Name: Regulacja składników odżywczych poprzez ciągłe karmienie w celu ekspansji komórek ssaków w sferoidach na dużą skalę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Poznaj technikę ciągłego karmienia z regulacją składników odżywczych w bioreaktorach z mieszaniem. Metoda poprawia wzrost sferoidów komórek ssaków i zapewnia równomierne rozprowadzenie substancji odżywczych, co umożliwia skalowanie kultur komórkowych do zastosowań w terapiach komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Michaelowi Garwoodowi i Samowi Steinowi za pomocne komentarze, a Kristen M. Maynard za pomoc w przygotowaniu manuskryptu.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wytwarzanie produktów z komórek ssaków do produkcji czynników biologicznych i terapii komórkowych wymaga hodowli i monitorowania komórek ssaków na dużą skalę55–58. Co więcej, aplikacje te wymagają zdefiniowanych i zweryfikowanych warunków hodowli. Samo zwiększenie objętości ogniw za pomocą technologii badawczych nie spełni wszystkich tych wymagań. Ręczne zmiany pożywki powodujące wahania składników odżywczych i gromadzenie się produktów przemiany materii obniżają jakość, żywotność i wydaj...

Aby wygenerować dużą liczbę zdolnych do życia i funkcjonalnych komórek ludzkich do przeszczepu, konieczna jest regulacja warunków hodowli. Wyczerpanie składników odżywczych wraz z nagromadzeniem odpadów metabolicznych jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do starzenia się i zmian metabolicznych, które obniżają jakość produktu komórkowego 1-3. Procedura ta demonstruje metodę hodowli komórek ssaków w sferoidach przy użyciu bioreaktora z mieszadłem w połączeniu z systemem podawania perfuzyjnego o regulowanej szybkości w celu regulacji glukozy w zakresie fizjologicznym4 przez cały czas trwania hodowli. Na potrzeby tych badań zakres fizjologiczny określono jako od 100 do 200 mg/dl. Te same metody można zastosować do regulacji innych składników odżywczych i produktów przemiany materii, takich jak mleczan.
Statyczne kultury w małych objętościach (1 - 30 ml) są zazwyczaj używane w warunkach laboratoryjnych do utrzymania i różnicowania linii komórkowych do celów eksperymentalnych. Pasażowanie komórek odbywa się z całkowitą wymianą pożywki w razie potrzeby w regularnych odstępach czasu. Większość "konwencjonalnych" pożywek hodowlanych ma wysokie stężenie glukozy (450 mg/dl dla DMEM stosowanego w tych badaniach), aby umożliwić rzadsze zmiany pożywki bez ryzyka ograniczeń składników odżywczych. Jednak ta metoda karmienia partiami nadal wymaga częstych manipulacji, wprowadza zmienność w środowisku komórek i zwiększa ryzyko zanieczyszczenia5–9. Bioreaktory zawiesinowe z mieszaniem (SSB) zapewniają lepsze mieszanie i mniejszą obsługę3,10–20, ale podobnie jak kultury statyczne, wymagają ręcznej zmiany podłoża, co przyczynia się do potencjalnie szkodliwych wahań poziomu składników odżywczych i produktów odpadowych. Karmienie perfuzyjne kultur SSB zmniejsza te problemy poprzez ciągłą infuzję i usuwanie pożywki, ale duże zmiany w poziomach składników odżywczych spowodowane wzrostem komórek pozostają problemem. Zastosowanie skorygowanej dawki karmienia na podstawie obliczeń zużycia składników odżywczych w oparciu o szacowane zapotrzebowanie komórek może zapewnić stabilne środowisko komórkowe wymagane do optymalizacji żywotności i funkcji komórek21–24.
Istnieje obszerna literatura opisująca metody skalowalnych hodowli SSB komórek ssaków specjalnie do hodowli i ekspansji komórek pluripotencjalnych25–32, inne koncentrują się na komórkach wysp trzustkowych (beta)17,33,34 lub produkcji produktów biologicznych24,35–38. Wiele z tych badanych typów komórek może być hodowanych w hodowlach sferoidalnych, a określone procedury dla używanego typu komórek powinny być zoptymalizowane przed wdrożeniem systemu ciągłego karmienia. W tej demonstracji zastosowano metodę karmienia perfuzyjnego w celu rozprężenia linii komórek beta hodowanych jako sferoidy w bioreaktorze z mieszadłem39-43. Opisana w niniejszym dokumencie metoda zapewnia prostą implementację regulacji dawki karmienia w oparciu o pomiary glikemii off-line w celu uzyskania docelowych warunków hodowli. Wykazano, że dostosowanie szybkości karmienia tą metodą w celu utrzymania fizjologicznego poziomu glukozy zwiększa wydajność komórek. Komórki ssaków są zależne od kluczowego składnika odżywczego, glukozy, do produkcji energii, więc wykorzystanie tej linii komórkowej stanowi model dla wielu hodowanych komórek ssaków44. Ponadto linia ta ilustruje dalszą złożoność komórek beta, które są wrażliwe na przewlekły wysoki poziom glukozy45. W tym badaniu komórkom β-TC6 pozwolono tworzyć sferoidy w hodowli, aby zbliżyć się do średniej wielkości wysepek Langerhansa in vivo. System bioreaktora perfuzyjnego17–19,21,46 z szybkością podawania dostosowaną do zużycia glukozy, skutkował utrzymaniem warunków fizjologicznych i wyższą wydajnością komórek bez zmian w żywotności.

