Name: Szybkie frakcjonowanie i izolacja składników krwi pełnej w próbkach uzyskanych w warunkach środowiskowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Naucz się szybkiego frakcjonowania krwi pełnej w warunkach środowiskowych. Ta metoda umożliwia izolację DNA, RNA, osocza i komórek PBMC z wysoką jakością próbek do badań biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Henriette Mair-Meijers za nieocenioną dbałość o szczegóły i godziny poświęcone na przetwarzanie pobrań krwi. Jesteśmy wdzięczni za doświadczenie w projektowaniu graficznym Natalie Jameson Kiesling. Doceniamy również zgodę producentów (Qiagen (Walencja, Kalifornia), BD Biosciences (San Jose, Kalifornia), Life Technologies (Grand Island, NY)) wymienionych w niniejszym dokumencie na publikowanie zastosowań ich produktów zgodnie z opisem. Fundusze na tę pracę zostały hojnie zapewnione przez National Institutes of Health o numerach nagród DA022720, RC1MH088283 i DA022720-05-S1.

<ol><li>Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+selective+serotonin-reuptake+inhibitors+on+lymphocyte+subsets+in+patients+with+a+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Neuropsychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder.</a> Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).</li>
<li>Weigelt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1+and+DAP12+expression+in+monocytes+of+patients+with+severe+psychiatric+disorders+EGR3%2C+ATF3+and+PU.1+as+important+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors.</a> Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).</li>
<li>Robertson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+subset+differences+in+patients+with+chronic+fatigue+syndrome%2C+multiple+sclerosis+and+major+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression.</a> Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).</li>
<li>Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin+expression+and+promoter-methylation+in+peripheral+blood+of+patients+suffering+from+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder.</a> J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).</li>
<li>Klengel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+FKBP5+DNA+demethylation+mediates+gene-childhood+trauma+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions.</a> Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).</li>
<li>Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+mononuclear+cell+gene+expression+profiles+identify+emergent+post-traumatic+stress+disorder+among+trauma+survivors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors.</a> Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).</li>
<li>Smith, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohort+Profile%3A+Generation+Scotland%3A+Scottish+Family+Health+Study+%28GS%3ASFHS%29.+The+study%2C+its+participants+and+their+potential+for+genetic+research+on+health+and+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness.</a> Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).</li>
<li>Mallone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+preservation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+analysis+of+islet+antigen-reactive+T+cell+responses%3A+position+statement+of+the+T-Cell+Workshop+Committee+of+the+Immunology+of+Diabetes+Society%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society.</a> Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).</li>
<li>Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+in+processing+porcine+whole+blood+affects+cytokine+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression.</a> J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).</li>
<li>Debey, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+isolation+techniques+prior+gene+expression+profiling+of+blood+derived+cells%3A+impact+on+physiological+responses%2C+on+overall+expression+and+the+role+of+different+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types.</a> Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).</li>
<li>Uddin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+immune+function+profiles+associated+with+posttraumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).</li>
<li>Kessler, R. C., Wang, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+descriptive+epidemiology+of+commonly+occurring+mental+disorders+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States.</a> Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).</li>
<li>Qiagen. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook. , Valencia, California, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea">https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea</a> (2010).</li>
<li>Thermo Scientific. NanoDrop 1000 Spectrophotometer. , Waltham, Massachusetts, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8">http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8</a> (2010).</li>
<li>Life Technologies. LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf">http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf</a> (2011).</li>
<li>Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess">http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess</a> (2009).</li>
<li>Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html">http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html</a> (2011).</li>
<li>Life Technologies. DNA-free™ Kit. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf">http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf</a> (2012).</li>
<li>Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , Santa Clara, California, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf">http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf</a> (2006).</li>
<li>Koenen, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6A4+methylation+modifies+the+effect+of+the+number+of+traumatic+events+on+risk+for+posttraumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Depress+Anxiety%22%5BJournal%5D)">SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder.</a> Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).</li>
<li>Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+the+SS+variant+of+5-HTTLPR+and+PTSD+among+adults+with+histories+of+childhood+emotional+abuse%3A+Results+from+two+African+American+independent+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples.</a> J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).</li>
<li>Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. American Association of Physical Anthropologists 82nd Annual Meeting, Knoxville, TN, , Comprehensive Psychiatry. (2013).</li>
<li>Sipahi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+epigenetic+variation+of+DNA+methyltransferase+genes+is+associated+with+vulnerability+to+post-traumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder.</a> Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).</li>
<li>Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+inflammatory+marker+profiles+associated+with+depression+in+a+community-based+epidemiologic+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample.</a> Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).</li>
<li>Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 3rd North American Congress of Epidemiology, Montreal, QC, , (2011).</li>
<li>Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 101st Annual Conference of the American Psychopathological Association, New York, NY, , (2011).</li>
<li>Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).</li>
<li>Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).</li>
<li>Bustamante, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBustamante%2C+AC+%22Distinct+gene+expression+profiles+characterize+lifetime+PTSD+and+childhood+maltreatment+in+the+Detroit+Neighborhood+Health+Study%22">Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study</a>. , International Society for Traumatic Stress Studies. Philadelphia, PA. (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Opisaliśmy uproszczony protokół, który został z powodzeniem zastosowany do przetwarzania ponad 1600 próbek krwi pełnej w Detroit Neighborhood Health Study. Chociaż wiele z tych technik jest dostępnych w istniejącej literaturze, nasza kompilacja krok po kroku, obejmująca precyzyjnie określone w czasie zmiany między każdym krokiem, odzwierciedla zoptymalizowany, wydajny protokół, który z powodzeniem wytwarza różnorodne próbki biologiczne o szerokim zakresie dalszych zastosowań, w tym metylacji DNA, ekspresji mRNA i analizi...

