Name: Profilowanie proteomiczne makrofagów za pomocą elektroforezy 2D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Naucz się profilowania proteomicznego makrofagów M1 i M2 człowieka za pomocą elektroforezy 2D. Ta czuła metoda pozwala wykryć różnice w ekspresji białek przy użyciu zaledwie pięciu mikrogramów próbki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Inserm. Marion Bouvet jest stypendystką francuskiego Ministerstwa Badań Naukowych i Technologii. Annie Turkieh jest stypendystką programu Unii Europejskiej HOMAGE 7PR (305507).

Protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach w naszych instytucjach. Sierść buffy od zdrowych dawców została pozyskana z Regionalnego Centrum Transfuzji Krwi (Lille, Francja). Próbki uzyskane z kożuchów są deklarowane jako kolekcja Inserm (nr DC2010-1209).
1. Przygotowanie materiałów i pożywek kulturowych
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 10x sól fizjologiczną buforu fosforanowego (PBS) w sterylnej wodzie destylowanej, aby uzyskać 1x PBS.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę RPMI 1640 uzupełnioną gentamycyną (40 μg/ml) i L-glutaminą (2 mM), z 10% pulą surowicy ludzkiej i bez niej.</li>
</ol>
2. Pierwotne kultury makrofagów pochodzących z monocytów (MDM)
<ol>
	<li>Rozcieńczyć buffycoat (25 ml) z 1x PBS. Ostrożnie załadować do probówki Ficoll/leucosep i odwirować przy 1 600 x g przez 20 minut, w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zbierz monocyty na granicy faz do nowej probówki. Przemyć 3x 10 ml 1x PBS zawierający 0,1% kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) przez kolejne wirowanie po 1.000 x g, 370 x g i 160 x g przez 10 min każde, a następnie raz w 1x PBS sam przy 160 x g przez 10 min.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki RPMI-1640 bez surowicy i zasiać komórki w szalkach o średnicy 35 mm o gęstości 1 x 106 komórek na szalkę.</li>
	<li>Po sedymentacji przez 90 minut w inkubatorze należy odrzucić supernatant zawierający nieprzylegające komórki. Przemyć przylegające komórki, składające się z monocytów, 3x 1 ml PBS; Następnie dodać 1 ml świeżej pożywki zawierającej 10% (v/v) ludzkiej surowicy do wcześniej wolnych komórek surowicy.</li>
	<li>Po 6 dniach hodowli, aby uzyskać alternatywne zróżnicowane makrofagi (M2), dodaj rekombinowaną ludzką IL-4 (15 ng / ml) i utrzymuj przez 6 dni. Następnie należy potraktować zróżnicowane makrofagi lipopolisacharydem (100 ng / ml) w dniu 12 przez 4 godziny, aby uzyskać makrofagi M1.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja białek makrofagów M1 i M2 do elektroforezy 2D
<ol>
	<li>Przemyć makrofagi trzykrotnie 25 mM Tris, pH 7,4 i złom w buforze zawierającym 30 mM Tris pH 8, 4% 3-[(3-cholamidopropylo)dimetyloamonio]-1-propanosulfonianu (CHAPS), 2 M tiomocznika i 7 M mocznika.</li>
	<li>Lizować komórki za pomocą mieszalnika odpowiedniego do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml przez 5 minut w lodzie i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Określ stężenie białka za pomocą komercyjnego odczynnika Bradforda. Przechowywać 100 μl porcji białek w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
4. Izoelektrofokus
UWAGA: Wszystkie procedury etykietowania wykonuj w ciemności.
<ol>
	<li>Zredukować 5 μg każdej próbki (makrofagi M1 i M2) dostosowane do 9 μl za pomocą buforu do lizy z 2 mM tris(2-karboksyetylo)fosfiną (TCEP) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać cyjaninę 3 (Cy3) do ekstraktu M1 i ekstraktu barwnika sulfhydryl-reaktywnego M2 w stężeniu 0,8 nM/μg białka. Dodać cyjaninę 5 (Cy5) do ekstraktów M1 i M2 o stężeniu 0,8 nM/μg białka i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję przez dodanie równej objętości buforu próbki zawierającego 7 M mocznika, 2 M tiomocznik, 4% CHAPS, 130 mM ditiotreitol (DTT) i 2% pharmalitów.</li>
	<li>Mieszaj próbki M1 znakowane Cy3 z próbkami M2 znakowanymi Cy5 w jednej ręce i próbkami M2 znakowanymi Cy3 z próbkami M1 znakowanymi Cy5 w drugiej ręce.</li>
	<li>Ponownie uwodnić pasek z immobilizowanym gradientem pH (IPG) (240 mm, gradient liniowy pH 3-10) z 450 μl znakowanych próbek mieszanych w buforze zawierającym 7 M mocznika, 2 M tiomocznika i 4% CHAPS na izoelektrycznym systemie ogniskowania (IEF) przez 24 godziny bez stosowania prądu.</li>
	<li>Wykonuj ostrość przy napięciu 300 V (V) przez 3 godziny, a następnie przy nachyleniu do 1,000 V przez 6 godzin, przy nachyleniu do 8,000 V przez 3 godziny i wreszcie przy 8,000 V przez 3 godziny.</li>
</ol>
5. Drugi wymiar
UWAGA: Wszystkie procedury elektroforezy wykonuj w ciemności.
<ol>
	<li>Inkubować paski IPG w buforze równowagowym zawierającym 0,1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M mocznika, 2% (w/v) dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 30% (v/v) glicerolu przez 10 minut.</li>
	<li>Przenieść zrównoważone paski IPG dla drugiego wymiaru (elektroforeza w żelu poliakrylamidowym SDS (PAGE)) na 12,5% żele PAGE i uszczelnić niskotopliwą agarozą.</li>
	<li>Przeprowadzić elektroforezę w temperaturze 20 °C przy użyciu systemu Ettan-Daltsix przy stałym napięciu 70 V przez noc, a następnie 300 V, aż czoło błękitu bromofenolowego dotrze do dna żelu.</li>
</ol>
6. Akwizycja obrazu i analiza bioinformatyczna
<ol>
	<li>Żele skanujące odlane między dwiema szklanymi płytkami o niskiej fluorescencji za pomocą skanera DIGE Imager o długościach fal wzbudzenia/emisji 532/580 nm dla Cy3 i 633/670 nm dla Cy5 w celu uzyskania obrazów o rozmiarze piksela 100 μm.</li>
	<li>Wykonaj analizę obrazu za pomocą komercyjnego oprogramowania, jak opisano wcześniejw punkcie 12.</li>
	<li>Obliczanie i normalizowanie objętości punktów na każdym obrazie. Przypisz znormalizowaną objętość plamki jako proporcję całkowitej wartości każdej plamki wykrytej w żelu.</li>
	<li>Przeanalizuj różnice w objętości plamki białkowej dla każdego typu makrofagów, porównując znormalizowaną wartość objętości plamki między dwiema grupami (M1 i M2). Uznaj, że różnica między wolumenami spot jest znacząca, jeśli zmiana jest 1,5-krotna (p <0,05, jednoczynnikowa analiza ANOVA).</li>
</ol>

