Name: Protokoły cytometrii przepływowej do powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych analiz antygenowych typów komórek nerwowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Poznaj protokoły cytometrii przepływowej do analizy powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych antygenów w komórkach nerwowych. Ta metoda umożliwia identyfikację specyficznych subpopulacji nerwowych i badanie ich funkcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nasz program badawczy jest finansowany przez Emmy Noether-Program Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG), grant PR1132/3-1. Z wdzięcznością dziękujemy za dalsze wsparcie ze strony Fundacji Müller-Fahnenberg Uniwersytetu we Fryburgu. Badanie to było częściowo wspierane przez Inicjatywę Doskonałości Niemieckiej Fundacji Badawczej (GSC-4, Spemann Graduate School).

1. Pozyskiwanie komórek neuronalnych
<ol>
	<li>Ocena pod mikroskopem:
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu należy sprawdzić stan hodowli za pomocą mikroskopii w jasnym polu lub mikroskopii fazokontrastowej. 
		UWAGA: Chociaż pierwotna tkanka nerwowa uzyskana z sekcji jest zasadniczo równie podatna na analizę cytometryczną z przepływem14,28, należy pamiętać, że protokół ten skupia się na komórkach uzyskanych z układów komórek nerwowych in vitro.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbiór komórek7:
	<ol>
		<li>Naczynie/kolbę z komórkami adherentnymi należy delikatnie przemyć fosforanowym buforem solnym (PBS) wolnym od Mg2+/ Ca2+ w temperaturze pokojowej (RT) (np. 5 ml dla kolby T75, 3 ml na dołek dla płytki 6-dołkowej lub 10 ml dla naczynia o średnicy 10 cm). 
		UWAGA: PBS stosowany w całym protokole jest wolny od Mg2+/ Ca2+ .
		<ol>
			<li>W przykładzie wideo należy użyć kolby T75 z komórkami neuroblastoma SH-SY5Y przy 80% konfluencji. W przypadku obecności znacznej ilości debris w naczyniu należy zastosować dodatkowe etapy płukania.</li>
			<li>Należy rozważyć płukanie PBS zawierającym albuminę surowiczą48, zastosowanie gradientów wirowania Percoll lub Ficoll49 i/lub komercyjnie dostępnych kulek magnetycznych50,51. Usunięcie mieliny oraz innych zanieczyszczeń lipidowych lub innych jest krytyczne, szczególnie w przypadku korzystania z pierwotnych źródeł tkankowych od osobników dorosłych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Należy dodać uprzednio ogrzany (37 °C) zamiennik trypsyny w odpowiedniej objętości, która pokryje całą powierzchnię naczynia do hodowli tkanek. 
		UWAGA: Alternatywnie można rozważyć Accutase lub inne opcje trawienia enzymatycznego. Ten krytyczny krok może negatywnie wpłynąć na ekspresję epitopów powierzchniowych (patrz 7).</li>
		<li>Naczynie/kolbę należy inkubować w 37 °C przez 2 – 5 min (w zależności od typu komórek), aby umożliwić odlepienie się komórek. Należy delikatnie opukać naczynie do hodowli tkanek lub przepłukać je pipetą serologiczną, aby oderwać komórki. Należy unikać nadmiernego trawienia (ponieważ może to spowodować utratę komórek i tworzenie się grudek w późniejszych etapach).</li>
		<li>Należy zneutralizować zamiennik trypsyny, dodając dwukrotną objętość buforu do przepływu (2% FBS w PBS), a następnie zebrać komórki do probówki stożkowej o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Zawiesinę komórkową należy delikatnie utrzeć za pomocą pipety mikrolitrowej (100 – 1 000 µl) lub pipety serologicznej 5 ml, aby przygotować zawiesinę pojedynczych komórek.</li>
		<li>Komórki należy wirować przy 220 x g przez 5 min w 25 °C. Należy ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając osad.</li>
		<li>Osad należy resuspender w odpowiedniej objętości buforu do przepływu, w zależności od wielkości osadu (np. dla jednej konfluencyjnej kolby T75 z komórkami SH-SY5Y typowa wydajność wynosi co najmniej 10 x 106 komórek, w takim przypadku komórki resuspenderuje się w 5 ml buforu do przepływu). 
		UWAGA: Jeśli zaobserwowano większe grudki lub agregaty, należy przefiltrować zawiesinę przez siatkę 30 – 100 µm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liczenie komórek52:
	<ol>
		<li>Niewielką alikwot zawiesiny komórkowej należy przenieść do probówki do mikrowirowania i rozcieńczyć w określonym stosunku w objętości błękitu trypanu lub alternatywnego barwnika żywotności przed przeniesieniem do hemocytometru lub automatycznego systemu liczenia komórek.</li>
		<li>Zawiesinę komórkową należy rozcieńczyć do stężenia 1 x 106 żywych komórek/ml, dodając odpowiednią objętość buforu do przepływu lub PBS z 0,1% BSA (jeśli planowane jest znakowanie CFSE). 
		UWAGA: Jodek propidyny, 7-aminoaktynomycyna D, aneksyna V oraz komercyjnie dostępne zestawy do oceny żywotności stanowią alternatywne opcje oceny żywotności komórek. Można również stosować testy apoptozy z wykorzystaniem fluorescencji kaspazy-3, jak opisano wcześniej53. Kanały fluorescencyjne będą „zajęte” przez te odczynniki, co może ograniczyć opcje w kolejnych krokach, jeśli zostaną one włączone do wszystkich próbek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wewnątrzkomórkowe znakowanie barwnikiem CFSE (Rycina 3)
<ol>
	<li>Rozcieńczyć CFSE do pożądanego stężenia roztworu zapasu, który będzie łatwy w użyciu. 
	UWAGA: W tych eksperymentach zastosowano stężenie zapasu 0,01 mM. Optymalne stężenie robocze CFSE należy wyznaczyć empirycznie.</li>
	<li>Do każdego ml komórek (Sekcja 1.3.2, stężenie 1 x 106 komórek/ml w PBS + 0,1% BSA) dodać 10 µl roztworu CFSE o stężeniu 0,01 mM, aby uzyskać stężenie końcowe 0,1 µM. Krótko wymieszać na wirówce typu vortex. 
	UWAGA: Stężenia CFSE użyte w tym protokole są około dziesięciokrotnie niższe od tych powszechnie stosowanych w testach proliferacji, dzięki czemu toksyczność barwnika dla komórek jest minimalna. Nie zaobserwowano negatywnego wpływu na żywotność komórek.</li>
	<li>Inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej przy stałym mieszaniu (200 rpm). Chronić przed światłem.</li>