Liczne badania scharakteryzowały różnice w ekspresji genów, metylacji DNA i podzbiorach komórek we krwi u osób z chorobami psychicznymi (lub innymi) oraz u osób zdrowych1-4. Wyniki tych badań uzyskano jednak w warunkach klinicznych, w których różnice związane z chorobą mogą być wyolbrzymione ze względu na zazwyczaj cięższy przebieg schorzeń, z powodu których pacjenci szukają leczenia. Dzięki postępowi w podejściach „omicznych”, w ostatniej dekadzie odnotowano gwałtowny wzrost zainteresowania pobieraniem próbek biologicznych w środowiskach społecznych i/lub epidemiologicznych5-7, aby dostarczyć opartych na populacji szacunków rozpowszechnienia chorób oraz szerszego obrazu determinant środowiskowych tych schorzeń psychicznych i/lub somatycznych.
Kluczowym wyzwaniem w tym zakresie jest wymóg szybkiego przetworzenia pobranych próbek. Degradacja komórek mononuklearnych, kluczowych elementów układu odpornościowego często wykorzystywanych do oceny stanu zdrowia jednostki, rozpoczyna się natychmiast po pobraniu krwi, a po 2 hr od pobrania następuje znaczący spadek wydajności ich odzyskiwania8-10. Aby sprostać temu wyzwaniu, przedstawiamy zoptymalizowany protokół, w którym wiele składników pełnej krwi ludzkiej jest izolowanych jednocześnie z próbek pobranych w domach osób mieszkających w dużym obszarze metropolitalnym. Protokół opiera się na naszym opracowaniu i modyfikacji aktualnych technik, w tym na przechowywaniu wszystkich „nadmiarowych” frakcji na wypadek, gdyby przyszłe techniki umożliwiły dalszą izolację/analizy. Choć zamiast opisanych tutaj poszczególnych metod można zastosować alternatywne sposoby lub zestawy, przedstawione procedury okazały się niezawodnym i wydajnym sposobem przetwarzania próbek w trybie wysokoprzepustowym. Wysokiej jakości frakcje (PBMCs, DNA, surowica i RNA) ze świeżej krwi mogą zostać otrzymane w ciągu 2 hr od pobrania, a wszystkie próbki gotowe do analizy mogą być dostępne w ciągu 2 dni (Rysunek 1).
Niniejszy protokół opracowano w celu umożliwienia efektywnego przetwarzania próbek pobranych od dorosłych mieszkańców miasta Detroit w ramach Detroit Neighborhood Health Study (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1) – populacyjnego badania społecznych i biologicznych uwarunkowań zespołu stresu pourazowego (PTSD) oraz innych chorób psychicznych. Częstość występowania PTSD w Detroit jest ponad dwukrotnie wyższa od średniej krajowej11,12. Identyfikacja biologicznych uwarunkowań PTSD w tej populacji może pomóc w opracowaniu odpowiednich interwencji farmakologicznych i/lub poznawczo-behawioralnych, aby wspomóc osoby cierpiące na to zaburzenie, zarówno w tej populacji miejskiej, jak i w innych populacjach wysokiego ryzyka (np. powracających weteranach wojennych). Nasze laboratorium, wcześniej zlokalizowane na Wayne State University w Detroit w stanie Michigan, zostało wybrane do przetwarzania próbek ze względu na nasze doświadczenie w pracy ze świeżymi próbkami tkanek pochodzącymi z różnych źródeł, konieczność rozpoczęcia obróbki próbek w ciągu 2 hr od momentu pobrania oraz bliskość miejsc pobrań. Korzystając z tej wyjątkowej okazji, naszym celem była optymalizacja procesu w celu uzyskania maksymalnej wydajności DNA, RNA, surowicy oraz mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMCs) z każdego materiału (łącznie N=1639 próbek pobranych w 5 seriach). Przedstawione tutaj procedury mogą być wykonywane jednocześnie w warunkach pozaklinicznych, dostarczając tym samym materiału wyjściowego (średnie wydajności podano w tabeli 1) do wielu analiz następczych, w tym mikromacierzy, analiz epigenetycznych, RT-PCR w czasie rzeczywistym oraz cytometrii przepływowej.
