Regulacja składników odżywczych poprzez ciągłe karmienie w celu ekspansji komórek ssaków w sferoidach na dużą skalę

Ogólnym celem tego procesu jest hodowla dużej liczby komórek w kontrolowanych warunkach odżywczych. Korzystanie z konwencjonalnego sprzętu znajdującego się w laboratorium hodowli komórkowych. Powiązane algorytmy pozwalają na kontrolę i manipulowanie składnikami odżywczymi w zakresach eksperymentalnych.

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące zastosowań hodowli komórkowych na dużą skalę. Takich jak terapie komórkowe u ludzi. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia hodowlę komórek na dużą skalę z równomiernym rozkładem składników odżywczych i gazów.

Pozwala to na większą gęstość komórek niż w przypadku hodowli komórkowych karmionych statycznie lub masowo, zwiększa wydajność i zmniejsza utratę komórek. Można to zrobić za pomocą sprzętu powszechnie spotykanego w większości laboratoriów hodowli komórkowych. Wizualna demonstracja tej metody może być pomocna dla nowych badaczy, ponieważ stosowane techniki mogą być trudne do opanowania ze względu na dużą liczbę kroków, które muszą być wykonane w określonej kolejności w sterylnych warunkach.

Zbierz pięć podstawowych elementów potrzebnych do systemu karmienia. Zbiornik pożywki, pompa perystaltyczna, bioreaktor z mieszadłem, zbiornik na odpady i specjalnie zaprojektowany zestaw do pobierania próbek przewodów. Ustal zbiornik pożywki za pomocą jednolitrowej szklanej butelki.

Zbiornik na odpady za pomocą dwulitrowej szklanej butelki. Bioreaktor z mieszaniem przy użyciu szklanego reaktora o pojemności 250 ml. Użyj cyfrowej pompy perystaltycznej lub podobnej pompy z ośmiokanałową głowicą pompy, aby sterować wymianą medium.

Zmontuj zbiornik i zmodyfikowane pokrywy bioreaktora z twardego i nadającego się do autoklawu tworzywa sztucznego. Z otworami przelotowymi ze stali nierdzewnej, które zapewniają wentylację przez sterylne filtry i umożliwiają transfer medium między zbiornikami a bioreaktorami. Podłączyć rurkę odpływową wykonaną z porowatych szklanych rurek napowietrzających do zmodyfikowanej pokrywy bioreaktora z mieszadłem zawieszonym.

Zmontuj zestawy rurek perfuzyjnych do autoklawu z łączników rurek z polifluorku winylidenu i trwałych rurek pompy perystaltycznej. Długość odcinka zależy od odległości między różnymi komponentami. Zamontuj przewód zasilający za pomocą dwóch średnic przewodów.

Użyj L/S 14 dla rurki głównej, która będzie rozciągać się na odległość od bioreaktora do zbiornika medium. Włożyć rurkę L/S 13 o długości pośrodku długości przewodu dla sekcji pompy, używając odpowiednich adapterów PVDF. Użyj standardowych adapterów węży kolczastych PVDF, aby połączyć dwa kawałki rurki L/S 14 po obu stronach krótszej rurki sekcji pompy.

Zamontuj sekcję rurki sekcyjnej do usuwania odpadów za pomocą rurki L/S 16 o większej średnicy i włóż krótki odcinek rurki L/S 14 pośrodku sekcji pompującej. Odbywa się to w taki sam sposób, jak montaż linii zasilającej za pomocą adapterów PVDF z zadziorami węża. Zmontuj ostatni element zestawu przewodów, konstruując zestaw z trzech krótkich odcinków przewodów L/S 14.

Połączone ze sobą za pomocą złącza HVDF typu T i dwóch małych zacisków węża na dwóch długościach przewodów. Podłącz zespół próbki do złącza próbki ze stali nierdzewnej umieszczonego na pokrywie bioreaktora. Po sterylizacji do jednej z zaciśniętych długości zostanie przymocowany sterylny filtr gazu do odpowietrzania gazu.

Drugi służy do podłączenia do sterylnej strzykawki do pobierania próbek. Autoklawować zestaw do pobierania próbek, gdy jest on podłączony do bioreaktora, przed rozpoczęciem eksperymentu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Użyj tego zestawu do pobierania sterylnych próbek z bioreaktora w razie potrzeby, bez zakłócania ciągłego procesu podawania.

Podłączyć sterylne otwory wentylacyjne w odpowiednich miejscach na pokrywach kolby obrotowej, naczynia na pożywkę, pojemniki na odpady i porty na próbki. Hodować i zbierać komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pozwól komórkom inkubować w temperaturze pokojowej w trypsynie przez dwie do trzech minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego, a następnie zbierz je do stożkowej probówki.

Następnie pobiera się próbkę małych komórek i barwi ją błękitem trypanowym. Policz gęstość komórek za pomocą mikroskopu i standardowego hemocytometru z barwieniem błękitem trypanowym, jak opisano w protokole tekstowym. Dodaj żądaną liczbę komórek do sterylnych bioreaktorów zawiesinowych z mieszadłem dla każdego stanu.

