Name: Wysokoprzepustowa charakterystyka dorosłych komórek macierzystych zmodyfikowanych pod kątem dostarczania czynników terapeutycznych w strategiach neuroprotekcyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj metodę szybkiej charakterystyki zmodyfikowanych komórek macierzystych myszy przy użyciu systemu HCS. Technika obejmuje obrazowanie żywych komórek i analizę parametrów wzrostu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fundusze na te badania zostały zapewnione przez US Army Medical Research and Materiel Command (nr konta grantowego W81XWH-11-1-0700) oraz Stem Cell Research Fund. PAB i EMP były laureatami Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).

1. Przygotowanie podłoża dla płytek 96-dołkowych
<ol>
	<li>Stwórz mapę 96-dołkowej płytki, przedstawiając różne podłoża i typy komórek, które mają być badane (ryc. 1).</li>
	<li>Otrzymać roztwory podstawowe różnych substratów [poli-L-lizyna, fibronektyna, kolagen typu I, laminina i entaktyna-kolagen IV-laminina (ECL)], 96-dołkową płytkę wielodołkową i przygotować stację roboczą w sterylnym kapturze do hodowli komórek.</li>
	<li>Przygotować poszczególne substraty, rozcieńczając materiał w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 5 μg/ml (stężenie to zostało wcześniej określone na podstawie testu zależnego od stężenia substratu dla wzrostu i proliferacji komórek). Wymieszaj za pomocą wiru przed wlaniem do sterylnego zbiornika.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu substratu do każdego dołka zgodnie z mapą 96-dołkową (rysunek 1) (12- lub 8-kanałowa mikropipeta jest wygodna do mikropipetowania do płytki 96-dołkowej). Uszczelnić pokrywkę do płytki 96-dołkowej za pomocą paska Parafilm i przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Powlekanie komórek i obrazowanie poklatkowe
UWAGA: Mysie MSCs zostały wyizolowane ze szpiku kostnego dorosłych myszy C57BL/6 i utrzymywane jako przylegająca linia komórkowa. MSCs zostały zakażone za pomocą wektorów lentiwirusowych w celu zmodyfikowania ich do wydzielania neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF; ludzkie cDNA) i neurotroficznego czynnika pochodzącego z komórek glejowych (GDNF; ludzkie cDNA) przy użyciu kodowania wektora lentiwirusowego BDNF (LV-BDNF; CMV-BDNF-IRES-GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP) i białko zielonej fluorescencji (GFP, LV-GFP; CMV-GFP). 
UWAGA: Pożywką hodowlaną dla mysich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) jest zmodyfikowana pożywka Dulbecco firmy Iscove, zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej kwalifikowanej przez hybrydomę, 10% surowicy końskiej, 2 mM L-glutaminy i 10 000 U/ml penicyliny, 10 mg/ml streptomycyny. Pięć różnych typów mysich MSC (MSC, GMP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-MSC) posiano przy około 30% zbiegu w kolbach do hodowli komórkowych T75.
<ol>
	<li>Posiewanie komórek
	<ol>
		<li>Następnego dnia usunąć roztwory substratu przez aspirację i dwukrotnie przepłukać każdą studzienkę około 200 μl sterylnego PBS. Dodać pożywkę do hodowli komórkowych (200 μl/basenik) do każdego dołka po ostatnim płukaniu PBS. Umieścić 96-dołkową płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych ustawionym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu zrównoważenia.</li>
		<li>Podczas gdy 96-dołkowa płytka jest równoważona w inkubatorze, należy zebrać komórki (MSC w kolbach T75 powinny być w około 70% zlewające się w momencie zbierania/posiewu), zbierając pożywkę wzrostową (określaną jako pożywka kondycjonowana) z kolby T75 i przechowując w stożkowej probówce o pojemności 15 ml w sterylnych warunkach (ta kondycjonowana pożywka zostanie użyta w kroku 2.1.4 poniżej).</li>
		<li>Dodać 8 ml sterylnego PBS do kolby i delikatnie zakręcić, a następnie odpipetować PBS i dodać 1 ml 0,05% trypsyny i 0,01% roztworu EDTA w celu odłączenia komórek od powierzchni hodowli kolby T75. Monitorować odłączenie komórek, oglądając kolbę za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w optykę z kontrastem fazowym.</li>
		<li>Po odłączeniu komórek natychmiast dodać do kolby 8 ml kondycjonowanej pożywki (zebranej w kroku 2.1.2). Zebrać zawiesinę komórek i przenieść do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przez 4 minuty przy 450 x g w celu osadzenia komórek.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μl świeżej i ogrzanej (37 °C) pożywki do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Określ liczbę komórek w zawiesinie komórek, wykonując zliczanie żywych komórek błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru. Płytkie komórki o gęstości około 300 komórek/studzienkę należy umieścić w odpowiednich dołkach płytki 96-dołkowej.</li>
		<li>Powtórz te kroki dla każdej populacji komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie poklatkowe
	<ol>
		<li>Po pokryciu wszystkich MSC umieść 96-dołkową płytkę w inkubatorze na 2 godziny, aby umożliwić MSC przyczepienie się do substratu.</li>
		<li>Uruchom system HCS i odczekaj 2 godziny, aż system się zrównoważy. Ustaw regulator środowiskowy na 37 °C i podłącz butlę z mieszanym gazem zawierającą 5% CO2 w powietrzu do komory środowiskowej systemu HCS dostarczającej stałe źródło powietrza.</li>
		<li>Po upływie 2-godzinnego okresu równoważenia wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora i umieścić bezpośrednio w komorze wzrostu komórek systemu HCS. Odczekaj 30 minut, aby zrównoważyć wszelkie rozszerzanie się płytki związane z ciepłem, a następnie uruchom oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazu, aby skonfigurować ustawienia płytki.</li>
		<li>Wybierz obiektyw 20X do obrazowania. Wybierz dwie studzienki na warunek [tj. GFP-MSC na fibronektynie itp. (6 substratów x 5 podtypów MSC, co daje łącznie 30 warunków x 2 powtórzenia = łącznie 60 dołków)] w celu skonfigurowania obrazowania poklatkowego. Wybierz dwa miejsca do obrazowania w każdej studzience.</li>
		<li>Wybierz odpowiednie długości fal świetlnych do obrazowania. 
		UWAGA: Do obrazowania poklatkowego wybrano dwie różne długości fal (kontrast fazowy i fluorescencja GFP).</li>
		<li>Ustaw ostrość na dnie studni za pomocą laserowego autofokusa i wykonaj zdjęcia testowe dla wielu miejsc i wielu studzienek, aby znaleźć zoptymalizowaną płaszczyznę ogniskowej.</li>
		<li>Po ustaleniu ostrości rozpocznij robienie zdjęć co 5 minut przez 48 godzin dla wszystkich 60 dołków (120 miejsc).</li>
		<li>Podawaj komórki co 24 godziny, wyjmując 96-dołkową płytkę z systemu HCS. Usunąć 75 μl pożywki z każdej studzienki i dodać 100 μl świeżej pożywki do każdej studzienki (zrównoważyć tę świeżą pożywkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 ).</li>