	<li>Zneutralizować barwnik, dodając do probówek 5 objętości buforu do cytometrii przepływowej. Wirować przy 94 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odlać supernatant, pozostawiając osad komórkowy. Ponownie zawiesić komórki w 5 objętościach buforu do cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Wirować przy 94 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Odlać supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze do cytometrii przepływowej w stężeniu 1 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Do zawiesiny barwionych komórek dodać równą liczbę niebarwionych komórek badanego typu. Przejść do protokołu barwienia antygenów powierzchniowych (Sekcja 3).</li>
</ol>
<img alt="Diagramy cytometrii przepływowej pokazujące interakcje komórek SH-SY5Y i BJ barwionych CFSE, CD24-APC i CD54-PE." src="/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Wykrywanie różnic w ekspresji antygenów powierzchniowych CD pomiędzy dwiema liniami komórkowymi za pomocą znakowania barwnikiem CFSE. Komórki neuroblastoma SH-SY5Y są wstępnie znakowane CFSE w celu ich późniejszej identyfikacji w porównaniu z nieznakowanymi fibroblastami BJ. Współbarwienie zmieszanej próbki (panele po prawej) markerami powierzchniowymi CD24 lub CD54 (oba sprzężone z APC) wykazuje, że linie komórkowe są łatwo rozróżnialne dzięki barwieniu CFSE (strzałki = SH-SY5Y; groty strzałek = fibroblasty BJ). Większość komórek SH-SY5Y wykazuje ekspresję CD24, ale nie CD54 (ICAM-1). W przeciwieństwie do nich, fibroblasty BJ (ujemne pod kątem CFSE) są dodatnie dla CD54, ale w przeważającej mierze ujemne dla CD24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
3. Barwienie powierzchni komórek
<ol>
	<li>Oznakuj probówki, w tym próbki i kluczowe kontrole (patrz Tabela 1).</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nr probówki</td>
			<td>Nazwa próbki</td>
			<td>Antygen-fluorofor</td>
			<td>Rozcieńczanie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Nabarwione komórki</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Pojedyncze barwienie</td>
			<td>CD24-APC</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Pojedynczo barwione</td>
			<td>TUJ1-Alexa fluor 488 nm</td>
			<td>1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>Podwójnie barwione</td>
			<td>CD24-APC</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TUJ1-Alexa fluor 488 nm</td>
			<td>1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Pojedyncze barwienie</td>
			<td>Tylko wtórne: Alexa fluor 488 nm</td>
			<td>1:2,000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Lista probówek uwzględnionych w typowym eksperymencie z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. Tabela przedstawia minimalny zestaw probówek z próbkami niezbędnych do przeprowadzenia eksperymentu z barwieniem współistniejącym opisanego w tym artykule wideo. Idealny eksperyment powinien obejmować wszystkie niezbędne kontrole (negatywne, pozytywne oraz kontrole kompensacyjne) w celu dokładnej interpretacji uzyskanych wyników.
<ol start="2">
	<li>Do każdej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml dodać 100 µl zawiesiny komórkowej (z Sekcji 2.7 lub 1.3.2). 
	UWAGA: Należy upewnić się, że w 100 µl zawiesiny komórkowej znajduje się minimum 0,1 x 106 komórek.</li>
	<li>Do próbki dodać przeciwciała znakowane fluorochromem w odpowiednim rozcieńczeniu. 
	UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentu należy ustalić rozcieńczenie robocze dla każdego przeciwciała. Listę antygenów powierzchniowych neuronów znajduje się w Tabeli 2.</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Antygen</td>
			<td >Typ komórki</td>
			<td >Referencja</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CD15</td>
			<td >Neuralne komórki macierzyste </td>
			<td >[28, 67]</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CD24</td>
			<td >Komórki neuronalne</td>
			<td >[28, 68]</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CD29</td>
			<td >Neuralne komórki macierzyste</td>
			<td >[28, 69, 70]</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CD44</td>
			<td >Komórki glejowe</td>
			<td >[25]</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CD49f</td>
			<td >Neuralne komórki macierzyste </td>
			<td >[38]</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CD56 (NCAM)</td>
			<td >Komórki neuronalne</td>
			<td >[71]</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CD133</td>
			<td >Neuralne komórki macierzyste </td>
			<td >[27]</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CD184</td>
			<td >Neuralne komórki macierzyste i komórki glejowe</td>
			<td >[25]</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CD200</td>
			<td >Komórki neuronalne</td>
			<td >[38]</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CD271</td>
			<td >Komórki macierzyste grzebienia neuronalnego</td>
			<td >[25]</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >A2B5</td>
			<td >Komórki glejowe</td>
			<td >[31]</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CORIN</td>
			<td >Prekursory dopaminergiczne</td>
			<td >[35, 36]</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >FORSE1</td>
			<td >Neuralne komórki macierzyste (NSC)</td>
			<td >[72 ]</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >GLAST</td>
			<td >Komórki glejowe</td>
			<td >[33]</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >NG2</td>
			<td >Komórki glejowe</td>
			<td >[32]</td>
		</tr >
	</tbody >
</table >
Tabela 2. Wybór antygenów powierzchniowych neuronów. Tabela ta zawiera listę epitopów powierzchniowych wykazujących ekspresję w różnych typach komórek neuronalnych, co egzemplifikuje rozszerzający się panel antygenów powierzchniowych stosowanych do charakteryzacji linii neuronalnych. Należy zauważyć, że powyższy wybór nie jest kompletny, a większość tych markerów jest również ekspresowana w szeregu innych komórek neuronalnych i nieneuronalnych. W związku z tym, do lepszego zdefiniowania i wyizolowania wskazanych podzbiorów neuronalnych wymagane będzie zastosowanie kombinacji kilku markerów.
<ol start="4">
	<li>Inkubować przez 30 min na wytrząsarce orbitalnej (200 rpm) w ciemności.</li>
	<li>Przemywanie buforem do cytometrii
	<ol>
		<li>Dodać 1 ml buforu do cytometrii do probówek. Odwirować przy 380 x g przez 4 min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odlać supernatant, pozostawiając osad.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórzyć etap przemywania.</li>
	<li>Po drugim przemyciu odlać supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze do cytometrii do uzyskania końcowej objętości 100 µl.</li>