<table><tbody><tr><td>&#946; Komórki TC-6</td><td>ATCC, Manassas, VA</td><td>CRL-11506</td><td>Linia komórkowa mysiego insulinoma (typ komórki adherentnej)</td></tr><tr><td>DPBS No Ca, No Mg</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>14190-144</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=szukaj-14190144">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=search-14190144</a></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td></td><td>Poniżej znajdują się numery produktów&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM Wysoki poziom glukozy (500 mM)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>11965-092</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092</a></td></tr><tr><td>DMEM Niski poziom glukozy (100 mM)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>11885-084</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084%20(note%20that%20this%20medium%20already%20contains%20pyrugronian)">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (zauważ, że to podłoże zawiera już pirogronian)</a></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>25030081</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=produkt-wyszukiwania">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=search-product</a></td></tr><tr><td>Sodium Pyrprecious</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>11360070</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=produkt-wyszukiwania">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=search-product</a></td></tr><tr><td>Heat Inactivated Porcane Serum</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td>10082147</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147</a></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>25200056</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=produkt-wyszukiwania">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=search-product</a></td></tr><tr><td>T-150 Kolby poddane hodowli tkankowej</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>430825</td><td>http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(nauki przyrodnicze) & categoryname=</td></tr><tr><td>Inkubator kultur komórkowych NuAire</td><td>Princeton, MN</td><td></td><td>US Autoflow. Można użyć dowolnego inkubatora z płaszczem wodnym regulującym hodowle komórkowe CO2</td></tr>.<tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td>Sorvall RT 7 (można użyć dowolnej podobnej wirówki stołowej)</td></tr><tr><td>Lodówka</td><td></td><td></td><td>Można użyć dowolnej lodówki laboratoryjnej (do tych badań użyto małej wersji stołowej)</td></tr><tr><td>1 L Szklana butelka</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>1395-1L</td><td>Można użyć dowolnego dostawcy. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(nauki przyrodnicze) & categoryname=</td></tr><tr><td>2 L Szklana butelka</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>1395-2L</td><td>Każdy sprzedawca może być używany</td></tr><tr><td>250 ml mieszanych bioreaktorów&nbsp;</td><td>Corning, Corning, Nowy Jork</td><td>4500-250</td><td>http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250 (nauki przyrodnicze) & categoryname=</td></tr><tr><td>Płytka mieszająca</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-496-104A</td><td>Można użyć dowolnej płytki mieszającej bezpiecznej dla inkubatora, dowolnego dostawcy</td></tr><tr><td>Naczynia do kultur tkankowych o średnicy 100 mm</td><td>Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific)</td><td>1256598&nbsp;</td><td>Można użyć dowolnego sprzedawcy (zamówionego przez Fisher Sci)</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe FALCON 50 ml</td><td>Falcon, San Jose, CA</td><td>1256598</td><td>Można użyć dowolnego dostawcy</td></tr><tr><td>Delran Plastic używany do niestandardowych części</td><td>McMaster Carr</td><td>Różne</td><td>Można użyć dowolnego materiału, ale Deran jest wybierany, ponieważ jest bezpieczny w autoklawie, niereaktywny i łatwy w obróbce. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac</td></tr><tr><td>Rura ze stali nierdzewnej do niestandardowych pokryw</td><td>McMaster Carr</td><td>Różne</td><td>Można użyć dowolnego dostawcy. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91</td></tr><tr><td>Niestandardowe zmodyfikowane pokrywki bioreaktora Delran do ciągłego karmienia</td><td>Wykonane</td><td></td> na zamówienie <td>Nie wiem o żadnych dostawcach produkujących podobny produkt</td></tr><tr><td>Niestandardowe zmodyfikowane szklane pokrywki do butelek do ciągłego karmienia</td><td>Wykonane</td><td></td> na zamówienie <td>Niektórzy dostawcy (np. , Fischer Sci, Corning) wytwarzają podobne produkty w poniższych linkach.</td></tr><tr><td>Cyfrowa pompa perystaltyczna Masterflex Cole</td><td>Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>EW-77919-25</td><td>Można użyć dowolnej precyzyjnej pompy perystaltycznej. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25</td></tr><tr><td>Łączniki rurowe PVDF (różne)</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>Zobacz link</td><td>Można użyć dowolnego dostawcy. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889</td></tr><tr><td>Rurka Pharmed BPT L/S 16</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>WU-06508-16</td><td>Można użyć dowolnego dostawcy. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16</td></tr><tr><td>Rurki Pharmed BPT L/S 14</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>WU-06508-14</td><td>Można użyć dowolnego dostawcy. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14</td></tr><tr><td>Rurka Pharmed BPT L/S 13</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>WU-06508-13</td><td>Można użyć dowolnego dostawcy. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/ WU-06508-13</td></tr><tr><td>Membrana Millipore Millex GP PES 0,22 &#181; l sterylny filtr strzykawkowy (używany do wentylacji i filtracji średniej)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>SLGP033RS</td><td>Można użyć dowolnego dostawcy</td></tr><tr><td>25 ml Pipeta z podziałką</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11</td><td>Można użyć dowolnego dostawcy i można użyć różnych rozmiarów</td></tr><tr><td>Pikultarka</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-15E</td><td>Można użyć dowolnego dostawcy lub podobnego produktu</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td>Można użyć dowolnego dostawcy lub podobnego produktu</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Można użyć dowolnego dostawcy lub podobnego produktu. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061</td></tr><tr><td>Mikroskop światła odwróconego</td><td>Leica</td><td></td><td>Można użyć dowolnego dostawcy lub podobnego produktu</td></tr><tr><td>Ultra glukometr One Touch</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-293</td><td>Można użyć dowolnego dostawcy lub podobnego produktu (<np>. , Bayer)</td></tr><tr><td>One Touch Ultra-Strips</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-292&nbsp;</td><td>Można użyć dowolnego dostawcy lub podobnego produktu (<np. >np. , Bayer)</td></tr></tbody></table>

