Generowanie wektorów plazmidowych eksprymujących białka znakowane FLAG pod regulacją promotora ludzkiego czynnika wydłużenia-1α przy użyciu zespołu Gibsona
9 lutego 2015
Synteza niestandardowych plazmidów jest pracochłonna i czasochłonna. Protokół ten opisuje zastosowanie klonowania zespołu Gibsona w celu zmniejszenia pracy i czasu trwania niestandardowej procedury klonowania DNA. Opisany protokół pozwala również na uzyskanie wiarygodnych znakowanych konstruktów białkowych do ekspresji ssaków przy podobnych kosztach jak w przypadku tradycyjnego klonowania DNA metodą "wytnij i wklej".
Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie podejścia składania Gibsona do tworzenia dużych, złożonych konstruktów DNA, które łączą krótkie i długie segmenty z kilku różnych źródeł DNA. Najpierw zaprojektuj obliczeniowo pełną sekwencję nukleotydów plazmidów, a następnie zaprojektuj nakładające się zestawy starterów. Następnie matryce DNA do reakcji składania są amplifikowane metodą PCR.
Następnie przeprowadza się oczyszczanie produktów PCR. Ostatnim etapem jest transformacja powstałych plazmidów w reakcji składania i weryfikacja klonów plazmidów. Ostatecznie reakcja składania Gibsona jest wykorzystywana do równoległego rozwoju plazmidów, które zawierają oznakowane flagą wersje białek typu dzikiego i zmutowanych białek CSTF 64 pod regulacją transkrypcji ludzkiego czynnika wydłużenia jednego promotora alfa.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjne DNA Corning, jest to, że może ona tworzyć równolegle, podobne w konstrukcji, dzikie i zmutowane plazmidy bez sekwencyjnych etapów Corninga. Zaprojektuj ciągłą sekwencję nukleotydów, która będzie reprezentować końcowy plazmid. Teraz wymień rzeczywiste plazmidy i fragmenty DNA, które zostaną użyte jako matryce w kolejności PCR Fragmenty DNA, które nie są łatwo dostępne, takie jak różne kombinacje znaczników i promotorów jako pojedyncze lub wiele syntetycznych dwuniciowych fragmentów DNA.
Następnie podziel ciągłą sekwencję nukleotydową końcowego konstruktu na fragmenty DNA nadające się do PCR. Upewnij się, że fragmenty pasują do dostępnych plazmidów i syntetycznych fragmentów DNA. Unikaj fragmentów DNA mniejszych niż 200 nukleotydów.
Obok celu uzyskania dostępu do narzędzia do generowania podkładu wybierz menu ustaw preferencje w wyskakującym oknie zmiany ustawień zespołu Gibsona. Wybierz kartę zmiany prespekcji, a następnie wybierz menu budowy konstrukcji, aby wstawić podzielone fragmenty DNA w narzędziu do generowania starterów sekwencyjnie od pięciu pierwszych do trzech pierwszych końców. Otwórz okno wprowadzania wektora lub wstaw fragment, wklej pierwszy fragment DNA reprezentujący pięć głównych końców wektora DNA w szybkim formacie A i nazwij ten fragment DNA.
Wybierz odpowiedni sposób uzyskania fragmentu DNA. Następnie kliknij zakładkę Kontynuuj. Jeśli zachodzi potrzeba dodania dodatkowych nukleotydów lub miejsc restrykcyjnych na styku końcowego konstruktu, otwórz okno dodaj i wstaw fragment do zespołu w obszarach dystansu startera do przodu lub do tyłu.
Wprowadź dodatkowe nukleotydy lub miejsca restrykcyjne tylko do jednego z fragmentów DNA. Następnie kliknij zakładkę Gotowe. Powtarzaj dla wszystkich fragmentów, aż konstrukcja zostanie ukończona.
Wybierz menu widoku starterów i przejrzyj sekwencje starterów. Powtórz również dla wszystkich konstruktów, wektorów, szkieletów i insertów lub dla fragmentów DNA, które są różne. Rozcieńczyć startery PCR do 10 mikromolów w wodzie lub buforze.
Następnie rozcieńczyć wszystkie matryce DNA i jednoniciowe syntetyczne DNA do PCR do jednego nanograma na mikrolitr w wodzie. Zbierz reakcje PCR w temperaturze pokojowej, łącząc 2,5 mikrolitra po 10 mikromolów każdego startera. Jeden mikrolitr jednego nanograma na mikrolitr matrycy fragment DNA 25 mikrolitrów gorącego.
Rozpocznij korektę polimerazy DNA i 19 mikrolitrów wody. Wymieszaj probówkę, delikatnie trzepając i zbierz kropelki płynu przez krótkie odwirowanie. Amplifikować jednocześnie w oddzielnych probówkach fragmenty DNA o podobnej wielkości zgodnie z zaleceniami dla zastosowanej polimerazy DNA.
