłonkiem. Heterogeniczna populacja komórek jest następnie hodowana w pożywkach miofibroblastów, w których przylegają miofibroblasty, podczas gdy komórki nabłonkowe nie przeżywają i są wypłukiwane.
Ostatecznie immunochemia i cytometria przepływowa są wykorzystywane do potwierdzenia, że komórki w hodowli pierwotnej są miofibroblastami. Procedury zademonstruję ja, Matthew Gargas, technik, i mój nowy, doktor habilitowany z mojego laboratorium, Tori. Po eutanazji myszy w wieku od 8 do 12 dni, przypnij grzbietową stronę zwierzęcia i zwilż powierzchnię brzuszną 70% etanolem.
Następnie za pomocą kleszczy chwyć i unieś skórę przed otworem cewki moczowej. Przeciąć wzdłuż brzusznej linii środkowej od ujścia cewki moczowej do podbródka. Przetnij tylko skórę.
Następnie wykonaj nacięcia od ujścia cewki moczowej do kolan, tworząc odwróconą literę Y. Po nacięciach do kolan wykonaj nacięcia po obu stronach klatki piersiowej. Po wykonaniu nacięć ostrożnie oderwij skórę i odłóż ją na bok. Teraz podnieś otrzewną i przetnij ją aż do przepony i klatki piersiowej.
Trzymaj nożyczki skierowane do góry, aby uniknąć uszkodzenia treści w klatce piersiowej i jamie brzusznej. Następnie delikatnie podnieś lewy płat wątroby, aby odsłonić leżący pod spodem żołądek, połączenie żołądkowe przełyku i brzuszną część przełyku za pomocą nożyczek chirurgicznych przeciętych wzdłuż linii środkowej mostka i klatki piersiowej aż do obręczy szyjnej. Znów. Robiąc to, trzymaj nożyczki pod kątem z dala od leżących poniżej narządów.
Następnie odsuń klatkę piersiową, aby odsłonić zawartość jamy klatki piersiowej. Teraz delikatnie usuń serce i oba płaty płuc. W razie potrzeby użyj bawełnianych aplikatorów, aby wchłonąć krwawienie.
Przełyk piersiowy jest wąską, elastyczną rurką znajdującą się za tchawicą i przednią do kręgu piersiowego. U noworodków znajdź połączenie żołądkowo-przełykowe, aby zidentyfikować przełyk od żołądka. Dosadnie przeanalizuj układ naczyniowy otaczający przełyk, w tym tkankę tłuszczową i krezkową, aż do początku przełyku w jamie szyjki macicy.
Teraz wytnij całą długość przełyku i w razie potrzeby przenieś go do schłodzonego HBSS. Usuń również część żołądka w celach orientacyjnych. Rozpocznij ten protokół od zmielenia fragmentów błony śluzowej uzyskanych z tkanki mysiej lub ludzkiej w HBSS w 1,7-mililitrowej mikroprobówce lub pięciomililitrowej probówce.
Teraz, gdy uzyskuje się ludzkie komórki zrębu przełyku, ważne jest, aby oddzielić błonę śluzową od leżących pod nią mięśni właściwych przez ostre rozwarstwienie. Teraz w tubie dalej bije tkankę na dwa do trzech milimetrowych kawałków za pomocą cienkich nożyczek. Po osadzie fragmentu błony śluzowej przełyku powoli zdekantuj HBSS, uważając, aby przypadkowo nie wyrzucić tkanki.
Możesz również użyć pipety z dużą końcówką, aby usunąć dodatkowe HBSS. Następnie dodaj świeży HBSS. Wymieszaj tubkę z delikatnym wstrząsem i pozwól chusteczce osiąść.
Po ustabilizowaniu ponownie zdekantuj HBSS i powtórz to pranie. W sumie zrób krok osiem razy. Po ośmiu płukaniach inkubuj tkankę z kolagenazą 11 i inkubuj tkankę mysią do 25 minut na kołyszącym się wytrząsarce ustawionym na niską prędkość i w temperaturze pokojowej.
W tych samych warunkach inkubuj ludzką tkankę przez sześć godzin. Po strawieniu wymieszaj tkankę jeszcze bardziej za pomocą drobnych nożyczek, a następnie odwiruj tkankę w sile 200 G przez 10 minut. Wyrzucić supernatant i zdekantować granulowaną tkankę do czystej probówki o pojemności 1,7 mililitra.