	<li>Próbkę wykorzystać do analizy cytometrycznej. Alternatywnie przejść do Sekcji 4 i 5. 
	UWAGA: Jeśli komórki mają zostać posortowane i ponownie poddane hodowli po FACS (t.j. żywa zawiesina komórkowa bez fiksacji lub permeabilizacji), należy stosować techniki aseptyczne podczas etapów zbioru, barwienia i analizy.</li>
</ol>
4. Fixacja i permeabilizacja38
<ol>
	<li>Fiksacja przy użyciu paraformaldehydu (PFA):
	<ol>
		<li>Przygotować bufor do fiksacji zawierający 2% PFA w PBS. 
		UWAGA: PFA jest szkodliwy dla ludzi i środowiska. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i utylizować odpady zgodnie z lokalnymi przepisami.</li>
		<li>Do 100 µl zawiesiny komórkowej dodać 500 µl buforu do fiksacji.</li>
		<li>Probjówki inkubować w RT przez 15 min na wytrząsarce orbitalnej (100 rpm) w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Płukanie w PBS:
	<ol>
		<li>Do probówki dodać 1 ml PBS. Odwirować przy 380 x g przez 3 min w 4 °C.</li>
		<li>Usunąć/odlać supernatant, pozostawiając w probówce około 100 µl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Permeabilizacja za pomocą Tween-20:
	<ol>
		<li>Przygotować bufor do permeabilizacji zawierający 0,7% Tween-20 w PBS.</li>
		<li>Do 100 µl zawiesiny komórkowej dodać 500 µl buforu do permeabilizacji.</li>
		<li>Probójki inkubować w RT przez 15 min na wytrząsarce orbitalnej (100 rpm) w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki przemyć raz w PBS (zgodnie z opisem w Sekcji 4.2) i całkowicie usunąć supernatant z probówek, pozostawiając jedynie osad.</li>
</ol>
5. Wewnątrzkomórkowe barwienie antygenów38 (Rysunek 4)
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów przeciwciał pierwszorzędowych:
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w buforze do rozcieńczania zawierającym 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 10% surowicy (np. normalnej surowicy osła lub kozy) oraz 0,5% Tween-20 w PBS. 
		UWAGA: Wybrać surowicę w zależności od gatunku, w którym otrzymano przeciwciała drugorzędowe.</li>
		<li>Alternatywnie zastosować znakowanie fluoresceiną Zenon przeciwciał pierwszorzędowych zgodnie z instrukcją producenta.
		<ol>
			<li>Przygotować 1 µg przeciwciała pierwszorzędowego w PBS w odpowiednim rozcieńczeniu (całkowita objętość ≤ 20 µl).</li>
			<li>Do roztworu przeciwciał dodać 5 µl odczynnika do znakowania IgG fluoresceiną Zenon (Komponent A).</li>
			<li>Mieszaninę inkubować przez 5 min w RT.</li>
			<li>Do mieszaniny reakcyjnej dodać 5 µl odczynnika blokującego Zenon (Komponent B).</li>
			<li>Mieszaninę inkubować przez 5 min w RT. Przeciwciała nanieść na próbkę w ciągu 30 min.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie przeciwciałami pierwszorzędowymi:
	<ol>
		<li>Do pelletu komórkowego dodać 100 µl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych i delikatnie zmieszać poprzez tryturację.</li>
		<li>Alternatywnie dodać przeciwciała znakowane fluoresceiną Zenon do zawiesiny komórkowej w odpowiednim rozcieńczeniu.</li>
		<li>Probówki inkubować w RT przez 30 min na wytrząsarce orbitalnej (200 rpm), chroniąc przed światłem. Przemyć komórki raz w PBS (zgodnie z opisem w Sekcji 4.2) i całkowicie usunąć nadsącz z probówek, pozostawiając jedynie pellet.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie przeciwciałami drugorzędowymi (nie jest wymagane dla przeciwciał znakowanych fluoresceiną Zenon):
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w PBS do odpowiedniego stężenia.</li>
		<li>Do pelletu komórkowego dodać 100 µl roztworu przeciwciał drugorzędowych i delikatnie zmieszać poprzez tryturację. Probówki inkubować w RT przez 30 min na wytrząsarce (200 rpm) w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyć próbki dwukrotnie w PBS (zgodnie z opisem w Sekcji 4.2).</li>
	<li>Przemyć raz buforem do cytometrii (patrz Sekcja 3.5).</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w około 150 µl buforu do cytometrii i przeanalizować za pomocą cytometru przepływowego.</li>
</ol>
<img alt="Analiza danych z cytometrii przepływowej z FITC vs. APC; sześć wykresów kropkowych dla znakowania MAP2 i CD24." src="/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Podwójne barwienie białek powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych. Dane z cytometrii przepływowej przedstawiają porównanie barwienia wewnątrzkomórkowego opartego na przeciwciałach pierwotnych i wtórnych z barwieniem opartym na fluoresceinie Zenon, w połączeniu z barwieniem powierzchniowym. Wyłączna pozytywność na osi y (lewy górny kwadrant) i osi x (prawy dolny kwadrant) wskazuje odpowiednio komórki zabarwione na MAP2 i CD24. Po podwójnym barwieniu współwystępowanie ekspresji MAP2 i CD24 jest widoczne w prawym górnym kwadrancie (panele po prawej). Porównanie zastosowania Alexa fluor 488 (góra; AF488) i fluoresceiny Zenon (dół) do znakowania MAP2 daje podobne wyniki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
6. Analiza cytometryczna
<ol>
	<li>Przeprowadź analizę cytometryczną natychmiast po zakończeniu protokołu barwienia, używając cytometru przepływowego z odpowiednimi filtrami do detekcji sygnału. Wykorzystaj laser niebieski 488 nm i czerwony 640 nm z filtrami przepustowymi FL-1 (533/30), FL-2 (585/40) oraz FL-4 (675/25).</li>
	<li>Ustaw bramki pierwotne na podstawie rozpraszania światła w przód (FSC) i w bok (SSC), aby wykluczyć zanieczyszczenia i martwe komórki.</li>
	<li>Ustaw bramki fluorescencji dla antygenów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych na poziomie ≤0,5% na podstawie próbek niebarwionych oraz przeprowadź kompensację nakładania się widm przy użyciu kontroli barwionych pojedynczo.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Przedstawiony tutaj protokół jest dobrze znany dla hodowli komórek nerwowych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych, ale może być równie dobrze stosowany do innych źródeł komórek nerwowych, w tym tkanek pierwotnych lub linii komórek nerwowych. Oprócz źródeł embrionalnych, nerwowe komórki macierzyste lub progenitorowe mogą być ekstrahowane z neurogennych obszarów dorosłego mózgu27. Co więcej, cytometria przepływowa i FACS mogą być wykorzystywane do ilościowego określania, analizowania i izolowania różnyc...