		<li>Pod koniec eksperymentu poklatkowego wyjmij 96-dołkową płytkę z systemu HCS. W sterylnych warunkach należy pobrać próbki kondycjonowanych pożywek z każdej studzienki i przenieść je na inną płytkę 96-dołkową. 
		UWAGA: Próbki te można wykorzystać do dalszej analizy poprzez wykonanie testu ELISA dla czynników neurotroficznych.</li>
		<li>Przygotuj 96-dołkową płytkę z hodowanymi MSCs do dodatkowych testów, takich jak test proliferacji komórek Ki67 lub test barwienia żywych/martwych jodków propidyny (patrz szczegóły poniżej).</li>
		<li>Wykonaj analizę obrazowania poklatkowego dla migracji komórek/śledzenia komórek, jak opisano w sekcji 5 poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Proliferacja komórek Ki67 i test na żywy/martwy jodek propidyny
<ol>
	<li>Test proliferacji komórek Ki67 (immunocytochemia)
	<ol>
		<li>Przepłukać kultury komórkowe 0,1 M buforem fosforanowym (PO4) przez jedną minutę dwa razy. Utrwal kulturę za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Usuń PFA i przepłucz studzienki PBS przez siedem minut trzy razy.</li>
		<li>Po ostatnim płukaniu dodać 100 μl roztworu blokującego (sól fizjologiczna z buforu fosforanowego, 5% normalnej surowicy osła, 0,4% surowicy albuminy bydlęcej i 0,2% Triton X-100) do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe, królicze przeciwciało anty-Ki67, rozcieńczając je w roztworze blokera w stosunku roboczym 1:200.</li>
		<li>Usuń roztwór blokujący i nałóż 100 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdej studzienki. Przykryć 96-dołkową płytkę i inkubować próbki w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Następnego dnia usuń roztwór przeciwciał i płucz PBS przez 7 minut, 3 razy.</li>
		<li>Przygotować przeciwciało drugorzędowe, anty-królicze Cy3 osła w roztworze blokującym w stosunku roboczym 1:500. Dodać barwienie jądrowe DAPI do roztworu przeciwciała drugorzędowego w rozcieńczeniu 1:100. Po usunięciu ostatniego płukania PBS nanieść 100 μl roztworu przeciwciała wtórnego/DAPI do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 90 minut.</li>
		<li>Usuń wtórne przeciwciało/roztwór DAPI i płucz każdą studzienkę PBS przez 7 minut, 3 razy. Przykryć płytkę 96-dołkową i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu wykonania obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test żywego/martwego jodku propidymu
	<ol>
		<li>Zmierz śmierć komórki za pomocą testu wykluczającego jodek propidyny (PI), jak opisano poniżej.</li>
		<li>Przygotować roztwór barwienia jodku propidyny o stężeniu 1,5 μM w pożywce hodowlanej.</li>
		<li>Dodać 100 μl 70% etanolu do jednego dołka MSCs na 2 minuty z zamiarem zabicia tych komórek. To dobrze służy jako pozytywna kontrola dla plamy PI. Większość MSCs będzie wybarwiona PI, co wskazuje na śmierć komórki. Usunąć roztwór etanolu.</li>
		<li>Dodać 100 μl roztworu barwienia jodku propidyny do każdej studzienki i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . </li>
		<li>Przepłukać komórki 0,1 M buforem fosforanowym przez 1 minutę, 2 razy. Utrwalić komórki za pomocą 4% PFA w buforze 0,1 M P04 przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Usuń PFA i spłucz PBS trzy razy przez 7 minut.</li>
		<li>Inkubować z roztworem DAPI (1:50) rozcieńczonym w roztworze blokera przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przepłukać wszystkie studzienki PBS przez 7 minut, 3 razy.</li>
		<li>Usuń roztwór DAPI i płucz każdą studzienkę PBS przez 7 minut, 3 razy. Przykryć płytkę 96-dołkową i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu wykonania obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zautomatyzowane obrazowanie i analiza punktacji na wielu długościach fal
<ol>
	<li>Załaduj 96-dołkową płytkę (wcześniej przetworzoną do znakowania immunologicznego Ki67 lub wybarwioną jodkiem propidyny) do systemu HCS i pozwól płytce zrównoważyć się przez 20 minut Otwórz oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazów systemu HCS.</li>
	<li>Wybierz ustawienia akwizycji dla obiektywu 10X, korzystając z binowania kamery na 1 i ustawieniu wzmocnienia na 2. Znajdź płaszczyznę Z, w której znajdują się komórki, korzystając z funkcji automatycznej ekspozycji i oblicz przesunięcie dla każdej interesującej nas długości fali. Na potrzeby tej analizy uchwyć obrazy dla DAPI (W1), Cy3 (W2) i FITC (W3). Wybierz maksymalny poziom intensywności, przy którym studzienki kontroli ujemnej nie wykazują sygnału do akwizycji obrazu. Upewnij się, że to ustawienie jest odpowiednie dla dołków dodatnich.</li>
	<li>Zdobądź płytę. Przechwytuj obrazy i przechowuj je w bazie danych oprogramowania do akwizycji i analizy obrazów.</li>
	<li>Po uzyskaniu obrazów otwórz oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazów w trybie offline i przejrzyj dane płyt z powyższych obrazów.</li>
	<li>Wybierz analizę punktacji dla wielu długości fali. Skonfiguruj minimalne i maksymalne natężenia dla każdej długości fali. 
	UWAGA: Wykrycie DAPI powinno oznaczać zabarwienie wokół każdego widocznego jądra. Cy3 powinien wykrywać dodatnie komórki o immunoreaktywności Ki67 (IR) i nie powinien wykrywać IR w kontrolach ujemnych. Dla Cy3 Ki67 IR przybliżona minimalna szerokość wynosiła 7 μm, przybliżona maksymalna szerokość wynosiła 30 μm, intensywność powyżej lokalnego tła wynosiła 150 poziomów szarości, a minimalny obszar barwiony wynosił 50μm2.</li>
	<li>Przeprowadź analizę dla wszystkich pozycji. Wyeksportuj dane do wyświetlenia w arkuszu kalkulacyjnym.</li>
</ol>
5. Śledzenie komórek
<ol>
	<li>Otwórz program do akwizycji i analizy obrazu i kliknij "Review Plate Data [DB]...", wybierając interesującą Cię tabliczkę.</li>
	<li>Wyświetl dane jako "Czas a dobrze".</li>
	<li>Wybierz jedną z witryn z sekcji "Witryny", klikając lewym przyciskiem myszy żądaną opcję. Wybierz "Transmitowane..." w sekcji "Długości fal:". Kliknij prawym przyciskiem myszy docelowy dołek w szablonie płytki 96-dołkowej i kliknij "Załaduj obrazy".</li>
	<li>Śledź komórki, klikając "Aplikacje", a następnie "Śledź obiekty".</li>
	<li>Użyj opcji "Dynamiczna wymiana danych (DDE)", aby wybrać format eksportu danych, np. Microsoft Excel.</li>
	<li>Wybierz dane śledzenia do wyeksportowania, np. czas, który upłynął, numer obiektu, odległość, przedział czasu, prędkość, kąt bezwzględny, odległość do początku, delta x i delta y.</li>
	<li>Oznacz każdą interesującą komórkę "Ctrl + lewy przycisk myszy" w komórkach docelowych.</li>
	<li>Śledź komórki. W razie potrzeby zatrzymaj/zmień niewłaściwe śledzenie komórek za pomocą "Esc", a następnie dostosuj ustawienia.</li>
	<li>Po zakończeniu śledzenia komórek zapisz dane za pomocą "Dane dziennika".</li>
</ol>