Dodaj pożywkę do bioreaktora z mieszaną zawiesiną za pomocą pipety, aby osiągnąć pożądaną całkowitą objętość kultury. Przenieść bioreaktor zawiesinowy z mieszadłem z komórkami na płytkę mieszającą wewnątrz inkubatora do hodowli komórkowych. Hodowanie komórek w bioreaktorach bez karmienia przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z 5% dwutlenkiem węgla, 100% wilgotnością względną i szybkością mieszania 70 obr./min, aby umożliwić tworzenie się sferoid.

Po utworzeniu sferoidy wyjąć bioreaktor zawiesinowy z mieszadłem z inkubatora. Elementy systemu ciągłego żywienia należy zamontować w szafie bezpieczeństwa biologicznego. Najpierw napełnij zbiornik świeżej pożywki żądaną pożywką hodowlaną, a następnie podłącz z jednej strony linii zasilającej.

Upewnij się również, że zbiornik świeżej pożywki jest odpowiednio odpowietrzony sterylnym filtrem. Sterylny filtr należy wymienić na porcie wlotowym bioreaktora, aby przefiltrować medium przed jego wejściem do bioreaktora. Podłącz przewód odpływowy do średniego zbiornika na odpady i upewnij się, że zbiornik na odpady jest prawidłowo odpowietrzony za pomocą sterylnego filtra.

Umieścić bioreaktor zawiesinowy z mieszadłem na płytce mieszającej wewnątrz inkubatora, stosując te same parametry hodowli, co w przypadku tworzenia sferoidów. Umieść zbiornik świeżego podłoża w pobliskiej minilodówce. Upewnij się, że przewody zasilające są w stanie wyjść z lodówki bez uniemożliwiania zamykania drzwi.

Bardzo ważne jest również, aby przewody zasilające nie były przyciśnięte do drzwi ani lodówki, ani inkubatora. Zbiornik na odpady można umieścić na blacie na zewnątrz inkubatora w dogodnym miejscu. Przełóż pozostałe końcówki przewodów do inkubatora i podłącz przewód zasilający do filtra na porcie wlotowym bioreaktora.

Następnie podłącz przewód odpływowy do portu rury odpływowej. Następnie umieść sekcję pompy przewodów zasilających i odpływowych w głowicy pompy, zapewniając odpowiednią orientację, tak aby przewody zasilające pompowały medium ze zbiornika świeżego medium do bioreaktora zawiesinowego z mieszadłem, a przewody kanalizacyjne pompowały medium z bioreaktora i do zbiornika medium odpadowego. Obliczyć prędkość posuwu, korzystając z równania skorygowanej prędkości posuwu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Użyj najnowszej próbki z informacjami o liczbie komórek, wraz z przewidywaniem szybkości wzrostu i pomiarami stężenia glukozy w pożywce, aby oszacować szybkość podawania potrzebną do utrzymania pożądanego stężenia glukozy w hodowli. Ustawić prędkość pompy na podstawie obliczonej prędkości posuwu. Powtórz obliczanie prędkości podawania i dostosuj prędkość pompy dla każdego punktu pobierania próbek.

Pomiary stężenia glukozy w pożywce przedstawiono z hodowli sferoidalnych insulinoma Beta-TC6 przy użyciu bioreaktorów zawiesinowych z mieszaniem statycznym oraz metod hodowli bioreaktorów z mieszaniem w zawiesinie podawanych w sposób ciągły. Karmienie standardową pożywką o wysokiej zawartości glukozy. Ciągłe karmienie jest w stanie wyeliminować wahania glukozy, ale średni poziom glukozy w pożywce zmienia się dramatycznie w okresie hodowli i znacznie przekracza zakres fizjologiczny.

Dostosowane żywienie jest w stanie wyeliminować wahania, a także utrzymać stężenie glukozy na poziomie zbliżonym do fizjologicznego przez cały okres hodowli. W tym miejscu porównano wzrost komórek zgłoszony jako krotna zmiana liczby komórek w ciągu 21-dniowego okresu hodowli dla bioreaktorów zawiesinowych z mieszaniem z regularnymi zmianami pożywki, kultur bioreaktorów zawiesinowych z mieszaną szybkością podawania i kultur bioreaktorów zawiesinowych z dostosowaną szybkością zasilania. Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak różne warunki, powinny zostać wdrożone, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wymagania dotyczące składników odżywczych dla nowych linii komórkowych lub konkretne wyniki eksperymentalne.

Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie biologii komórki do zbadania wymagań metabolicznych w komórkach ludzi z rakiem lub innymi zaburzeniami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak złożyć system hodowli komórek profuzyjnych, aby lepiej kontrolować warunki hodowli i maksymalizować wydajność komórek. Nie zapominaj, że praca z ludzkimi komórkami może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak ochrona przed patogenami przenoszonymi przez krew.