<ol><li>van Ginderachter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+and+alternative+activation+of+mononuclear+phagocytes%3A+picking+the+best+of+both+worlds+for+tumor+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion.</a> Immunobiology. 211, (2006).</li>
<li>Porcheray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+switching%3A+an+asset+for+the+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation.</a> Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoy+receptors%3A+a+strategy+to+regulate+inflammatory+cytokines+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines.</a> Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).</li>
<li>Pinet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology%2C+homogeneity+and+functionality+of+human+monocytes-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages.</a> Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Chinetti-Gbaguidi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atherosclerotic+plaque+alternative+macrophages+display+low+cholesterol+handling+but+high+phagocytosis+because+of+distinct+activities+of+the+PPAR%CE%B3+and+LXR%CE%B1+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways.</a> Circ. Res. 108, 985-995 (2011).</li>
<li>Tonge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+development+of+fluorescence+two-dimensional+differential+gel+electrophoresis+proteomics+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology.</a> Proteomics. 1, 377-396 (2001).</li>
<li>Shaw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+saturation+labelling+two-dimensional+difference+gel+electrophoresis+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes.</a> Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).</li>
<li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+saturation+dye+2D+DIGE+proteomics+to+characterize+proteins+modulated+by+oxidized+low+density+lipoprotein+treatment+of+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages.</a> J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).</li>
<li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+maps+and+databases+of+the+human+macrophage+proteome+and+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome.</a> Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).</li>
<li>Acosta-Martin, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+incomplete+DNase+I+treatment+on+human+macrophage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis.</a> Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).</li>
<li>Acosta-Martin, A. E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+bioinformatics+and+MS-based+proteomics%3A+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications.</a> Expert Rev Proteomics. , (2014).</li>
<li>Boytard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+proinflammatory+CD68%2BMR-+macrophages+in+peroxiredoxin-1+expression+and+in+abdominal+aortic+aneurysms+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).</li>
</ol>

Nie ma zadeklarowanego konfliktu interesów.