Wykonaj od 25 do 28 cykli PCR lub określ liczbę cykli, które dają wystarczającą wydajność DNA. Rozpuść pięć mikrolitrów PCR za pomocą standardowej elektroforezy żelowej AROS. Sprawdź, czy widoczne jest pojedyncze prążki DNA reprezentujące produkt PCR.
Określić wielkość i względną ilość fragmentów DNA za pomocą wzorców masy cząsteczkowej DNA, jeśli to konieczne, powtórzyć PCR, aby uzyskać wystarczającą ilość fragmentów DNA. Przenieś PCR wstępnie strawione za pomocą DPN od jednego do 1,5 mililitra probówek i dodaj 81 mikrolitrów kulek magnetycznych do oczyszczania DNA do każdej probówki. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
Umieść rurki na kolektorze magnetycznym na dwie minuty. Teraz wylej klarowny płyn. Umyć dwukrotnie 200 mikrolitrami 80% etanolu przez 30 sekund.
Następnie ponownie zawieś wysuszone kulki w 10 mikrolitrach 10-milimolowego chlorowodorku trisu o pH 8,0 Po dwóch minutach krótko odkręć, a następnie umieść rurki na kolektorze magnetycznym na dwie minuty. Usuń od 8,5 do 10 mikrolitrów klarownego roztworu i umieść go w nowej, wstępnie oznakowanej probówce. Określić stężenie fragmentów DNA za pomocą spektroskopii UV.
Należy użyć co najmniej 100 nanogramów fragmentu DNA reprezentującego szkielet wektora lub fragment DNA przenoszący marker selektywny. Oblicz trzykrotny nadmiar molowy dla fragmentów DNA, które zostaną użyte jako wstawki. Wymieszaj obliczone ilości fragmentów DNA w probówce do PCR.
Następnie dostosuj objętość do 10 mikrolitrów. Dodaj 10 mikrolitrów głównej mieszanki montażowej Gibsona. Inkubować reakcję w temperaturze 50 stopni Celsjusza w termocyklerze PCR.
Kontynuuj przekształcanie produktu montażowego w niekompetentne e coli lub zamroź produkty w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne. Postępuj zgodnie z procedurą transformacji, która towarzyszy ogniwom chemicznym lub elektrokompetentnym. Zwykle używa się dwóch mikrolitrów reakcji montażu na reakcję przemiany.
Na koniec potwierdź sukces klonowania DNA poprzez sekwencjonowanie DNA przy użyciu specyficznych lub standardowych starterów. Analizuj dane sekwencjonowania pod kątem dokładności. Eksperyment ten miał na celu sklonowanie białka czynnika stymulacji rozszczepienia 64, a także zmutowanego CSTF 64.
Białka połączyły się ze znacznikiem flagi trzy x pod ekspresyjną regulacją promotora alfa HE F1. Plazmid zawierający HE F1 alfa, po którym następuje znacznik flagi trzy x, nie był dla nas dostępny. Dostępne były jednak następujące plazmidy.
PC DNA 3,1 M syczy HF jeden alfa zawierający plazmid i mysie plazmidy CSTF 64. Cała sekwencja konstruktu została złożona przy użyciu aplikacji do edycji nukleotydów i tekstu. Następnie sekwencja została podzielona na cztery dogodne części odpowiadające dostępnym plazmidowym DNA.
Cztery fragmenty DNA do reakcji składania amplifikowano metodą PCR. Powstałe plazmidy z poszczególnych klonów amplifikowano i analizowano przez trawienie enzymem restrykcyjnym w celu prawidłowego złożenia w wektorze DNA pc, a następnie zweryfikowano wybrane klony przez sekwencjonowanie. Po opanowaniu techniki składania, w tym plazmidu i projektu pierwotnego, późniejszą weryfikację PCR i komunikację można przeprowadzić w ciągu pięciu dni, z wyłączeniem czasu na pierwotną i syntetyczną syntezę i dostarczenie DNA.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje zastosowanie klonowania metodą Gibson assembly w celu usprawnienia syntezy niestandardowych plazmidów, co znacząco skraca czas i nakład pracy związany z klonowaniem DNA. Metoda ta umożliwia tworzenie wiarygodnych konstruktów białek z etykietami do ekspresji w komórkach ssaków przy koszcie porównywalnym z metodami tradycyjnymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia molekularna
- Inżynieria genetyczna
- Ekspresja białek
Wstęp
- Synteza plasmidów na zamówienie jest tradycyjnie pracochłonna.
- Metoda Gibson assembly umożliwia równoległe tworzenie plasmidów.
- Białka znakowane są niezbędne do badania funkcji białek.
- Efektywne techniki klonowania są kluczowe dla badań genetycznych.