<img alt="Schemat procesu pobierania i przetwarzania krwi; od flebotomii do izolacji DNA/RNA; kroki osi czasu." src="/files/ftp_upload/52227/52227fig1highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Ogólny schemat postępowania. Przedstawiony tutaj ogólny proces obejmuje logistykę pozyskiwania próbek krwi, od zidentyfikowania uczestników wyrażających zgodę, po samo pobranie krwi. Wysokiej jakości frakcje świeżej krwi pełnej (mononuklearne komórki krwi obwodowej; PBMCs, DNA, surowica i RNA) mogą zostać otrzymane w ciągu 2 hr od pobrania, a wszystkie próbki gotowe do analizy mogą być dostępne w ciągu 2 dni. Co więcej, frakcje przygotowane tą metodą nadają się do długoterminowego przechowywania, jeśli próbki nie mają być badane natychmiast. Cały opisany tutaj harmonogram mógłby zostać zrealizowany w ciągu jednego dnia (łącznie ok. 5 hr). Jednak taki dzień byłby niezwykle pracochłonny, szczególnie dla jednego technika, nawet z dużym doświadczeniem w tych technikach. Dlatego zalecamy podział procedur z Dnia 1 pomiędzy co najmniej dwóch techników i zakończenie przetwarzania RNA w Dniu 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52227/52227fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Dzień 1: Izolacja DNA</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5493-1L</td><td>Dzień 1: Izolacja PBMC</td></tr><tr><td>5 i frac34; &rdquo; Pipety Pasteura</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>Dzień 1: Izolacja PBMC</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS), inaktywowana termicznie</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td>Dzień 1: Izolacja PBMC</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418-500ml</td><td>Dzień 1: Izolacja PBMC</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640, płyn</td><td>Invitrogen</td><td>11875119</td><td>Dzień 1: Izolacja PBMC</td></tr><tr><td>0,4% plama błękitu trypanowego&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Dzień 1: Izolacja PBMC</td></tr><tr><td>Komora do liczenia komórek hrabiny</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Dzień 1: Izolacja PBMC</td></tr><tr><td>Hrabina Automatyczny licznik komórek lub urządzenie do liczenia komórek, takie jak mikroskop i hemocytometr</td><td>Invitrogen</td><td>C10281</td><td>Dzień 1: Izolacja PBMC</td></tr><tr><td>Frakcjonowanie i LeukoLOCK Zestaw stabilizacyjny&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>1933</td><td>Dzień 1: Izolacja RNA leukocytów</td></tr><tr><td>25&nbsp; G x 5/8 cala igły</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td> Dzień 1: Strzykawki <td>do izolacji RNA leukocytów</td></tr><tr><td>(5&nbsp; ml)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309646</td><td>Dzień 1 i 2: Roztwór do lizy denaturacyjnej izolacji RNA leukocytów</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>8540G</td><td>Dzień 2: Izolacja RNA leukocytów</td></tr><tr><td>5&nbsp; M NaCl</td><td>Life Technologies</td><td>24740011</td><td>Dzień 2: Izolacja RNA leukocytów</td></tr><tr><td>Odczynnik TRI</td><td>Ambion</td><td>9738</td><td>Dzień 2: Izolacja RNA leukocytów</td></tr><tr><td>Bromo-3-chloro-propan (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B-9673</td> Dzień 2: Wkłady wirowe <td>do izolacji RNA leukocytów</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>10051G</td><td>Dzień 2: Izolacja RNA leukocytów</td></tr><tr><td>0,1&nbsp; mM EDTA</td><td>Ambion</td><td>9912</td><td>Dzień 2: Zestaw do izolacji RNA leukocytów</td></tr><tr><td>bez DNA</td><td>Ambion</td><td>AM1960</td><td>Dzień 2: Drabina RNA 6000 do pomiaru