Wysokoprzepustowa charakterystyka dorosłych komórek macierzystych zmodyfikowanych pod kątem dostarczania czynników terapeutycznych w strategiach neuroprotekcyjnych
4 stycznia 2015
To badanie opisuje eksperymentalną platformę do szybkiego charakteryzowania zmodyfikowanych komórek macierzystych i ich zachowań przed ich zastosowaniem w długoterminowych badaniach nad przeszczepami in vivo w celu ratowania i naprawy układu nerwowego.
Ogólnym celem tej procedury jest szybkie scharakteryzowanie genetycznie modyfikowanych komórek macierzystych przy użyciu systemu badań przesiewowych o wysokiej zawartości lub HCS. Osiąga się to poprzez najpierw zaprojektowanie i przygotowanie eksperymentów dla płytki 96-dołkowej, a następnie posiew różnych populacji zmodyfikowanych komórek macierzystych. Następnie system przesiewowy o wysokiej zawartości jest przygotowywany do obrazowania żywych komórek, a następnie inicjowane jest obrazowanie poklatkowe na żądany okres czasu.
Następnie, po zakończeniu obrazowania poklatkowego, płytka hodowlana jest przygotowywana do procedur barwienia komórek, takich jak jodek propidyny, barwienie w celu śmierci komórki lub znakowanie immunologiczne KI 67 w celu scharakteryzowania proliferacji komórek. Na koniec 96-dołkowa płytka jest ponownie ładowana do systemu przesiewowego o wysokiej zawartości w celu obrazowania fluorescencyjnego i akwizycji obrazu. Ostatecznie oprogramowanie do analizy obrazu służy do przeprowadzania analizy danych w celu określenia różnych parametrów wzrostu komórek.
Metodologia ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów w dziedzinie biologii komórek macierzystych, takich jak identyfikacja i charakterystyka czynników stymulujących różnicowanie komórek macierzystych. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku strategii terapeutycznych opartych na komórkach ze względu na znaczenie charakterystyki typów komórek przed ich zastosowaniem in vivo. Ta metoda może zapewnić wgląd w zachowania komórek i może być zastosowana do praktycznie każdego innego typu komórek, które dobrze rosną w hodowli.
Ponadto podejścia te mogą być potencjalnie stosowane na całych organizmach, takich jak larwy danio pręgowanego. Na początek należy utworzyć mapę, jak pokazano tutaj, płytki 96-dołkowej, przedstawiającą różne substraty i typy komórek, które mają być badane pod sterylnym kapturem hodowlanym. Przygotuj stację roboczą z różnymi podłożami i płytką 96-dołkową.
Dodaj 100 mikrolitrów roztworu substratu do każdego, dobrze zgodnie z mapą. Następnie użyj paska perfilu, aby uszczelnić pokrywę i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc po wyizolowaniu mezenchymalnych komórek macierzystych myszy i zakażeniu ich wektorami lentiwirusowymi zgodnie z protokołem tekstowym, usuń roztwory substratu z płytki 96-dołkowej i użyj około 200 mikrolitrów sterylnego PBS do dwukrotnego umycia studzienek. Po usunięciu końcowego płukania z 200 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych i zrównoważyć płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
W międzyczasie, w sterylnych warunkach, zbierz MSC, najpierw zbierając pożywkę wzrostową, obecnie określaną jako kondycjonowana pożywka z kolby do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Następnie dodaj osiem mililitrów sterylnego PBS do kolby i delikatnie zamieszaj przed zasysaniem buforu Aby odłączyć komórki od kolby, dodaj jeden mililitr 0,05% trypsyny i 0,01% roztworu EDTA. Gdy komórki się odłączą, dodaj osiem mililitrów kondycjonowanej pożywki przed zebraniem zawiesiny komórek i ponownym posiewem komórek w ilości około 300 komórek na studzienkę.
Zgodnie z protokołem tekstowym, inkubuj płytkę przez dwie godziny, aby umożliwić MSCs przyczepienie się do substratu podczas inkubacji komórek. Uruchom system HCS i poczekaj dwie godziny, aż się zrównoważy. Ustaw regulator środowiskowy na 37 stopni Celsjusza i ostrożnie włącz butlę z mieszanym gazem zawierającą 5% dwutlenku węgla w powietrzu do systemu HCS, komory środowiskowej, która dostarcza stałe źródło powietrza.
Następnie, po dwugodzinnym okresie inkubacji, wyjmij 96-dołkową płytkę z inkubatora i umieść ją bezpośrednio w komorze środowiskowej systemu HCS. Po pozostawieniu płytki do równowagi przez 30 minut, uruchom oprogramowanie, aby skonfigurować ustawienia płytki. Po ustawieniu parametrów obrazowania, zgodnie z protokołem tekstowym, użyj laserowego autofokusa, aby ustawić ostrość na dnie studni i wykonaj zdjęcia testowe z wielu miejsc i wielu studni, aby znaleźć zoptymalizowaną płaszczyznę ogniskowej.