<ol><li>Thoenen, H., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins%3A+from+enthusiastic+expectations+through+sobering+experiences+to+rational+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins: from enthusiastic expectations through sobering experiences to rational therapeutic approaches.</a> Nature neuroscience. 5 Suppl, 1046-1050 (2002).</li>
<li>Park, H., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin+regulation+of+neural+circuit+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin regulation of neural circuit development and function.</a> Nature reviews. 14, 7-23 (2013).</li>
<li>Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLin%2C+LF+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 260, 1130-1132 (1993).</li>
<li>Azizi, S. A., Stokes, D., Augelli, B. J., DiGirolamo, C., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+and+migration+of+human+bone+marrow+stromal+cells+implanted+in+the+brains+of+albino+rats--similarities+to+astrocyte+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats--similarities to astrocyte grafts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3908-3913 (1998).</li>
<li>Prockop, D. J., Gregory, C. A., Spees, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+strategy+for+cell+and+gene+therapy%3A+harnessing+the+power+of+adult+stem+cells+to+repair+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 Suppl 1, 11917-11923 (2003).</li>
<li>Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+of+the+spinal+cord+following+intravenous+delivery+of+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells.</a> Glia. 39, 229-236 (2002).</li>
<li>Hofstetter, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow+stromal+cells+form+guiding+strands+in+the+injured+spinal+cord+and+promote+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 2199-2204 (2002).</li>
<li>Chopp, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+neural+injury+with+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+neurology%22%5BJournal%5D)">Treatment of neural injury with marrow stromal cells.</a> Lancet neurology. 1, 92-100 (2002).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+marrow+stromal+cells+restores+cerebral+blood+flow+and+reduces+cerebral+atrophy+in+rats+with+traumatic+brain+injury%3A+in+vivo+MRI+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Transplantation of marrow stromal cells restores cerebral blood flow and reduces cerebral atrophy in rats with traumatic brain injury: in vivo MRI study.</a> Journal of neurotrauma. 28, 535-545 (2011).</li>
<li>Jin, H. K., Carter, J. E., Huntley, G. W., Schuchman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+transplantation+of+mesenchymal+stem+cells+into+acid+sphingomyelinase-deficient+mice+delays+the+onset+of+neurological+abnormalities+and+extends+their+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Intracerebral transplantation of mesenchymal stem cells into acid sphingomyelinase-deficient mice delays the onset of neurological abnormalities and extends their life span.</a> The Journal of clinical investigation. 109, 1183-1191 (2002).</li>
<li>Harper, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+BDNF-secreting+mesenchymal+stem+cells+provides+neuroprotection+in+chronically+hypertensive+rat+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Transplantation of BDNF-secreting mesenchymal stem cells provides neuroprotection in chronically hypertensive rat eyes.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 52, 4506-4515 (2011).</li>
<li>Arnhold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirally+transduced+bone+marrow+stromal+cells+differentiate+into+pigment+epithelial+cells+and+induce+rescue+effects+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Adenovirally transduced bone marrow stromal cells differentiate into pigment epithelial cells and induce rescue effects in RCS rats.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 47, 4121-4129 (2006).</li>
<li>Inoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+transplantation+of+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+delays+retinal+degeneration+in+the+RCS+rat+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">Subretinal transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells delays retinal degeneration in the RCS rat model of retinal degeneration.</a> Experimental eye research. 85, 234-241 (2007).</li>
<li>Xia, X., Wong, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+a+high-content+screening+approach+to+stem+cell+research+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+%28Dayton%2C+Ohio%29%22%5BJournal%5D)">Concise review: a high-content screening approach to stem cell research and drug discovery.</a> Stem cells (Dayton, Ohio). 30, 1800-1807 (2012).</li>
<li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ki-67+protein%3A+from+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> Journal of cellular physiology. 182, 311-322 (2000).</li>
<li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAPI%3A+a+DNA-specific+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+histochemistry+%3A+official+publication+of+the+Biological+Stain+Commission%22%5BJournal%5D)">DAPI: a DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic & histochemistry : official publication of the Biological Stain Commission. 70, 220-233 (1995).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418, 41-49 (2002).</li>
<li>Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+rat+and+human+bone+marrow+stromal+cells+differentiate+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons.</a> Journal of Neuroscience Research. 61, 364-370 (2000).</li>
<li>Huang, B., Tabata, Y., Gao, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+as+therapeutic+agents+and+potential+targeted+gene+delivery+vehicle+for+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells as therapeutic agents and potential targeted gene delivery vehicle for brain diseases.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 162, 464-473 (2012).</li>
<li>Uccelli, A., Benvenuto, F., Laroni, A., Giunti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+features+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Pract+Res+Clin+Haematol%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective features of mesenchymal stem cells.</a> Best Pract Res Clin Haematol. 24, 59-64 (2011).</li>
<li>Forostyak, S., Jendelova, P., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mesenchymal+stromal+cells+in+spinal+cord+injury%2C+regenerative+medicine+and+possible+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">The role of mesenchymal stromal cells in spinal cord injury, regenerative medicine and possible clinical applications.</a> Biochimie. 95, 2257-2270 (2013).</li>
<li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+lentivirus-mediated+TH+and+GDNF+genetic+engineering+mesenchymal+stem+cells+on+Parkinson%27s+disease+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+sciences+%3A+official+journal+of+the+Italian+Neurological+Society+and+of+the+Italian+Society+of+Clinical+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">The effect of lentivirus-mediated TH and GDNF genetic engineering mesenchymal stem cells on Parkinson's disease rat model.</a> Neurological sciences : official journal of the Italian Neurological Society and of the Italian Society of Clinical Neurophysiology. 32, 41-51 (2011).</li>
<li>Harper, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+released+from+engineered+mesenchymal+stem+cells+attenuates+glutamate-+and+hydrogen+peroxide-mediated+death+of+staurosporine-differentiated+RGC-5+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor released from engineered mesenchymal stem cells attenuates glutamate- and hydrogen peroxide-mediated death of staurosporine-differentiated RGC-5 cells.</a> Experimental eye research. 89, 538-548 (2009).</li>
<li>Harrill, J. A., Freudenrich, T. M., Machacek, D. W., Stice, S. L., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+human+embryonic+stem+cell-derived+hN2+cells+using+automated+high-content+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of neurite outgrowth in human embryonic stem cell-derived hN2 cells using automated high-content image analysis.</a> Neurotoxicology. 31, 277-290 (2010).</li>
</ol>