Opisany w niniejszym dokumencie protokół szczegółowo opisuje metodę analizy wpływu różnych bodźców dwóch podtypów makrofagów, M1 (prozapalne) i M2 (przeciwzapalne). Pierwotne kultury makrofagów M1 i M2 uzyskano z różnicowania monocytów, jak wcześniej opublikowano7.
Procedura elektroforezy żelowej 2D DIGE wymaga specjalistycznych materiałów i sprzętu, takich jak komórka IEF do izoelektrofokusowania, płytki o niskiej fluorescencji do SDS-PAGE w celu dwukrotnego zeskanowania żelu na dł...

Makrofagi to heterogeniczne i plastyczne komórki, które są w stanie uzyskać odrębne funkcjonalne fenotypy. In vivo komórki te reagują na wiele różnych sygnałów mikrośrodowiskowych, takich jak produkty mikrobiologiczne, cytokiny itp. 1. In vitro fenotyp prozapalny (M1) makrofagów może być indukowany przez lipopolisacharyd (LPS), a fenotyp przeciwzapalny (M2) przez niektóre cytokiny, takie jak interleukina-4 (IL-4). Co więcej, makrofagi mogą przełączać się z aktywowanego fenotypu M1 na M2 i odwrotnie, na określone sygnały2.
W zależności od fenotypu, makrofagi będą miały różne funkcje. Makrofagi M1 to komórki, które wytwarzają cytokiny prozapalne, takie jak czynnik martwicy nowotworu α (TNF-α), w celu zabijania mikroorganizmów lub komórek nowotworowych3. Natomiast makrofagi M2 zapobiegają tej reakcji zapalnej, takiej jak gojenie się ran i zwłóknienie, wytwarzając czynniki przeciwzapalne, takie jak TGF-β3,4.
Ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej od zdrowych dawców zostały wyizolowane przez wirowanie w gradiacji gęstości Ficoll, jak wcześniej opisano5, przy użyciu techniki zaadaptowanej z Boyum6. Makrofagi w hodowli mogą być zróżnicowane do fenotypu M1 lub M2 po 6 dniach hodowli pierwotnej7.
Analiza ekspresji białek lub zmian białek między dwoma podtypami makrofagów pod wpływem różnych kontrolowanych bodźców, takich jak patogenność gospodarza czy toksyny mikrobiologiczne, będzie pomocna w rozszyfrowaniu funkcjonalności makrofagów pro- i przeciwzapalnych.
Proteomika to unikalne narzędzia do bezpośredniego monitorowania białek, które są specyficznie regulowane w górę lub w dół w ludzkich makrofagach pod wpływem różnych bodźców. Barwniki fluorescencyjne rozwiązały niektóre ograniczenia elektroforezy żelowej 2D, takie jak niska czułość i analiza obrazu8. Barwniki reagujące z resztą cysteiny mają zwiększoną czułość wykrywania w porównaniu z tymi reagującymi z resztą lizyny9. W poprzednim badaniu wykazaliśmy przydatność znakowania nasyceniem DIGE do analizy rzadkich próbek10 w porównaniu z klasyczną elektroforezą 2D barwioną srebrem11. Technologia ta jest pomocna w szybkiej analizie modyfikacji białek między dwoma podtypami makrofagów lub między makrofagami nieleczonymi i poddanymi działaniu substancji z tego samego podtypu.
Zaletą tej techniki proteomicznej jest dostęp do informacji o wielkości białka i modyfikacjach potranslacyjnych poprzez analizę żelu 2D12. Należy wziąć pod uwagę, że nie jest to technika o wysokiej przepustowości, ograniczająca liczbę próbek, które można poddać analizie. Opracowanie wysokoprzepustowych testów opartych na spektrometrii mas, które zostały poddane niedawnemu przeglądowi13, może poprawić ten stan rzeczy.
Tutaj prezentujemy, jak przeprowadzić analizę DIGE 2D od ekstrakcji białek hodowanych makrofagów poprzez procesy elektroforezy, izoelektrofokusa i SDS-PAGE, a także informacje na temat przydatności odpowiedniego oprogramowania 2D.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>31870-074</td><td></td></tr><tr><td>PBX 10 X</td><td>Invitrogen</td><td>14200-083</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina-200 mM-100X</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>gentamycyna 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>surowica ludzka</td><td>Invitrogen</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll d = 1,077</td><td>ATGC</td><td>L6115</td><td></td></tr><tr><td>Leucosep</td><td>Dutscher</td><td>16760</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Płytka 6-dołkowa PRIMARIA&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>353846</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Promocell</td><td>B-61410</td><td></td></tr><tr><td>lipopolisacharyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2654</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Fluka</td><td>48900</td><td></td></tr><tr><td>EDTA MM372,2</td><td>Research Organics&nbsp;</td><td>3.00E+01</td><td></td></tr><tr><td>Filtr 0,22 i mikro; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPTORE</td><td></td></tr><tr><td>100 ml cylinder</td><td>Corning</td><td>430182</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Interchim</td><td>UP242214</td><td></td></tr><tr><td>Bradford odczynnik</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Cy3+Cy5-reaktywny barwnik</td><td>GE Healthcare</td><td>25-8009-83</td><td></td></tr><tr><td>IPG 3-10 24cm</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6002-44</td><td></td></tr><tr><td>Protean Komórka IEF</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4000</td><td></td></tr><tr><td>Niskotopliwa agaroza</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>System Ettan-Daltsix</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6485-08</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DIGE Skaner do obrazowania</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Progeneza Samespot</td><td>Dynamika nieliniowa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki</td><td>dowolny dostawca</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>dowolny dostawca</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5070</td><td></td></tr><tr><td>ur&eacute; e</td><td>Merk</td><td>108484-500</td><td></td></tr><tr><td>Thiour&eacute; e</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7875</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Bio-Rad</td><td>1610611</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Pharmalytes 3-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0456-01</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3773</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid 40%</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>Czyszczenie 2D GE</td><td>Healthcare</td><td>80-6454-51</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Ciemny i ostry; elektrodowe tyloformamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22705-6</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>165-4071</td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie proteomiczne makrofagów za pomocą elektroforezy 2d