Po ustaleniu ostrości zacznij robić zdjęcia co pięć minut przez 48 godzin dla wszystkich 60 dołków. Pod koniec eksperymentu wyjąć 96-dołkową płytkę z systemu HCS w sterylnych warunkach, zebrać kondycjonowane próbki pożywki z każdej studzienki i przenieść je na świeżą 96-dołkową płytkę. Próbki te można później wykorzystać do testu ELIZA w celu przeprowadzenia testu proliferacji komórek KI 67.
Użyj 0,1 molowego buforu fosforanowego, aby przepłukać kultury komórkowe przez jedną minutę. Po powtórzeniu prania użyj 4% para formaldehydu lub PFA w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby utrwalić kultury po utrwaleniu. Usunąć PFA i użyć PBS do przepłukania studzienek trzy razy przez siedem minut każdy.
Po zablokowaniu komórek zgodnie z protokołem tekstowym, nałóż 100 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na każdą z nich. Dobrze przykryj płytkę i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po trzykrotnym umyciu komórek przez siedem minut.
Do każdego prania należy zastosować przeciwciało wtórne. Umieść komórki w ciemności i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 90 minut po kolejnych trzech płukaniach. Przykryj płytkę i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu wykonania obrazowania.
Aby wykonać automatyczne obrazowanie, należy załadować płytkę znakowaną immunologicznie do systemu HCS i pozostawić płytkę do równowagi przez 20 minut. Otwórz oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazów systemu HCS. Wybierz ustawienia akwizycji dla obiektywu 10x, korzystając z wygięcia kamery na jednym i ustawieniu wzmocnienia na dwa.
Użyj funkcji automatycznej ekspozycji, aby znaleźć płaszczyznę Z, w której znajdują się komórki, i obliczyć przesunięcie dla każdej długości fali będącej przedmiotem zainteresowania dla analizy przedstawionej tutaj. Przechwytuj obrazy dla DAP, EGFP i S3. Wybierz maksymalny poziom intensywności, przy którym studzienki kontroli ujemnej nie wykazują sygnału do akwizycji obrazu. Użyj tych samych ustawień progowych dla dołków dodatnich.
Na koniec przechwyć obrazy i zapisz je w bazie danych przed wykonaniem analizy obrazu. Zgodnie z protokołem tekstowym, jak pokazano tutaj, pięć różnych populacji podtypów MSC zostało posianych na 96 płytkach do hodowli tkankowych Well, wstępnie zakodowanych różnymi substratami na tym rysunku, anty KI 67, który identyfikuje komórki proliferacyjne, a DAPI wykorzystano do oceny, czy różne substraty wpłynęły na proliferację różnych populacji zmodyfikowanych MSC, jak pokazano tutaj, chociaż występowały różnice w odsetku proliferujących MSC, wszystkie substraty sprzyjały znacznej proliferacji komórek dla każdego podtypu MSC. Wykres ten pokazuje, że odsetek komórek z jodkiem propidyny lub barwieniem PI, które identyfikuje martwe komórki w populacji, jest niski na wszystkich badanych substratach komórek traktowanych 70% etanolem, który zabija większość komórek, wykazywał wysoki wskaźnik znakowania PI i służy jako kontrola pozytywna do badania zachowania MSCs na różnych podłożach.
Migrację komórek w okresie 29 godzin analizowano za pomocą poklatkowej mikroskopii cyfrowej. Ścieżka migracji dla komórki pierwszej i drugiej jest oznaczona odpowiednio zieloną i niebieską linią. Jak pokazano tutaj, wszystkie podtypy MSCs wykazywały najszybszy wskaźnik migracji na macierzy zewnątrzkomórkowej, powierzchniach powlekanych, a najwolniejsze na powierzchniach z polistyrenu niepowlekanego.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o starannym zaplanowaniu i zaprojektowaniu eksperymentu dla formatu płytki wielodołkowej, takiej jak płytka 96-dołkowa Zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak Eliza S, mogą być wykonywane na pożywkach warunkowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące produkcji i wydzielania czynników terapeutycznych przez zmodyfikowane komórki macierzyste po jego opracowaniu. Procedury badań przesiewowych o wysokiej zawartości utorowały drogę naukowcom zajmującym się biologią komórek macierzystych i odkrywaniem leków do badania złożonych systemów biologicznych w sposób wysokoprzepustowy.
Przegląd
Niniejsze badanie opisuje platformę eksperymentalną do szybkiej charakterystyki zmodyfikowanych komórek macierzystych oraz ich zachowań przed zastosowaniem ich w długoterminowych badaniach transplantacyjnych in vivo w celu ratowania i naprawy układu nerwowego. Przedstawiona metodologia może pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów w biologii komórek macierzystych, takich jak identyfikacja czynników stymulujących różnicowanie komórek macierzystych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Przesiew wysokotreściowy
- Proliferacja komórek
Wstęp
- zmodyfikowane komórki macierzyste są kluczowe dla zastosowań terapeutycznych.
- Charakteryzacja komórek macierzystych jest niezbędna przed zastosowaniem in vivo.
- Przesiewanie wysokoprzepustowe (High Content Screening) umożliwia szczegółową analizę zachowań komórek.