Cytometria przepływowa jest szeroko wykorzystywana w immunologii, hematologii i onkologii do definiowania populacji komórkowych poprzez właściwości rozproszenia wewnętrznego, ekspresję antygenów powierzchniowych oraz inne parametry fluorescencyjne1-3. Nasza wiedza na temat rozwoju linii krwi i chorób jest w znacznym stopniu wynikiem ciągłego udoskonalania tej metody po jej pierwotnym wdrożeniu4,5. Wzrost świadomości dotyczącej ilościowego i ogólnego potencjału analitycznego cytometrii przepływowej zachęcił ostatnio do jej szerszego zastosowania w badaniach nad komórkami macierzystymi i może umożliwić podobnie znaczący postęp w krótszym czasie6. Jednak zastosowanie cytometrii przepływowej do specyficznej analizy i izolacji populacji neuronalnych od dawna było postrzegane jako trudne. W przeciwieństwie do komórek hematopoetycznych, które naturalnie występują w zawiesinie, typy komórek neuronalnych są zazwyczaj pozyskiwane z nadmiernie złożonych źródeł, które mogą obejmować glej i różne inne komórki otaczające, a także skomplikowaną sieć neuronów posiadających wypustki. W konsekwencji neurobiologia nie wykorzystała jeszcze w pełni wszechstronności cytometrii przepływowej w codziennej rutynie badawczej. Niemniej jednak, o ile możliwe jest przygotowanie żywej zawiesiny pojedynczych komórek (a protokoły w tym celu zostały opracowane i zoptymalizowane7), cytometria przepływowa oraz fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS) mogą być uznane za cenny element instrumentarium analitycznego w neurobiologii8-11.
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej: zawiesina pojedynczych komórek, ogniskowanie hydrodynamiczne, wzbudzenie laserowe, detekcja rozproszenia." src="/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Zasada analizy cytometrycznej i komponenty cytometru przepływowego. Cytometry przepływowe składają się z trzech głównych systemów: hydrauliki, optyki i elektroniki. Uporządkowany przepływ komórek w zawiesinie (przygotowanej z tkanki pierwotnej lub hodowli in vitro) jest zapewniony przez płyn osłonowy poprzez ogniskowanie hydrodynamiczne, co ogranicza próbkę do jej centralnego rdzenia. Części optyczne składają się z laserów oświetlających strumień komórek oraz filtrów optycznych, które kierują sygnał do odpowiednich detektorów. Wykryte sygnały świetlne są konwertowane na sygnały elektroniczne, następnie przetwarzane przez komputer i wizualizowane na monitorze w celu analizy danych i bramkowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Użytkownicy metod cytometrii przepływowej odnoszą korzyść z co najmniej podstawowej znajomości fundamentalnych zasad, w tym elementów budowy cytometru (w ramach powtórzenia patrz12,13; patrz również Rysunek 1). Wiązka laserowa przecina hydrodynamicznie skupiony strumień płynu zawierający komórki w zawiesinie, które następnie przechodzą przez wiązkę lasera „jedno po drugim”. Przecięcie komórki (lub jakiejkolwiek innej cząstki) z laserem skutkuje rozproszeniem światła w punkcie badania. Rozproszone światło może być wykrywane w kierunku kontynuacji wiązki lasera (rozproszenie przednie, powiązane z wielkością cząstki), a także prostopadle do jego kierunku (rozproszenie boczne; odzwierciedlające ziarnistość cząstki/komórki). Wspomniane właściwości rozproszenia nie wymagają specyficznego znakowania, dlatego nieznakowana próbka (lub także szczątki komórkowe, pęcherzyki powietrza, itp.) wygeneruje sygnał (zdarzenie) na dwuwymiarowym wykresie rozproszenia przedniego względem bocznego, powszechnie stosowanym do wstępnego bramkowania. Dzięki zastosowaniu odpowiednich laserów i filtrów specyficznych dla odpowiadających im widm wzbudzenia i emisji, komórka może być analizowana pod kątem pozytywności, poziomu intensywności lub braku markerów fluorescencyjnych. Większość zastosowań cytometrii przepływowej koncentrowała się na charakterystyce za pomocą antygenów powierzchniowych komórek. W przeciwieństwie do linii hematopoetycznej, linia neuronalna pozostaje mniej obszernie zdefiniowana pod kątem wzorców ekspresji epitopów powierzchniowych5. Jedną z zalet wykorzystania antygenów powierzchniowych jest możliwość poddania żywych komórek paradygmatom sortowania komórkowego, takim jak FACS. W przeciwieństwie do tego, barwienie antygenów wewnątrzkomórkowych wymaga etapów fiksacji i permeabilizacji w celu umożliwienia interakcji epitopu z przeciwciałem, co wyklucza dalsze zastosowania wymagające żywych komórek. Warto zauważyć, że takie podejścia wciąż pozwalają na liczne analizy ilościowe14, a także analizy ekspresji RNA i białek15. W hematologii, immunologii i onkologii często stosowano ponad tuzin markerów łącznie w celu zdefiniowania konkretnych subpopulacji16. Dodatkowo, cytometria masowa lub CyTOF może obecnie być wykorzystywana do jednoczesnej analizy do 30 parametrów17,18.
W przypadku zastosowań związanych z neuronalnymi komórkami macierzystymi, jak również w hodowlach pierwotnych14,19,20, heterogeniczność komórek in vitro jest częstym zjawiskiem21-23. Komórki nieprzedstawiające docelowej, interesującej nas populacji stanowią potencjalny czynnik zakłócający odczyt eksperymentalny24,25. Wygodnym jest to, że różne podgrupy komórkowe obecne w heterogenicznej zawiesinie komórkowej posiadają odmienne (znane lub jeszcze nieodkryte) profile ekspresji antygenów, które mogą być wykorzystane do zdefiniowania tych różnorodnych populacji. Cytometria przepływowa może zatem odgrywać kluczową rolę w rozwiązywaniu heterogeniczności komórkowej, a tym samym wspomagać zastosowania biomedyczne (testy in vitro, terapia komórkowa) i optymalizować ilościowy odczyt poprzez skupienie się na najbardziej istotnej podgrupie24,26. W ciągu ostatnich kilku lat zidentyfikowano różne kombinacje antygenów powierzchniowych, aby umożliwić ilościowe określenie i izolację specyficznych typów komórek neuronalnych. Obejmuje to CD133 do wzbogacania neuronalnych komórek macierzystych27, kombinację antygenów powierzchniowych CD15/CD24/CD29 do izolacji NSC, zróżnicowanych neuronów i komórek grzebienia neuronalnego28 lub CD15/CD24/CD44/CD184/CD271 do izolacji podgrup neuronalnych i glejowych25, wśród innych sygnatur29,30. Poza neuronami, markery glejowe obejmują A2B531, CD4425, NG232 i GLAST33. W niedawnej publikacji wykorzystano marker prekursorów płyty dna śródmózgowia CORIN34,35 w celu wzbogacenia prekursorów dopaminergicznych w paradygmatach transplantacji komórek w chorobie Parkinsona36. Cząsteczki CD nie są jedynie markerami, lecz funkcjonalnie istotnymi mediatorami oddziaływań międzykomórkowych oraz zdolności komórki do reagowania na sygnały z cząsteczek macierzy pozakomórkowej i czynników wzrostu37. Jedną ze strategii dalszego rozszerzania arsenału kombinatorycznych antygenów CD do charakterystyki rozwoju linii neuronalnej jest wykorzystanie znanych markerów wewnątrzkomórkowych do przesiewania i definiowania kombinacji antygenów CD dla konkretnego, interesującego nas typu komórek. Niedawno zastosowaliśmy takie podejście i zidentyfikowaliśmy kombinatoryczne wzorce ekspresji CD49f–/CD200high jako nową metodę wzbogacania podgrup neuronowych z systemów hodowli indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych zróżnicowanych w kierunku neuronalnym38. Przedstawiamy i omawiamy poniżej ten protokół (oraz jego opcjonalne warianty), w którym barwienie powierzchniowe i barwienie wewnątrzkomórkowe mogą być stosowane jednocześnie do definiowania subpopulacji komórek neuronalnych za pomocą cytometrii przepływowej.
<img alt="Schemat procesu hodowli komórek nerwowych, znakowanie barwnikiem CFSE, analiza cytometryczna, sortowanie FACS." src="/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" width="300" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schemat blokowy opcji protokołu eksperymentalnego. Rycina przedstawia schematyczne ujęcie głównych etapów zawartych w protokole. Kroki opcjonalne (znakowanie barwnikiem CFSE lub znakowanie antygenów wewnątrzkomórkowych) zaznaczono jasnoszarymi polami. Po zbiorze niezbędna jest ocena żywotności i liczby komórek w zawiesinach komórek nerwowych przed barwieniem powierzchni komórkowych. Oprócz badanych próbek należy uwzględnić kontrole pozytywne oraz negatywne. Próbki mogą być analizowane za pomocą cytometrii przepływowej i/lub wykorzystane w schematach sortowania komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Choć wcześniej stosowaliśmy przeciwciało pierwotne w połączeniu z przeciwciałem wtórnym do barwienia wewnątrzkomórkowego38, obecnie wprowadzamy niekowalencyjne znakowanie przeciwciała pierwotnego za pomocą fluorescencyjnych fragmentów Fab (znakowanie Zenon) jako niewielką modyfikację, co pozwala na zmniejszenie liczby etapów manipulacji komórkami39. Ponadto, jako kolejny przykład wszechstronności protokołu, stosujemy opcjonalne znakowanie jednego podzbioru eksperymentalnego za pomocą estru succinimidylowego karboksyfluoresceiny (CFSE) przed barwieniem antygenów powierzchniowych. Takie wstępne znakowanie CFSE umożliwia bezpośrednie porównanie dwóch linii komórkowych lub warunków eksperymentalnych (znakowane CFSE vs. nieznakowane) w jednej probówce z próbką, co redukuje wariancję lub subtelne różnice w czasie inkubacji oraz pozwala oszczędzać przeciwciała. CFSE jest uznanym barwnikiem fluorescencyjnym powszechnie stosowanym w badaniach nad śledzeniem komórek40, proliferacją41,42 oraz w eksperymentach z kodowaniem paskowym (barcoding)43,44. Wreszcie, choć rzeczywiste etapy sortowania (FACS, immunomagnetyczna separacja komórek lub immunopanning) nie stanowią części tego protokołu, opisane tutaj procedury pozyskiwania i znakowania w zasadzie pozwalają na uzyskanie próbek, które mogą zostać poddane aplikacjom sortowania opartym na znakowaniu antygenów powierzchniowych lub wewnątrzkomórkowych15 25,28.
W niniejszym artykule dążymy do: podsumowania skutecznego protokołu barwienia antygenów powierzchniowych25,28, omówienia protokołu wykrywania celów wewnątrzkomórkowych, a także łączonej analizy antygenów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych38, przedstawienia etapu znakowania wewnątrzkomórkowego barwnikiem CFSE41,45 jako opcji eksperymentalnej do analiz porównawczych populacji komórek neuronalnych oraz podsumowania podejść do analizy cytometrycznej (odpowiednie kontrole13,46, strategia bramkowania i prezentacja danych47).