DNazy</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5067-1529</td><td>Dzień 2: Zestaw do analizy bioanalizatora</td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Series II&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>Dzień 2: Analiza bioanalizatorem</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Ambion</td><td>AM8782</td><td>Dzień 2: Analiza bioanalizatorem</td></tr><tr><td>Etanol >99%</td><td>Sigma</td><td>E7023-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol >99%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I9516-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Ultra czysta woda bez nukleaz&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>9938</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (bez nukleazy)</td><td>Eppendorf</td><td>22491253</td><td></td></tr><tr><td>Pipeter (serologiczny)</td><td>Eppendorf</td><td>2223020-4</td><td></td></tr><tr><td>Pipety (do objętości poniżej 1&nbsp; ml)</td><td>Eppendorf</td><td>3120000-054</td><td></td></tr><tr><td>Pipety (serologiczne)</td><td>Fisher</td><td>13-678-27E</td><td></td></tr><tr><td>Pojemniki do zamrażania z kontrolowaną szybkością</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Cryoboxy (do 2&nbsp; ml oraz 5&nbsp; ml kriowialiów i 1,5&nbsp; ml probówki do mikrowirówek)</td><td>Fisher</td><td>03-395-464</td><td></td></tr><tr><td>Stojak na probówki</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-804-134</td><td></td></tr><tr><td>15&nbsp; ml rurki polipropylenowe</td><td>Fisher</td><td>14-959-49D</td><td></td></tr><tr><td>1,5&nbsp; ml i 0,65 probówki do mikrowirówek</td><td>Fisher</td><td>07-200-534 i 07-200-185</td><td></td></tr><tr><td>2&nbsp; ml oraz 5&nbsp; ml kriowiale</td><td>Fisher</td><td>10-500-26 i 10-269-88F&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>8&nbsp; ml CPT vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>362761</td><td>2 probówki</td></tr><tr><td>6&nbsp; ml K2 Vacutainer EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>367863</td><td>2 probówki</td></tr><tr><td>8,5&nbsp; ml SST vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>367988</td><td>1 probówka</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do suchej kąpieli z blokiem grzewczym do probówek do mikrowirówek</td><td>Fisher</td><td>11-715-1250</td><td></td></tr><tr><td>System filtracji/próżni do stosowania w okapie do hodowli komórkowych</td><td>Fisher</td><td>01-257-87</td><td></td></tr><tr><td>Wirnik o stałym kącie nachylenia do probówek do mikrowirówek z pokrywą</td> <td>szczelną na aerozolEppendorf</td><td>22637002</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem z obracanym wirnikiem kubełkowym i nasadkami aerozolowymi do 16 x 125&nbsp; mm vacutainery i 15&nbsp; ml probówki polipropylenowe</td><td>Eppendorf</td><td>22628157</td><td>2, nie trzeba przechowywać w lodówce</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 (zalecane do dokładności małych objętości) lub innego urządzenia spektrofotometrycznego</td><td>Fisher</td><td>13-400-411</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator Agilent</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik ciekłego azotu</td><td>Thermo Scientific</td><td>11-676-56</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik na ostre przedmioty</td><td>Fisher</td><td>22-037-970</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik na odpady biologiczne</td><td>Thermo Scientific</td><td>1223P52</td><td></td></tr><tr><td>Poziom bezpieczeństwa biologicznego 2&nbsp; certyfikowany kaptur do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-261-315</td><td></td></tr></tbody></table>

