Szybkie frakcjonowanie i izolacja składników krwi pełnej w próbkach uzyskanych w warunkach środowiskowych

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie uproszczonego protokołu, który umożliwia szybki przepływ oczu, jednoczesne przetwarzanie próbek krwi pełnej. W warunkach nieklinicznych przetwarzanie próżniowe odbywa się w sposób nakładający się, aby umożliwić skuteczną izolację wysokiej jakości frakcji jednojądrzastych komórek krwi obwodowej D-N-A-R-N-A lub surowicy pbmc oraz pozostałych frakcji osocza i czerwonych krwinek. Przetwarzanie rozpoczyna się od odwirowania próżniowego surowicy, usunięcia podwielokrotności z jednego fiala zawierającego wakutainer w celu odwirowania probówek do izolacji DNA.

Następnie może nastąpić zakończenie izolacji DNA po izolacji DNA izolacji RNA pochodzącego z leukocytów z wakutainera K 2 EDTA. Krew z każdego vacutainera jest przepuszczana przez odpowiedni filtr i przemywana PBS, a następnie traktowana środkiem stabilizującym RNA powracającym do fiala zawierającego vacutainer. Szczątkowa plazma jest odciągana, a warstwa jednojądrzasta jest przemywana PBS.

Podczas wirowania probówek zbiera się resztki czerwonych krwinek, a oddzielona surowica jest podwielokrotna. Na koniec pbmc są konserwowane w pożywce do zamrażania komórek. Ostatecznie wysokiej jakości frakcje świeżej krwi mogą zostać wyprodukowane w ciągu dwóch godzin od pobrania, a wszystkie gotowe do testów próbki mogą być dostępne w ciągu dwóch dni.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że procedury mogą być wykonywane jednocześnie w warunkach nieklinicznych, co pozwala na uzyskanie materiału wyjściowego w ciągu dwóch dni do wielu dalszych zastosowań, w tym mikromacierzy epigenetycznych R-T-P-C-R i analiz cytometrii przepływowej. Procedurę zademonstruje Amy Weckl, moja kierowniczka laboratorium, aby rozpocząć przetwarzanie próbek krwi pełnej. Upewnij się, że, wirówka i blok grzewczy zostały przygotowane.

Udokumentuj czas dostarczenia urządzenia próżniowego na arkuszu śledzenia próbki. Po otrzymaniu próbek należy udokumentować izolację surowicy. Czas rozpoczęcia w dzienniku próbki Natychmiast rozpocznij przetwarzanie, odwirowując siedmiomililitrowy odkurzacz surowicy z wyłączonym hamulcem i przyspieszeniem.

Za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego z nasadkami aerozolowymi przez 20 minut w temperaturze 1300 GS cztery stopnie Celsjusza podczas wirowania próżniowego surowicy. Udokumentuj czas rozpoczęcia izolacji DNA w kapturze do hodowli dwukomórkowej BSL. Odwrócić pojemniki próżniowe zawierające żel fial pięć razy i dodać 200 mikrolitrów krwi pełnej z górnej części jednego z wakutainerów do każdej z dwóch 20-mikrolitrowych porcji proteazy.

Pozostaw probówki z proteazą i mikrowirówką krwi w okapie i kontynuuj wirowanie wezwania zawierającego pojemniki próżniowe. Przed odwirowaniem. Udokumentuj czas rozpoczęcia izolacji PBMC, który musi przypadać w ciągu dwóch godzin od pobrania krwi.

Odwróć wywołanie FI zawierające pojemniki próżniowe znajdujące się już w szczelnych pojemnikach aerozolowych od ośmiu do 10 razy. Następnie odwirować vacutainer z przerwą i wyłączonym przyspieszeniem przez 30 minut w temperaturze 1600 Gs 22 stopni Celsjusza. Wróć do próbek do izolacji DNA w kapturze i dodaj 200 mikrolitrów buforu do każdej z probówek z proteazą i mikrowirówką krwi.

Zakryj rurki i zdejmij je z maski. Następnie wiruj je przez 15 sekund. Po wirowaniu natychmiast flashuj, odwiruj próbki.

Kontynuuj izolację DNA zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym, aż DNA zostanie nawiązane z kolumny na Ellucian. Połączono DNA z dwóch kolumn na uczestnika, aby uzyskać łączną wydajność 800 mikrolitrów na uczestnika. Udokumentuj czas rozpoczęcia izolacji RNA leukocytów.

Przebić gumową przegrodę odkurzacza K two EDTA za pomocą kolca przenoszącego. Zachowaj osłonę i nakrętkę do późniejszego użycia po zmontowaniu systemu lamp K two EDTA. Użyj końca metalowej szpatułki, aby bezpiecznie odłączyć igłę i włóż igłę do pustej 10-mililitrowej probówki do pobierania krwi.

Odwróć zespół rurki odbiornika filtra próżniowego K two EDTA, aby zakończyć konfigurację Po filtracji i umyciu PBS należy pobrać trzy mililitry środka stabilizującego RNA za pomocą nowej strzykawki o pojemności 10 mililitrów. Przepłukać filtr, upewniając się, że środek stabilizujący RNA pozostaje podłączony. Następnie odłączyć strzykawkę od filtra, nie wsuwając tłoka.