regulacja składników odżywczych poprzez ciągłe karmienie w celu ekspansji komórek ssaków w sferoidach na dużą skalę

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

W tej demonstracji, sferoidy utworzone z linii komórkowej insulinoma β-TC6 zostały wyhodowane jako model wytwarzania produktu komórkowego wysp trzustkowych ssaków, aby zademonstrować, jak regulacja poziomu składników odżywczych może poprawić wydajność komórek. W poprzednich badaniach bioreaktory ułatwiały zwiększenie objętości hodowli w porównaniu z kulturami statycznymi, ale nie zaobserwowano wzrostu wydajności komórek. Ograniczenia w kluczowych składnikach odżywczych, takich jak glukoza, które były spożywane między karmieniami grupowymi, mogą prowadzić do ograniczeń w ekspansji komórek. Zaobserwowano duże wahania poziomu glukozy, pomimo wzrostu stężenia glukozy w pożywce. Zastosowanie systemów ciągłego karmienia wyeliminowało wahania poziomu glukozy i poprawiło tempo wzrostu komórek w porównaniu z metodami hodowli statycznej karmionej wsadowo i SSB. Dodatkowy wzrost tempa wzrostu zaobserwowano poprzez dostosowanie dawki paszy na podstawie obliczonego zużycia składników odżywczych, co pozwoliło na utrzymanie fizjologicznego poziomu glukozy przez trzy tygodnie w hodowli. Tę metodę można również dostosować do innych typów komórek.