szybkie frakcjonowanie i izolacja składników krwi pełnej w próbkach uzyskanych w warunkach środowiskowych

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

Pobieranie i przetwarzanie próbek krwi pełnej w warunkach nieklinicznych oferuje unikalną okazję do oceny osób mieszkających w społecznościach zarówno z wcześniej istniejącymi schorzeniami, jak i bez nich. Szybkie przetwarzanie tych próbek jest niezbędne, aby uniknąć degradacji kluczowych składników komórkowych. Uwzględniono tutaj metody jednoczesnej izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), DNA, RNA i surowicy z pojedynczego pobrania krwi przeprowadzonego w domach uczestników, którzy wyrazili na to zgodę, na obszarze metropolitalnym, z przetwarzaniem rozpoczętym w ciągu 2 godzin od pobrania. Wykorzystaliśmy te techniki do przetworzenia ponad 1600 próbek krwi, uzyskując spójny, wysokiej jakości materiał, który następnie został wykorzystany w udanych analizach metylacji DNA, genotypowania, ekspresji genów i cytometrii przepływowej. Niektóre z zastosowanych metod są standardowe; Jednak po połączeniu w opisany sposób umożliwiają one efektywne przetwarzanie próbek pochodzących od uczestników badań populacyjnych i/lub środowiskowych, którzy normalnie nie byliby oceniani w warunkach klinicznych. W związku z tym protokół ten ma potencjał do uzyskania próbek (a następnie danych), które są bardziej reprezentatywne dla populacji ogólnej.

Kluczowe jest, aby cała procedura pozwalała na uzyskanie materiału wysokiej jakości do analiz w wielu zastosowaniach następczych, w tym do badania ekspresji genów za pomocą mikromacierzy i analizy RT-PCR, wykrywania modyfikacji epigenetycznych oraz zmienności podzbiorów komórek. Tabela 1 przedstawia średnią wydajność i jakość materiałów uzyskanych z każdego z procesów. Rysunek 3 prezentuje przykład jakości materiału uzyskanego metodami izolacji RNA z leukocytów oraz przetwarzania filtr...

Przedstawiamy metodologię przetwarzania krwi pełnej w celu uzyskania różnych składników do dalszej analizy. Zoptymalizowaliśmy uproszczony protokół, który umożliwia szybkie, wysokoprzepustowe jednoczesne przetwarzanie próbek krwi pełnej w warunkach nieklinicznych.

Szybkie frakcjonowanie i izolacja składników krwi pełnej w próbkach uzyskanych w warunkach środowiskowych