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Celem opisanego tutaj dwuwymiarowego (2D) protokołu elektroforezy jest pokazanie, jak analizować fenotyp makrofagów hodowanych przez człowieka. Wykazano kluczową rolę makrofagów w różnych zaburzeniach patologicznych, takich jak choroby zapalne, immunologiczne i zakaźne. W tym protokole używamy pierwotnych kultur ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów, które można różnicować w fenotyp M1 (prozapalny) lub M2 (przeciwzapalny). Ten model in vitro jest wiarygodny w badaniu aktywności biologicznej makrofagów M1 i M2, a także w podejściu proteomicznym. Techniki proteomiczne są przydatne do porównywania fenotypu i zachowania makrofagów M1 i M2 podczas patogenności gospodarza. Elektroforeza żelowa 2D jest potężną techniką proteomiczną do jednoczesnego mapowania dużej liczby białek lub polipeptydów. Opisujemy protokół elektroforezy 2D z użyciem barwników fluorescencyjnych, zwany 2D Różnicową Elektroforezą Żelową (DIGE). Białka makrofagów M1 i M2 są znakowane barwnikami cyjaninowymi przed rozdzieleniem przez ogniskowanie izoelektryczne, zgodnie z ich punktem izoelektrycznym w pierwszym wymiarze i masą cząsteczkową w drugim wymiarze. Oddzielone plamki białkowe lub polipeptydowe są następnie wykorzystywane do wykrywania różnic w poziomach ekspresji białek lub polipeptydów. Opisane tutaj podejścia proteomiczne pozwalają na badanie zmian białek makrofagów związanych z różnymi zaburzeniami, takimi jak patogenność gospodarza lub toksyny mikrobiologiczne.