Opłaty za publikację tego artykułu wideo zostały pokryte przez Molecular Devices, LLC.

Dorosłe mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są atrakcyjnym typem komórek do opracowania eksperymentalnej strategii łączącej terapię komórkową i opartą na dostarczaniu genów. MSCs są multipotencjalne, zdolne do różnicowania się w komórki linii mezodermalnej i wykazują znaczną plastyczność, różnicując się/transróżnicując w linie neuronalne i glejowe z odpowiednimi paradygmatami indukcji17,18. Co więcej, MSCs zostały przeszczepione i udowodniono ich skuteczność w badaniach przedklinicznych w przypadku wielu zaburzeń, w tym schorzeń neurodegeneracyjnych19. Skuteczność terapeutyczna MSCs jest dobrze znana ze względu na ich korzystne działanie przeciwproliferacyjne, przeciwzapalne i przeciwapoptotyczne20. Wiadomo również, że MSCs wytwarzają i wydzielają różne czynniki neurotroficzne i wzrostowe, co prawdopodobnie przyczynia się do cech neuroprotekcyjnych związanych z naiwnymi MSCs po przeszczepieniu w miejscach urazu lub choroby21. Co ważne, MSCs mogą być genetycznie modyfikowane w celu trwałego dostarczania czynników neurotroficznych do połączonych zastosowań opartych na terapii komórkowej i genowej i były stosowane w wielu zwierzęcych modelach urazów lub chorób OUN11,19,22.
Przy opracowywaniu połączonej strategii opartej na terapii komórkowej i genowej ważne jest, aby stan zdrowia komórek został dokładnie oceniony przed ich szerokim zastosowaniem do zastosowań in vitro, a zwłaszcza in vivo . W ramach dowodu słuszności koncepcji zbadaliśmy wiele populacji zmodyfikowanych i kontrolnych linii MSC w celu zbadania konsekwencji modyfikacji genetycznych na zdrowie i sprawność komórek przy użyciu podejścia opartego na badaniach przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS). Ogólnie rzecz biorąc, HCS odnosi się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych opartych na obrazach komórkowych14. To podejście przesiewowe pozwala na ilościową ocenę fenotypów komórkowych na wielu poziomach rozdzielczości przestrzennej (od komórki do subkomórki) i czasowej (od milisekund do dni) w różnych warunkach eksperymentalnych. Korzystając z tego podejścia, uzyskaliśmy dostęp do możliwych różnic w preferencjach substratów w odniesieniu do następujących parametrów: proliferacja komórek, ekspresja białka zielonej fluorescencji (GFP), śmierć komórki oraz ruchliwość/migracja komórek. Eksperymenty zaprojektowano w formacie 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Na jednej płytce rutynowo badaliśmy możliwe różnice związane z substratem w odniesieniu do każdego parametru dla różnych populacji MSC komórek transdukowanych lentiwirusem i porównaliśmy zmodyfikowane MSCs z oryginalnymi, nietransdukowanymi MSC. Umożliwiło to bezpośrednie porównanie wyników dla różnych podtypów MSC z zestawem testów in vitro , takich jak proliferacja komórek przy użyciu znakowania immunologicznego Ki67, test żywotności żywych/martwych komórek przy użyciu barwienia jodkiem propidyny oraz zachowanie komórek poprzez wykonanie poklatkowego obrazowania cyfrowego. Jako rozszerzenie tego HCS można również przeprowadzić test ELISA na kondycjonowanych próbkach pożywek pobranych z poszczególnych studzienek w celu ilościowego określenia wydzielania czynników neurotroficznych. Kondycjonowane pożywki z różnych podtypów MSC mogą być również stosowane w testach biologicznych in vitro w celu określenia aktywności biologicznej wydzielanych czynników11,23. Ten typ platformy HCS może być również wykorzystywany do pomiarów in vitro wzrostu neurytów z pierwotnych kultur neuronalnych i linii nerwowych komórek macierzystych24. Ogólnie rzecz biorąc, nasze wyniki wykazały, że subpopulacje genetycznie zmodyfikowanych MSCs wykazywały podobne zachowania w porównaniu z niezmodyfikowanymi MSCs. Wpływ różnych substratów hodowlanych na wzrost komórek i migrację komórek nie różnił się dramatycznie między podtypami MSC, a także substratami hodowlanymi. W związku z tym testowane substraty macierzy zewnątrzkomórkowej nie wydawały się odgrywać kluczowej roli w modulowaniu tych aspektów zachowania komórek dla tych różnych zmodyfikowanych MSC.
Badanie to demonstruje wykorzystanie systemu HCS do analizy różnych aspektów zachowania komórek. Nierzadko jednak można spotkać się z ograniczeniami związanymi z analizą obrazu. Czasami, podczas analizy obrazów fluorescencyjnych, nieco trudno było określić prawidłową wartość progową, powyżej której komórki znakowane immunologicznie lub barwione byłyby liczone jako pozytywnie znakowane/barwione. Tak więc, aby zminimalizować subiektywny błąd systematyczny, określenie wartości progowych zależało od porównania z kontrolami (kontrole ujemne do obrazowania fluorescencyjnego przeprowadzano równolegle podczas całego przetwarzania przez pominięcie przeciwciał pierwszorzędowych lub drugorzędowych). Kolejne ograniczenie napotkano podczas analizy migracji komórek za pomocą cyfrowego obrazowania poklatkowego. W niektórych przypadkach oprogramowanie do obrazowania nie było w stanie odróżnić losowych ruchów Browna komórki od komórek migrujących na bardzo niewielką odległość. Dodatkowe ograniczenia były widoczne w sytuacjach, w których oprogramowanie analityczne nie było w stanie rozróżnić obecności wielu komórek w bardzo bliskiej odległości od siebie. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, konieczne było ręczne wybieranie komórek podczas analizy, a nie w pełni zautomatyzowana analiza. Gęstość posiewu komórek może również powodować zniekształcanie danych migracji komórek między populacjami komórek, które wykazują większą preferencję do wzrostu w skupiskach w porównaniu z komórkami, które rosną w izolacji od siebie. Tego typu różnice są po części prawdopodobnie odzwierciedleniem preferencji komórka-substrat w porównaniu z preferencjami komórka-komórka.
Wykorzystanie systemu HCS do pozyskiwania obrazów i przeprowadzania analizy danych zapewnia skuteczny i szybki sposób oceny wielu parametrów komórek. Ponadto rutynowo rejestrowano cyfrowe filmy poklatkowe dla 30 różnych warunków (6 podłoży i 5 różnych podtypów MSC) przez okresy od godzin do dni (48 godzin) podczas korzystania z komory środowiskowej. Dane te wykorzystano następnie do obliczenia i określenia różnic w szybkościach migracji komórek w różnych liniach komórkowych na różnych cząsteczkach ECM.
W tym raporcie zwróciliśmy uwagę na wdrożenie platformy przesiewowej o wysokiej zawartości w celu oceny stanu zdrowia i funkcji komórek. Ten rodzaj analizy jest przydatny do opracowywania racjonalnych strategii projektowania typów komórek, a także substratów polimerowych w celu ułatwienia ukierunkowanego wzrostu komórek i regeneracji neuronów. Jest to niezbędny krok w kierunku zastosowania dostarczania czynników terapeutycznych za pomocą komórek macierzystych przed szeroko zakrojonymi badaniami przedklinicznymi in vivo z wykorzystaniem strategii przeszczepu komórek.

Głównym problemem związanym z wdrażaniem użytecznych terapii w leczeniu zaburzeń układu nerwowego jest opracowanie skutecznych metod, które zapobiegają dalszej degeneracji, a także ułatwiają odzyskanie funkcji. Innowacyjną strategią jest inżynieria genetyczna komórek macierzystych ex vivo, w celu produkcji czynników neuroprotekcyjnych, przed ich przeszczepem. Ta kombinacja terapii komórkowej, w połączeniu z rodzajem terapii genowej, zapewnia potężną metodę leczenia choroby lub śmierci neuronów w układzie nerwowym wywołanej urazem.
Czynniki neurotroficzne są niezbędne dla wzrostu i przetrwania rozwijających się neuronów, jak również utrzymania i plastyczności dojrzałych neuronów. Wiele badań wykazało znaczącą rolę czynników neurotroficznych w promowaniu początkowego wzrostu i różnicowania neuronów w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym (OUN i PNS), a także mogą stymulować regenerację in vitro i w zwierzęcych modelach uszkodzenia neuronów1. Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF) ulega silnej ekspresji w OUN i odgrywa ważną rolę w regulacji rozwoju neuronów, plastyczności synaptycznej i naprawy2. Czynnik neurotroficzny pochodzenia komórkowego glejowego (GDNF) sprzyja przetrwaniu wielu typów neuronów, w tym neuronów dopaminergicznych i ruchowych3. Dlatego ważną strategią naprawy neuronów jest zapewnienie egzogennych źródeł czynników neurotroficznych do uszkodzonych lub chorych obszarów układu nerwowego.
Multipotencjalne mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) pochodzące ze szpiku kostnego mają ogromny potencjał do dostarczania białek terapeutycznych do leczenia uszkodzonego lub chorego układu nerwowego. Przeszczepianie MSCs przyciągnęło znaczną uwagę w wysiłkach na rzecz opracowania terapii komórkowych kompatybilnych z pacjentem, ponieważ mają one szereg zalet, w tym: 1) względną łatwość izolacji i utrzymania, 2) zdolność multipotencjalną, 3) niewielkie obawy etyczne, 4) zdolność do przeżycia i migracji po przeszczepieniu oraz 5) potencjał przeszczepu autologicznego4,5. Obiecujące wyniki uzyskano dzięki zastosowaniu wcześniej i genetycznie modyfikowanych MSCs w modelach zwierzęcych dla wielu różnych schorzeń neurodegeneracyjnych, w tym urazu rdzenia kręgowego6,7, udaru8,9, niedoboru mieliny10 i zwyrodnienia siatkówki11-13. Sprzężenie przeszczepu komórek z dostarczaniem czynników neurotroficznych z genetycznie modyfikowanych komórek macierzystych jest nową i ważną strategią naprawy neuronów.
Kluczowym krokiem w rozwoju komórkowych systemów dostarczania czynników terapeutycznych jest określenie normalnego stanu zdrowia zmodyfikowanych komórek. W związku z tym głównym celem tego badania była ocena ogólnych parametrów wzrostu genetycznie modyfikowanych dorosłych komórek macierzystych. Ważnym podejściem do szybkiej oceny parametrów wielu komórek jest zastosowanie wysokoprzelotowych badań przesiewowych opartych na obrazie komórkowym (HTS), często nazywanych procedurami badań przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS)14. Technologia ta umożliwia zautomatyzowane pozyskiwanie i analizę obrazów, a podejście to szczególnie dobrze nadaje się do zastosowań badawczych nad komórkami macierzystymi. W ramach tego projektu opracowaliśmy platformę profilowania, która pozwala na szybką charakterystykę i optymalizację preferencji substratów komórkowych i funkcji komórkowych z genetycznie modyfikowanymi dorosłymi komórkami macierzystymi wykorzystującymi system HCS.