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>DPBS bez Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, zatwierdzona przez E.U., pochodzenia z Ameryki Południowej (FBS)</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy MEM (100x)</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td><a href="http://www.carlroth.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Carl Roth</a></td><td>335.3</td><td></td></tr><tr><td>Albuminy surowicy bydlęcej (BSA) frakcja V</td><td><a href="http://www.gelifesciences.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> PAA Laboratories, Coelbe</a></td><td>K41-001</td><td></td></tr><tr><td>Detergent Tween-20</td><td><a href="http://www.merckmillipore.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Calbiochem</a></td><td>655205</td><td></td></tr><tr><td>Karboksyfluoresceina z estrem succynimidylowym (CFSE)</td><td><a href="http://www.ebioscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> eBioscience</a></td><td>65-0850-84</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td><a href="http://www.applichem.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AppliChem</a></td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>Filtry nakrętkowe express plus 0,22 &amp;micro;m, 250 ml</td><td><a href="http://www.millipore.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Millipore</a></td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Kolby traktowane do hodowli komórkowych (T 25)</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> NUNC</a></td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>Kolby traktowane do hodowli komórkowych (T 75)</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> NUNC</a></td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe (15 ml)</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One</a></td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe (50 ml)</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One</a></td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura, szklana (150 mm)</td><td><a href="http://www.stein-labortechnik.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> STEIN Labortechnik, Remchingen</a></td><td>S03710150</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (0,1-10 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4125</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (1-200 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4126</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (100-1000 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4129</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne, 5 ml</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4051</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne, 10 ml</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4101</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne, 25 ml</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrocentryfugowania (0,5 ml)</td><td><a href="http://www.sarstedt.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sarstedt</a></td><td>72,699</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrocentryfugowania (1,5 ml)</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One</a></td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrocentryfugowania (2,0 ml)</td><td><a href="http://www.sarstedt.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sarstedt</a></td><td>72,695,500</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiemu CD24 APC</td><td><a href="http://www.ebioscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> eBioscience</a></td><td>17-0247-42</td><td>Rozcieńczenie robocze 1:50</td></tr><tr><td>Monoklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiemu CD54 PE</td><td><a href="http://www.ebioscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> eBioscience</a></td><td>12-0549-42</td><td>Rozcieńczenie robocze 1:50</td></tr><tr><td>Poliklonalne przeciwciało przeciwko neuronalnej tubulinie klasy III &amp;beta; (Tuj1)</td><td><a href="http://www.covance.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Covance</a></td><td>PRB-435P</td><td>Rozcieńczenie robocze 1:2 000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 przeciwciało osiołkowe przeciwko króliczym</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>A21206</td><td>Rozcieńczenie robocze 1:2 000</td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania króliczych IgG fluoresceinią Zenon&amp;reg;</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>Z-25342</td><td></td></tr><tr><td>Udoskonolona komora licznikowa Neubauera</td><td><a href="http://www.marienfeld-superior.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Marienfeld</a></td><td>0640010</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td><a href="http://www.scientificindustries.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Scientific Industries</a></td><td>G560E</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td><a href="http://www.eppendorf.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Eppendorf</a></td><td>5355 000.001</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Accuri C6</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com/instruments/accuri" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Becton Dickinson (BD)</a></td><td>653118</td><td></td></tr><tr><td>Chłodzona mikrocentryfuga, PerfectSpin 24 R</td><td><a href="http://www.peqlab.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Peqlab</a></td><td>91-PSPIN-24R</td><td></td></tr><tr><td>Wstrząsarka orbitalna, Unimax 1010</td><td><a href="http://www.heidolph-instruments.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Heidolph</a></td><td>543-12310-00</td><td></td></tr><tr><td>Chłodzona wirówka, Rotanta 96 RC</td><td><a href="http://www.hettichlab.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Hettich</a></td><td>4480-50</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II Safe 2020</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>51026640</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, Heracell 240i</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>System próżniowy, Vacusafe comfort</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Integra Biosciences</a></td><td>158320</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop, Axiovert 40 CFL</td><td><a href="http://www.zeiss.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>451212</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik pipety, accu-jet pro</td><td><a href="http://www.brand.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Brand</a></td><td>26303</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta, Pipetman neo P20N (2-20 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.gilson.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gilson</a></td><td>F144563</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta, Pipetman neo P200N (20-200 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.gilson.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gilson</a></td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta, Pipetman neo P1000N (100-1000 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.gilson.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gilson</a></td><td>F144566</td><td></td></tr></tbody></table>