Średnie poziomy glukozy i jej wahania ograniczają ekspansję komórek w standardowych hodowlach SSB
Poziomy glukozy ulegają wahaniom w kulturach statycznych i kulturach SSB przez cały okres hodowli3. Wahania te nasilają się wraz ze wzrostem liczby komórek podczas 21-dniowego okresu hodowli i były niemal identyczne zarówno w kulturach statycznych, jak i SSB. Obserwacje te zostały przedstawione w naszej poprzedniej publikacji3. Poziomy glukozy mogą być nadfiz...

Regulacja składników odżywczych za pomocą ciągłego karmienia dostosowanego do wzrostu poprawia tempo wzrostu sferoid komórek ssaków w porównaniu do przerywanego karmienia partiami dla kultur w bioreaktorach z mieszaną zawiesiną. Niniejsze badanie demonstruje metody wymagane do ustalenia prostych kultur karmionych o skorygowanej dawce.

Regulacja składników odżywczych poprzez ciągłe karmienie w celu ekspansji komórek ssaków w sferoidach na dużą skalę

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Ogólnym celem tego procesu jest hodowla dużej liczby komórek w kontrolowanych warunkach odżywczych. Korzystanie z konwencjonalnego sprzętu znajdującego się w laboratorium hodowli komórkowych. Powiązane algorytmy pozwalają na kontrolę i manipulowanie składnikami odżywczymi w zakresach eksperymentalnych.Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące zastosowań hodowli komórkowych na dużą skalę. Takich jak terapie komórkowe u ludzi. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia hodowlę komórek na dużą skalę z równomiernym rozkładem składników odżywczych i gazów.Pozwala to na większą gęstość komórek niż w przypadku hodowli komórkowych karmionych statycznie lub masowo, zwiększa wydajność i zmniejsza utratę komórek. Można to zrobić za pomocą sprzętu powszechnie spotykanego w większości laboratoriów hodowli komórkowych. Wizualna demonstracja tej metody może być pomocna dla nowych badaczy, ponieważ stosowane techniki mogą być trudne do opanowania ze względu na dużą liczbę kroków, które muszą być wykonane w określonej kolejności w sterylnych warunkach.Zbierz pięć podstawowych elementów potrzebnych do systemu karmienia. Zbiornik pożywki, pompa perystaltyczna, bioreaktor z mieszadłem, zbiornik na odpady i specjalnie zaprojektowany zestaw do pobierania próbek przewodów. Ustal zbiornik pożywki za pomocą jednolitrowej szklanej butelki.Zbiornik na odpady za pomocą dwulitrowej szklanej butelki. Bioreaktor z mieszaniem przy użyciu szklanego reaktora o pojemności 250 ml. Użyj cyfrowej pompy perystaltycznej lub podobnej pompy z ośmiokanałową głowicą pompy, aby sterować wymianą medium.Zmontuj zbiornik i zmodyfikowane pokrywy bioreaktora z twardego i nadającego się do autoklawu tworzywa sztucznego. Z otworami przelotowymi ze stali nierdzewnej, które zapewniają wentylację przez sterylne filtry i umożliwiają transfer medium między zbiornikami a bioreaktorami. Podłączyć rurkę odpływową wykonaną z porowatych szklanych rurek napowietrzających do zmodyfikowanej pokrywy bioreaktora z mieszadłem zawieszonym.Zmontuj zestawy rurek perfuzyjnych do autoklawu z łączników rurek z polifluorku winylidenu i trwałych rurek pompy perystaltycznej. Długość odcinka zależy od odległości między różnymi komponentami. Zamontuj przewód zasilający za pomocą dwóch średnic przewodów.Użyj L/S 14 