<table><tbody><tr><td>Płytki 96-dołkowe</td><td>Greiner Bio One</td><td>655090</td><td>Płytki 96-dołkowe wybrane do użycia w</td></tr><tr><td>albuminie surowicy bydlęcej ImageXpress (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Ki67 królika</td><td>Abcam (Cambridge, MA)</td><td>Ab16667</td><td>rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Kolagen typu I</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>C7661</td><td>Kolagen z ogona</td></tr> <tr>szczura<td>DAPI</td><td>Invitrogen (Carlsbad, Kalifornia)</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-królik Cy3</td><td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&nbsp;</td><td>711-165-152</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>ECL(Entaktyna-Kolagen-Laminina)</td><td>Milipore/Chemicon (Temecula, CA)</td><td>08-110</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Hyklon (Logan, UT)</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Surowica koni</td><td>Hyclon (Logan, UT)</td><td>SH3007403</td><td></td></tr><tr><td>Sklep chemiczny etanolu</td><td>(Ames, IA)</td><td>12003510</td><td>100%, 200 proof</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>CB-40008</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Zmodyfikowany Hyklon Dulbeccos Medium (IMDM)</td> <td>(Logan, UT)</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>P285</td><td>Dla bufora PO4</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>P288</td><td>Dla buforu PO4</td></tr><tr><td>L-glutaminy</td><td>Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Laminine (mysz)</td><td>Trevigen (Gaithersburg, MD)</td><td>3400-010-01</td><td></td></tr><tr><td>Mysie MSCs dorosłych myszy C57BL/6</td><td>Tulane Cent do terapii genowej (Nowy Orlean, LA)</td><td></td><td>Izolowany ze szpiku kostnego</td></tr><tr><td>Genetycznie modyfikowane MSC (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/ GDNF)</td><td>Komórki te uzyskano z naszego poprzedniego badania: Ye i in. (w przygotowaniu)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła (NDS)</td><td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&nbsp;</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>O4042</td><td>4% PFA w 0,1 M buforze PO4</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny (PI)</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 0,05% (EDTA 1x)</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Ilbecco's Medium</td><td>Invitrogen (Carlsbad, Kalifornia)</td><td>12440&ndash; 046</td><td></td></tr><tr>Hyclon<td>FBS z kwalifikacją Hybridoma</td><td>(Logan, UT)</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon surowicy koni</td><td>(Logan, UT)</td><td>SH3007403</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenia ImageXpress Micro</td><td>Molecular (Sunnyvale, Kalifornia)</td><td>System badań przesiewowych</td> <td>ImageXpress micro</td> o wysokiej zawartości</tr><tr>Urządzenia molekularne<td>MetaXpress 4.0</td><td>(Sunnyvale, Kalifornia)</td><td>MetaXpress 4.0</td><td>Akwizycja i analiza obrazu oprogramowanie</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa charakterystyka dorosłych komórek macierzystych zmodyfikowanych pod kątem dostarczania czynników terapeutycznych w strategiach neuroprotekcyjnych

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) pochodzące ze szpiku kostnego są potężnym zasobem komórkowym i były wykorzystywane w licznych badaniach jako potencjalni kandydaci do opracowania strategii leczenia różnych chorób. Celem tego badania było opracowanie i scharakteryzowanie MSCs jako wehikułów komórkowych zaprojektowanych do dostarczania czynników terapeutycznych w ramach strategii neuroprotekcyjnej ratowania uszkodzonego lub chorego układu nerwowego. W tym badaniu wykorzystaliśmy mysie MSCs, które zostały genetycznie zmodyfikowane przy użyciu wektorów lentiwirusowych, które kodują czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego (BDNF) lub czynnik neurotroficzny pochodzący z komórek glejowych (GDNF), wraz z białkiem zielonej fluorescencji (GFP). 
Przed przystąpieniem do badań nad przeszczepami in vivo ważne było scharakteryzowanie zmodyfikowanych komórek, aby ustalić, czy modyfikacja genetyczna zmieniła aspekty normalnego zachowania komórek. Zbadano różne substraty hodowlane pod kątem ich zdolności do wspierania adhezji komórek, proliferacji, przeżycia i migracji komórek czterech subpopulacji zmodyfikowanych MSC. Przeprowadzono badania przesiewowe o wysokiej zawartości (HCS) i przeprowadzono analizę obrazu. 
Badane substraty obejmowały: poli-L-lizynę, fibronektynę, kolagen typu I, lamininę, entaktynę-kolagen IV-lamininę (ECL). Do zbadania proliferacji komórek wykorzystano znakowanie immunologiczne Ki67, a do zbadania żywotności komórek wykorzystano barwienie jodkiem propidyny. Obrazowanie poklatkowe przeprowadzono przy użyciu systemu komór światła przechodzącego/środowiskowego w systemie przesiewowym o wysokiej zawartości.
Nasze wyniki pokazały, że różne subpopulacje genetycznie modyfikowanych MSCs wykazywały podobne zachowania, które były ogólnie porównywalne do oryginalnych, niemodyfikowanych MSCs. Wpływ różnych substratów hodowlanych na wzrost komórek i migrację komórek nie różnił się dramatycznie między grupami porównującymi różne podtypy MSC, a także substraty hodowlane. 
To badanie dostarcza eksperymentalnej strategii szybkiego charakteryzowania zmodyfikowanych komórek macierzystych i ich zachowań przed ich zastosowaniem w długoterminowych badaniach in vivo nad przeszczepami w celu ratowania i naprawy układu nerwowego.

