Protokoły cytometrii przepływowej do powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych analiz antygenowych typów komórek nerwowych

Ogólnym celem tej procedury jest analiza ekspresji antygenów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych na komórkach nerwowych za pomocą cytometrii przepływowej. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie komórek nerwowych z kultur in vitro lub pierwotnej tkanki nerwowej. Następnie na komórki nakłada się opcjonalne niespecyficzne barwienie wewnątrzkomórkowe.

Następnie pożądane antygeny powierzchniowe są natychmiast znakowane przeciwciałem pierwszorzędowym, podczas gdy pożądane antygeny wewnątrzkomórkowe są znakowane po utrwaleniu i przenikaniu komórkowym. Ostatecznie wyniki można uzyskać, stosując analizę cytometrii przepływowej do koekspresji antygenów powierzchniowych w określonych subpopulacjach neuronalnych będących przedmiotem zainteresowania, zgodnie z definicją znacznika wewnątrzkomórkowego. Protokół ten pokaże, jak przygotować komórki nerwowe pochodzące z hodowli tkankowej do badania antygenów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych za pomocą wielobarwnej cytometrii przepływowej.

Aby rozpocząć zbieranie, należy pobrać przylegające komórki nerwowe wyhodowane w kolbach T 75, najpierw delikatnie myjąc komórki pięcioma mililitrami PBS wolnego od magnezu i wapnia w temperaturze pokojowej. Następnie odłącz komórki od kolby, dodając trzy mililitry trypsyny zastępczej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do pięciu minut. Ugasić trawienie enzymatyczne, dodając sześć mililitrów buforu przepływowego po rozluźnieniu grudek komórek, kilkakrotnie pipetując zawiesinę komórkową w górę iw dół, przenieść całą zawiesinę komórkową do świeżej 15-mililitrowej probówki, aby wyizolować komórki.

Umieścić probówkę w wirówce, wirować komórki przez pięć minut w temperaturze pokojowej i odessać snat w ramach przygotowań do wewnątrzkomórkowego znakowania barwnikiem. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą pięciu mililitrów PBS plus 0,1% BSA. W przeciwnym razie dodaj pięć mililitrów buforu przepływu w połączeniu ze standardowym protokołem barwienia trian blue.

Użyj cytometru hemologicznego, aby oszacować efektywną liczbę żywotnych komórek. Dostosuj stężenie komórek w istniejącej zawiesinie do 1 miliona żywotnych komórek na mililitr przy użyciu tego samego buforu, który został użyty w poprzednim kroku. Komórki te są teraz gotowe na dwie opcje barwienia, powierzchniowe barwienie przeciwciałami antygenowymi lub opcjonalne fluorescencyjne barwienie wewnątrzkomórkowe z karboksylowym fluoresceiną, a następnie wspomniane wcześniej powierzchniowe barwienie antygenem.

Aby wykonać etap znakowania wewnątrzkomórkowego za pomocą barwnika estrowego karboksyl-fluoresceiny, najpierw dodaj 10 mikrolitrów roztworu podstawowego CFSE. Na każdy mililitr zawiesiny komórkowej umieść probówkę na wytrząsarce z prędkością 200 obr./min i inkubuj mieszaninę przez pięć minut. W temperaturze pokojowej należy zapobiec fotowybielaniu, chroniąc rurkę przed bezpośrednim narażeniem na światło.

Zgasić wszystkie niereaktywne barwniki, dodając pięć objętości serum zawierającego bufor przepływowy i delikatnie pipetę kilka razy w górę iw dół, aby wymieszać. Następnie wiruj komórki przez pięć minut w wirówce o temperaturze pokojowej i odsysaj supernatant w celu usunięcia pozostałości niereaktywnych barwników. Przemyj osad komórkowy przez resus, zawieszając go za pomocą pięciu objętości bufora przepływowego.