protokoły cytometrii przepływowej do powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych analiz antygenowych typów komórek nerwowych

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Cytometria przepływowa była szeroko stosowana do definiowania populacji komórek w immunologii, hematologii i onkologii. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis protokołów analizy cytometrii przepływowej antygenów powierzchniowych klastrów różnicowania (CD) i antygenów wewnątrzkomórkowych w typach komórek nerwowych. Nasz opis procedur metodologicznych krok po kroku obejmuje: pobieranie kultur neuronalnych in vitro, opcjonalny etap znakowania estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE), a następnie barwienie antygenu powierzchniowego za pomocą sprzężonych przeciwciał CD (np. CD24, CD54), a następnie wewnątrzkomórkowe wykrywanie antygenu za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych/drugorzędowych lub znakowanych fluorescencyjnie fragmentów Fab (znakowanie zenon). Film pokazuje najważniejsze kroki. Ponadto pokrótce wyjaśniono zasady planowania eksperymentalnego, włączenie krytycznych kontroli oraz podstawy analizy cytometrii przepływowej (identyfikacja populacji docelowej i wykluczenie zanieczyszczeń; strategia bramkowania; kompensacja nakładania się spektralnego), aby umożliwić neurobiologom z ograniczoną wcześniejszą wiedzą lub specjalistycznym szkoleniem w zakresie cytometrii przepływowej ocenę jej użyteczności i lepsze wykorzystanie tej potężnej metodologii.

Przedstawiony tutaj protokół pozwala na wszechstronne podejścia eksperymentalne (Rysunek 2). W swojej najkrótszej wersji (kroki 1, 3 i 6) można go uznać za przewodnik po prostym barwieniu antygenów powierzchniowych. W swojej bardziej złożonej formie można dążyć do osiągnięcia szeregu paradygmatów współznakowania z szeregiem antygenów wewnątrzkomórkowych (opcjonalne kroki 2 i/lub 4 do 5). Co więcej, etap znakowania CFSE i...

Dostarczamy szczegółowy opis protokołu analizy cytometrycznej powierzchni i/lub antygenów wewnątrzkomórkowych w typach komórek nerwowych. Wyjaśniono kluczowe aspekty planowania eksperymentalnego, procedury metodologiczne krok po kroku i podstawowe zasady cytometrii przepływowej, aby umożliwić neurobiologom wykorzystanie tej potężnej technologii.

Protokoły cytometrii przepływowej do powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych analiz antygenowych typów komórek nerwowych