Parametry wzrostu MSC badano poprzez hodowlę różnych populacji MSC na różnych podłożach. Pięć różnych populacji podtypów MSC (MSCs, GFP-MSCs, BDNF-GFP-MSCs, GDNF-GFP-MSCs oraz BDNF/GDNF-GFP-MSCs) wysiano na 96-dołkowe płytki do hodowli tkanek, uprzednio pokryte różnymi podłożami, zgodnie z przedstawieniem na Ryc. 1. Po czterech dniach hodowli płytki utrwalono i poddano immunoznakowaniu i/lub barwieniu odpowiednimi odczynnikami, a następnie zbadano przy użyciu systemu HCS; analizy przeprowadzono za pomocą oprogramowania do akwizycji i analizy obrazów.
<img alt="Schemat układu eksperymentalnego hodowli komórkowej, płytka wielodołkowa z różnymi powłokami i typami komórek." src="/files/ftp_upload/52242/52242fig1highres.jpg" width="650" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Szablon płytki 96-dołkowej dla planowania eksperymentu. Płytki 96-dołkowe powleczono różnymi substratami, a do dołków zasiano zmodyfikowane komórki macierzyste zgodnie z przedstawionym szablonem. Przykładowo, w tym eksperymencie wykorzystano jedynie dołki w rzędach B-F. Rzędy A, G i H pozostały puste. Skróty – MSCs: mezenchymalne komórki macierzyste; GFP-MSCs: MSCs wykazujące ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego; BDNF-GFP-MSCs: MSCs wykazujące ekspresję BDNF-GFP (mózgowego czynnika neurotroficznego); GDNF-GFP-MSCs: MSCs wykazujące ekspresję GDNF-GFP (czynnika neurotroficznego pochodzenia komórek glejowych); BDNF/GDNF-GFP-MSCs: MSCs wykazujące ekspresję BDNF i GDNF-GFP; ECL: entaktyna-kolagen IV-laminina).
Immunoznakowanie przeciwciałami anty-Ki67, a następnie przeciwbarwienie DAPI, zastosowano w celu oceny, czy różne podłoża wpływały na proliferację poszczególnych populacji zmodyfikowanych MSC (Ryc. 2A). Ekspresja antygenu Ki67 występuje preferencyjnie podczas późnej fazy G1, S, G2 oraz M cyklu komórkowego i nie jest wykrywana w komórkach w fazie spoczynku (G0), w związku z czym jest użyteczna jako komórkowy marker proliferacji15. 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) jest powszechnie stosowanym barwnikiem kontrastowym do jąder komórkowych i chromosomów, który emituje niebieską fluorescencję po związaniu się z regionami AT DNA16. Całkowitą liczbę komórek w polu widzenia można określić, licząc liczbę jąder zabarwionych DAPI. Jak pokazano na Ryc. 2B, mimo różnic w procentowym udziale proliferujących MSC, wszystkie podłoża wspierały znaczną proliferację komórek dla każdego z podtypów MSC.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, MSC oznakowane Ki67, wykres słupkowy porównujący interakcje komórek z podłożem." src="/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Analiza proliferacji komórek Ki67. (A) Nałożony obraz podwójnej fluorescencji z immunoznakowaniem Ki67 (czerwony) i barwieniem jąder DAPI (niebieski). Wiele MSC zostało oznakowanych przeciwciałem Ki67 (czerwony). Pasek skali = 50 µm. (B) Wykres słupkowy przedstawiający procentowe udziały podtypów MSC oznakowanych immunochemicznie Ki67, hodowanych przez 5 dni in vitro (DIV) na podłożach z polistyrenu (PS), poli-L-lizyny (PLL), fibronektyny, kolagenu typu I, lamininy lub entaktyny-kolagenu IV-lamininy (ECL). N = jeden eksperyment. Każdy słupek reprezentuje uśrednione dane z 8 obrazowanych obszarów z 2 studzienek dla każdego warunku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Do oceny wpływu różnych podłoży na przeżywalność komórek wykorzystano barwienie jodkiem propidium (PI) (Rysunek 3). Jodek propidium jest powszechnie stosowanym czerwonofluorescencecencyjnym barwnikiem przeciwstawnym do jąder komórkowych i chromosomów. Jodek propidium nie przenika przez błony komórkowe i jest zazwyczaj wykluczany z żywych komórek, co czyni go użytecznym w wykrywaniu martwych komórek w populacji. Procentowy udział martwych komórek w określonych warunkach można wyznaczyć, łącząc go z ogólnym markerem jądrowym, takim jak DAPI, w celu zidentyfikowania wszystkich komórek w polu widzenia. Odsetek komórek dodatnich dla PI był niski na wszystkich badanych podłożach (Rysunek 3). Jako kontrolę dodatnią dla odczynnika PI, kilka studzienek zawierających MSCs inkubowano w 70% etanolu — warunku znanego z tego, że zabija większość komórek —, co doprowadziło do wysokiego odsetka komórek znakowanych PI, jak pokazano na Rysunku 3B i 3C (kontrola dodatnia traktowana etanolem).
<img alt="Analiza barwienia komórek: obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej (A, B) i wykres 3D MSC barwionych PI." src="/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Test śmierci komórkowej z użyciem jodku propidyny. (A) Połączony obraz z podwójną fluorescencją dla barwienia jodkiem propidyny (czerwony) i DAPI (niebieski). Chociaż jądra wszystkich żywych komórek zostały zabarwione DAPI (niebieski), w MSC nie stwierdzono barwienia jodkiem propidyny. (B) Praktycznie wszystkie MSC zostały zabarwione jodkiem propidyny po ekspozycji na 70% etanol. Paski skali w A i B = 100 µm. (C) Wykres słupkowy przedstawiający procenty podtypów MSC zabarwionych jodkiem propidyny (PI), hodowanych przez 5 dni in vitro (DIV) na podłożach z polistyrenu (PS), poli-L-lizyny (PLL), fibronektyny, kolagenu typu I, lamininy lub entaktyny-kolagenu IV-lamininy (ECL). Kontrola etanolem: warunek ten służył jako kontrola dodatnia dla odczynnika barwiącego PI. Większość komórek poddanych barwieniu PI po traktowaniu etanolem jest martwa, a tym samym wykazuje dodatnie barwienie odczynnikiem PI. N = jeden eksperyment. Każdy słupek reprezentuje uśrednione dane z 8 obrazowanych obszarów z 2 studzienek dla każdego warunku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Aby zbadać możliwy wpływ różnych podłoży na zachowanie zmodyfikowanych MSC, analizowano migrację komórek przy użyciu cyfrowej mikroskopii time-lapse oraz systemu światła przechodzącego/komory środowiskowej w systemie HCS (patrz Supplemental Video 1). Wykonano obrazowanie time-lapse wielu obszarów w każdej studzience, co posłużyło do obliczenia szybkości migracji komórek dla różnych subpopulacji MSC rosnących na różnych podłożach z wykorzystaniem programu do akwizycji i analizy obrazów. Ogólnie, jak pokazano na Rysunku 4C, wszystkie podtypy MSC wykazały najszybszą szybkość migracji na powierzchniach powlekanych macierzą zewnątrzkomórkową (Fibronektyna, Kolagen, Laminina i ECL) oraz najwolniejszą na niepowlekanych powierzchniach polistyrenowych.
<img alt="Analiza migracji komórek; mikroskopia żywych komórek; wykres słupkowy 3D; porównanie szybkości migracji MSC na różnych podłożach." src="/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Rysunek 4: Śledzenie i migracja komórek. Śledzenie MSC przy użyciu oprogramowania do akwizycji i analizy obrazów. Nałożone na siebie obrazy w świetle przechodzącym i fluorescencyjnym z (A) początku obrazowania time-lapse oraz (B) po 29 hr, na koniec sesji obrazowania time-lapse (patrz Supplemental Video 1). Ścieżki migracji komórek zaznaczono kolorowymi liniami. Pasek skali: 50 µm. (C) Wykres słupkowy przedstawiający średnie szybkości migracji (wyrażone w µm/hr) dla podtypów MSC hodowanych przez 2 dni in vitro (DIV) na podłożach z polistyrenu (PS), poli-L-lizyny (PLL), fibronektyny, kolagenu typu I, lamininy lub entaktyny-kolagenu IV-lamininy (ECL). N = jeden eksperyment. Każdy słupek reprezentuje średnią z co najmniej 10 obrazowanych komórek z 2 studni dla każdego stanu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wszystkie razem wzięte wyniki dostarczają wstępnych dowodów na to, że te subpopulacje genetycznie zmodyfikowanych MSC wykazują podobne właściwości wzrostu. Wyniki te stanowią przekonujący dowód na to, że modyfikacje genetyczne tych MSC za pomocą wektorów lentiwirusowych nie wywołały żadnych znaczących, wykrywalnych negatywnych skutków w zakresie parametrów wzrostu badanych przy użyciu tej platformy przesiewowej.
Film uzupełniający 1. Cyfrowy film poklatkowy z procesu śledzenia MSC przy użyciu programu komputerowego do akwizycji i analizy obrazów. Przedstawiono ścieżki migracji dwóch komórek MSC [oznaczonych jako 1 (zielona linia śledzenia) i 2 (niebieska linia śledzenia)]. Film został zarejestrowany w ciągu 29 h. Obrazy były pobierane co 5 min. Do przygotowania filmu poklatkowego wykorzystano obrazy fluorescencyjne MSC wykazujących ekspresję GFP. Pasek kalibracyjny = 50 µm. Ten rodzaj analizy jest przydatny do badania zachowań komórkowych, w tym migracji i podziałów komórek.