Następnie pod kapturem do hodowli tkankowej umyj komórki pięć razy w DMEM z 2% sorbitolem, aby wyeliminować niezdolne do życia komórki i inne zanieczyszczenia. Przy każdym płukaniu pozwól komórkom osiąść grawitacyjnie i zdekantuj roztwór do mycia. Po umyciu zasiej komórki do trzech dołków po sześć.
Dobrze płytkować i hodować je w filtrowanym próżniowo uzupełnionym DMEM. Tkanka ludzka może wymagać większej liczby dołków lub płytek, w zależności od wielkości próbki kultury, komórek, aż studzienki będą zlewać się w 80%. Następnie najpierw przełóż komórki adhezyjne do kolb T 25, użyj 0,05% trypsyny w EDTA, aby usunąć komórki.
Następnie dodaj pożywkę, aby zneutralizować reakcję. Zebrać usunięte komórki do probówki wirówkowej. Następnie obróć komórki pod ciśnieniem 400 G, aby zebrać je pod mikroskopem.
Obserwuj wrzecionowatą morfologię przylegających komórek, aby odróżnić hodowane komórki zrębu od komórek mięśniowych, zabarwić je immunologicznie dla Desmonda. Korzystając ze standardowego protokołu, krótko połóż 15 000 komórek w czterech szkiełkach dołek i hoduj w pożywce miofibroblastów przez 24 godziny. Następnego dnia utrwal komórki, a następnie przed zastosowaniem przeciwciała pierwszorzędowego zablokuj utrwalone komórki 5% surowicą kozią w PBS, zarówno przeciwciała pierwszorzędowe, jak i drugorzędowe należy również rozcieńczyć w 5% surowicy kozy.
Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie po przepłukaniu komórek trzykrotnie przepłukać je PBS. Dodaj przeciwciała drugorzędowe i inkubuj komórki przez godzinę.
W temperaturze pokojowej należy trzykrotnie przepłukać PBS w celu usunięcia przeciwciał drugorzędowych. Następnie wybarwione komórki można przeanalizować po przepłukaniu. Zastosuj DPI z podłożem montażowym i szkiełkiem nakrywkowym, aby ustalić czystość komórek przełyku.
Sprawdź je pod kątem markerów powierzchni komórek krwiotwórczych i śródbłonka. Korzystanie z cytometrii przepływowej. Wyhoduj wystarczającą liczbę w kolbach hodowlanych, aż będą gotowe do zebrania.
Następnie odłącz hodowane komórki zrębu przełyku myszy za pomocą nieenzymatycznego roztworu dysocjacji komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po ich zebraniu. Umyj komórki dwukrotnie buforem faksu i policz komórki.
Teraz za pomocą standardowej procedury barwienia wybarwić CD 45 w celu identyfikacji komórek odpornościowych i wybarwić CD 31 w celu identyfikacji komórek śródbłonka, a następnie przepuścić komórki przez cytometr przepływowy. Komórki zrębu przełyku wyizolowano za pomocą trawienia mechanicznego i enzymatycznego i wyhodowano na sześciu płytkach dołkowych w ciągu kilku godzin od posiewu. Komórki znajdowały się w mieszaninie luźno przylegającej do płytki.
W ciągu następnych 24 godzin komórki w kształcie wrzeciona wyrosły z zawiesiny ogniw i mocno przylegały do dna płytki. Komórki te pokryły całą studnię w ciągu pięciu dni i z powodzeniem przeszły, zachowując swoją morfologię przez co najmniej 15 widocznych tutaj pasaży, komórki mają niską gęstość. Są to komórki w kształcie wrzeciona w pobliżu współpłynności, barwienie immunologiczne pierwotnych kultur komórek zrębu przełyku.
Hodowane na szkiełkach komorowych wykazały obfitą ekspresję markerów cytoszkieletu miofibroblastów. Czystość kultur alfa, SMA i mentonów oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. Ustalono rozproszenie do przodu i na boki dla pierwotnych komórek zrębu przełyku, a następnie bramkowanie i analizę żywych komórek pod kątem białek powierzchniowych komórek.