Aby przeprowadzić odpowiednią analizę proteomiczną różnicową, należy zweryfikować proces przygotowania próbek przeznaczonych do analizy.
W przedstawionym przykładzie, jakość hodowli komórkowej makrofagów pod kątem aspektów morfologicznych i molekularnych była wymagana zgodnie z wcześniejszymi publikacjami5. Dyferencjację monocytów w makrofagi oraz homogenność hodowli monitorowano za pomocą mikroskopii fazowej. Rycina 1 przedstawia przykład pierwotnych hodowli makrof...

Makrofagi są kluczowymi komórkami zaangażowanymi w patogeniczność gospodarza. Makrofagi wykazują różnorodność fenotypową i funkcjonalną, którą można analizować i wykrywać za pomocą analizy proteomicznej. W artykule opisano, jak przeprowadzić elektroforezę 2D pierwotnych kultur ludzkich makrofagów zróżnicowanych do fenotypu M1 lub M2.

Profilowanie proteomiczne makrofagów za pomocą elektroforezy 2D

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Ogólnym celem tej procedury jest analiza fenotypu ludzkich podzbiorów prozapalnych M1 i przeciwzapalnych M dwóch makrofagów poprzez różnicowanie 2D w elektroforezie żelowej. Osiąga się to poprzez pierwsze znakowanie białek wyekstrahowanych z pierwotnych kultur makrofagów M1 i M za pomocą barwników sinusoidalnych. W drugim etapie białka miesza się ze sobą, a na próbkach przeprowadza się ogniskowanie elektryczne ISO poprzez ponowne uwodnienie.Następny drugi wymiar, elektroforeza jest wykonywana za pomocą zmobilizowanego gradientu pH lub pasków IPG w ciemności, a następnie żele są skanowane za pomocą różnicówki w skanerze elektroforezy żelowej. Ostatecznie przeprowadza się analizę ponumerowanych obrazów w celu wykrycia różnic w plamkach trawiennych polipów między dwoma podzbiorami makrofagów M1 i M. Główną zaletą tej techniki wśród istniejących metod, takich jak klasyczna elektroforeza w żelu todi, jest to, że technika ta jest bardziej czuła, wymaga tylko pięciu mikrogramów białek, co jest bardzo ważne w przypadku próbek pobieranych od ludzi.Procedurę zademonstrują Mario Bove, doktorant, Olivia Beza i technik Magac z mojego laboratorium Aby przygotować pierwotne kultury makrofagów pochodzących z monocytów, zacznij od rozcieńczenia 25 mililitrów sierści Buffy w 25 mililitrach PBS. Następnie ostrożnie załaduj rozcieńczoną krew na gradient separacji i odwiruj komórki przez 20 minut w temperaturze 1600 G i temperaturze pokojowej, gdy komórki zakończą wirowanie. Zebrać monocyty w warstwie międzyfazowej, a następnie trzy kolejne płukania pobranych komórek w 10 mililitrach PBS zawierających 0,1% EDTA po trzecim płukaniu.Zakręć komórki jeszcze raz w samym PBS, a następnie ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach pożywki RPMI 1640 bez nasion surowicy. Komórki w 35-milimetrowych szalkach o gęstości od jednego razy 10 do sześciu komórek na szalkę, a następnie po 90-minutowej sedymentacji w inkubatorze wyrzucić supernatant i przemyć przylegające monocyty trzykrotnie jednym mililitrem PBS. Następnie hodowla, komórki w 10 mililitrach świeżej pożywki zawierającej 10% objętości na objętość ludzkiej surowicy przez sześć dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Następnie, aby uzyskać przeciwzapalne makrofagi M dwa, uzupełnij niektóre kultury 15 nanogramami na mililitr IL cztery w szóstym dniu hodowli, aby uzyskać prozapalne makrofagi w 12 dniu. Traktuj inne kultury zróżnicowanych makrofagów 100 nanogramami na mililitr LPS przez cztery godziny, aby wyizolować podzbiory makrofagów do elektroforezy 2D. Następnie umyj interesującą kulturę trzykrotnie 25 milimolowymi trisami, a następnie uwolnij komórki z dna płytek za pomocą buforu ekstrakcyjnego czapsów.Następnie przenieś komórki do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i zasznuruj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po pięciu