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Ogólnym celem tej procedury jest analiza ekspresji antygenów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych na komórkach nerwowych za pomocą cytometrii przepływowej. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie komórek nerwowych z kultur in vitro lub pierwotnej tkanki nerwowej. Następnie na komórki nakłada się opcjonalne niespecyficzne barwienie wewnątrzkomórkowe.Następnie pożądane antygeny powierzchniowe są natychmiast znakowane przeciwciałem pierwszorzędowym, podczas gdy pożądane antygeny wewnątrzkomórkowe są znakowane po utrwaleniu i przenikaniu komórkowym. Ostatecznie wyniki można uzyskać, stosując analizę cytometrii przepływowej do koekspresji antygenów powierzchniowych w określonych subpopulacjach neuronalnych będących przedmiotem zainteresowania, zgodnie z definicją znacznika wewnątrzkomórkowego. Protokół ten pokaże, jak przygotować komórki nerwowe pochodzące z hodowli tkankowej do badania antygenów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych za pomocą wielobarwnej cytometrii przepływowej.Aby rozpocząć zbieranie, należy pobrać przylegające komórki nerwowe wyhodowane w kolbach T 75, najpierw delikatnie myjąc komórki pięcioma mililitrami PBS wolnego od magnezu i wapnia w temperaturze pokojowej. Następnie odłącz komórki od kolby, dodając trzy mililitry trypsyny zastępczej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do pięciu minut. Ugasić trawienie enzymatyczne, dodając sześć mililitrów buforu przepływowego po rozluźnieniu grudek komórek, kilkakrotnie pipetując zawiesinę komórkową w górę iw dół, przenieść całą zawiesinę komórkową do świeżej 15-mililitrowej probówki, aby wyizolować komórki.Umieścić probówkę w wirówce, wirować komórki przez pięć minut w temperaturze pokojowej i odessać snat w ramach przygotowań do wewnątrzkomórkowego znakowania barwnikiem. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą pięciu mililitrów PBS plus 0,1% BSA. W przeciwnym razie dodaj pięć mililitrów buforu przepływu w połączeniu ze standardowym protokołem barwienia trian blue.Użyj cytometru hemologicznego, aby oszacować efektywną liczbę żywotnych komórek. Dostosuj stężenie komórek w istniejącej zawiesinie do 1 miliona żywotnych komórek na mililitr przy użyciu tego samego buforu, który został użyty w poprzednim kroku. Komórki te są teraz gotowe na dwie opcje barwienia, powierzchniowe barwienie przeciwciałami antygenowymi lub opcjonalne fluorescencyjne barwienie wewnątrzkomórkowe z karboksylowym fluoresceiną, a następnie wspomniane wcześniej powierzchniowe barwienie antygenem.Aby wykonać etap znakowania wewnątrzkomórkowego za pomocą barwnika estrowego karboksyl-fluoresceiny, najpierw dodaj 10 mikrolitrów roztworu podstawowego CFSE. Na każdy mililitr zawiesiny komórkowej umieść probówkę na wytrząsarce z prędkością 200 obr./min i inkubuj mieszaninę przez pięć minut. W temperaturze pokojowej należy zapobiec fotowybielaniu, chroniąc rurkę przed bezpośrednim narażeniem na światło.Zgasić wszystkie niereaktywne barwniki, dodając pięć objętości serum zawierającego bufor przepływowy i delikatnie pipetę kilka razy w górę iw dół, aby wymieszać. Następnie wiruj komórki przez pięć minut w wirówce o temperaturze pokojowej i odsysaj supernatant w celu usunięcia pozostałości niereaktywnych barwników. Przemyj osad komórkowy przez resus, zawieszając go za pomocą pięciu objętości bufora przepływowego.Komórki są następnie ponownie wirowane w wirówce o temperaturze pokojowej przez pięć minut przed wyrzuceniem natantu SUP. Na koniec ponownie zawiesić osad komórkowy z buforem przepływowym, tak aby końcowe stężenie komórek wynosiło 1 milion żywych komórek na mililitr. W przypadku eksperymentu multipleksowego dodaj równą liczbę niebarwionych komórek będących przedmiotem zainteresowania z różnych warunków eksperymentalnych do zawiesiny komórek barwionych CFSC.Komórki są teraz gotowe do znakowania antygenów powierzchniowych przeciwciałami, aby rozpocząć barwienie powierzchni komórek. Przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny komórek z etykietami CFSC lub bez nich do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodać przeciwciała sprzężone z fluorem czterema do zawiesiny komórkowej w ilości uprzednio określonej za pomocą testów miareczkowania przeciwciał.Umieść probówkę na wytrząsarce orbitalnej o temperaturze pokojowej przy 100 obr./min i inkubuj mieszaninę przez 30 minut. W przypadku braku światła rozcieńczyć mieszaninę przeciwciał, dodając jeden mililitr buforu przepływowego. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać i odwirować komórki we wstępnie schłodzonej mikrowirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery minuty.Odessać supinat w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał i powtórzyć płukanie, odwirować i zasysać. Krok jeszcze raz. Reus zawiesił osad komórkowy w 100 mikrolitrach bufora przepływowego do wcześniej wybarwionych komórek.Dodać 500 mikrolitrów buforu utrwalającego do 100 mikrolitrów zawiesiny komórek. Umieść probówkę na wytrząsarce orbitalnej o temperaturze pokojowej przy 100 obr./min i inkubuj przez 15 minut w ciemności. Formaldehyd sieciuje wszystkie gatunki białek i DNA, które znajdują się blisko siebie i dają nieżywotne zawiesiny komórkowe.Rozcieńczyć mieszaninę utrwalającą, dodając jeden mililitr PBS i delikatnie pipetować w górę iw dół kilka razy, aby wymieszać. Następnie odwiruj utrwalone komórki w schłodzonej wirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy minuty. Odessać supinat tak, aby 100 mikrolitrów płynu pozostało nad osadem komórkowym, aby przeniknąć przez błonę komórkową w celu późniejszego wewnątrzkomórkowego znakowania antygenu.Dodaj 500 mikrolitrów buforu przenikającego do 100 mikrolitrów zawiesiny komórek. Umieść probówkę na wytrząsarce orbitalnej o temperaturze pokojowej przy 100 obr./min i inkubuj przez 15 minut w ciemności. Rozcieńczyć mieszaninę przenikania, dodając jeden mililitr PBS, delikatnie pipetować kilka razy w górę iw dół, aby wymieszać i odwirować utrwalone komórki we wstępnie schłodzonej wirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy minuty.Całkowicie odessać natant SUP przed inkubacją. Przygotować zapas roboczy przeciwciała pierwszorzędowego, rozcieńczając przeciwciało w buforze PBS plus 0,5% tween 20. Jest to dodatkowo wzbogacone 1% BSA 10% osło serum lub 10% kozie surowica.Następnie ponownie zawiesić przepuszczalny przez błonę osad komórkowy ze 100 mikrolitrami pierwotnego materiału roboczego przeciwciała. Umieść probówkę na wytrząsarce orbitalnej o temperaturze pokojowej z prędkością 200 obr./min i inkubuj przez 30 minut w ciemności. Rozcieńczyć mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych, dodając jeden mililitr buforu przepływowego.Delikatnie pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby wymieszać i odwirować komórki w schłodzonej wirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery minuty. Całkowicie odessać supinat w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał. Następnie ponownie zawiesić osad ze 100 mikrolitrami wtórnego materiału roboczego przeciwciała.Powtarzać inkubację w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem przez 30 minut. W tym samym wytrząsarce rozcieńczyć mieszaninę przeciwciał wtórnych, dodając jeden mililitr buforu przepływowego. Powtórzyć tę samą inwersję probówki, mieszanie, odwirowanie i usunięcie supernatantu, aby wyeliminować wszystkie niezwiązane przeciwciała.Powtórzyć te same etapy wirowania i usuwania supernatantu o pojemności jednego mililitra jeszcze dwa razy, ale ze świeżym PBS jako buforem do mycia. Zamiast tego efektem końcowym będzie czysta osadka komórkowa znakowana zewnątrzkomórkowymi lub wewnątrzkomórkowymi przeciwciałami fluorescencyjnymi CFSC lub dowolnymi kombinacjami trzech powtórzeń, znakowaną osadką komórkową w 150 mikrolitrach bufora przepływowego. Przenieś zawiesinę komórek do cytometru przepływowego i rozpocznij analizę z odpowiednimi ustawieniami filtra wzbudzenia laserowego i emisji dla każdego piętra z czterech.Korzystając z danych rozproszenia do przodu i z boku jako przewodnika, skonfiguruj początkowe rozproszenie do przodu i boczne w oprogramowaniu do analizy cytometrii przepływowej, aby wykluczyć niespecyficzne punkty danych, takie jak szczątki komórek i martwe komórki. Następnie, wykorzystując surowe dane z niebarwionej zawiesiny komórkowej jako kontroli ujemnej, ustaw wiele bramek integracji fluorescencyjnej, które wybierają dodatnie sygnały emisyjne zarówno z zewnątrzkomórkowych, jak i wewnątrzkomórkowych etykiet antygenowych, aby uwzględnić fluorescencyjne tło z wielokolorowego. Efekty nakładania się widm ponownie dostosowują bramki fluorescencyjne przy użyciu surowych danych z kontrolnych barwionych pojedynczymi przeciwciałami.W eksperymencie z faksem multipleksowym znaczniki karboksylowefluoresceinowe mogą być użyte jako sygnał wyjściowy, który może rozróżniać komórki z dwóch różnych linii lub warunków eksperymentalnych bez użycia przeciwciała. Na przykład w heterogenicznej zawiesinie komórek można natychmiast odróżnić komórki nerwowe oznaczone CFSC od nieoznakowanych fibroblastów, patrząc tylko na obecność lub brak fluorescencji w zielonym kanale. Ponadto, w połączeniu z znakowaniem CFSE Esther, można użyć przeciwciał fluorescencyjnych o różnych kolorach do określenia zróżnicowanej ekspresji antygenów powierzchniowych między podzbiorami znakowanymi CFSE i nieznakowanymi w mieszanej próbce.Na przykład SHSY pięć komórek nerwiaka zarodkowego Y znakowanych CFSE w zielonym kanale fluorescencyjnym wykazywało koekspresję wysokiego poziomu antygenu powierzchniowego CD 24, ale nie markera fibroblastów CD 54. W przeciwieństwie do tego, CFSC ujemne fibroblasty BJ są dodatnie dla CD 54 z niższymi poziomami CD 24.Kombinatoryczny. Analiza antygenów powierzchniowych neuronów może być również wykonywana w połączeniu z wykrywaniem antygenów wewnątrzkomórkowych na podstawie przeciwciał.Włączenie niebarwionych próbek i pojedynczo barwionych kontroli antygenów powierzchniowych i antygenów wewnątrzkomórkowych ma kluczowe znaczenie jako alternatywa dla pierwotnego i wtórnego znakowania antygenów wewnątrzkomórkowych opartego na przeciwciałach, takiego jak pokazana tutaj mapa markerów neuronalnych. Niekowalencyjne znakowanie fluorescencyjne przeciwciała pierwszorzędowego może dać porównywalne wyniki w analizie koekspresji i skraca protokół. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować komórki nerwowe do podstawowej analizy cytometrii przepływowej przy użyciu różnych alternatywnych podejść do znakowania i ich kombinacji.