Pierwotne komórki zrębu przełyku nie miały ekspresji hematopoetycznego CD 45 i brakowało ekspresji śródbłonkowych markerów powierzchni komórek CD 31. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustalić pierwotne kultury miofibroblastów z przełyku myszy i człowieka. Tak.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje izolację pierwotnych myofibroblastów z przełyku mysiego i ludzkiego. Kultivowane komórki wykazują fenotyp myofibroblastów, charakteryzujący się wrzecionowatą morfologią i specyficznym występowaniem markerów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Neuronauki
- Inżynieria tkankowa
Tło
- Myofibroblasty odgrywają kluczową rolę w naprawie tkanek i fibrozie.
- Zrozumienie interakcji epitelialno-stromalnych jest niezbędne dla różnych badań biologicznych.
- Kultury pierwotne zapewniają odpowiedni model do badania tych interakcji.
- Izolacja myofibroblastów może poprawić badania nad chorobami przełyku.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody izolacji pierwotnych myofibroblastów.
- Charakteryzacja izolowanych komórek do badań funkcjonalnych.
- Ułatwienie badań nad interakcjami epitelialno-stromalnymi w przełyku.
Stosowane metody
- Zbieranie przełyku od noworodków myszy dawców.
- Oddzielenie błony śluzowej od warstwy mięśniowej właściwej.
- Mięczenie i mycie tkanki w HBSS.
- Trawienie tkanki kolagenazą w celu uwolnienia komórek mezenchymalnych.
Główne wyniki
- Udana izolacja myofibroblastów o wrzecionowatej morfologii.
- Występowanie α-SMA i wimentyny potwierdza fenotyp myofibroblastów.
- Brakują markery epitelialne, krwiotwórcze i śródbłonkowe w hodowanych komórkach.
- Komórki nadają się do badań funkcjonalnych interakcji epitelialno-stromalnych.
Wnioski
- Protokół skutecznie izolowuje pierwotne myofibroblasty z tkanki przełyku.
- Charakteryzowane komórki mogą być wykorzystane w dalszych badaniach.
- Ta metoda przyczynia się do zrozumienia roli myofibroblastów w biologii przełyku.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and characterization of primary esophageal myofibroblasts enables disease-relevant modeling of stromal-epithelial interactions, a critical inflection point for target validation in fibrosis and tissue remodeling research. This protocol supports predictive confidence in early discovery by providing primary cell systems that closely reflect in vivo biology, reducing mechanistic ambiguity compared to immortalized lines. Consistent generation of pure stromal cultures facilitates cross-study and cross-condition comparisons, enhancing translational continuity across the R&D pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of stromal cell contributions to esophageal disease mechanisms.
- Supports functional target validation by providing primary, non-hematopoietic, non-endothelial stromal cells.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct study of epithelial-stromal interactions.
- Improves predictive confidence for pathway and target selection in fibrotic disease research.
Screening & Assay Development
- Provides validated primary cell systems for downstream functional assays.
- Ensures assay reproducibility and standardization by confirming cell purity via flow cytometry and immunostaining.
- Enables quantitative assessment of stromal cell responses to candidate compounds.
- Supports development of disease-relevant screening platforms for esophageal disorders.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with in vivo disease states by using primary human and murine cells.
- Facilitates translational biomarker discovery through comparative studies across clinical and experimental conditions.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing physiologically relevant data for preclinical validation.
- Enables functional studies of stromal-epithelial crosstalk relevant to fibrosis and tissue repair.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and preclinical research, providing a foundation for target validation, assay development, and translational studies in esophageal disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating pure stromal populations for mechanistic studies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation using primary myofibroblast cultures.
- Analytics: Enables robust measurement of cell marker expression and purity via flow cytometry and immunostaining.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by modeling disease-relevant stromal-epithelial interactions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol for isolating primary stromal cells from diverse clinical and experimental sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes primary cell isolation and characterization for reproducible results across studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing physiologically relevant data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on disease-relevant functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, primary cell culture, and flow cytometry analysis.
- Needs access to specialized instrumentation for cell sorting and immunostaining.
- Demands rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility of primary cultures.
- Adaptation may be necessary for different tissue sources or disease contexts.
- Primary culture variability across donors must be managed for consistent experimental outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:22
Isolating Murine Esophagi
3:51
Isolating Murine and Human Esophageal Stromal Cells
6:58
Characterizing Murine and Human Esophageal Stromal Cells
9:23
Results: Morphology, Cytochemistry and Purity of Cultured Esophageal Stromal Cells
10:56
Conclusion