Komórki są następnie ponownie wirowane w wirówce o temperaturze pokojowej przez pięć minut przed wyrzuceniem natantu SUP. Na koniec ponownie zawiesić osad komórkowy z buforem przepływowym, tak aby końcowe stężenie komórek wynosiło 1 milion żywych komórek na mililitr. W przypadku eksperymentu multipleksowego dodaj równą liczbę niebarwionych komórek będących przedmiotem zainteresowania z różnych warunków eksperymentalnych do zawiesiny komórek barwionych CFSC.

Komórki są teraz gotowe do znakowania antygenów powierzchniowych przeciwciałami, aby rozpocząć barwienie powierzchni komórek. Przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny komórek z etykietami CFSC lub bez nich do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodać przeciwciała sprzężone z fluorem czterema do zawiesiny komórkowej w ilości uprzednio określonej za pomocą testów miareczkowania przeciwciał.

Umieść probówkę na wytrząsarce orbitalnej o temperaturze pokojowej przy 100 obr./min i inkubuj mieszaninę przez 30 minut. W przypadku braku światła rozcieńczyć mieszaninę przeciwciał, dodając jeden mililitr buforu przepływowego. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać i odwirować komórki we wstępnie schłodzonej mikrowirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery minuty.

Odessać supinat w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał i powtórzyć płukanie, odwirować i zasysać. Krok jeszcze raz. Reus zawiesił osad komórkowy w 100 mikrolitrach bufora przepływowego do wcześniej wybarwionych komórek.

Dodać 500 mikrolitrów buforu utrwalającego do 100 mikrolitrów zawiesiny komórek. Umieść probówkę na wytrząsarce orbitalnej o temperaturze pokojowej przy 100 obr./min i inkubuj przez 15 minut w ciemności. Formaldehyd sieciuje wszystkie gatunki białek i DNA, które znajdują się blisko siebie i dają nieżywotne zawiesiny komórkowe.

Rozcieńczyć mieszaninę utrwalającą, dodając jeden mililitr PBS i delikatnie pipetować w górę iw dół kilka razy, aby wymieszać. Następnie odwiruj utrwalone komórki w schłodzonej wirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy minuty. Odessać supinat tak, aby 100 mikrolitrów płynu pozostało nad osadem komórkowym, aby przeniknąć przez błonę komórkową w celu późniejszego wewnątrzkomórkowego znakowania antygenu.

Dodaj 500 mikrolitrów buforu przenikającego do 100 mikrolitrów zawiesiny komórek. Umieść probówkę na wytrząsarce orbitalnej o temperaturze pokojowej przy 100 obr./min i inkubuj przez 15 minut w ciemności. Rozcieńczyć mieszaninę przenikania, dodając jeden mililitr PBS, delikatnie pipetować kilka razy w górę iw dół, aby wymieszać i odwirować utrwalone komórki we wstępnie schłodzonej wirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy minuty.

Całkowicie odessać natant SUP przed inkubacją. Przygotować zapas roboczy przeciwciała pierwszorzędowego, rozcieńczając przeciwciało w buforze PBS plus 0,5% tween 20. Jest to dodatkowo wzbogacone 1% BSA 10% osło serum lub 10% kozie surowica.

Następnie ponownie zawiesić przepuszczalny przez błonę osad komórkowy ze 100 mikrolitrami pierwotnego materiału roboczego przeciwciała. Umieść probówkę na wytrząsarce orbitalnej o temperaturze pokojowej z prędkością 200 obr./min i inkubuj przez 30 minut w ciemności. Rozcieńczyć mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych, dodając jeden mililitr buforu przepływowego.

Delikatnie pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby wymieszać i odwirować komórki w schłodzonej wirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery minuty. Całkowicie odessać supinat w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał. Następnie ponownie zawiesić osad ze 100 mikrolitrami wtórnego materiału roboczego przeciwciała.