flow-cytometry-protocols-for-surface-intracellular-antigen-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Protokoły cytometrii przepływowej do analiz antygenów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych typów komórek nerwowych

Niniejszy protokół wideo demonstruje nową metodę generowania i następnego oczyszczania neuronalnych komórek progenitorowych z odnawialnego źródła neuralnych komórek macierzystych (NSCs) w oparciu o ich właściwości fizyczne (rozmiar i ziarnistość wewnętrzną) oraz fluorescencyjne, z wykorzystaniem technologii cytometrii przepływowej.

Analiza neuroblastów: metoda generowania i wzbogacania populacji neuronalnych komórek progenitorowych z różnicujących się potomków neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

Źródło: Becker-Kojić, Z. A.,  i inni. al., Wolne od GMO pokolenie komórek neuronalnych pochodzących z krwi. J. Vis. Exp. (2021)Film przedstawia protokół przygotowania komórek nerwowych pochodzących z przeprogramowanych komórek krwi obwodowej do mikroskopii fluorescencyjnej, prezentując różne typy komórek i etapy rozwoju za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego.

Mikroskopia immunofluorescencyjna komórek nerwowych zróżnicowanych z obwodowych komórek krwiopochodnych 

Źródło: Hidmark, A. S., et al. {{}}Analiza komórek odpornościowych w pojedynczych nerwach kulszowych i zwoju korzenia grzbietowego od pojedynczej myszy za pomocą cytometrii przepływowej. J. Vis. Exp.{{TAG_ 27}} (2017).  Ten film demonstruje zastosowanie cytometrii przepływowej do analizy komórek odpornościowych w nerwach kulszowych myszy i zwojach korzenia grzbietowego (DRG). Proces ten polega na znakowaniu komórek odpornościowych przeciwciałami znakowanymi fluoroforem i biotyną, stabilizacji i...

Analiza komórek odpornościowych w tkankach nerwowych myszy za pomocą cytometrii przepływowej

W ostatnich latach testy oparte na żywych komórkach były z powodzeniem wykorzystywane do wykrywania przeciwciał przeciwko antygenom powierzchniowym i konformacyjnym. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą wysokoprzepustową cytometrię przepływową, umożliwiającą analizę dużych kohort pacjentów. Wykrycie nowych przeciwciał poprawi diagnostykę i leczenie zaburzeń o podłożu immunologicznym.

Wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej oparty na komórkach do wykrywania przeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu lub receptorowi dopaminy-2 w ludzkiej surowicy

Celem tego protokołu jest użycie techniki sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) do sortowania określonych typów komórek nerwowych w celu późniejszej analizy ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, markerów epigenetycznych i/lub ekspresji białek.

Wykorzystanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją do zbadania ekspresji genów specyficznych dla typu komórki w tkance mózgowej szczura

Prezentujemy metodę cytometrii przepływowej do jednoczesnej identyfikacji różnych typów komórek pobranych z mózgu myszy lub rdzenia kręgowego. Metoda ta może być wykorzystana do wyizolowania lub scharakteryzowania czystych populacji komórek w chorobach neurodegeneracyjnych lub do ilościowego określenia zakresu celowania w komórki po podaniu in vivo wektorów wirusowych lub nanocząstek.

Jednoczesna charakterystyka cytometryczna przepływowa wielu typów komórek pobranych z mózgu / rdzenia kręgowego myszy za pomocą różnych metod homogenizacji

Ten manuskrypt przedstawia protokół indukcji aktywnego eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) u myszy. Przedstawiono również metodę izolacji i charakterystyki naciekających limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), aby pokazać, w jaki sposób limfocyty są zaangażowane w rozwój choroby autoimmunologicznej OUN.

Analiza cytometryczna przepływowa nacieku limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Opracowaliśmy metodę, która wzbogaca i izoluje ludzkie populacje astrocytów ze świeżo zamrożonej tkanki do wykorzystania w dalszych analizach molekularnych.

Izolacja populacji astrocytów dorosłych ludzi ze świeżo zamrożonej kory mózgowej przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

Ten protokół opisuje strategie identyfikacji i wzbogacania stanu komórki w pierwotnych hodowlach dorosłych mysich nerwowych komórek macierzystych za pomocą obrazowania autofluorescencyjnego przy użyciu i) mikroskopu konfokalnego, ii) aktywowanego fluorescencyjnie sortera komórek do wykonywania obrazowania intensywności, lub iii) mikroskopu wielofotonowego do wykonywania obrazowania czasu życia fluorescencji.

Klasyfikacja stanu aktywacji neuronalnych komórek macierzystych in vitro za pomocą autofluorescencji

Do tej pory, protokoły jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od tej samej myszy są niezaspokojonym wymaganiem. Protokół przedstawia procedurę mającą zastosowanie u myszy z nieleczonym i eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia w celu zbadania złożonych sieci komórkowych podczas zapalenia nerwów i jednoczesnego zmniejszenia wymaganej liczby myszy.

Jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do ilościowego oznaczania pochłaniania mikrogleju przez synapsy vGLUT1-dodatnie oraz surowych synaptosomów pHRodo znakowanych na czerwono za pomocą cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny za pomocą cytometrii przepływowej

Poznaj protokoły cytometrii przepływowej do analizy powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych antygenów w komórkach nerwowych. Ta metoda umożliwia identyfikację specyficznych subpopulacji nerwowych i badanie ich funkcji.

Protokoły cytometrii przepływowej do powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych analiz antygenowych typów komórek nerwowych

Przeglądaj więcej filmów