Uszczelnij wlot i wylot filtra osłoną i nakrętką przytrzymanymi przed kolcem transferowym i pozostaw filtr nasycony środkiem stabilizującym RNA. Przechowuj filtr w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny, aż czas pozwoli na zakończenie izolacji RA. Po powrocie odkurzacza do drugiego kaptura BSL, usuń korek i użyj pipety serologicznej, aby pobrać 1,5 mililitra górnej warstwy plazmy bez zbliżania się do warstwy jednojądrzastej.

Przenieś osocze z dwóch urządzeń próżniowych do pięciomililitrowej fiolki kriogenicznej. Następnie zarejestruj zebrany wolumin. Przenieść pozostałą plazmę i warstwę jednojądrzastą za pomocą pipety serologicznej do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Następnie dodaj wystarczającą ilość wcześniej przygotowanego jednego XPBS, aby całkowita objętość w stożkowej rurce wzrosła do 15 mililitrów. Zakryj rurkę i odwróć ją pięć razy. Następnie odwirować probówkę z przerwami i wyłączonym przyspieszeniem przez 15 minut w temperaturze 300 GS 22 stopni Celsjusza.

Wróć do fiala zawierającego pojemniki próżniowe w kapturze i zbierz czerwone krwinki lub erytrocyty. Użyj pipety o średnicy 5 i 3/4 cala, aby zawirować i poluzować zewnętrzną warstwę żelu fialnego, a następnie usunąć ją. Użyj pipety serologicznej, aby zebrać i przenieść erytrocyty do pięciomililitrowej fiolki kriogenicznej.

Następnie zarejestruj wolumin. Następnie przenieś fiolki kriogeniczne z osoczem i RBC do pojemnika do zamrażania z kontrolowaną szybkością i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej 24 godziny. Po 24 godzinach przenieś próbki do pudełka kriogenicznego i zwróć je do minus 80 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania.

Po zakończeniu wirowania włóż stożkową rurkę z powrotem do okapu i zassaj ciecz, pozostawiając 500 mikrolitrów PBS bez naruszania osadu. Dodaj jeden XPBS, aby zwiększyć objętość do 10 mililitrów i ponownie zawiesić granulki. Delikatnie zakryj rurkę i odwróć ją pięć razy.

Następnie odwirować próbkę z wyłączonym hamulcem i przyspieszeniem przez 10 minut w temperaturze 300 GS 22 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu podwielokrotnić górną warstwę surowicy z urządzenia próżniowego do dwóch mililitrowych fiolek kriogenicznych i udokumentować objętość. Użyj czterech fiolek kriograficznych i wlej 200 mikrolitrów do fiolki kriogenicznej.

Jeden 1000 mikrolitrów do fiolki kriogenicznej dwóch. Następnie podziel pozostałą objętość na fiolki kriogeniczne trzy i cztery. Przenieś fiolki kriogeniczne do kriopudełka i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania.

I udokumentuj czas uruchomienia zamrażarki. Kontynuuj izolację PBMC. Zwracając próbki do okapu po odwirowaniu, należy zassać jak najwięcej supernatantu, nie naruszając osadu.

Zawiesiliśmy pellet w 2,5 mililitra PBMC. Średnia. Dodaj 2,5 mililitra PBMC, pożywki do zamrażania dwóch zawierającej DMSO i RPMI.

Pożywkę do wcześniej przygotowanego roztworu komórkowego i delikatnie zagrynować próbkę. Następnie podwielokrotność 10 mikrolitrów roztworu komórkowego do mikroprobówki wirówkowej. Dodaj 10 mikrolitrów 0,4% niebieskiej plamy z patelni do mikrowirówki i wymieszaj roztwór, pipetując kilka razy.

Następnie odpipetować 10 mikrolitrów mieszaniny do komory do liczenia komórek. Przesuń i umieść szkiełko w liczniku komórek w ciągu trzech minut od wymieszania. Powiększ i skup się na komórkach.

Następnie wybierz opcję zlicz komórki, aby uzyskać liczbę A-P-B-M-C. Jeśli żywotna liczba PBMC przekracza 3 miliony komórek na mililitr, podwielokrotność próbki należy podzielić na maksymalnie pięć fiolek kriogenicznych o stężeniu co najmniej 3 milionów komórek na mililitr. Każdy dokumentuje liczbę komórek w fiolce kriogenicznej w dzienniku próbki.

Zapoznaj się z dołączonym protokołem tekstowym, aby dowiedzieć się, jak postępować, jeśli żywotna liczba PBMC jest mniejsza niż 3 miliony komórek na mililitr. Na koniec przenieś fiolki kriogeniczne do pojemnika do zamrażania z kontrolowaną szybkością i umieść je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na co najmniej 24 godziny. Po 24 godzinach przenieś fiolki kriogeniczne do kriopojemnika i umieść pudełko w fazie gazowej zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.

Udokumentuj czas uruchomienia zamrażarki w dzienniku próbek. Metody izolacji i przetwarzania filtra RNA leukocytów pozwoliły uzyskać obraz żelu powstały w wyniku elektroforezy kapilarnej. Wyprodukowano dwie odrębne prążki z minimalną degradacją reprezentujące rybosomalne RNA ATT s i 28 s.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że utrzymanie dokładnych zapisów ma kluczowe znaczenie. Zalecamy opracowanie bazy danych do przechowywania wszystkich informacji o fiolce kriogenicznej, w tym objętości, stężenia, jakości, kodu kreskowego i miejsca przechowywania na początku. Dalsze zalecenia dotyczące organizacji próbek można znaleźć w protokole tekstowym.