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie uproszczonego protokołu, który umożliwia szybki przepływ oczu, jednoczesne przetwarzanie próbek krwi pełnej. W warunkach nieklinicznych przetwarzanie próżniowe odbywa się w sposób nakładający się, aby umożliwić skuteczną izolację wysokiej jakości frakcji jednojądrzastych komórek krwi obwodowej D-N-A-R-N-A lub surowicy pbmc oraz pozostałych frakcji osocza i czerwonych krwinek. Przetwarzanie rozpoczyna się od odwirowania próżniowego surowicy, usunięcia podwielokrotności z jednego fiala zawierającego wakutainer w celu odwirowania probówek do izolacji DNA.Następnie może nastąpić zakończenie izolacji DNA po izolacji DNA izolacji RNA pochodzącego z leukocytów z wakutainera K 2 EDTA. Krew z każdego vacutainera jest przepuszczana przez odpowiedni filtr i przemywana PBS, a następnie traktowana środkiem stabilizującym RNA powracającym do fiala zawierającego vacutainer. Szczątkowa plazma jest odciągana, a warstwa jednojądrzasta jest przemywana PBS.Podczas wirowania probówek zbiera się resztki czerwonych krwinek, a oddzielona surowica jest podwielokrotna. Na koniec pbmc są konserwowane w pożywce do zamrażania komórek. Ostatecznie wysokiej jakości frakcje świeżej krwi mogą zostać wyprodukowane w ciągu dwóch godzin od pobrania, a wszystkie gotowe do testów próbki mogą być dostępne w ciągu dwóch dni.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że procedury mogą być wykonywane jednocześnie w warunkach nieklinicznych, co pozwala na uzyskanie materiału wyjściowego w ciągu dwóch dni do wielu dalszych zastosowań, w tym mikromacierzy epigenetycznych R-T-P-C-R i analiz cytometrii przepływowej. Procedurę zademonstruje Amy Weckl, moja kierowniczka laboratorium, aby rozpocząć przetwarzanie próbek krwi pełnej. Upewnij się, że, wirówka i blok grzewczy zostały przygotowane.Udokumentuj czas dostarczenia urządzenia próżniowego na arkuszu śledzenia próbki. Po otrzymaniu próbek należy udokumentować izolację surowicy. Czas rozpoczęcia w dzienniku próbki Natychmiast rozpocznij przetwarzanie, odwirowując siedmiomililitrowy odkurzacz surowicy z wyłączonym hamulcem i przyspieszeniem.Za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego z nasadkami aerozolowymi przez 20 minut w temperaturze 1300 GS cztery stopnie Celsjusza podczas wirowania próżniowego surowicy. Udokumentuj czas rozpoczęcia izolacji DNA w kapturze do hodowli dwukomórkowej BSL. Odwrócić pojemniki próżniowe zawierające żel fial pięć razy i dodać 200 mikrolitrów krwi pełnej z górnej części jednego z wakutainerów do każdej z dwóch 20-mikrolitrowych porcji proteazy.Pozostaw probówki z proteazą i mikrowirówką krwi w okapie i kontynuuj wirowanie wezwania zawierającego pojemniki próżniowe. Przed odwirowaniem. Udokumentuj czas rozpoczęcia izolacji PBMC, który musi przypadać w ciągu dwóch godzin od pobrania krwi.Odwróć wywołanie FI zawierające pojemniki próżniowe znajdujące się już w szczelnych pojemnikach aerozolowych od ośmiu do 10 razy. Następnie odwirować vacutainer z przerwą i wyłączonym przyspieszeniem przez 30 minut w temperaturze 1600 Gs 22 stopni Celsjusza. Wróć do próbek do izolacji DNA w kapturze i dodaj 200 mikrolitrów buforu do każdej z probówek z proteazą i mikrowirówką krwi.Zakryj rurki i zdejmij je z maski. Następnie wiruj je przez 15 sekund. Po wirowaniu natychmiast flashuj, odwiruj próbki.Kontynuuj izolację DNA zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym, aż DNA zostanie nawiązane z kolumny na Ellucian. Połączono DNA z dwóch kolumn na uczestnika, aby uzyskać łączną wydajność 800 mikrolitrów na uczestnika. Udokumentuj czas rozpoczęcia izolacji RNA leukocytów.Przebić gumową przegrodę odkurzacza K two EDTA za pomocą kolca przenoszącego. Zachowaj osłonę i nakrętkę do późniejszego użycia po zmontowaniu systemu lamp K two EDTA. Użyj końca metalowej szpatułki, aby bezpiecznie odłączyć igłę i włóż igłę do pustej 10-mililitrowej probówki do pobierania krwi.Odwróć zespół rurki odbiornika filtra próżniowego K two EDTA, aby zakończyć konfigurację Po filtracji i umyciu PBS należy pobrać trzy mililitry środka stabilizującego RNA za pomocą nowej strzykawki o pojemności 10 mililitrów. Przepłukać filtr, upewniając się, że środek stabilizujący RNA pozostaje podłączony. Następnie odłączyć strzykawkę od filtra, nie wsuwając tłoka.Uszczelnij wlot i wylot filtra osłoną i nakrętką przytrzymanymi przed kolcem transferowym i pozostaw filtr nasycony środkiem stabilizującym RNA. Przechowuj filtr w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny, aż czas pozwoli na zakończenie izolacji RA. Po powrocie odkurzacza