Powtarzać inkubację w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem przez 30 minut. W tym samym wytrząsarce rozcieńczyć mieszaninę przeciwciał wtórnych, dodając jeden mililitr buforu przepływowego. Powtórzyć tę samą inwersję probówki, mieszanie, odwirowanie i usunięcie supernatantu, aby wyeliminować wszystkie niezwiązane przeciwciała.

Powtórzyć te same etapy wirowania i usuwania supernatantu o pojemności jednego mililitra jeszcze dwa razy, ale ze świeżym PBS jako buforem do mycia. Zamiast tego efektem końcowym będzie czysta osadka komórkowa znakowana zewnątrzkomórkowymi lub wewnątrzkomórkowymi przeciwciałami fluorescencyjnymi CFSC lub dowolnymi kombinacjami trzech powtórzeń, znakowaną osadką komórkową w 150 mikrolitrach bufora przepływowego. Przenieś zawiesinę komórek do cytometru przepływowego i rozpocznij analizę z odpowiednimi ustawieniami filtra wzbudzenia laserowego i emisji dla każdego piętra z czterech.

Korzystając z danych rozproszenia do przodu i z boku jako przewodnika, skonfiguruj początkowe rozproszenie do przodu i boczne w oprogramowaniu do analizy cytometrii przepływowej, aby wykluczyć niespecyficzne punkty danych, takie jak szczątki komórek i martwe komórki. Następnie, wykorzystując surowe dane z niebarwionej zawiesiny komórkowej jako kontroli ujemnej, ustaw wiele bramek integracji fluorescencyjnej, które wybierają dodatnie sygnały emisyjne zarówno z zewnątrzkomórkowych, jak i wewnątrzkomórkowych etykiet antygenowych, aby uwzględnić fluorescencyjne tło z wielokolorowego. Efekty nakładania się widm ponownie dostosowują bramki fluorescencyjne przy użyciu surowych danych z kontrolnych barwionych pojedynczymi przeciwciałami.

W eksperymencie z faksem multipleksowym znaczniki karboksylowefluoresceinowe mogą być użyte jako sygnał wyjściowy, który może rozróżniać komórki z dwóch różnych linii lub warunków eksperymentalnych bez użycia przeciwciała. Na przykład w heterogenicznej zawiesinie komórek można natychmiast odróżnić komórki nerwowe oznaczone CFSC od nieoznakowanych fibroblastów, patrząc tylko na obecność lub brak fluorescencji w zielonym kanale. Ponadto, w połączeniu z znakowaniem CFSE Esther, można użyć przeciwciał fluorescencyjnych o różnych kolorach do określenia zróżnicowanej ekspresji antygenów powierzchniowych między podzbiorami znakowanymi CFSE i nieznakowanymi w mieszanej próbce.

Na przykład SHSY pięć komórek nerwiaka zarodkowego Y znakowanych CFSE w zielonym kanale fluorescencyjnym wykazywało koekspresję wysokiego poziomu antygenu powierzchniowego CD 24, ale nie markera fibroblastów CD 54. W przeciwieństwie do tego, CFSC ujemne fibroblasty BJ są dodatnie dla CD 54 z niższymi poziomami CD 24.Kombinatoryczny. Analiza antygenów powierzchniowych neuronów może być również wykonywana w połączeniu z wykrywaniem antygenów wewnątrzkomórkowych na podstawie przeciwciał.

Włączenie niebarwionych próbek i pojedynczo barwionych kontroli antygenów powierzchniowych i antygenów wewnątrzkomórkowych ma kluczowe znaczenie jako alternatywa dla pierwotnego i wtórnego znakowania antygenów wewnątrzkomórkowych opartego na przeciwciałach, takiego jak pokazana tutaj mapa markerów neuronalnych. Niekowalencyjne znakowanie fluorescencyjne przeciwciała pierwszorzędowego może dać porównywalne wyniki w analizie koekspresji i skraca protokół. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować komórki nerwowe do podstawowej analizy cytometrii przepływowej przy użyciu różnych alternatywnych podejść do znakowania i ich kombinacji.