Cel badania
- W celu uproszczenia procesu tworzenia złożonych konstruktów DNA.
- W celu jednoczesnej produkcji plazmidów typu dzikiego oraz mutantów.
- W celu zwiększenia wydajności składania plazmidów do ekspresji w komórkach ssaków.
Zastosowane metody
- Projektowanie nakładających się zestawów starterów do asemblacji DNA.
- Amplifikacja matryc DNA za pomocą PCR.
- Oczyszczanie produktów PCR przed asemblacją.
- Transformacja kompetentnych komórek E. coli zasemblowanymi plazmidami.
Główne wyniki
- Pomyślny montaż plazmidów zawierających białka CSTF 64 z tagiem flag.
- Weryfikacja konstruktów plazmidowych poprzez sekwencjonowanie.
- Wykazanie zalet montażu równoległego w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Produkcja konstruktów pod kontrolą ludzkiego promotora czynnika elongacji 1 alfa.
Wnioski
- Metoda Gibson assembly znacząco skraca czas klonowania.
- Umożliwia ona wydajną produkcję konstruktów białek z tagiem.
- Podejście to można zastosować w różnych projektach z zakresu inżynierii genetycznej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybkie, równoległe generowanie spersonalizowanych wektorów plazmidowych z wykorzystaniem metody Gibson assembly umożliwia efektywną produkcję tagowanych konstruktów białkowych do badań funkcjonalnych w systemach ssaków. Podejście to eliminuje wąskie gardło związane ze stabilnością ekspresji sterowanej promotorem oraz dostępnością konstruktów, wspierając przepływy pracy w zakresie wczesnego odkrywania i walidacji celów. Metoda ta zwiększa pewność predykcyjną i przyspiesza selekcję portfolio poprzez skrócenie czasu cykli klonowania oraz zwiększenie niezawodności konstruktów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia szybką analizę funkcji genów dzięki możliwości dostosowania konstruktów ekspresyjnych.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wspieranie równoległych badań białek typu dzikiego oraz białek zmutowanych.
- Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów poprzez zapewnienie stabilnej ekspresji genów w modelach komórek macierzystych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Służy do przygotowania zwalidowanych wektorów ekspresyjnych do późniejszych analiz fenotypowych lub biochemicznych.
- Wspiera standaryzację testów, umożliwiając odtwarzalne generowanie konstruktów z określonymi znacznikami i promotorami.
- Przyspiesza przygotowanie do screeningu poprzez skrócenie czasu składania konstruktów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dopasowuje projekt konstruktu do systemów istotnych dla danej choroby, umożliwiając ekspresję w ssaczych komórkach macierzystych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dzięki stabilnej ekspresji sterowanej przez promotor.
- Zmniejsza ryzyko utraty ekspresji, co wspomaga translacyjne badania biomarkerów w odpowiednich przypadkach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda oparta na montażu Gibsona integruje wczesne etapy odkrywania i opracowywania testów, łącząc projektowanie konstruktów z walidacją funkcjonalną w systemach ssaczych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie szybkiego generowania konstruktów do badań nad funkcją genów.
- Screening: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne plazmidy z potencjałem do uzyskania wyników ilościowych.
- Analityka: Zapewnia zweryfikowane sekwencyjnie konstrukty, co umożliwia wiarygodne porównanie efektów białek typu dzikiego i zmutowanych.
- Badania translacyjne: Ułatwia ekspresję w modelach komórek macierzystych istotnych dla danej jednostki chorobowej, wspierając ciągłość badań przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Ustanawia skalowalny, wielokrotnego użytku przepływ pracy dla przyszłych potrzeb w zakresie konstruktów w różnych programach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad funkcją genów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i przyspiesza generowanie konstruktów przy wysokiej powtarzalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji typu go/no-go i poprawia efektywność kapitałową poprzez skracanie cykli klonowania.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zwalidowanych celów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obszarze komputerowego projektowania sekwencji oraz narzędzi do generowania starterów.
- Wymaga dostępu do infrastruktury PCR, oczyszczania DNA oraz sekwencjonowania.
- Wymaga standaryzacji projektowania konstruktów i etapów weryfikacji pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych systemów modelowych poprzez odpowiedni dobór promotora i znacznika.
- Zależne od dostępności matryc DNA oraz terminów pozyskiwania syntetycznych fragmentów DNA.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:30
In Silico Design: Final Plasmid and Overlapping Primers
3:58
Amplification of the DNA Fragments
5:44
DNA Purification Using Magnetic Beads
6:58
Assembly Cloning Reaction and Transformation of the Products in E. coli
8:21
Results: Cloning of CstF-54 and CstF-64 Mutants Under the Transcriptional Regulation of Human Elongation Factor 1α Promoter
9:47
Conclusion