do drugiego kaptura BSL, usuń korek i użyj pipety serologicznej, aby pobrać 1,5 mililitra górnej warstwy plazmy bez zbliżania się do warstwy jednojądrzastej.Przenieś osocze z dwóch urządzeń próżniowych do pięciomililitrowej fiolki kriogenicznej. Następnie zarejestruj zebrany wolumin. Przenieść pozostałą plazmę i warstwę jednojądrzastą za pomocą pipety serologicznej do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.Następnie dodaj wystarczającą ilość wcześniej przygotowanego jednego XPBS, aby całkowita objętość w stożkowej rurce wzrosła do 15 mililitrów. Zakryj rurkę i odwróć ją pięć razy. Następnie odwirować probówkę z przerwami i wyłączonym przyspieszeniem przez 15 minut w temperaturze 300 GS 22 stopni Celsjusza.Wróć do fiala zawierającego pojemniki próżniowe w kapturze i zbierz czerwone krwinki lub erytrocyty. Użyj pipety o średnicy 5 i 3/4 cala, aby zawirować i poluzować zewnętrzną warstwę żelu fialnego, a następnie usunąć ją. Użyj pipety serologicznej, aby zebrać i przenieść erytrocyty do pięciomililitrowej fiolki kriogenicznej.Następnie zarejestruj wolumin. Następnie przenieś fiolki kriogeniczne z osoczem i RBC do pojemnika do zamrażania z kontrolowaną szybkością i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej 24 godziny. Po 24 godzinach przenieś próbki do pudełka kriogenicznego i zwróć je do minus 80 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania.Po zakończeniu wirowania włóż stożkową rurkę z powrotem do okapu i zassaj ciecz, pozostawiając 500 mikrolitrów PBS bez naruszania osadu. Dodaj jeden XPBS, aby zwiększyć objętość do 10 mililitrów i ponownie zawiesić granulki. Delikatnie zakryj rurkę i odwróć ją pięć razy.Następnie odwirować próbkę z wyłączonym hamulcem i przyspieszeniem przez 10 minut w temperaturze 300 GS 22 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu podwielokrotnić górną warstwę surowicy z urządzenia próżniowego do dwóch mililitrowych fiolek kriogenicznych i udokumentować objętość. Użyj czterech fiolek kriograficznych i wlej 200 mikrolitrów do fiolki kriogenicznej.Jeden 1000 mikrolitrów do fiolki kriogenicznej dwóch. Następnie podziel pozostałą objętość na fiolki kriogeniczne trzy i cztery. Przenieś fiolki kriogeniczne do kriopudełka i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania.I udokumentuj czas uruchomienia zamrażarki. Kontynuuj izolację PBMC. Zwracając próbki do okapu po odwirowaniu, należy zassać jak najwięcej supernatantu, nie naruszając osadu.Zawiesiliśmy pellet w 2,5 mililitra PBMC. Średnia. Dodaj 2,5 mililitra PBMC, pożywki do zamrażania dwóch zawierającej DMSO i RPMI.Pożywkę do wcześniej przygotowanego roztworu komórkowego i delikatnie zagrynować próbkę. Następnie podwielokrotność 10 mikrolitrów roztworu komórkowego do mikroprobówki wirówkowej. Dodaj 10 mikrolitrów 0,4% niebieskiej plamy z patelni do mikrowirówki i wymieszaj roztwór, pipetując kilka razy.Następnie odpipetować 10 mikrolitrów mieszaniny do komory do liczenia komórek. Przesuń i umieść szkiełko w liczniku komórek w ciągu trzech minut od wymieszania. Powiększ i skup się na komórkach.Następnie wybierz opcję zlicz komórki, aby uzyskać liczbę A-P-B-M-C. Jeśli żywotna liczba PBMC przekracza 3 miliony komórek na mililitr, podwielokrotność próbki należy podzielić na maksymalnie pięć fiolek kriogenicznych o stężeniu co najmniej 3 milionów komórek na mililitr. Każdy dokumentuje liczbę komórek w fiolce kriogenicznej w dzienniku próbki.Zapoznaj się z dołączonym protokołem tekstowym, aby dowiedzieć się, jak postępować, jeśli żywotna liczba PBMC jest mniejsza niż 3 miliony komórek na mililitr. Na koniec przenieś fiolki kriogeniczne do pojemnika do zamrażania z kontrolowaną szybkością i umieść je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na co najmniej 24 godziny. Po 24 godzinach przenieś fiolki kriogeniczne do kriopojemnika i umieść pudełko w fazie gazowej zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.Udokumentuj czas uruchomienia zamrażarki w dzienniku próbek. Metody izolacji i przetwarzania filtra RNA leukocytów pozwoliły uzyskać obraz żelu powstały w wyniku elektroforezy kapilarnej. Wyprodukowano dwie odrębne prążki z minimalną degradacją reprezentujące rybosomalne RNA ATT s i 28 s.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że utrzymanie dokładnych zapisów ma kluczowe znaczenie. Zalecamy opracowanie bazy danych do przechowywania wszystkich informacji o fiolce kriogenicznej, w tym objętości, stężenia, jakości, kodu kreskowego i miejsca przechowywania na początku. Dalsze zalecenia dotyczące organizacji próbek można znaleźć w protokole tekstowym.