minutach przenieś komórki w podwielokrotnościach o objętości 100 mikrolitrów do przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu analizy stężenia białka w celu elektroogniskowania ISO podzbiorów makrofagów. Najpierw dostosuj próbki do dziewięciu mikrolitrowych podwielokrotności, a następnie zredukuj roztwory komórkowe buforem do lizy uzupełnionym dwoma milimolami TCEP w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po jednej godzinie inkubować ekstrakty z S SI trzy i S SI pięć w temperaturze 37 stopni Celsjusza, zatrzymując reakcję po 30 minutach przez dodanie równej objętości buforu próbki. Następnie utwórz dwie oddzielne mieszaniny o równych objętościach S SI, trzech znakowanych białek M1 z SCI pięcioma znakowanymi białkami M, two. Następnie należy ponownie uwodnić pasek IPG z 450 mikrolitrami oznakowanych zmieszanych próbek w buforze ekstrakcyjnym Chapsa na izoelektrycznym systemie komórek ogniskujących przez 24 godziny bez stosowania prądu.Następnego dnia rozpocznij ustawianie ostrości przy napięciu 300 woltów przez trzy godziny, następnie ustaw gradient do 1000 woltów na sześć godzin, a następnie dwa gradienty 8 000 woltów przez trzy godziny każdy, aby wykonać elektroforezę drugiego wymiaru, inkubować paski IPG w buforze równowagi. Po 10 minutach przenieś paski na 12,5% żele Page i uszczelnij je niskotopliwymi arosami. Następnie użyj systemu edin dsic o stałym napięciu 70 woltów, aby przeprowadzić elektroforezę w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez noc, a następnie 300 woltów, aż front błękitu bromofenolowego dotrze do dna żelu, aby uzyskać obrazy żeli.Umieść je między dwiema szklanymi płytkami o niskiej fluorescencji skanera do obrazowania elektroforezą różnicową i żelową i skanuj żele przy długościach fal emisji wzbudzenia 5, 32, 5, 80 nanometrów dla trzech i 6 33, 6 70 nanometrów dla pięciu, aby uzyskać obrazy o rozmiarze piksela 100 mikrometrów. Przeanalizuj je za pomocą odpowiedniego oprogramowania, a następnie oblicz i znormalizuj objętość plamki na każdym obrazie, przypisując znormalizowaną objętość plamki jako proporcję całkowitej wartości każdej plamki wykrytej w żelu. Przeanalizuj różnice w objętościach plamek białkowych dla każdego typu makrofagów, porównując znormalizowaną wartość objętości plamki między dwiema grupami makrofagów, uznając różnicę między objętościami plamki za znaczącą, jeśli zmiana jest 1,5-krotna.W tym eksperymencie. Wzorce białek 2D dwóch podtypów makrofagów, prozapalnego M1 i przeciwzapalnego M2, określono za pomocą różnicowania 2D. W elektroforezie żelowej ten sam wzór białek zaobserwowano dla M1 lub M 2, niezależnie od użytych barwników cyjanowych.Co ciekawe, analiza bioinformatyczna żelu ujawniła, że 20 obszarów zawierających plamki, wzrosty i spadki między objętościami plamek zostały określone ilościowo, jak pokazano za pomocą żółtych, niebieskich i zielonych plam barwiących, które uznano za mające znaczące wyrażenie różnicowe, jeśli zmiana fałdu znormalizowanej objętości plamki była większa niż 1,5 przy wartości P mniejszej niż 0,05. Podążając za tym CHE, można zastosować metody takie jak spektrometria ilościowa, spektrometria mas lub dodatkowa analiza proteomiczna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jaki rodzaj białek ulega zróżnicowanej ekspresji między dwoma podzbiorami makrofagów w odpowiedzi na różne bodźce.

proteomic-profiling-of-macrophages-by-2d-electrophoresis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zaprezentowano prostą i specyficzną metodę fluorescencyjnego znakowania oraz zwiększonej detekcji białek powierzchniowych komórek bez konieczności przeprowadzenia etapu frakcjonowania. Różnice w zawartości białek powierzchniowych komórek analizowano przy użyciu elektroforezy dwuwymiarowej (2-D) oraz technologii Ettan™ DIGE.

