Profilowanie proteomiczne makrofagów za pomocą elektroforezy 2D

Makrofagi są kluczowymi komórkami zaangażowanymi w patogeniczność gospodarza. Makrofagi wykazują różnorodność fenotypową i funkcjonalną, którą można analizować i wykrywać za pomocą analizy proteomicznej. W artykule opisano, jak przeprowadzić elektroforezę 2D pierwotnych kultur ludzkich makrofagów zróżnicowanych do fenotypu M1 lub M2.

Ogólnym celem tej procedury jest analiza fenotypu ludzkich podzbiorów prozapalnych M1 i przeciwzapalnych M dwóch makrofagów poprzez różnicowanie 2D w elektroforezie żelowej. Osiąga się to poprzez pierwsze znakowanie białek wyekstrahowanych z pierwotnych kultur makrofagów M1 i M za pomocą barwników sinusoidalnych. W drugim etapie białka miesza się ze sobą, a na próbkach przeprowadza się ogniskowanie elektryczne ISO poprzez ponowne uwodnienie.

Następny drugi wymiar, elektroforeza jest wykonywana za pomocą zmobilizowanego gradientu pH lub pasków IPG w ciemności, a następnie żele są skanowane za pomocą różnicówki w skanerze elektroforezy żelowej. Ostatecznie przeprowadza się analizę ponumerowanych obrazów w celu wykrycia różnic w plamkach trawiennych polipów między dwoma podzbiorami makrofagów M1 i M. Główną zaletą tej techniki wśród istniejących metod, takich jak klasyczna elektroforeza w żelu todi, jest to, że technika ta jest bardziej czuła, wymaga tylko pięciu mikrogramów białek, co jest bardzo ważne w przypadku próbek pobieranych od ludzi.

Procedurę zademonstrują Mario Bove, doktorant, Olivia Beza i technik Magac z mojego laboratorium Aby przygotować pierwotne kultury makrofagów pochodzących z monocytów, zacznij od rozcieńczenia 25 mililitrów sierści Buffy w 25 mililitrach PBS. Następnie ostrożnie załaduj rozcieńczoną krew na gradient separacji i odwiruj komórki przez 20 minut w temperaturze 1600 G i temperaturze pokojowej, gdy komórki zakończą wirowanie. Zebrać monocyty w warstwie międzyfazowej, a następnie trzy kolejne płukania pobranych komórek w 10 mililitrach PBS zawierających 0,1% EDTA po trzecim płukaniu.

Zakręć komórki jeszcze raz w samym PBS, a następnie ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach pożywki RPMI 1640 bez nasion surowicy. Komórki w 35-milimetrowych szalkach o gęstości od jednego razy 10 do sześciu komórek na szalkę, a następnie po 90-minutowej sedymentacji w inkubatorze wyrzucić supernatant i przemyć przylegające monocyty trzykrotnie jednym mililitrem PBS. Następnie hodowla, komórki w 10 mililitrach świeżej pożywki zawierającej 10% objętości na objętość ludzkiej surowicy przez sześć dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Następnie, aby uzyskać przeciwzapalne makrofagi M dwa, uzupełnij niektóre kultury 15 nanogramami na mililitr IL cztery w szóstym dniu hodowli, aby uzyskać prozapalne makrofagi w 12 dniu. Traktuj inne kultury zróżnicowanych makrofagów 100 nanogramami na mililitr LPS przez cztery godziny, aby wyizolować podzbiory makrofagów do elektroforezy 2D. Następnie umyj interesującą kulturę trzykrotnie 25 milimolowymi trisami, a następnie uwolnij komórki z dna płytek za pomocą buforu ekstrakcyjnego czapsów.

Następnie przenieś komórki do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i zasznuruj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po pięciu minutach przenieś komórki w podwielokrotnościach o objętości 100 mikrolitrów do przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu analizy stężenia białka w celu elektroogniskowania ISO podzbiorów makrofagów. Najpierw dostosuj próbki do dziewięciu mikrolitrowych podwielokrotności, a następnie zredukuj roztwory komórkowe buforem do lizy uzupełnionym dwoma milimolami TCEP w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po jednej godzinie inkubować ekstrakty z S SI trzy i S SI pięć w temperaturze 37 stopni Celsjusza, zatrzymując reakcję po 30 minutach przez dodanie równej objętości buforu próbki. Następnie utwórz dwie oddzielne mieszaniny o równych objętościach S SI, trzech znakowanych białek M1 z SCI pięcioma znakowanymi białkami M, two. Następnie należy ponownie uwodnić pasek IPG z 450 mikrolitrami oznakowanych zmieszanych próbek w buforze ekstrakcyjnym Chapsa na izoelektrycznym systemie komórek ogniskujących przez 24 godziny bez stosowania prądu.

Następnego dnia rozpocznij ustawianie ostrości przy napięciu 300 woltów przez trzy godziny, następnie ustaw gradient do 1000 woltów na sześć godzin, a następnie dwa gradienty 8 000 woltów przez trzy godziny każdy, aby wykonać elektroforezę drugiego wymiaru, inkubować paski IPG w buforze równowagi. Po 10 minutach przenieś paski na 12,5% żele Page i uszczelnij je niskotopliwymi arosami. Następnie użyj systemu edin dsic o stałym napięciu 70 woltów, aby przeprowadzić elektroforezę w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez noc, a następnie 300 woltów, aż front błękitu bromofenolowego dotrze do dna żelu, aby uzyskać obrazy żeli.

Umieść je między dwiema szklanymi płytkami o niskiej fluorescencji skanera do obrazowania elektroforezą różnicową i żelową i skanuj żele przy długościach fal emisji wzbudzenia 5, 32, 5, 80 nanometrów dla trzech i 6 33, 6 70 nanometrów dla pięciu, aby uzyskać obrazy o rozmiarze piksela 100 mikrometrów. Przeanalizuj je za pomocą odpowiedniego oprogramowania, a następnie oblicz i znormalizuj objętość plamki na każdym obrazie, przypisując znormalizowaną objętość plamki jako proporcję całkowitej wartości każdej plamki wykrytej w żelu. Przeanalizuj różnice w objętościach plamek białkowych dla każdego typu makrofagów, porównując znormalizowaną wartość objętości plamki między dwiema grupami makrofagów, uznając różnicę między objętościami plamki za znaczącą, jeśli zmiana jest 1,5-krotna.

W tym eksperymencie. Wzorce białek 2D dwóch podtypów makrofagów, prozapalnego M1 i przeciwzapalnego M2, określono za pomocą różnicowania 2D. W elektroforezie żelowej ten sam wzór białek zaobserwowano dla M1 lub M 2, niezależnie od użytych barwników cyjanowych.

Co ciekawe, analiza bioinformatyczna żelu ujawniła, że 20 obszarów zawierających plamki, wzrosty i spadki między objętościami plamek zostały określone ilościowo, jak pokazano za pomocą żółtych, niebieskich i zielonych plam barwiących, które uznano za mające znaczące wyrażenie różnicowe, jeśli zmiana fałdu znormalizowanej objętości plamki była większa niż 1,5 przy wartości P mniejszej niż 0,05. Podążając za tym CHE, można zastosować metody takie jak spektrometria ilościowa, spektrometria mas lub dodatkowa analiza proteomiczna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jaki rodzaj białek ulega zróżnicowanej ekspresji między dwoma podzbiorami makrofagów w odpowiedzi na różne bodźce.