dla rurki głównej, która będzie rozciągać się na odległość od bioreaktora do zbiornika medium. Włożyć rurkę L/S 13 o długości pośrodku długości przewodu dla sekcji pompy, używając odpowiednich adapterów PVDF. Użyj standardowych adapterów węży kolczastych PVDF, aby połączyć dwa kawałki rurki L/S 14 po obu stronach krótszej rurki sekcji pompy.Zamontuj sekcję rurki sekcyjnej do usuwania odpadów za pomocą rurki L/S 16 o większej średnicy i włóż krótki odcinek rurki L/S 14 pośrodku sekcji pompującej. Odbywa się to w taki sam sposób, jak montaż linii zasilającej za pomocą adapterów PVDF z zadziorami węża. Zmontuj ostatni element zestawu przewodów, konstruując zestaw z trzech krótkich odcinków przewodów L/S 14.Połączone ze sobą za pomocą złącza HVDF typu T i dwóch małych zacisków węża na dwóch długościach przewodów. Podłącz zespół próbki do złącza próbki ze stali nierdzewnej umieszczonego na pokrywie bioreaktora. Po sterylizacji do jednej z zaciśniętych długości zostanie przymocowany sterylny filtr gazu do odpowietrzania gazu.Drugi służy do podłączenia do sterylnej strzykawki do pobierania próbek. Autoklawować zestaw do pobierania próbek, gdy jest on podłączony do bioreaktora, przed rozpoczęciem eksperymentu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Użyj tego zestawu do pobierania sterylnych próbek z bioreaktora w razie potrzeby, bez zakłócania ciągłego procesu podawania.Podłączyć sterylne otwory wentylacyjne w odpowiednich miejscach na pokrywach kolby obrotowej, naczynia na pożywkę, pojemniki na odpady i porty na próbki. Hodować i zbierać komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pozwól komórkom inkubować w temperaturze pokojowej w trypsynie przez dwie do trzech minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego, a następnie zbierz je do stożkowej probówki.Następnie pobiera się próbkę małych komórek i barwi ją błękitem trypanowym. Policz gęstość komórek za pomocą mikroskopu i standardowego hemocytometru z barwieniem błękitem trypanowym, jak opisano w protokole tekstowym. Dodaj żądaną liczbę komórek do sterylnych bioreaktorów zawiesinowych z mieszadłem dla każdego stanu.Dodaj pożywkę do bioreaktora z mieszaną zawiesiną za pomocą pipety, aby osiągnąć pożądaną całkowitą objętość kultury. Przenieść bioreaktor zawiesinowy z mieszadłem z komórkami na płytkę mieszającą wewnątrz inkubatora do hodowli komórkowych. Hodowanie komórek w bioreaktorach bez karmienia przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z 5% dwutlenkiem węgla, 100% wilgotnością względną i szybkością mieszania 70 obr./min, aby umożliwić tworzenie się sferoid.Po utworzeniu sferoidy wyjąć bioreaktor zawiesinowy z mieszadłem z inkubatora. Elementy systemu ciągłego żywienia należy zamontować w szafie bezpieczeństwa biologicznego. Najpierw napełnij zbiornik świeżej pożywki żądaną pożywką hodowlaną, a następnie podłącz z jednej strony linii zasilającej.Upewnij się również, że zbiornik świeżej pożywki jest odpowiednio odpowietrzony sterylnym filtrem. Sterylny filtr należy wymienić na porcie wlotowym bioreaktora, aby przefiltrować medium przed jego wejściem do bioreaktora. Podłącz przewód odpływowy do średniego zbiornika na odpady i upewnij się, że zbiornik na odpady jest prawidłowo odpowietrzony za pomocą sterylnego filtra.Umieścić