- Niniejsze badanie koncentruje się na mezenchymalnych komórkach macierzystych myszy.
Cel badania
- Szybka charakterystyka genetycznie zmodyfikowanych komórek macierzystych.
- Wykorzystanie wysokoprzepustowego przesiewania (high content screening) do obrazowania żywych komórek.
- Analiza parametrów wzrostu i tempa proliferacji komórek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie płytki 96-dołkowej dla różnych populacji zmodyfikowanych komórek macierzystych.
- Obrazowanie żywych komórek z wykorzystaniem systemu wysokoprzepustowego screeningu (HCS).
- Procedury barwienia komórek w celu oceny śmierci i proliferacji komórek.
- Analiza obrazów w celu określenia parametrów wzrostu.
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie i analiza zachowań komórek macierzystych w czasie.
- Identyfikacja czynników wpływających na różnicowanie komórek macierzystych.
- Wnioski dotyczące zachowań komórek, które można zastosować do różnych typów komórek.
- Potencjalne zastosowania w strategiach terapeutycznych z wykorzystaniem komórek macierzystych.
Wnioski
- Opisana metodologia stanowi solidną platformę do charakteryzacji komórek macierzystych.
- Uzyskane informacje mogą być pomocne w przyszłych zastosowaniach in vivo.
- Podejście to można zaadaptować do innych typów komórek i organizmów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka charakterystyka zmodyfikowanych komórek macierzystych jest kluczowa dla ograniczenia ryzyka związanego ze strategiami terapeutycznymi o działaniu neuroprotekcyjnym przed ich zastosowaniem in vivo. Przesiewanie wysokoprzepustowe umożliwia ilościową ocenę proliferacji, migracji oraz zachowań zależnych od podłoża w wielu zmodyfikowanych liniach komórkowych. Podejście to wspiera walidację celów oraz zwiększa pewność predykcyjną systemów dostarczania opartych na komórkach macierzystych w modelach chorób neurodegeneracyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez porównanie proliferacji i migracji zmodyfikowanych MSCs wykazujących ekspresję BDNF i GDNF na określonych podłożach.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, wysokoprzepustowe odczyty do funkcjonalnej walidacji celów systemów dostarczania czynników neurotroficznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych wskaźników proliferacji i żywotności poprzez barwienie Ki67 oraz jodkiem propidium w celu standaryzacji testu.
- Wartość operacyjna: Wspiera opracowanie powtarzalnych i skalowalnych testów do badania zachowania komórek macierzystych w kontrolowanych warunkach mikrośrodowiskowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Określa zależne od substratu zachowania istotne dla przebiegu choroby, co pozwala na dostosowanie translacyjnych biomarkerów w celu ratowania układu nerwowego.
- Wartość operacyjna: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka poprzez potwierdzenie zachowania funkcji komórek macierzystych po modyfikacji genetycznej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć – od wczesnej inżynierii komórek macierzystych po walidację przedkliniczną – umożliwiając podejmowanie decyzji go/no-go w oparciu o dane przed przeprowadzeniem kosztownych badań in vivo.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących zachowania zmodyfikowanych MSC na powierzchniach powlekanych macierzą zewnątrzkomórkową w porównaniu z powierzchniami niepowlekanymi.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanemu wysiewaniu w płytkach 96-dołkowych, obrazowaniu time-lapse oraz odczytom proliferacji opartym na fluorescencji.
- Analityka: Umożliwia ilościowe porównanie parametrów wzrostu i ścieżek migracji pomiędzy podtypami komórek i warunkami hodowli.
- Badania translacyjne: Łączy charakterystykę in vitro z ciągłością przedkliniczną poprzez walidację neuroprotekcyjnego zachowania komórek przed transplantacją.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do charakterystyki dowolnego typu zmodyfikowanych lentiwirusowo komórek macierzystych w formacie wysokoprzepustowym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w zachowaniu komórek macierzystych poprzez izolację zmiennych, takich jak rodzaj podłoża i modyfikacja genetyczna.
- Wartość operacyjna: Zwiększa standaryzację i powtarzalność dzięki zautomatyzowanemu obrazowaniu i zdefiniowanym protokołom barwienia.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez wczesną identyfikację niefunkcjonalnych linii inżynieryjnych w procesie odkrywania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację linii komórek macierzystych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o profile migracji i proliferacji na podłożach istotnych dla układu nerwowego.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek macierzystych, transdukcji lentiwirusowej oraz obsłudze aparatury do wysokoprzepustowego obrazowania (high-content screening).
- Zależność od systemów kontroli środowiskowej w celu zapewnienia możliwości obrazowania żywych komórek oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Konieczność standaryzacji protokołów barwienia i potoków analizy obrazu pomiędzy zespołami w celu zapewnienia spójnej interpretacji danych.
- Kwestie adaptacyjne obejmują dobór podłoża oraz wydajność transfekcji w zależności od źródła lub gatunku MSC.
- Ograniczenia praktyczne obejmują czas trwania testu (ponad 48 godzin) oraz zależność od utrzymania optymalnej płaszczyzny ogniskowania podczas obrazowania time-lapse.