To badanie opisuje eksperymentalną platformę do szybkiego charakteryzowania zmodyfikowanych komórek macierzystych i ich zachowań przed ich zastosowaniem w długoterminowych badaniach nad przeszczepami in vivo w celu ratowania i naprawy układu nerwowego.

Wysokoprzepustowa charakterystyka dorosłych komórek macierzystych zmodyfikowanych pod kątem dostarczania czynników terapeutycznych w strategiach neuroprotekcyjnych

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Ogólnym celem tej procedury jest szybkie scharakteryzowanie genetycznie modyfikowanych komórek macierzystych przy użyciu systemu badań przesiewowych o wysokiej zawartości lub HCS. Osiąga się to poprzez najpierw zaprojektowanie i przygotowanie eksperymentów dla płytki 96-dołkowej, a następnie posiew różnych populacji zmodyfikowanych komórek macierzystych. Następnie system przesiewowy o wysokiej zawartości jest przygotowywany do obrazowania żywych komórek, a następnie inicjowane jest obrazowanie poklatkowe na żądany okres czasu.Następnie, po zakończeniu obrazowania poklatkowego, płytka hodowlana jest przygotowywana do procedur barwienia komórek, takich jak jodek propidyny, barwienie w celu śmierci komórki lub znakowanie immunologiczne KI 67 w celu scharakteryzowania proliferacji komórek. Na koniec 96-dołkowa płytka jest ponownie ładowana do systemu przesiewowego o wysokiej zawartości w celu obrazowania fluorescencyjnego i akwizycji obrazu. Ostatecznie oprogramowanie do analizy obrazu służy do przeprowadzania analizy danych w celu określenia różnych parametrów wzrostu komórek.Metodologia ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów w dziedzinie biologii komórek macierzystych, takich jak identyfikacja i charakterystyka czynników stymulujących różnicowanie komórek macierzystych. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku strategii terapeutycznych opartych na komórkach ze względu na znaczenie charakterystyki typów komórek przed ich zastosowaniem in vivo. Ta metoda może zapewnić wgląd w zachowania komórek i może być zastosowana do praktycznie każdego innego typu komórek, które dobrze rosną w hodowli.Ponadto podejścia te mogą być potencjalnie stosowane na całych organizmach, takich jak larwy danio pręgowanego. Na początek należy utworzyć mapę, jak pokazano tutaj, płytki 96-dołkowej, przedstawiającą różne substraty i typy komórek, które mają być badane pod sterylnym kapturem hodowlanym. Przygotuj stację roboczą z różnymi podłożami i płytką 96-dołkową.Dodaj 100 mikrolitrów roztworu substratu do każdego, dobrze zgodnie z mapą. Następnie użyj paska perfilu, aby uszczelnić pokrywę i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc po wyizolowaniu mezenchymalnych komórek macierzystych myszy i zakażeniu ich wektorami lentiwirusowymi zgodnie z protokołem tekstowym, usuń roztwory substratu z płytki 96-dołkowej i użyj około 200 mikrolitrów sterylnego PBS do dwukrotnego umycia studzienek. Po usunięciu końcowego płukania z 200 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych i zrównoważyć płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.W międzyczasie, w sterylnych warunkach, zbierz MSC, najpierw zbierając pożywkę wzrostową, obecnie określaną jako kondycjonowana pożywka z kolby do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Następnie dodaj osiem mililitrów sterylnego PBS do kolby i delikatnie zamieszaj przed zasysaniem buforu Aby odłączyć komórki od kolby, dodaj jeden mililitr 0,05% trypsyny i 0,01% roztworu EDTA. Gdy komórki się odłączą, dodaj osiem mililitrów kondycjonowanej pożywki przed zebraniem zawiesiny komórek i ponownym posiewem komórek w ilości około 300 komórek na studzienkę.Zgodnie z protokołem tekstowym, inkubuj płytkę przez dwie godziny, aby umożliwić MSCs przyczepienie się do substratu podczas inkubacji komórek. Uruchom system HCS i poczekaj dwie godziny, aż się zrównoważy. Ustaw regulator środowiskowy na 37 stopni Celsjusza i ostrożnie włącz butlę z mieszanym gazem zawierającą 5% dwutlenku węgla w powietrzu do systemu HCS, komory środowiskowej, która dostarcza stałe źródło powietrza.Następnie, po dwugodzinnym okresie inkubacji, wyjmij 96-dołkową płytkę z inkubatora i umieść ją bezpośrednio w komorze środowiskowej systemu HCS. Po pozostawieniu płytki do równowagi przez 30 minut, uruchom oprogramowanie, aby skonfigurować ustawienia płytki. Po ustawieniu parametrów obrazowania, zgodnie z protokołem tekstowym, użyj laserowego autofokusa, aby ustawić ostrość na dnie studni i wykonaj zdjęcia testowe z wielu miejsc i wielu studni, aby znaleźć zoptymalizowaną płaszczyznę ogniskowej.Po ustaleniu ostrości zacznij robić zdjęcia co pięć minut przez 48 godzin dla wszystkich 60 dołków. Pod koniec eksperymentu wyjąć 96-dołkową płytkę z systemu HCS w sterylnych warunkach, zebrać kondycjonowane próbki pożywki z każdej studzienki i przenieść je na świeżą 96-dołkową płytkę. Próbki te można później wykorzystać do testu ELIZA w celu przeprowadzenia testu proliferacji komórek KI 67.Użyj 0,1 molowego buforu fosforanowego, aby przepłukać kultury komórkowe przez jedną minutę. Po powtórzeniu prania użyj 4% para formaldehydu lub PFA w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby utrwalić kultury po utrwaleniu. Usunąć PFA i użyć PBS do przepłukania studzienek trzy razy przez siedem minut każdy.Po zablokowaniu komórek zgodnie z protokołem tekstowym, nałóż 100 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na każdą z nich. Dobrze przykryj płytkę i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po trzykrotnym umyciu komórek przez siedem minut.Do każdego prania należy zastosować przeciwciało wtórne. Umieść komórki w ciemności i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 90 minut po kolejnych trzech płukaniach. Przykryj płytkę i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu wykonania obrazowania.Aby wykonać automatyczne obrazowanie, należy załadować płytkę znakowaną immunologicznie do systemu HCS i pozostawić płytkę do równowagi przez 20 minut. Otwórz oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazów systemu HCS. Wybierz ustawienia akwizycji dla obiektywu 10x, korzystając z wygięcia kamery na jednym i ustawieniu wzmocnienia na dwa.Użyj funkcji automatycznej ekspozycji, aby znaleźć płaszczyznę Z, w której znajdują się komórki, i obliczyć przesunięcie dla każdej długości fali będącej przedmiotem zainteresowania dla analizy przedstawionej tutaj. Przechwytuj obrazy dla DAP, EGFP i S3. Wybierz maksymalny poziom intensywności, przy którym studzienki kontroli ujemnej nie wykazują sygnału do akwizycji obrazu. Użyj tych samych ustawień progowych dla dołków dodatnich.Na koniec przechwyć obrazy i zapisz je w bazie danych przed wykonaniem analizy obrazu. Zgodnie z protokołem tekstowym, jak pokazano tutaj, pięć różnych populacji podtypów MSC zostało posianych na 96 płytkach do hodowli tkankowych Well, wstępnie zakodowanych różnymi substratami na tym rysunku, anty KI 67, który identyfikuje komórki proliferacyjne, a DAPI wykorzystano do oceny, czy różne substraty wpłynęły na proliferację różnych populacji zmodyfikowanych MSC, jak pokazano tutaj, chociaż występowały różnice w odsetku proliferujących MSC, wszystkie substraty sprzyjały znacznej proliferacji komórek dla każdego podtypu MSC. Wykres ten pokazuje, że odsetek komórek z jodkiem propidyny lub barwieniem PI, które identyfikuje martwe komórki w populacji, jest niski na wszystkich badanych substratach komórek traktowanych 70% etanolem, który zabija większość komórek, wykazywał wysoki wskaźnik znakowania PI i służy jako kontrola pozytywna do badania zachowania MSCs na różnych podłożach.Migrację komórek w okresie 29 godzin analizowano za pomocą poklatkowej mikroskopii cyfrowej. Ścieżka migracji dla komórki pierwszej i drugiej jest oznaczona odpowiednio zieloną i niebieską linią. Jak pokazano tutaj, wszystkie podtypy MSCs wykazywały najszybszy wskaźnik migracji na macierzy zewnątrzkomórkowej, powierzchniach powlekanych, a najwolniejsze na powierzchniach z polistyrenu niepowlekanego.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o starannym zaplanowaniu i zaprojektowaniu eksperymentu dla formatu płytki wielodołkowej, takiej jak płytka 96-dołkowa Zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak Eliza S, mogą być wykonywane na pożywkach warunkowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące produkcji i wydzielania czynników terapeutycznych przez zmodyfikowane komórki macierzyste po jego opracowaniu. Procedury badań przesiewowych o wysokiej zawartości utorowały drogę naukowcom zajmującym się biologią komórek macierzystych i odkrywaniem leków do badania złożonych systemów biologicznych w sposób wysokoprzepustowy.