bioreaktor zawiesinowy z mieszadłem na płytce mieszającej wewnątrz inkubatora, stosując te same parametry hodowli, co w przypadku tworzenia sferoidów. Umieść zbiornik świeżego podłoża w pobliskiej minilodówce. Upewnij się, że przewody zasilające są w stanie wyjść z lodówki bez uniemożliwiania zamykania drzwi.Bardzo ważne jest również, aby przewody zasilające nie były przyciśnięte do drzwi ani lodówki, ani inkubatora. Zbiornik na odpady można umieścić na blacie na zewnątrz inkubatora w dogodnym miejscu. Przełóż pozostałe końcówki przewodów do inkubatora i podłącz przewód zasilający do filtra na porcie wlotowym bioreaktora.Następnie podłącz przewód odpływowy do portu rury odpływowej. Następnie umieść sekcję pompy przewodów zasilających i odpływowych w głowicy pompy, zapewniając odpowiednią orientację, tak aby przewody zasilające pompowały medium ze zbiornika świeżego medium do bioreaktora zawiesinowego z mieszadłem, a przewody kanalizacyjne pompowały medium z bioreaktora i do zbiornika medium odpadowego. Obliczyć prędkość posuwu, korzystając z równania skorygowanej prędkości posuwu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Użyj najnowszej próbki z informacjami o liczbie komórek, wraz z przewidywaniem szybkości wzrostu i pomiarami stężenia glukozy w pożywce, aby oszacować szybkość podawania potrzebną do utrzymania pożądanego stężenia glukozy w hodowli. Ustawić prędkość pompy na podstawie obliczonej prędkości posuwu. Powtórz obliczanie prędkości podawania i dostosuj prędkość pompy dla każdego punktu pobierania próbek.Pomiary stężenia glukozy w pożywce przedstawiono z hodowli sferoidalnych insulinoma Beta-TC6 przy użyciu bioreaktorów zawiesinowych z mieszaniem statycznym oraz metod hodowli bioreaktorów z mieszaniem w zawiesinie podawanych w sposób ciągły. Karmienie standardową pożywką o wysokiej zawartości glukozy. Ciągłe karmienie jest w stanie wyeliminować wahania glukozy, ale średni poziom glukozy w pożywce zmienia się dramatycznie w okresie hodowli i znacznie przekracza zakres fizjologiczny.Dostosowane żywienie jest w stanie wyeliminować wahania, a także utrzymać stężenie glukozy na poziomie zbliżonym do fizjologicznego przez cały okres hodowli. W tym miejscu porównano wzrost komórek zgłoszony jako krotna zmiana liczby komórek w ciągu 21-dniowego okresu hodowli dla bioreaktorów zawiesinowych z mieszaniem z regularnymi zmianami pożywki, kultur bioreaktorów zawiesinowych z mieszaną szybkością podawania i kultur bioreaktorów zawiesinowych z dostosowaną szybkością zasilania. Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak różne warunki, powinny zostać wdrożone, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wymagania dotyczące składników odżywczych dla nowych linii komórkowych lub konkretne wyniki eksperymentalne.Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie biologii komórki do zbadania wymagań metabolicznych w komórkach ludzi z rakiem lub innymi zaburzeniami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak złożyć system hodowli komórek profuzyjnych, aby lepiej kontrolować warunki hodowli i maksymalizować wydajność komórek. Nie zapominaj, że praca z ludzkimi komórkami może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak ochrona przed patogenami przenoszonymi przez krew.