Selektywne znakowanie białek powierzchni komórkowych z użyciem minimalnych barwników fluorescencyjnych CyDye DIGE Fluor

Ten protokół opisuje użycie spektrometrii mas MALDI-TOF na komórkach eukariotycznych. Tutaj ilustrujemy dokładność tej techniki, analizując wielokrotne stany aktywacji makrofagów w odpowiedzi na ich mikrośrodowisko.

Spektrometria mas MALDI-TOF dla całych komórek jest dokładną i szybką metodą analizy różnych trybów aktywacji makrofagów

Powszechny protokół ekstrakcji białek przy użyciu buforu mocznikowego/tiomocznikowego/SDS dla tkanki mózgowej ludzi i myszy umożliwia identyfikację białek za pomocą 2D-DIGE i ich późniejszą charakterystykę za pomocą mini immunoblottingu 2DE. Metoda ta umożliwia uzyskanie bardziej powtarzalnych i wiarygodnych wyników z biopsji człowieka i modeli eksperymentalnych.

Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE

Tutaj opisujemy protokół, który łączy dwie techniki proteomiczne, mianowicie dwuwymiarową elektroforezę (2DE) i spektrometrię mas (MS), w celu identyfikacji różnie wyrażonych/potranslacyjnych zmodyfikowanych białek wśród dwóch lub więcej grup próbek pierwotnych. Takie podejście, wraz z eksperymentami funkcjonalnymi, pozwala na identyfikację i charakterystykę markerów prognostycznych/celów terapeutycznych.

Od plamki 2DE-Gel do funkcji białka: lekcja wyciągnięta z HS1 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Przeprogramowanie metaboliczne jest cechą charakterystyczną i warunkiem wstępnym polaryzacji makrofagów M1 i M2. Niniejszy manuskrypt opisuje test do pomiaru podstawowych parametrów glikolizy i funkcji mitochondriów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Narzędzie to można zastosować do zbadania, w jaki sposób poszczególne czynniki wpływają na metabolizm i fenotyp makrofagów.

Charakterystyka metaboliczna spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego M1 i M2 przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Ten protokół pozwala badaczowi na wyizolowanie i scharakteryzowanie makrofagów rezydujących w tkankach w różnych charakterystycznych tkankach objętych stanem zapalnym, pobranych z modeli zaburzeń metabolicznych wywołanych dietą.

Izolacja, charakterystyka i oczyszczanie makrofagów z tkanek dotkniętych stanem zapalnym związanym z otyłością

Tutaj prezentujemy dwuwymiarową elektroforezę żelową (2DE) w połączeniu ze spektrometrią mas (MS) w celu oddzielenia i identyfikacji proteomu tkankowego ludzkiego gruczolaka przysadki, który przedstawia dobry i powtarzalny wzór 2DE. Wiele białek obserwuje się w każdym miejscu 2DE podczas analizy złożonego proteomu nowotworu przy użyciu MS o wysokiej czułości.

Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa w połączeniu z metodami spektrometrii mas do analizy proteomu tkanki gruczolaka przysadki mózgowej

Przedstawiamy protokół uzyskiwania sygnatur proteomicznych ludzkich makrofagów i stosowania go do określania wpływu środowiska o niskiej zawartości tlenu na polaryzację makrofagów.

Analiza proteomiczna polaryzacji ludzkich makrofagów w środowisku o niskiej zawartości tlenu

Opisujemy nasz protokół pomiaru rytmów biologicznych w katabolizmie białek poprzez autofagię i proteasom w wątrobie myszy.

Pomiar rytmów dobowych w strumieniu autofagicznym i proteasomalnym

Tutaj prezentujemy protokół do profilowania interakcji między gospodarzem a patogenem podczas infekcji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas. Protokół ten wykorzystuje kwantyfikację bez znaczników do pomiaru zmian w obfitości białek zarówno gospodarza (np. Makrofagi), jak i patogenu (np. Cryptococcus neoformans) w jednym eksperymencie.

Bezznacznikowy przepływ pracy proteomiki ilościowej dla interakcji gospodarz-patogen opartych na odkryciach

Naucz się profilowania proteomicznego makrofagów M1 i M2 człowieka za pomocą elektroforezy 2D. Ta czuła metoda pozwala wykryć różnice w ekspresji białek przy użyciu zaledwie pięciu mikrogramów próbki.

Profilowanie proteomiczne makrofagów za pomocą elektroforezy 2D

Przeglądaj więcej filmów