high-throughput-characterization-adult-stem-cells-engineered-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Charakterystyka wysokowydajnościowa komórek macierzystych u dorosłych zmodyfikowanych w celu dostarczania czynników terapeutycznych dla strategii neuroprotekcyjnych

Protokoły różnicowania neuronalnego pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych (hPSCs) są często czasochłonne i wymagają zaawansowanych umiejętności w hodowli komórkowej. W niniejszej pracy dostosowaliśmy procedurę różnicowania opartą na małych cząsteczkach do formatu płytek wielodobojowych, co umożliwia prostą, szybką i wydajną generację ludzkich neuronów w sposób kontrolowany.

Szybka i wydajna generacja neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płyt wielodołkowych

Źródło: Sharma, A. D., et.al. Wysokoprzepustowa charakterystyka dorosłych komórek macierzystych zmodyfikowanych w celu dostarczania czynników terapeutycznych w strategiach neuroprotekcyjnych. J. Vis. Exp. (2015)Film ten pokazuje proces charakteryzowania transgenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych zaprojektowanych do ekspresji terapeutycznych czynników neurotroficznych. Przedstawiono w nim etapy związane z utrwalaniem, przepuszczalnością i barwieniem komórek za pomocą pierwszorzędowych...

Charakterystyka genetycznie modyfikowanych mezenchymalnych komórek macierzystych do zastosowań neuroterapeutycznych

Neuronalne komórki macierzyste pobrane z dorosłego mózgu są coraz częściej wykorzystywane w różnych zastosowaniach, począwszy od podstawowych badań nad rozwojem układu nerwowego, a skończywszy na odkrywaniu potencjalnych zastosowań klinicznych w medycynie regeneracyjnej. To sprawia, że rygorystyczna kontrola warunków izolacji i hodowli stosowanych do hodowli tych komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania solidnych wyników eksperymentalnych.

Hodowla nerwowych komórek macierzystych z konwencjonalnych i niekonwencjonalnych regionów mózgu dorosłego gryzonia

Opracowano metodę bezpośredniego pozyskiwania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych wzbogaconych o komórki krwi obwodowej.

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Tutaj prezentujemy metodę dla ludzkiego modelu in vitro uszkodzenia rozciągającego w formacie 96-dołkowym w skali czasowej istotnej dla traumy uderzeniowej. Obejmuje to metody wytwarzania rozciągliwych płytek, ilościowego określania mechanicznej zniewagi, hodowli i uszkadzania komórek, obrazowania i analizy wysokiej zawartości w celu ilościowego określenia urazu.

Metoda szybkiego rozciągania indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych w formacie 96-dołkowym

Prezentujemy metodę bez modyfikacji genetycznie (GMO) do uzyskania komórek z fenotypem neuronalnym z przeprogramowanych komórek krwi obwodowej. Aktywacja szlaku sygnałowego powiązanego z nowym ludzkim białkiem połączonym z GPI ujawnia skuteczną, wolną od GMO metodę pozyskiwania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie komórek neuronalnych pochodzących z krwi bez GMO

Opisujemy produkcję mieszanych kultur astrocytów i komórek prekursorowych oligodendrocytów pochodzących z płodowych lub dorosłych nerwowych komórek macierzystych różnicujących się w dojrzałe oligodendrocyty, oraz modelowanie in vitro szkodliwych bodźców. Połączenie z techniką badań przesiewowych o wysokiej zawartości komórek tworzy niezawodny i solidny system badań przesiewowych leków.

Analiza przesiewowa, różnicowanie i dojrzewanie płodowych i dorosłych komórek macierzystych pochodzących z płodowych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego

Opisujemy protokół przeprogramowania fibroblastów pochodzących z ludzkiej skóry w indukowane neuronalne komórki progenitorowe (iNPC), a następnie ich różnicowanie w indukowane astrocyty (iAs). Metoda ta prowadzi do szybkiego i powtarzalnego generowania iNPC i iA w dużych ilościach.

Modelowanie in vitro chorób neurologicznych z wykorzystaniem bezpośredniej konwersji z fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych i różnicowania w astrocyty

Tutaj opisujemy system nukleofekcji zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności dostarczania genów w rozszerzonych nerwowych komórkach macierzystych (NSC) wyizolowanych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Wyniki pokazują, że metoda ta znacznie poprawia perturbację genów w NSC, przewyższając skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji i zwiększając wskaźnik przeżywalności komórek.

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Tutaj opisujemy protokół inżynierii chemicznie przeprogramowanych komórek macierzystych w celu osiągnięcia precyzyjnej modulacji neuronalnej poprzez różnicowanie tych komórek w dopaminergiczne komórki prekursorowe, przeszczepianie ich do mysich modeli choroby Parkinsona oraz ocenę wyników behawioralnych i elektrofizjologicznych w celu potwierdzenia udanej integracji i funkcjonalnej skuteczności przeszczepionych komórek.

Regulacja chemogenetyczna w przeprogramowanych komórkach prekursorowych pochodzących z komórek macierzystych w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych

Poznaj metodę szybkiej charakterystyki zmodyfikowanych komórek macierzystych myszy przy użyciu systemu HCS. Technika obejmuje obrazowanie żywych komórek i analizę parametrów wzrostu.

Wysokoprzepustowa charakterystyka dorosłych komórek macierzystych zmodyfikowanych pod kątem dostarczania czynników terapeutycznych w strategiach neuroprotekcyjnych (Wideo) | JoVE Journal

Wysokoprzepustowa charakterystyka dorosłych komórek macierzystych zmodyfikowanych pod kątem dostarczania czynników terapeutycznych w strategiach neuroprotekcyjnych

Przeglądaj więcej filmów