nutrient-regulation-continuous-feeding-for-large-scale-expansion

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Sferoidy to rodzaj modelu 3D hodowli komórkowej używany do dokładniejszego reprezentowania środowiska komórki w porównaniu do jednowarstwowych modeli hodowli komórkowych 2D. W przykładowym protokole zobaczymy, jak naukowcy generują sferoidy z linii komórkowej raka jelita grubego i stosują obrazowanie żywych komórek do śledzenia wzrostu sferoid.

Generowanie sferoidów z linii komórkowych: trójwymiarowa (3D) metoda hodowli komórek

Wprowadzamy protokół generowania dużych liczb (od tysięcy do setek tysięcy) sferoid guza o jednakowej wielkości i składzie, używając dostępnych na rynku płytek mikrodołkowych.

Produkcja dużej liczby sferoid guza o kontrolowanej wielkości przy użyciu płytek mikrodołkowych

Tutaj opisujemy szybki i elastyczny protokół tworzenia sferoid 3D komórek poprzez agregację komórek. Można go łatwo dostosować do wielu typów komórek i nadaje się do stosowania w różnych zastosowaniach, w tym w testach migracji komórek, inwazji lub anoikis, a także do obrazowania i ilościowego określania interakcji komórka-macierz.

Wydajna i elastyczna metoda agregacji komórek do produkcji sferoidów 3D

Tutaj opisujemy metodę generowania trójwymiarowych kultur sferoidalnych ludzkich komórek nabłonka nosa. Sferoidy są następnie stymulowane do napędzania wydzielania jonów i płynów zależnych od cyscydozy Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), określając ilościowo zmianę wielkości sferoidalnego światła jako wskaźnik zastępczy dla funkcji CFTR.

Generowanie sferoid ludzkich komórek nabłonka nosa do zindywidualizowanego badania transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy

Prezentujemy tutaj metodę, która łączy użycie chemicznego usuwania epigenetycznego z sygnałami związanymi z mechanosensoryką, aby efektywnie generować komórki pluripotencjalne ssaków, bez potrzeby transfekcji genów lub wektorów retrowirusowych. Strategia ta jest zatem obiecująca dla medycyny translacyjnej i stanowi znaczący postęp w technologii organoidów komórek macierzystych.

Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków

Ten protokół przedstawia nowatorski, solidny i powtarzalny system hodowli do generowania i hodowania trójwymiarowych sferoidów z komórek gruczolakoraka jelita grubego Caco2. Wyniki stanowią pierwszy dowód na słuszność koncepcji tego podejścia do badania biologii nowotworowych komórek macierzystych, w tym odpowiedzi na chemioterapię.

Trójwymiarowy model sferoid do badania komórek macierzystych raka jelita grubego

Te protokoły pomogą użytkownikom badać metabolizm energii mitochondrialnej w sferoidach 3D pochodzących z linii komórek rakowych za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse.

Badanie metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid mikrotkankowych 3D za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę produkcji trzech różnych typów sferoidów w sposób, który czyni je odpowiednimi do badań przesiewowych i analiz na dużą skalę o wysokiej zawartości. Ponadto przedstawiono przykłady pokazujące, w jaki sposób można je analizować na poziomie sferoidalnym i poszczególnych komórek.

Niezawodna metoda produkcji sferoid na dużą skalę do zastosowań związanych z przesiewaniem i analizą o wysokiej zawartości

Przedstawiamy protokół do hodowli sferoidów o wysokiej powtarzalności i ich charakterystyki fenotypowej za pomocą przechwytywania obrazów i proteomiki.

Półautomatyczna analiza fenotypowa funkcjonalnych hodowli komórek sferoidalnych 3D

Organoidy rewolucjonizują spersonalizowane modelowanie tkanek do rozwoju narządów, odkrywania leków i badań nad chorobami. Inżynieria organoidowa się naprzód w tworzeniu skomplikowanych tkanek syntetycznych. Celem jest zintegrowanie morfogenezy, technologii asembloidów i biomatryc w celu poczynienia postępów w inżynierii tkankowej. Protokół ten pomaga w modelowaniu organogenezy wątroby i ustalaniu wytycznych dotyczących budowy tkanek syntetycznych.

Techniki uprawy in vitro do modelowania organogenezy wątroby, budowania asembloidów i projektowania tkanek syntetycznych przy użyciu ludzkich linii komórkowych

Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.

Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych

Poznaj technikę ciągłego karmienia z regulacją składników odżywczych w bioreaktorach z mieszaniem. Metoda poprawia wzrost sferoidów komórek ssaków i zapewnia równomierne rozprowadzenie substancji odżywczych, co umożliwia skalowanie kultur komórkowych do zastosowań w terapiach komórkowych.

Regulacja składników odżywczych poprzez ciągłe karmienie w celu ekspansji komórek ssaków w sferoidach na dużą skalę

Przeglądaj więcej filmów