rapid-fractionation-isolation-whole-blood-components-samples-obtained

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film przedstawia przygotowanie wysokiej jakości osocza bogatopłytkowego (PRP) poprzez badanie przesiewowe liczby płytek krwi, pobieranie i odwirowywanie krwi oraz izolowanie płytek krwi. Ten PRP jest stosowany w zastosowaniach terapeutycznych do regeneracji i gojenia tkanek.

Przygotowanie osocza bogatopłytkowego z ludzkiej krwi obwodowej

Leukocyty krwi i płytki krwi mogą być używane jako marker ogólnego zdrowia bioenergetycznego danej osoby, a więc mają potencjał do monitorowania procesów patologicznych i wpływu leczenia. Tutaj opisujemy metodę izolacji i pomiaru funkcji mitochondriów oraz wybuchu oksydacyjnego w tych komórkach.

Bioenergetyka i wybuch oksydacyjny: protokoły izolacji i oceny ludzkich leukocytów i płytek krwi

Fibryna bogata w leukocyty-płytki krwi (L-PRF) reprezentuje zatwierdzony przez FDA preparat autologicznych koncentratów płytkowych, który posiada unikalną architekturę fibryny, wzbogacone płytki krwi i obfite czynniki wzrostu. W tym miejscu przedstawiamy protokół generowania L-PRF po stronie fotela, a także oceniamy jego właściwości mechaniczne, w tym testy jednoosiowe i testy wytrzymałości na utrzymanie szwów.

Charakterystyka fibryny bogatopłytkowej leukocytów, nowego biomateriału

Śródbłonkowe komórki progenitorowe (EPC) są kluczowe w neowaskularyzacji niedokrwionych tkanek. Metoda ta opisuje izolację ludzkich EPC z krwi obwodowej, a także identyfikację ich potencjału migracyjnego w próbkach surowicy pacjentów kardiochirurgicznych.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych od zdrowych ochotników i ich potencjał migracyjny pod wpływem próbek surowicy po operacji kardiochirurgicznej

Tutaj prezentujemy protokół izolacji błony plazmatycznej, cytoplazmy i mitochondriów komórek U937 bez użycia szybkiego wirowania. Technika ta może być stosowana do oczyszczania frakcji subkomórkowych w celu późniejszego zbadania lokalizacji białka za pomocą immunoblottingu.

Frakcjonowanie komórek U937 przy braku wirowania z dużą prędkością

Ten protokół szczegółowo opisuje klinicznie możliwe do wdrożenia przygotowanie wysokiej jakości PBMC i biopróbek osocza w ośrodku badań klinicznych, które mogą być wykorzystane do translacyjnej analizy biomarkerów.

Przygotowanie granulek komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i osocza z pojedynczego pobrania krwi w ośrodkach badań klinicznych do analizy biomarkerów

Przedstawiamy prosty protokół izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z krwi pełnej uzyskanej od pacjentów, u których zdiagnozowano zespół Sézary'ego, a następnie selekcję limfocytów T CD4+, ich stymulację octanem forbolu12-mirystynian13 i jonoforem A23187 oraz przygotowanie RNA do profilowania transkryptomicznego.

Izolowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i limfocytów T CD4+ od pacjentów z zespołem Sézary'ego w celu profilowania transkryptomicznego

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolacji neutrofili z krwi pełnej, kożuchów lub błon leukaferezy, osiągając dobrą wydajność, wysoką czystość i minimalną aktywację komórek. Wykorzystujemy oczyszczanie gradientowe, sedymentację czerwonych krwinek (RBC) i lizę RBC, aby uzyskać wysokiej jakości / czysty preparat neutrofili.

Izolacja ludzkich neutrofili z krwi pełnej i kożuchów

Płynna biopsja zrewolucjonizowała nasze podejście do badań translacyjnych w onkologii, a pobieranie, jakość i przechowywanie próbek są kluczowymi krokami dla jej udanego zastosowania klinicznego. W tym miejscu opisujemy ustandaryzowany i zwalidowany protokół dla dalszych zastosowań DNA wolnych od krążenia, który może być stosowany w większości laboratoriów badań translacyjnych.

Standaryzowany protokół przedanalityczny do biopsji płynnej do dalszych zastosowań DNA wolnych od krążenia

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę kompatybilną z automatyzacją o wysokiej przepustowości, polegającą na izolowaniu ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej do biobankowania i innych celów.

Izolowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej od kożuchów za pomocą wysokoprzepustowej separacji kulek immunomagnetycznych

Naucz się szybkiego frakcjonowania krwi pełnej w warunkach środowiskowych. Ta metoda umożliwia izolację DNA, RNA, osocza i komórek PBMC z wysoką jakością próbek do badań biologicznych.

Szybkie frakcjonowanie i izolacja składników krwi pełnej w próbkach uzyskanych w warunkach środowiskowych

Przeglądaj więcej filmów